JP4693972B2 - レーザ顕微鏡 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、標本の多光子吸収による化学反応又は蛍光を検出する走査型の多光子励起のレーザ顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、レーザ顕微鏡として、極短パルスレーザビームを観察対象の標本に照射し、標本の多光子吸収による化学反応又は蛍光を検出する多光子励起走査型レーザ顕微鏡が知られている。
【０００３】
ところで、多光子励起現象は単位面積、単位時間当たりの光子密度のｎ乗（２光子励起の場合はｎ＝２、３光子励起の場合はｎ＝３）に比例した確率で発生するため、多光子励起法の光源には通常サブピコ秒オーダの極短パルスのレーザビームが用いられる。
【０００４】
しかし、このようなサブピコ秒のパルスレーザビームは完全に単波長ではなく、そのパルス幅と相関を持つある波長幅を有する。一般的に光が光学系を通過する場合、波長が短いほど媒質中での速度は遅く、波長が長いほど媒質中の速度は速くなる。従って、上述のようにパルスレーザビームが波長幅を有していると、光学系を通過する際、波長によって通過時間に差が生じることとなり、その結果、光学系に入射する前のパルス幅に比べ、光学系を通過した後のパルス幅が広がってしまう、所謂チャープが発生する。
【０００５】
このことは、前述のように多光子励起現象は、光子密度に依存するため、チャープに原因する標本面でのパルス幅の広がりによって、多光子励起現象が発生する確率を低下させ、結果、得られる蛍光が暗くなってしまう。
【０００６】
この問題を解決する手段として、パルス幅調整手段、いわゆるプレチャープコンペンセーションを用いることが知られている。このプレチャープコンペンセーションは、プリズムペア、もしくはグレーティングペア、またはこれらを組合せた光学系で、パルスレーザの長波長光を短波長光より遅らせて入射させることで、光学系を通過した後のパルス幅の広がりを補正するようにしている。
【０００７】
一方、多光子励起法を走査型レーザ顕微鏡に用いた場合、通常択一的に選択される複数の対物レンズ及びその他の光学系（プリズム又はミラーなど）を有している。これら複数の対物レンズ及びその他の光学系は、それぞれで光路長及び材質が異なるため、どの対物レンズ及びその他の光学系を選択するかでパルス幅の広がりは異なり、そのため最適な条件で多光子励起法を行なうには、対物レンズ及びその他の光学系を選択する毎に、プレチャープコンペンセーションを調整する必要がある。
【０００８】
また、上述したようにパルス幅の広がりは、パルスレーザビームの波長にも依存するため、パルスレーザビームの波長が可変な場合は、波長を変更する毎に同様にプレチャープコンペンセーションを調整する必要がある。
【０００９】
そこで、従来、プレチャープコンペンセーションの調整を最適化する方法として、特開平１０−３１８９２４号公報および特開平１１−３２６７７５公報に開示されたものが知られている。
【００１０】
このうち特開平１０−３１８９２４公報には、対物レンズに対して標本を挟んで反対側のコリメート光学系と、パルス幅を測定するオートコリレータを備えて、標本上のパルス幅を測定しながらプレチャープコンペンセーションを調整することが開示されている。
【００１１】
また、特開平１１−３２６７７５公報には、各対物レンズの光路長に対応した補正光学部材を備えておき、対物レンズの選択に対応して補正光学部材を選択して光路に配置することが開示されている。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、特開平１０−３１８９２４公報の方法では、標本の近傍にコリメート光学系及びオートコリレータを配置することから装置が大型化してしまう。このため、例えば標本に電極を刺して行なうパッチクランプを行ないながら観察するような場合、標本の周りに作業スペースを確保するのが難しくなるなどの問題が生じる。
【００１３】
また、特開平１１−３２６７７５公報の方法では、対物レンズの数に加え、プリズムやミラーなど他の選択光学系がある場合は、これらの数だけ補正光学部材が必要となり装置が大型化してしまう。また、全ての光学系に対応させて補正光学部材を多数用意することも困難である。また、補正光学部材は切換えるのみで、細かい調整ができないため、波長可変レーザビームを使用した場合に全ての波長域でプレチャープコンペンセーションを最適に調整することが難しいという問題もある。
【００１４】
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、標本位置でのレーザビームのパルス幅を短く、望ましくは最短にする最適なパルス幅調整を行うことができるレーザ顕微鏡を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明は、レーザ光源から発せられる波長変更可能な極短パルスレーザビームを、光学部材を介して標本に照射するレーザ顕微鏡において、前記レーザ光源から発せられる前記極短パルスレーザビームの波長を認識するレーザ波長認識手段と、レーザ波長に対応させた前記光学部材の分散データを記憶した記憶手段と、前記極短パルスレーザビームのパルス幅を調整するパルス幅調整手段と、前記レーザ波長認識手段により認識された前記レーザ波長に対応する前記分散データを前記記憶手段から読み込み、読み込んだ該分散データに基づいてチャープ量を求め、該チャープ量により前記標本面での前記極短パルスレーザビームの前記パルス幅が短くなる方向に前記パルス幅調整手段による該極短パルスレーザビームの該パルス幅の調整を制御する制御手段と、を具備したことを特徴としている。
【００１６】
請求項２記載の発明は、レーザ光源から発せられる波長変更可能な極短パルスレーザビームを、光路に対して挿脱可能な光学部材を介して標本に照射するレーザ顕微鏡において、前記レーザ光源から発せられる前記極短パルスレーザビームの波長を認識するレーザ波長認識手段と、前記光路に挿入された前記光学部材の種類を認識する光学部材認識手段と、レーザ波長に対応させた前記光学部材の分散データを記憶した記憶手段と、前記極短パルスレーザビームのパルス幅を調整するパルス幅調整手段と、前記レーザ波長認識手段により認識された前記レーザ波長と前記光学部材認識手段により認識された前記光学部材とに対応する前記分散データを前記記憶手段から読み込み、読み込んだ該分散データに基づいてチャープ量を求め、該チャープ量により前記標本面での前記極短パルスレーザビームの前記パルス幅が短くなる方向に前記パルス幅調整手段による該極短パルスレーザビームの該パルス幅の調整を制御する制御手段と、を具備したことを特徴としている。
【００１７】
請求項３記載の発明は、レーザ光源から発せられる波長変更可能な極短パルスレーザビームを、光路に対して挿脱可能な光学部材を介して標本に照射するレーザ顕微鏡において、前記レーザ光源から発せられる極短パルスレーザビームの波長および前記光路に挿入する前記光学部材の種類を指定する入力手段と、レーザ波長に対応させた前記光学部材の分散データを記憶した記憶手段と、前記極短パルスレーザビームのパルス幅を調整するパルス幅調整手段と、前記入力手段により指定された前記レーザ波長および前記光学部材に対応する前記分散データを前記記憶手段から読み込み、読み込んだ該分散データに基づいてチャープ量を求め、該チャープ量により前記標本面での前記極短パルスレーザビームの前記パルス幅が短くなる方向に前記パルス幅調整手段による該極短パルスレーザビームの該パルス幅の調整を制御する制御手段と、を具備したことを特徴としている。
【００１８】
請求項４記載の発明は、レーザ光源から発せられる波長変更可能な極短パルスレーザビームを、光学部材を介して標本に照射するレーザ顕微鏡において、前記標本が発する光の光量を検出する光量検出手段と、前記レーザ光源から発せられる極短パルスレーザビームの波長を認識するレーザ波長認識手段と、前記極短パルスレーザビームのパルス幅を調整するパルス幅調整手段と、前記レーザ波長認識手段により認識されたレーザ波長が変化したことが認識されると、前記光量検出手段で検出される前記光量を増加させるように前記パルス幅調整手段による前記極短パルスレーザビームの前記パルス幅の調整を制御する制御手段と、を具備したことを特徴としている。
【００１９】
請求項５記載の発明は、レーザ光源から発せられる波長変更可能な極短パルスレーザビームを、光学部材を介して標本に照射するレーザ顕微鏡において、前記標本が発する光の光量を検出する光量検出手段と、前記レーザ光源から発せられる極短パルスレーザビームの波長を指定する入力手段と、前記極短パルスレーザビームのパルス幅を調整するパルス幅調整手段と、前記入力手段により前記レーザ光源から発せられる前記極短パルスレーザビームの前記波長の指定が指定されると、前記光量検出手段で検出される前記光量を増加させるように前記パルス幅調整手段による前記極短パルスレーザビームの前記パルス幅の調整を制御する制御手段と、を具備したことを特徴としている。
請求項６記載の発明は、レーザ光源から発せられる波長変更可能な極短パルスレーザビームを、光学部材を介して標本に照射するレーザ顕微鏡において、前記レーザ光源から発せられる極短パルスレーザビームの波長を指定する入力手段と、レーザ波長に対応させた前記光学部材の分散データを記憶した記憶手段と、前記極短パルスレーザビームのパルス幅を調整するパルス幅調整手段と、前記入力手段により指定された前記レーザ波長に対応させた前記光学部材の前記分散データを前記記憶手段から読み込み、読み込んだ該分散データに基づいてチャープ量を求め、該チャープ量により前記標本面での前記極短パルスレーザビームの前記パルス幅が短くなる方向に前記パルス幅調整手段による該極短パルスレーザビームの該パルス幅の調整を制御する制御手段と、を具備したことを特徴としている。
【００２０】
この結果、本発明によれば、極短パルスレーザの波長変更や対物レンズなどの光学部材の光路に対する挿脱による変更があっても、チャープコンペンセーションが適切に調整され、常に標本面でのレーザパルス幅が最短になるように極短パルスレーザのパルス幅の調整が制御されるので、最適な条件での観察を行うことができる。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。
【００２２】
（第１の実施の形態）
図１は、本発明が適用される走査型の多光子励起のレーザ顕微鏡の概略構成を示している。図において、１は極短パルスレーザビームを発生する極短パルスレーザ光源１で、極短パルスレーザ光源１から出射した極短パルスレーザビームは、コリメートレンズ２で平行ビームに整形され、後述するプレチャープコンペンセーション調整装置１４を介してスキャナユニット３へ入射し、ガルバノミラー５で２次元に振られて投影レンズ８を透過して顕微鏡本体９へ入射される。顕微鏡本体９に入射したレーザビームは、偏向部材１０で顕微鏡光軸へ偏向され、結像レンズ１１、対物レンズ１２を通って標本１３に結像する。
【００２３】
標本１３では対物レンズ１２の焦点で多光子励起現像が起こり蛍光を発する。この蛍光は、再び対物レンズ１２に取込まれ、結像レンズ１１、投影レンズ８を通った後、ガルバノミラー５で固定ビームに戻され、さらにダイクロイックミラー４でレーザビームと分離され、投影レンズ６により受光素子であるフォトマルチプライヤ７に投影され受光され、図示しないコンピュータで処理され画像として構築される。
【００２４】
この場合、顕微鏡本体９の対物レンズ１２は、倍率の異なる複数の対物レンズ１２ａ〜１２ｃからなり、これら対物レンズ１２ａ〜１２ｃは、レボルバ１５に設けられ、選択的に光路上に切換え可能になっている。また、結像レンズ１１と対物レンズ１２との間の光路には、微分干渉プリズム１６が挿脱可能に設けられている。
【００２５】
対物レンズ１２ａ〜１２ｃには、それぞれフラグ１７ａ〜１７ｃが設けられ、レボルバ１５には、フラグ１７ａ〜１７ｃを検知することで、光路中に位置される対物レンズ１２ａ〜１２ｃを認識するセンサ１８が設けられている。また、微分干渉プリズム１６にもフラグ１９が設けられ、顕微鏡本体９には、フラグ１９を検知することで、微分干渉プリズム１６が光路中に位置されることを認識するセンサ２０が設けられている。
【００２６】
そして、これらセンサ１８および２０は、コントローラ２１に接続されている。コントローラ２１には、記憶装置２２およびプレチャープコンペンセーション調整装置１４が接続されている。
【００２７】
記憶装置２２は、極短パルスレーザ光源１のパルスレーザビームの波長に対する対物レンズ１２ａ〜１２ｃおよび微分干渉プリズム１６のそれぞれのチャープ量を記憶したものである。
【００２８】
コントローラ２１は、センサ１８および２０の検知出力から光路中の対物レンズ１２ａ〜１２ｃの種類および微分干渉プリズム１６の有無を認識し、この認識結果に基づいて記憶装置２２から対応する対物レンズ１２ａ〜１２ｃおよび微分干渉プリズム１６のチャープ量を読み出すとともに、補正すべきチャープ量を求め、プレチャープコンペンセーション調整装置１４に出力するようにしている。
【００２９】
プレチャープコンペンセーション調整装置１４は、公知の技術であるプリズムペア若しくはグレーティングペア、又はこれらの組合せからなり、これらを駆動装置１４１により駆動することで、チャープ量を調整可能にしたもので、予め光路上に位置される固定光学部材、ここでは、ダイクロイックミラー４、投影レンズ８および結像レンズ１１などのチャープ量を初期調整量として設定していて、この初期調整量に対してコントローラ２１より与えられる補正すべきチャープ量だけ駆動装置１４１によりプレチャープコンペンセーションを調整し、極短パルスレーザビームのパルス幅の広がりを調整するようにしている。
【００３０】
このような構成において、極短パルスレーザ光源１から極短パルスレーザビームが出射すると、上述したと同様にして対物レンズ１２を通って標本１３に結像され、対物レンズ１２の焦点で多光子励起現像が起こり蛍光が発せられ、この蛍光は、再び対物レンズ１２に取込まれ、ダイクロイックミラー４、投影レンズ６を介してフォトマルチプライヤ７で受光され、コンピュータにより構築された画像から標本１３の観察が行われる。
【００３１】
この状態から、観察条件を変更するため、レボルバ１５により光路上に位置される対物レンズ１２ａ〜１２ｃを切換え、図示するように対物レンズ１２ｂを光路上に位置させ、同時に、微分干渉プリズム１６を光路上に挿入したとすると、対物レンズ１２ｂは、センサ１８により認識され、微分干渉プリズム１６は、センサ２０により認識され、これらの検知出力は、コントローラ２１に送られる。
【００３２】
コントローラ２１では、センサ１８および１９の検知出力から、対物レンズ１２ｂと微分干渉プリズム１６を認識し、記憶装置２２から対応する対物レンズ１２ｂおよび微分干渉プリズム１６のチャープ量を読み出すとともに、補正すべきチャープ量を求め、この補正情報をプレチャープコンペンセーション調整装置１４に出力する。
【００３３】
これにより、プレチャープコンペンセーション調整装置１４では、予め設定されている初期調整量に対して補正すべきチャープ量だけ駆動装置１４１によりプレチャープコンペンセーションを調整し、極短パルスレーザビームのパルス幅の広がりを調整するようになり、標本１３上におけるパルスレーザビームのパルス幅は、短くなるように、望ましくは最短に調整される。
【００３４】
従って、このようにすれば、対物レンズ１２ａ〜１２ｃの選択的な光路上への切換え、微分干渉プリズム１６の光路上への挿脱に応じて、これらのチャープ量の変化が自動的に補正され、チャープコンペンセーションが適切に調整されるようになるので、常に標本１３上のレーザビームパルス幅を短く、望ましくは最短に保つことができ、最適な条件での観察を行うことができる。
【００３５】
（第２の実施の形態）
図２は本発明の第２の実施の形態の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。
【００３６】
この場合、極短パルスレーザ光源３１は、波長変更機構３２を有していて、極短パルスレーザビームの波長を任意に可変できる構成になっていて、観察に使用する蛍光色素の吸収波長に合わせて波長を変更して極短パルスレーザビームを発振するようになっている。
【００３７】
極短パルスレーザ光源３１より発振された極短パルスレーザビームの光路の途中にはミラー３３が配置され、極短パルスレーザビームの一部を分岐して、スペクトラムアナライザヘッド３４を介して波長認識手段であるスペクトラムアナライザ３５に入射するようにしている。このスペクトラムアナライザ３５は、極短パルスレーザ光源３１より発振される極短パルスレーザビームの波長を認識するものである。
【００３８】
記憶装置２２は、光路中に位置される各光学部材、図示例ではダイクロイックミラー４、投影レンズ８、結像レンズ１１、対物レンズ１２などの分散データを記憶している。コントローラ２１は、スペクトラムアナライザ３５で認識された極短パルスレーザビームの波長と記憶装置２２に記憶された各光学部材の分散データからチャープ量を演算により求め、プレチャープコンペンセーション調整装置１４に出力する。そして、プレチャープコンペンセーション調整装置１４は、あらかじめ基準となる極短パルスレーザの波長に対する光路上の各光学部材のチャープ量を初期調整値として設定していて、この初期調整量とコントローラ２１より与えられるチャープ量の差分を求め、この差分だけ駆動装置１４１によりプレチャープコンペンセーションを調整して、極短パルスレーザビームのパルス幅の広がりを調整する。
【００３９】
従って、このようにすれば、極短パルスレーザ光源３１の極短パルスレーザビームの波長を変更しても、チャープ量の変化が自動的に補正され、チャープコンペンセーションが適切に調整されるようになるので、常に標本１３上のレーザのパルス幅を短く、望ましくは最短に保つことができ、最適な条件での観察を行うことができる。
【００４０】
（第３の実施の形態）
図３は、本発明の第３の実施の形態の概略構成を示すもので、図１および図２と同一部分には、同符号を付している。
【００４１】
この場合、第１の実施の形態で述べたと同様に複数の対物レンズ１２ａ〜１２ｃがレボルバ１５に切換え可能に設けられ、また、微分干渉プリズム１６が光路に対して挿脱可能に設けられている。さらに対物レンズ１２ａ〜１２ｃには、それぞれフラグ１７ａ〜１７ｃが設けられ、レボルバ１５には、フラグ１７ａ〜１７ｃを検知するセンサ１８が設けられ、各対物レンズ１２ａ〜１２ｃの切換えを検知可能にしている。また、微分干渉プリズム１６にはフラグ１９が設けられ、顕微鏡本体９には、フラグ１９を検知するセンサ２０が設けられ、微分干渉プリズム１６の光路に対する挿脱を検知可能にしている。
【００４２】
一方、第２の実施の形態で述べたと同様に極短パルスレーザ光源３１は、波長変更機構３２により波長変更可能になっており、この波長を変更されたパルスレーザビームの一部ははミラー３３を介してスペクトラムアナライザヘッド３４に入射され、スペクトラムアナライザ３５で波長が認識される。
【００４３】
記憶装置２２は、対物レンズ１２ａ〜１２ｃ、微分干渉プリズム１６などの分散データを記憶している。コントローラ２１は、スペクトラムアナライザ３５で認識された極短パルスレーザビームの波長と、光路上に位置される対物レンズ１２ａ〜１２ｃおよび微分干渉プリズム１６に対応して記憶装置２２に記憶された分散データからチャープ量を演算により求め、補正情報としてプレチャープコンペンセーション調整装置１４に出力する。そして、プレチャープコンペンセーション調整装置１４は、あらかじめ基準となる極短パルスレーザビームの波長に対する光路上の固定光学部材のチャープ量を初期調整値として設定していて、この初期調整量に対して補正すべきチャープ量だけ駆動装置１４１によりプレチャープコンペンセーションを調整し、極短パルスレーザビームのパルス幅の広がりを調整する。
【００４４】
従って、このようにすれば、光路に対する対物レンズ１２ａ〜１２ｃの切換え、微分干渉プリズム１６の挿脱、さらには極短パルスレーザ光源３１の極短パルスレーザビームの波長を変更に対しても、チャープ量が自動的に補正され、チャープコンペンセーションが適切に調整されるようになるので、常に標本１３上のレーザビームのパルス幅を短く、望ましくは最短に保つことができ、最適な条件での観察を行うことができる。
【００４５】
（第４の実施の形態）
図４は、本発明の第４の実施の形態の概略構成を示すもので、図３と同一部分には、同符号を付している。
【００４６】
この場合、複数の対物レンズ１２ａ〜１２ｃは、モータ３６を有する電動レボルバ３７に保持され、また微分干渉プリズム１６もモータ３８により挿脱可能に設けられている。さらに極短パルスレーザ光源３１は、電動の波長変更機構３２を備えている。
【００４７】
これらモータ３６、３８および波長変更機構３２は、コントローラ２１に接続され、入力手段としての操作装置３９にてリモートコントロールができるよう構成されている。この場合、操作装置３９に入力された光学部材の指定情報及び、レーザ波長の指定情報は、コントローラ２１を介してそれぞれのモータ３６、３８を駆動させるとともに、波長変更機構３２を制御する。
【００４８】
記憶装置２２は、対物レンズ１２ａ〜１２ｃ、微分干渉プリズム１６などの分散データを記憶している。コントローラ２１は、操作装置３９からの光学部材の指定情報およびレーザ波長の指定情報に基づいて、極短パルスレーザビームの波長に対応して記憶装置２２に記憶された分散データと対物レンズ１２ａ〜１２ｃおよび微分干渉プリズム１６に対応して記憶装置２２に記憶された分散データからチャープ量を演算により求め、補正情報としてプレチャープコンペンセーション調整装置１４に出力する。プレチャープコンペンセーション調整装置１４は、あらかじめ基準となる極短パルスレーザビームの波長に対する光路上の固定光学部材のチャープ量を初期調整値として設定していて、この初期調整量に対して補正すべきチャープ量だけ駆動装置１４１によりプレチャープコンペンセーションを調整し、極短パルスレーザビームのパルス幅の広がりを調整する。
【００４９】
従って、このようにすれば、光路に対する対物レンズ１２ａ〜１２ｃの切換え、微分干渉プリズム１６の挿脱、さらには極短パルスレーザ光源３１の極短パルスレーザビームの波長を変更を、外部の操作装置３９によりリモートで操作できるとともに、このリモート操作により生じたチャープ量の変化が自動的に補正され、チャープコンペンセーションが適切に調整されるようになるので、常に標本１３上のレーザビームパルス幅を短く、望ましくは最短に保つことができ、最適な条件での観察を行うことができる。
【００５０】
（第５の実施の形態）
図５は、本発明の第５の実施の形態の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。
【００５１】
この場合、複数の対物レンズ１２ａ〜１２ｃがレボルバ１５に切換え可能に設けられ、また、微分干渉プリズム１６が光路に対して挿脱可能に設けられている。さらにレボルバ１５には、対物レンズ取付け部に対応する位置に、それぞれフラグ４０ａ〜４０ｃが設けられ、レボルバ１５には、フラグ４０ａ〜４０ｃを検知するセンサ１８が設けられ、レボルバ１５の回転操作、つまり各対物レンズ１２ａ〜１２ｃの切換えを検知可能にしている。また、微分干渉プリズム１６にフラグ１９が設けられ、顕微鏡本体９には、フラグ１９を検知するセンサ２０が設けられ、微分干渉プリズム１６の光路に対する挿脱を検知可能にしている。
【００５２】
コントローラ２１は、センサ１８によりレボルバ１５による対物レンズ１２ａ〜１２ｃの切換え、またはセンサ２０により微分干渉プリズム１６の光路に対する挿脱を検知すると、操作されたことを記憶しておき、その次に画像取得が実行されたときに、フォトマルチプライヤ７の出力を監視しながらプレチャープコンペンセーション調整装置１４の駆動装置１４１を駆動させ、フォトマルチプライヤ７の出力が増加する位置、望ましくは最大になる位置を探し、そこで駆動機構１４１を停止させる。つまり、フォトマルチプライヤ７の出力が大きくなるところがチャープ量の補正が最適であり、標本１３上のパルス幅が短く、望ましくは最短になっている。
【００５３】
従って、このようにすれば、光路に対する対物レンズ１２ａ〜１２ｃの切換え、微分干渉プリズム１６の挿脱に対して、チャープ量が自動的に補正され、常に標本１３上のレーザビームのパルス幅を短く、望ましくは最短に保つことができるので、最適な条件での観察を行うことができる。
【００５４】
（第６の実施の形態）
図６は、本発明の第６の実施の形態の概略構成を示すもので、図５と同一部分には、同符号を付している。
【００５５】
この場合、複数の対物レンズ１２ａ〜１２ｃは、モータ３６を有する電動レボルバ３７に保持され、また微分干渉プリズム１６もモータ３８により挿脱可能に設けられている。これらモータ３６、３８は、コントローラ２１に接続され、操作装置３９にてリモートコントロールができるよう構成されている。
【００５６】
コントローラ２１は、電動レボルバ３７による対物レンズ１２ａ〜１２ｃの切換え指示または微分干渉プリズム１６の挿脱指示が操作装置３９より入力されると、操作されたことを記憶しておき、その次に画像取得動作が実行されたときに、フォトマルチプライヤ７の出力を監視しながらプレチャープコンペンセーション調整装置１４の駆動装置１４１を駆動させ、フォトマルチプライヤ７の出力が大きく、望ましくは最大になる位置を探し、そこで駆動機構１１４を停止させる。つまり、フォトマルチプライヤ７の出力が大きく、望ましくは最大になるところで、チャープ量の補正が最適で、標本１３上のパルス幅が短く、望ましくは最短になっている。
【００５７】
従って、このようにすれば光路に対する対物レンズ１２ａ〜１２ｃの切換え、微分干渉プリズム１６の挿脱を、外部の操作装置３９によりリモートで操作できるとともに、このリモート操作により生じたチャープ量の変化が自動的に補正され、常に標本１３上のレーザビームのパルス幅を短く、望ましくは最短に保つことができるので、最適な条件での観察を行うことができる。
【００５８】
なお、上述した実施の形態では、挿脱及び又は交換可能な光学部材として対物レンズ１２と微分干渉プリズム１６について述べたが、これに限定されるものでなく、その他のレンズ、ミラー、プリズム等の光学部材においても同様に適用できる。また、プレチャープコンペンセーションの手法は図示例で述べたプリズムペアに限定されるものでなく、グレーティングペアあるいはこれらの組合せによる手法においても同様である。また、波長を可変可能にした極短パルスレーザ光源３１は、１台のみで連続的に波長を可変できるものに限られず、複数のレーザをコンバイナにてコントロールするシステムにおいてレーザを切り換えて使用する装置も同様に適用できる。また、レーザ顕微鏡は多光子励起現象で発生する蛍光を観察するタイプの走査型のレーザ蛍光顕微鏡に限定されるものでなく、パルスピークでの高エネルギーを利用して標本の微細加工を行なうレーザ顕微鏡についても同様に適用できる。また、本発明は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の本質を逸脱しない範囲で、種々変更可能であり、例えば、実施の形態を夫々組み合わせることも可能である。
【００５９】
【発明の効果】
以上述べたように本発明によれば、標本位置でのレーザビームのパルス幅を短く、望ましくは最短にする最適なパルス幅調整を行うことができ、最適な条件下での観察を行うことができるレーザ顕微鏡を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態の概略構成を示す図。
【図２】本発明の第２の実施の形態の概略構成を示す図。
【図３】本発明の第３の実施の形態の概略構成を示す図。
【図４】本発明の第４の実施の形態の概略構成を示す図。
【図５】本発明の第５の実施の形態の概略構成を示す図。
【図６】本発明の第６の実施の形態の概略構成を示す図。
【符号の説明】
１、３１…極短パルスレーザ光源
２…コリメートレンズ
３…スキャナユニット
４…ダイクロイックミラー
５…ガルバノミラー
６…投影レンズ
７…フォトマルチプライヤ
８…投影レンズ
９…顕微鏡本体
１０…偏向部材
１１…結像レンズ
１２ａ〜１２ｃ…対物レンズ
１３…標本
１４…プレチャープコンペンセーション調整装置
１５…レボルバ
１６…微分干渉プリズム
１７ａ〜１７ｃ、１９、４０ａ〜４０ｃ…フラグ
１８、２０…センサ
２１…コントローラ
２２…記憶装置
３２…波長変更機構
３３…ミラー
３４…スペクトラムアナライザヘッド
３５…スペクトラムアナライザ
３６、３８…モータ
３７…電動レボルバ
３９…操作装置
【発明の属する技術分野】
本発明は、標本の多光子吸収による化学反応又は蛍光を検出する走査型の多光子励起のレーザ顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、レーザ顕微鏡として、極短パルスレーザビームを観察対象の標本に照射し、標本の多光子吸収による化学反応又は蛍光を検出する多光子励起走査型レーザ顕微鏡が知られている。
【０００３】
ところで、多光子励起現象は単位面積、単位時間当たりの光子密度のｎ乗（２光子励起の場合はｎ＝２、３光子励起の場合はｎ＝３）に比例した確率で発生するため、多光子励起法の光源には通常サブピコ秒オーダの極短パルスのレーザビームが用いられる。
【０００４】
しかし、このようなサブピコ秒のパルスレーザビームは完全に単波長ではなく、そのパルス幅と相関を持つある波長幅を有する。一般的に光が光学系を通過する場合、波長が短いほど媒質中での速度は遅く、波長が長いほど媒質中の速度は速くなる。従って、上述のようにパルスレーザビームが波長幅を有していると、光学系を通過する際、波長によって通過時間に差が生じることとなり、その結果、光学系に入射する前のパルス幅に比べ、光学系を通過した後のパルス幅が広がってしまう、所謂チャープが発生する。
【０００５】
このことは、前述のように多光子励起現象は、光子密度に依存するため、チャープに原因する標本面でのパルス幅の広がりによって、多光子励起現象が発生する確率を低下させ、結果、得られる蛍光が暗くなってしまう。
【０００６】
この問題を解決する手段として、パルス幅調整手段、いわゆるプレチャープコンペンセーションを用いることが知られている。このプレチャープコンペンセーションは、プリズムペア、もしくはグレーティングペア、またはこれらを組合せた光学系で、パルスレーザの長波長光を短波長光より遅らせて入射させることで、光学系を通過した後のパルス幅の広がりを補正するようにしている。
【０００７】
一方、多光子励起法を走査型レーザ顕微鏡に用いた場合、通常択一的に選択される複数の対物レンズ及びその他の光学系（プリズム又はミラーなど）を有している。これら複数の対物レンズ及びその他の光学系は、それぞれで光路長及び材質が異なるため、どの対物レンズ及びその他の光学系を選択するかでパルス幅の広がりは異なり、そのため最適な条件で多光子励起法を行なうには、対物レンズ及びその他の光学系を選択する毎に、プレチャープコンペンセーションを調整する必要がある。
【０００８】
また、上述したようにパルス幅の広がりは、パルスレーザビームの波長にも依存するため、パルスレーザビームの波長が可変な場合は、波長を変更する毎に同様にプレチャープコンペンセーションを調整する必要がある。
【０００９】
そこで、従来、プレチャープコンペンセーションの調整を最適化する方法として、特開平１０−３１８９２４号公報および特開平１１−３２６７７５公報に開示されたものが知られている。
【００１０】
このうち特開平１０−３１８９２４公報には、対物レンズに対して標本を挟んで反対側のコリメート光学系と、パルス幅を測定するオートコリレータを備えて、標本上のパルス幅を測定しながらプレチャープコンペンセーションを調整することが開示されている。
【００１１】
また、特開平１１−３２６７７５公報には、各対物レンズの光路長に対応した補正光学部材を備えておき、対物レンズの選択に対応して補正光学部材を選択して光路に配置することが開示されている。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、特開平１０−３１８９２４公報の方法では、標本の近傍にコリメート光学系及びオートコリレータを配置することから装置が大型化してしまう。このため、例えば標本に電極を刺して行なうパッチクランプを行ないながら観察するような場合、標本の周りに作業スペースを確保するのが難しくなるなどの問題が生じる。
【００１３】
また、特開平１１−３２６７７５公報の方法では、対物レンズの数に加え、プリズムやミラーなど他の選択光学系がある場合は、これらの数だけ補正光学部材が必要となり装置が大型化してしまう。また、全ての光学系に対応させて補正光学部材を多数用意することも困難である。また、補正光学部材は切換えるのみで、細かい調整ができないため、波長可変レーザビームを使用した場合に全ての波長域でプレチャープコンペンセーションを最適に調整することが難しいという問題もある。
【００１４】
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、標本位置でのレーザビームのパルス幅を短く、望ましくは最短にする最適なパルス幅調整を行うことができるレーザ顕微鏡を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明は、レーザ光源から発せられる波長変更可能な極短パルスレーザビームを、光学部材を介して標本に照射するレーザ顕微鏡において、前記レーザ光源から発せられる前記極短パルスレーザビームの波長を認識するレーザ波長認識手段と、レーザ波長に対応させた前記光学部材の分散データを記憶した記憶手段と、前記極短パルスレーザビームのパルス幅を調整するパルス幅調整手段と、前記レーザ波長認識手段により認識された前記レーザ波長に対応する前記分散データを前記記憶手段から読み込み、読み込んだ該分散データに基づいてチャープ量を求め、該チャープ量により前記標本面での前記極短パルスレーザビームの前記パルス幅が短くなる方向に前記パルス幅調整手段による該極短パルスレーザビームの該パルス幅の調整を制御する制御手段と、を具備したことを特徴としている。
【００１６】
請求項２記載の発明は、レーザ光源から発せられる波長変更可能な極短パルスレーザビームを、光路に対して挿脱可能な光学部材を介して標本に照射するレーザ顕微鏡において、前記レーザ光源から発せられる前記極短パルスレーザビームの波長を認識するレーザ波長認識手段と、前記光路に挿入された前記光学部材の種類を認識する光学部材認識手段と、レーザ波長に対応させた前記光学部材の分散データを記憶した記憶手段と、前記極短パルスレーザビームのパルス幅を調整するパルス幅調整手段と、前記レーザ波長認識手段により認識された前記レーザ波長と前記光学部材認識手段により認識された前記光学部材とに対応する前記分散データを前記記憶手段から読み込み、読み込んだ該分散データに基づいてチャープ量を求め、該チャープ量により前記標本面での前記極短パルスレーザビームの前記パルス幅が短くなる方向に前記パルス幅調整手段による該極短パルスレーザビームの該パルス幅の調整を制御する制御手段と、を具備したことを特徴としている。
【００１７】
請求項３記載の発明は、レーザ光源から発せられる波長変更可能な極短パルスレーザビームを、光路に対して挿脱可能な光学部材を介して標本に照射するレーザ顕微鏡において、前記レーザ光源から発せられる極短パルスレーザビームの波長および前記光路に挿入する前記光学部材の種類を指定する入力手段と、レーザ波長に対応させた前記光学部材の分散データを記憶した記憶手段と、前記極短パルスレーザビームのパルス幅を調整するパルス幅調整手段と、前記入力手段により指定された前記レーザ波長および前記光学部材に対応する前記分散データを前記記憶手段から読み込み、読み込んだ該分散データに基づいてチャープ量を求め、該チャープ量により前記標本面での前記極短パルスレーザビームの前記パルス幅が短くなる方向に前記パルス幅調整手段による該極短パルスレーザビームの該パルス幅の調整を制御する制御手段と、を具備したことを特徴としている。
【００１８】
請求項４記載の発明は、レーザ光源から発せられる波長変更可能な極短パルスレーザビームを、光学部材を介して標本に照射するレーザ顕微鏡において、前記標本が発する光の光量を検出する光量検出手段と、前記レーザ光源から発せられる極短パルスレーザビームの波長を認識するレーザ波長認識手段と、前記極短パルスレーザビームのパルス幅を調整するパルス幅調整手段と、前記レーザ波長認識手段により認識されたレーザ波長が変化したことが認識されると、前記光量検出手段で検出される前記光量を増加させるように前記パルス幅調整手段による前記極短パルスレーザビームの前記パルス幅の調整を制御する制御手段と、を具備したことを特徴としている。
【００１９】
請求項５記載の発明は、レーザ光源から発せられる波長変更可能な極短パルスレーザビームを、光学部材を介して標本に照射するレーザ顕微鏡において、前記標本が発する光の光量を検出する光量検出手段と、前記レーザ光源から発せられる極短パルスレーザビームの波長を指定する入力手段と、前記極短パルスレーザビームのパルス幅を調整するパルス幅調整手段と、前記入力手段により前記レーザ光源から発せられる前記極短パルスレーザビームの前記波長の指定が指定されると、前記光量検出手段で検出される前記光量を増加させるように前記パルス幅調整手段による前記極短パルスレーザビームの前記パルス幅の調整を制御する制御手段と、を具備したことを特徴としている。
請求項６記載の発明は、レーザ光源から発せられる波長変更可能な極短パルスレーザビームを、光学部材を介して標本に照射するレーザ顕微鏡において、前記レーザ光源から発せられる極短パルスレーザビームの波長を指定する入力手段と、レーザ波長に対応させた前記光学部材の分散データを記憶した記憶手段と、前記極短パルスレーザビームのパルス幅を調整するパルス幅調整手段と、前記入力手段により指定された前記レーザ波長に対応させた前記光学部材の前記分散データを前記記憶手段から読み込み、読み込んだ該分散データに基づいてチャープ量を求め、該チャープ量により前記標本面での前記極短パルスレーザビームの前記パルス幅が短くなる方向に前記パルス幅調整手段による該極短パルスレーザビームの該パルス幅の調整を制御する制御手段と、を具備したことを特徴としている。
【００２０】
この結果、本発明によれば、極短パルスレーザの波長変更や対物レンズなどの光学部材の光路に対する挿脱による変更があっても、チャープコンペンセーションが適切に調整され、常に標本面でのレーザパルス幅が最短になるように極短パルスレーザのパルス幅の調整が制御されるので、最適な条件での観察を行うことができる。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。
【００２２】
（第１の実施の形態）
図１は、本発明が適用される走査型の多光子励起のレーザ顕微鏡の概略構成を示している。図において、１は極短パルスレーザビームを発生する極短パルスレーザ光源１で、極短パルスレーザ光源１から出射した極短パルスレーザビームは、コリメートレンズ２で平行ビームに整形され、後述するプレチャープコンペンセーション調整装置１４を介してスキャナユニット３へ入射し、ガルバノミラー５で２次元に振られて投影レンズ８を透過して顕微鏡本体９へ入射される。顕微鏡本体９に入射したレーザビームは、偏向部材１０で顕微鏡光軸へ偏向され、結像レンズ１１、対物レンズ１２を通って標本１３に結像する。
【００２３】
標本１３では対物レンズ１２の焦点で多光子励起現像が起こり蛍光を発する。この蛍光は、再び対物レンズ１２に取込まれ、結像レンズ１１、投影レンズ８を通った後、ガルバノミラー５で固定ビームに戻され、さらにダイクロイックミラー４でレーザビームと分離され、投影レンズ６により受光素子であるフォトマルチプライヤ７に投影され受光され、図示しないコンピュータで処理され画像として構築される。
【００２４】
この場合、顕微鏡本体９の対物レンズ１２は、倍率の異なる複数の対物レンズ１２ａ〜１２ｃからなり、これら対物レンズ１２ａ〜１２ｃは、レボルバ１５に設けられ、選択的に光路上に切換え可能になっている。また、結像レンズ１１と対物レンズ１２との間の光路には、微分干渉プリズム１６が挿脱可能に設けられている。
【００２５】
対物レンズ１２ａ〜１２ｃには、それぞれフラグ１７ａ〜１７ｃが設けられ、レボルバ１５には、フラグ１７ａ〜１７ｃを検知することで、光路中に位置される対物レンズ１２ａ〜１２ｃを認識するセンサ１８が設けられている。また、微分干渉プリズム１６にもフラグ１９が設けられ、顕微鏡本体９には、フラグ１９を検知することで、微分干渉プリズム１６が光路中に位置されることを認識するセンサ２０が設けられている。
【００２６】
そして、これらセンサ１８および２０は、コントローラ２１に接続されている。コントローラ２１には、記憶装置２２およびプレチャープコンペンセーション調整装置１４が接続されている。
【００２７】
記憶装置２２は、極短パルスレーザ光源１のパルスレーザビームの波長に対する対物レンズ１２ａ〜１２ｃおよび微分干渉プリズム１６のそれぞれのチャープ量を記憶したものである。
【００２８】
コントローラ２１は、センサ１８および２０の検知出力から光路中の対物レンズ１２ａ〜１２ｃの種類および微分干渉プリズム１６の有無を認識し、この認識結果に基づいて記憶装置２２から対応する対物レンズ１２ａ〜１２ｃおよび微分干渉プリズム１６のチャープ量を読み出すとともに、補正すべきチャープ量を求め、プレチャープコンペンセーション調整装置１４に出力するようにしている。
【００２９】
プレチャープコンペンセーション調整装置１４は、公知の技術であるプリズムペア若しくはグレーティングペア、又はこれらの組合せからなり、これらを駆動装置１４１により駆動することで、チャープ量を調整可能にしたもので、予め光路上に位置される固定光学部材、ここでは、ダイクロイックミラー４、投影レンズ８および結像レンズ１１などのチャープ量を初期調整量として設定していて、この初期調整量に対してコントローラ２１より与えられる補正すべきチャープ量だけ駆動装置１４１によりプレチャープコンペンセーションを調整し、極短パルスレーザビームのパルス幅の広がりを調整するようにしている。
【００３０】
このような構成において、極短パルスレーザ光源１から極短パルスレーザビームが出射すると、上述したと同様にして対物レンズ１２を通って標本１３に結像され、対物レンズ１２の焦点で多光子励起現像が起こり蛍光が発せられ、この蛍光は、再び対物レンズ１２に取込まれ、ダイクロイックミラー４、投影レンズ６を介してフォトマルチプライヤ７で受光され、コンピュータにより構築された画像から標本１３の観察が行われる。
【００３１】
この状態から、観察条件を変更するため、レボルバ１５により光路上に位置される対物レンズ１２ａ〜１２ｃを切換え、図示するように対物レンズ１２ｂを光路上に位置させ、同時に、微分干渉プリズム１６を光路上に挿入したとすると、対物レンズ１２ｂは、センサ１８により認識され、微分干渉プリズム１６は、センサ２０により認識され、これらの検知出力は、コントローラ２１に送られる。
【００３２】
コントローラ２１では、センサ１８および１９の検知出力から、対物レンズ１２ｂと微分干渉プリズム１６を認識し、記憶装置２２から対応する対物レンズ１２ｂおよび微分干渉プリズム１６のチャープ量を読み出すとともに、補正すべきチャープ量を求め、この補正情報をプレチャープコンペンセーション調整装置１４に出力する。
【００３３】
これにより、プレチャープコンペンセーション調整装置１４では、予め設定されている初期調整量に対して補正すべきチャープ量だけ駆動装置１４１によりプレチャープコンペンセーションを調整し、極短パルスレーザビームのパルス幅の広がりを調整するようになり、標本１３上におけるパルスレーザビームのパルス幅は、短くなるように、望ましくは最短に調整される。
【００３４】
従って、このようにすれば、対物レンズ１２ａ〜１２ｃの選択的な光路上への切換え、微分干渉プリズム１６の光路上への挿脱に応じて、これらのチャープ量の変化が自動的に補正され、チャープコンペンセーションが適切に調整されるようになるので、常に標本１３上のレーザビームパルス幅を短く、望ましくは最短に保つことができ、最適な条件での観察を行うことができる。
【００３５】
（第２の実施の形態）
図２は本発明の第２の実施の形態の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。
【００３６】
この場合、極短パルスレーザ光源３１は、波長変更機構３２を有していて、極短パルスレーザビームの波長を任意に可変できる構成になっていて、観察に使用する蛍光色素の吸収波長に合わせて波長を変更して極短パルスレーザビームを発振するようになっている。
【００３７】
極短パルスレーザ光源３１より発振された極短パルスレーザビームの光路の途中にはミラー３３が配置され、極短パルスレーザビームの一部を分岐して、スペクトラムアナライザヘッド３４を介して波長認識手段であるスペクトラムアナライザ３５に入射するようにしている。このスペクトラムアナライザ３５は、極短パルスレーザ光源３１より発振される極短パルスレーザビームの波長を認識するものである。
【００３８】
記憶装置２２は、光路中に位置される各光学部材、図示例ではダイクロイックミラー４、投影レンズ８、結像レンズ１１、対物レンズ１２などの分散データを記憶している。コントローラ２１は、スペクトラムアナライザ３５で認識された極短パルスレーザビームの波長と記憶装置２２に記憶された各光学部材の分散データからチャープ量を演算により求め、プレチャープコンペンセーション調整装置１４に出力する。そして、プレチャープコンペンセーション調整装置１４は、あらかじめ基準となる極短パルスレーザの波長に対する光路上の各光学部材のチャープ量を初期調整値として設定していて、この初期調整量とコントローラ２１より与えられるチャープ量の差分を求め、この差分だけ駆動装置１４１によりプレチャープコンペンセーションを調整して、極短パルスレーザビームのパルス幅の広がりを調整する。
【００３９】
従って、このようにすれば、極短パルスレーザ光源３１の極短パルスレーザビームの波長を変更しても、チャープ量の変化が自動的に補正され、チャープコンペンセーションが適切に調整されるようになるので、常に標本１３上のレーザのパルス幅を短く、望ましくは最短に保つことができ、最適な条件での観察を行うことができる。
【００４０】
（第３の実施の形態）
図３は、本発明の第３の実施の形態の概略構成を示すもので、図１および図２と同一部分には、同符号を付している。
【００４１】
この場合、第１の実施の形態で述べたと同様に複数の対物レンズ１２ａ〜１２ｃがレボルバ１５に切換え可能に設けられ、また、微分干渉プリズム１６が光路に対して挿脱可能に設けられている。さらに対物レンズ１２ａ〜１２ｃには、それぞれフラグ１７ａ〜１７ｃが設けられ、レボルバ１５には、フラグ１７ａ〜１７ｃを検知するセンサ１８が設けられ、各対物レンズ１２ａ〜１２ｃの切換えを検知可能にしている。また、微分干渉プリズム１６にはフラグ１９が設けられ、顕微鏡本体９には、フラグ１９を検知するセンサ２０が設けられ、微分干渉プリズム１６の光路に対する挿脱を検知可能にしている。
【００４２】
一方、第２の実施の形態で述べたと同様に極短パルスレーザ光源３１は、波長変更機構３２により波長変更可能になっており、この波長を変更されたパルスレーザビームの一部ははミラー３３を介してスペクトラムアナライザヘッド３４に入射され、スペクトラムアナライザ３５で波長が認識される。
【００４３】
記憶装置２２は、対物レンズ１２ａ〜１２ｃ、微分干渉プリズム１６などの分散データを記憶している。コントローラ２１は、スペクトラムアナライザ３５で認識された極短パルスレーザビームの波長と、光路上に位置される対物レンズ１２ａ〜１２ｃおよび微分干渉プリズム１６に対応して記憶装置２２に記憶された分散データからチャープ量を演算により求め、補正情報としてプレチャープコンペンセーション調整装置１４に出力する。そして、プレチャープコンペンセーション調整装置１４は、あらかじめ基準となる極短パルスレーザビームの波長に対する光路上の固定光学部材のチャープ量を初期調整値として設定していて、この初期調整量に対して補正すべきチャープ量だけ駆動装置１４１によりプレチャープコンペンセーションを調整し、極短パルスレーザビームのパルス幅の広がりを調整する。
【００４４】
従って、このようにすれば、光路に対する対物レンズ１２ａ〜１２ｃの切換え、微分干渉プリズム１６の挿脱、さらには極短パルスレーザ光源３１の極短パルスレーザビームの波長を変更に対しても、チャープ量が自動的に補正され、チャープコンペンセーションが適切に調整されるようになるので、常に標本１３上のレーザビームのパルス幅を短く、望ましくは最短に保つことができ、最適な条件での観察を行うことができる。
【００４５】
（第４の実施の形態）
図４は、本発明の第４の実施の形態の概略構成を示すもので、図３と同一部分には、同符号を付している。
【００４６】
この場合、複数の対物レンズ１２ａ〜１２ｃは、モータ３６を有する電動レボルバ３７に保持され、また微分干渉プリズム１６もモータ３８により挿脱可能に設けられている。さらに極短パルスレーザ光源３１は、電動の波長変更機構３２を備えている。
【００４７】
これらモータ３６、３８および波長変更機構３２は、コントローラ２１に接続され、入力手段としての操作装置３９にてリモートコントロールができるよう構成されている。この場合、操作装置３９に入力された光学部材の指定情報及び、レーザ波長の指定情報は、コントローラ２１を介してそれぞれのモータ３６、３８を駆動させるとともに、波長変更機構３２を制御する。
【００４８】
記憶装置２２は、対物レンズ１２ａ〜１２ｃ、微分干渉プリズム１６などの分散データを記憶している。コントローラ２１は、操作装置３９からの光学部材の指定情報およびレーザ波長の指定情報に基づいて、極短パルスレーザビームの波長に対応して記憶装置２２に記憶された分散データと対物レンズ１２ａ〜１２ｃおよび微分干渉プリズム１６に対応して記憶装置２２に記憶された分散データからチャープ量を演算により求め、補正情報としてプレチャープコンペンセーション調整装置１４に出力する。プレチャープコンペンセーション調整装置１４は、あらかじめ基準となる極短パルスレーザビームの波長に対する光路上の固定光学部材のチャープ量を初期調整値として設定していて、この初期調整量に対して補正すべきチャープ量だけ駆動装置１４１によりプレチャープコンペンセーションを調整し、極短パルスレーザビームのパルス幅の広がりを調整する。
【００４９】
従って、このようにすれば、光路に対する対物レンズ１２ａ〜１２ｃの切換え、微分干渉プリズム１６の挿脱、さらには極短パルスレーザ光源３１の極短パルスレーザビームの波長を変更を、外部の操作装置３９によりリモートで操作できるとともに、このリモート操作により生じたチャープ量の変化が自動的に補正され、チャープコンペンセーションが適切に調整されるようになるので、常に標本１３上のレーザビームパルス幅を短く、望ましくは最短に保つことができ、最適な条件での観察を行うことができる。
【００５０】
（第５の実施の形態）
図５は、本発明の第５の実施の形態の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。
【００５１】
この場合、複数の対物レンズ１２ａ〜１２ｃがレボルバ１５に切換え可能に設けられ、また、微分干渉プリズム１６が光路に対して挿脱可能に設けられている。さらにレボルバ１５には、対物レンズ取付け部に対応する位置に、それぞれフラグ４０ａ〜４０ｃが設けられ、レボルバ１５には、フラグ４０ａ〜４０ｃを検知するセンサ１８が設けられ、レボルバ１５の回転操作、つまり各対物レンズ１２ａ〜１２ｃの切換えを検知可能にしている。また、微分干渉プリズム１６にフラグ１９が設けられ、顕微鏡本体９には、フラグ１９を検知するセンサ２０が設けられ、微分干渉プリズム１６の光路に対する挿脱を検知可能にしている。
【００５２】
コントローラ２１は、センサ１８によりレボルバ１５による対物レンズ１２ａ〜１２ｃの切換え、またはセンサ２０により微分干渉プリズム１６の光路に対する挿脱を検知すると、操作されたことを記憶しておき、その次に画像取得が実行されたときに、フォトマルチプライヤ７の出力を監視しながらプレチャープコンペンセーション調整装置１４の駆動装置１４１を駆動させ、フォトマルチプライヤ７の出力が増加する位置、望ましくは最大になる位置を探し、そこで駆動機構１４１を停止させる。つまり、フォトマルチプライヤ７の出力が大きくなるところがチャープ量の補正が最適であり、標本１３上のパルス幅が短く、望ましくは最短になっている。
【００５３】
従って、このようにすれば、光路に対する対物レンズ１２ａ〜１２ｃの切換え、微分干渉プリズム１６の挿脱に対して、チャープ量が自動的に補正され、常に標本１３上のレーザビームのパルス幅を短く、望ましくは最短に保つことができるので、最適な条件での観察を行うことができる。
【００５４】
（第６の実施の形態）
図６は、本発明の第６の実施の形態の概略構成を示すもので、図５と同一部分には、同符号を付している。
【００５５】
この場合、複数の対物レンズ１２ａ〜１２ｃは、モータ３６を有する電動レボルバ３７に保持され、また微分干渉プリズム１６もモータ３８により挿脱可能に設けられている。これらモータ３６、３８は、コントローラ２１に接続され、操作装置３９にてリモートコントロールができるよう構成されている。
【００５６】
コントローラ２１は、電動レボルバ３７による対物レンズ１２ａ〜１２ｃの切換え指示または微分干渉プリズム１６の挿脱指示が操作装置３９より入力されると、操作されたことを記憶しておき、その次に画像取得動作が実行されたときに、フォトマルチプライヤ７の出力を監視しながらプレチャープコンペンセーション調整装置１４の駆動装置１４１を駆動させ、フォトマルチプライヤ７の出力が大きく、望ましくは最大になる位置を探し、そこで駆動機構１１４を停止させる。つまり、フォトマルチプライヤ７の出力が大きく、望ましくは最大になるところで、チャープ量の補正が最適で、標本１３上のパルス幅が短く、望ましくは最短になっている。
【００５７】
従って、このようにすれば光路に対する対物レンズ１２ａ〜１２ｃの切換え、微分干渉プリズム１６の挿脱を、外部の操作装置３９によりリモートで操作できるとともに、このリモート操作により生じたチャープ量の変化が自動的に補正され、常に標本１３上のレーザビームのパルス幅を短く、望ましくは最短に保つことができるので、最適な条件での観察を行うことができる。
【００５８】
なお、上述した実施の形態では、挿脱及び又は交換可能な光学部材として対物レンズ１２と微分干渉プリズム１６について述べたが、これに限定されるものでなく、その他のレンズ、ミラー、プリズム等の光学部材においても同様に適用できる。また、プレチャープコンペンセーションの手法は図示例で述べたプリズムペアに限定されるものでなく、グレーティングペアあるいはこれらの組合せによる手法においても同様である。また、波長を可変可能にした極短パルスレーザ光源３１は、１台のみで連続的に波長を可変できるものに限られず、複数のレーザをコンバイナにてコントロールするシステムにおいてレーザを切り換えて使用する装置も同様に適用できる。また、レーザ顕微鏡は多光子励起現象で発生する蛍光を観察するタイプの走査型のレーザ蛍光顕微鏡に限定されるものでなく、パルスピークでの高エネルギーを利用して標本の微細加工を行なうレーザ顕微鏡についても同様に適用できる。また、本発明は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の本質を逸脱しない範囲で、種々変更可能であり、例えば、実施の形態を夫々組み合わせることも可能である。
【００５９】
【発明の効果】
以上述べたように本発明によれば、標本位置でのレーザビームのパルス幅を短く、望ましくは最短にする最適なパルス幅調整を行うことができ、最適な条件下での観察を行うことができるレーザ顕微鏡を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態の概略構成を示す図。
【図２】本発明の第２の実施の形態の概略構成を示す図。
【図３】本発明の第３の実施の形態の概略構成を示す図。
【図４】本発明の第４の実施の形態の概略構成を示す図。
【図５】本発明の第５の実施の形態の概略構成を示す図。
【図６】本発明の第６の実施の形態の概略構成を示す図。
【符号の説明】
１、３１…極短パルスレーザ光源
２…コリメートレンズ
３…スキャナユニット
４…ダイクロイックミラー
５…ガルバノミラー
６…投影レンズ
７…フォトマルチプライヤ
８…投影レンズ
９…顕微鏡本体
１０…偏向部材
１１…結像レンズ
１２ａ〜１２ｃ…対物レンズ
１３…標本
１４…プレチャープコンペンセーション調整装置
１５…レボルバ
１６…微分干渉プリズム
１７ａ〜１７ｃ、１９、４０ａ〜４０ｃ…フラグ
１８、２０…センサ
２１…コントローラ
２２…記憶装置
３２…波長変更機構
３３…ミラー
３４…スペクトラムアナライザヘッド
３５…スペクトラムアナライザ
３６、３８…モータ
３７…電動レボルバ
３９…操作装置
Claims (6)
- レーザ光源から発せられる波長変更可能な極短パルスレーザビームを、光学部材を介して標本に照射するレーザ顕微鏡において、
前記レーザ光源から発せられる前記極短パルスレーザビームの波長を認識するレーザ波長認識手段と、
レーザ波長に対応させた前記光学部材の分散データを記憶した記憶手段と、
前記極短パルスレーザビームのパルス幅を調整するパルス幅調整手段と、
前記レーザ波長認識手段により認識された前記レーザ波長に対応する前記分散データを前記記憶手段から読み込み、読み込んだ該分散データに基づいてチャープ量を求め、該チャープ量により前記標本面での前記極短パルスレーザビームの前記パルス幅が短くなる方向に前記パルス幅調整手段による該極短パルスレーザビームの該パルス幅の調整を制御する制御手段と、
を具備したことを特徴とするレーザ顕微鏡。 - レーザ光源から発せられる波長変更可能な極短パルスレーザビームを、光路に対して挿脱可能な光学部材を介して標本に照射するレーザ顕微鏡において、
前記レーザ光源から発せられる前記極短パルスレーザビームの波長を認識するレーザ波長認識手段と、
前記光路に挿入された前記光学部材の種類を認識する光学部材認識手段と、
レーザ波長に対応させた前記光学部材の分散データを記憶した記憶手段と、
前記極短パルスレーザビームのパルス幅を調整するパルス幅調整手段と、
前記レーザ波長認識手段により認識された前記レーザ波長と前記光学部材認識手段により認識された前記光学部材とに対応する前記分散データを前記記憶手段から読み込み、読み込んだ該分散データに基づいてチャープ量を求め、該チャープ量により前記標本面での前記極短パルスレーザビームの前記パルス幅が短くなる方向に前記パルス幅調整手段による該極短パルスレーザビームの該パルス幅の調整を制御する制御手段と、
を具備したことを特徴とするレーザ顕微鏡。 - レーザ光源から発せられる波長変更可能な極短パルスレーザビームを、光路に対して挿脱可能な光学部材を介して標本に照射するレーザ顕微鏡において、
前記レーザ光源から発せられる極短パルスレーザビームの波長および前記光路に挿入する前記光学部材の種類を指定する入力手段と、
レーザ波長に対応させた前記光学部材の分散データを記憶した記憶手段と、
前記極短パルスレーザビームのパルス幅を調整するパルス幅調整手段と、
前記入力手段により指定された前記レーザ波長および前記光学部材に対応する前記分散データを前記記憶手段から読み込み、読み込んだ該分散データに基づいてチャープ量を求め、該チャープ量により前記標本面での前記極短パルスレーザビームの前記パルス幅が短くなる方向に前記パルス幅調整手段による該極短パルスレーザビームの該パルス幅の調整を制御する制御手段と、
を具備したことを特徴とするレーザ顕微鏡。 - レーザ光源から発せられる波長変更可能な極短パルスレーザビームを、光学部材を介して標本に照射するレーザ顕微鏡において、
前記標本が発する光の光量を検出する光量検出手段と、
前記レーザ光源から発せられる極短パルスレーザビームの波長を認識するレーザ波長認識手段と、
前記極短パルスレーザビームのパルス幅を調整するパルス幅調整手段と、
前記レーザ波長認識手段により認識されたレーザ波長が変化したことが認識されると、前記光量検出手段で検出される前記光量を増加させるように前記パルス幅調整手段による前記極短パルスレーザビームの前記パルス幅の調整を制御する制御手段と、
を具備したことを特徴とするレーザ顕微鏡。 - レーザ光源から発せられる波長変更可能な極短パルスレーザビームを、光学部材を介して標本に照射するレーザ顕微鏡において、
前記標本が発する光の光量を検出する光量検出手段と、
前記レーザ光源から発せられる極短パルスレーザビームの波長を指定する入力手段と、
前記極短パルスレーザビームのパルス幅を調整するパルス幅調整手段と、
前記入力手段により前記レーザ光源から発せられる前記極短パルスレーザビームの前記波長の指定が指定されると、前記光量検出手段で検出される前記光量を増加させるように前記パルス幅調整手段による前記極短パルスレーザビームの前記パルス幅の調整を制御する制御手段と、
を具備したことを特徴とするレーザ顕微鏡。 - レーザ光源から発せられる波長変更可能な極短パルスレーザビームを、光学部材を介して標本に照射するレーザ顕微鏡において、
前記レーザ光源から発せられる極短パルスレーザビームの波長を指定する入力手段と、
レーザ波長に対応させた前記光学部材の分散データを記憶した記憶手段と、
前記極短パルスレーザビームのパルス幅を調整するパルス幅調整手段と、
前記入力手段により指定された前記レーザ波長に対応させた前記光学部材の前記分散データを前記記憶手段から読み込み、読み込んだ該分散データに基づいてチャープ量を求め、該チャープ量により前記標本面での前記極短パルスレーザビームの前記パルス幅が短くなる方向に前記パルス幅調整手段による該極短パルスレーザビームの該パルス幅の調整を制御する制御手段と、
を具備したことを特徴とするレーザ顕微鏡。
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