JP2008015030A - レーザ走査顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、走査速度の変動に依らず走査軌跡上のレーザ照射密度を均一化することのできるレーザ走査顕微鏡を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明のレーザ走査顕微鏡は、レーザ光で被観察面上を走査するスキャナ（１１）と、前記走査の速度変化を検出する検出手段（１１，２０３）と、前記検出された前記速度変化に応じて前記レーザ光のパワーを変化させるパワー制御手段（２０４，２０５）とを備えたことを特徴とする。したがって、走査軌跡に与えられるレーザ光の照射密度は均一となる。
【選択図】 図１

Description

本発明は、レーザ走査顕微鏡に関する。

レーザ走査顕微鏡は、レーザ光で標本上を走査するガルバノスキャナと、標本で発した光を検出する検出器と、検出器の出力信号を基に標本の画像を生成する画像生成装置とを備える。このレーザ走査顕微鏡では、通常、走査軌跡上のレーザ照射密度を均一化するため、レーザ光のパワーを一定に保つ制御が行われる（特許文献１等を参照）。
特開２００５−３０８９７４号公報 特開２００５−２４１３２１号公報

しかし、ガルバノスキャナによるレーザ光の走査速度（線速度）は一定とは限らないので、レーザ光のパワー制御が高精度に行われても、走査軌跡上のレーザ照射密度は均一化されない可能性がある。
因みに、特許文献２では、特殊なパターンの走査軌跡を採用することで走査速度の安定化を図っているが、特殊なパターンの走査軌跡は、複雑な画像生成処理を要するので望ましくない。

そこで本発明は、走査速度の変動に依らず走査軌跡上のレーザ照射密度を均一化することのできるレーザ走査顕微鏡を提供することを目的とする。

本発明のレーザ走査顕微鏡は、レーザ光で被観察面上を走査するスキャナと、前記走査の速度変化を検出する検出手段と、前記検出された前記速度変化に応じて前記レーザ光のパワーを変化させるパワー制御手段とを備えたことを特徴とする。
なお、前記速度変化は、前記スキャナのポジション信号から算出してもよい。

本発明によれば、走査速度の変動に依らず走査軌跡上のレーザ照射密度を均一化することのできるレーザ走査顕微鏡が実現する。

［実施形態］
以下、実施形態を説明する。本実施形態は、蛍光共焦点レーザ走査顕微鏡システムの実施形態である。
先ず、本システムの構成を説明する。
図１は、本システムの構成図である。図１に示すとおり、本システムは、顕微鏡本体１００、コントローラ２０、コンピュータ２１、モニタ２２、入力器２３などを備える。

顕微鏡本体１００には、レーザユニット１、光ファイバ７、コリメートレンズ８、ダイクロイックミラー９、ガルバノスキャナ１１、リレーレンズ１４、対物レンズ１５、標本１６、集光レンズ１７、共焦点検出用のピンホール絞り１８、光検出器１９などが配置される。標本１６は、不図示のステージ上に支持された蛍光観察用の標本（蛍光色素が添加された標本）である。

ガルバノスキャナ１１は、直列の関係で配置された主走査用ガルバノミラーと副走査用ガルバノミラーとを備えると共に、主走査用ガルバノミラーの配置角度をリアルタイムで表す角度信号を生成するポジションセンサと、副走査用ガルバノミラーの配置角度をリアルタイムで表す角度信号を生成するポジションセンサとを備える。また、ガルバノスキャナ１１は、これらの角度信号を外部へ出力するための出力端子も備えている。

レーザユニット１には、自己変調型のレーザ光源２（例えば半導体レーザ）と、非自己変調型のレーザ光源３（例えばＨｅ−Ｎｅレーザ）とが搭載されている。レーザ光源２の射出光路と、レーザ光源３の射出光路とは、コンバイナミラー４によって共通光路に統合され、ファイバカプラ６へ向かう。
レーザ光源３（非自己変調型のレーザ光源）の単独光路には、音響光学フィルタ（ＡＯＴＦ）５が挿入されており、このＡＯＴＦ５を制御することにより、レーザ光源３のレーザパワーを制御することが可能である。因みに、レーザ光源２（自己変調型のレーザ光源）のレーザパワーは、レーザ光源２を直接制御することで制御可能である。

また、前述した共通光路には、レーザ光の一部を反射する分岐ミラー４’が挿入される。その分岐ミラー４’で反射したレーザ光は、パワーモニタ１Ａへ入射し、電気信号に変換される。この電気信号は、レーザユニット１から射出するレーザ光のパワー、つまり標本１６へ入射するレーザ光のパワーをリアルタイムで表す。
レーザユニット１から射出したレーザ光は、光ファイバ７の一端へ入射した後、光ファイバ７の内部を伝搬し、光ファイバ７の他端から射出すると、コリメートレンズ８において平行光束化された後、ダイクロイックミラー９へ入射する。そのレーザ光は、ダイクロイックミラー９を通過し、ガルバノスキャナ１１の２つのガルバノミラーで順次反射した後、リレーレンズ１４及び対物レンズ１５を通り標本１６上の１点に集光する。この状態でガルバノスキャナ１１が駆動されると、レーザ光が標本１６上を走査する。

レーザ光の集光位置で生じた蛍光は、そのレーザ光と同じ光路を逆に辿り、ダイクロイックミラー９へ向かう。その蛍光は、ダイクロイックミラー９で反射し、集光レンズ１７によって集光され、ピンホール絞り１８を通過した後、光検出器１９へ入射して蛍光信号へと変換される。
本システムのコントローラ２０は、以上のレーザユニット１、ガルバノスキャナ１１、光検出器１９を同期制御することにより、レーザ光で標本１６上を二次元的に走査しながら蛍光信号を繰り返し取り込む。さらに、取り込んだ蛍光信号を基に、コントローラ２０は、標本１６上の走査範囲の蛍光画像データを生成する。この蛍光画像データは、コンピュータ２１へ送出され、必要に応じてモニタ２２へ出力されたり、コンピュータ２０において保存されたりする。

本システムのユーザは、以上の同期制御に先立ち、入力器２３を操作して必要な情報をコンピュータ２１へ入力する。その情報には、光源種類Ｉ、標本１６上の走査範囲Ａ、レーザ光のパワーＰ、レーザ光の走査速度Ｖの各情報が含まれる。因みに、ユーザの入力したパワーがＰであり、ユーザの入力した走査速度がＶであるとき、走査軌跡に与えられるべきレーザ光の照射密度（エネルギー密度）は、Ｅ＝Ｐ／Ｖである。以下、このエネルギー密度Ｅを、ユーザの入力したエネルギー密度とみなす。

なお、ここでは、ユーザが入力する情報を、パワーＰと走査速度Ｖとの組み合わせとしたが、パワーＰとエネルギー密度Ｅとの組み合わせや、走査速度Ｖとエネルギー密度Ｅとしても構わない。また、ユーザによる情報の入力方法は、数値入力であっても選択式であっても構わない。
ユーザが入力した各情報は、コンピュータ２１からコントローラ２０へと与えられる。コントローラ２０は、各情報に従って顕微鏡本体１００を設定・制御し、前述した同期制御を行うが、本実施形態では、走査軌跡に与えられるレーザ光のエネルギー密度を均一化するため、前述した同期制御中にレーザ光のパワー制御も行う。

次に、パワー制御に関するコントローラ２０の動作を詳しく説明する。なお、前述した同期制御に関するコントローラ２０の動作は周知なので説明を省略する。
図２は、パワー制御に関するコントローラ２０の機能ブロック図である。図２に示すとおり、コントローラ２０には、ＣＰＵ，ＲＯＭ，ＲＡＭなどからなる制御部２０１と、制御部２０１に接続されたスキャナ駆動部２０２、速度検出部２０３、パワー演算部２０４、パワー制御部２０５、インタフェース部２０６などが備えられる。このうち、インタフェース部２０６がコンピュータ２１へ接続され、スキャナ駆動部２０２がガルバノスキャナ１１の入力端子（駆動信号の入力端子）に接続され、速度検出部２０３がガルバノスキャナ１１の出力端子（角度信号の出力端子）に接続され、パワー制御部２０５がレーザユニット１内のパワーモニタ１Ａ、ＡＯＴＦ５、レーザ光源２に接続される。

制御部２０１は、インタフェース部２０６を介してコンピュータ２１と通信を行い、そのコンピュータ２１からユーザの入力した光源種類Ｉ、走査範囲Ａ、パワーＰ、走査速度Ｖの情報を取り込む。このうち、光源種類Ｉ、パワーＰの情報はパワー制御部２０５へ与えられ、走査範囲Ａ、走査速度Ｖの情報はスキャナ駆動部２０２へ与えられ、エネルギー密度Ｅ（＝Ｐ／Ｖ）の情報はパワー演算部２０４へ与えられる。以下、ユーザの入力した光源種類Ｉがレーザ光源３（非自己変調型）であった場合を説明する。

このとき、レーザユニット１の駆動対象は、レーザ光源３となる。パワー制御部２０５は、レーザ光源３の射出光路中のＡＯＴＦ５に対し制御信号ｃを与える。この制御信号ｃは、標本１６に入射するレーザ光のパワーを、ユーザの入力したパワーＰに設定するための信号である。これによって、標本１６には、レーザ光源３からのレーザ光がパワーＰで入射することになる。

また、スキャナ駆動部２０２は、走査範囲Ａを走査速度Ｖでレーザ走査するための駆動信号Ｓ_X，Ｓ_Yを生成し、それをガルバノスキャナ１１の入力端子へ与える。この駆動信号Ｓ_X，Ｓ_Yに応じて、ガルバノスキャナ１１の２つのガルバノミラーが駆動され、標本１６上の走査範囲Ａをレーザ光が二次元的に走査する。
この走査中、ガルバノスキャナ１１の出力端子からは、２つのガルバノミラーの角度信号θ_X，θ_Yが出力される。角度信号θ_X，θ_Yは、速度検出部２０３へと順次取り込まれ、レーザ光の走査速度を示す走査速度信号ｖへと順次変換される。この変換を行うために、速度検出部２０３は、取り込んだ角度信号θ_X，θ_Yに対し時間微分の処理を施す。

速度検出部２０３が生成する走査速度信号ｖは、パワー演算部２０４へと順次取り込まれ、目標パワー信号ｐ₀へと順次変換される。目標パワー信号ｐ₀は、走査軌跡上のエネルギー密度をユーザの入力したエネルギー密度Ｅに一致させるのに必要なパワーに相当し、レーザ光の走査速度が速いほど高い値を採る。具体的に、走査速度信号ｖ（単位：ｍ／ｓｅｃ）と、ユーザの入力したエネルギー密度Ｅ（単位：Ｊ／ｍ）とに対し、目標パワー信号ｐ₀は、ｐ₀＝ｖ×Ｅ（単位：Ｗ）で与えられる。

パワー演算部２０４が生成する目標パワー信号ｐ₀は、パワー制御部２０５へと順次取り込まれる。パワー制御部２０５は、取り込まれた目標パワー信号ｐ₀と、パワーモニタ１Ａが生成する電気信号（パワー信号）ｐとの差分をとり、その差分がゼロに近づく方向に制御信号ｃ（ＡＯＴＦ５に与える制御信号）を調節する。
以上の速度検出部２０３、パワー演算部２０４、パワー制御部２０５における各処理は、何れも高速に実行される。したがって、標本１６へ入射するレーザ光のパワーは、そのレーザ光の走査速度に追従することになる。これによって、標本１６の走査軌跡上のエネルギー密度は、均一になる。

例えば、本システムのユーザがFRAP（Fluorescence recovery after photobleaching）の実験を行うため、図３（ａ）に示すような円形の走査範囲Ａを入力し、このときの走査軌跡のパターンが、図３（ａ）に示すとおり連続曲線状に設定されたとする。このような走査軌跡によると、走査速度は、図３（ｂ）に示すとおり正弦波状に変化するが、本システムでは、レーザ光のパワーがレーザ光の走査速度に追従し、図３（ｃ）に示すとおり正弦波状に変化するので、走査軌跡上のエネルギー密度は均一になる。

［その他］
なお、上述した説明では、ユーザの入力した光源種類Ｉをレーザ光源３（非自己変調型）としたが、レーザ光源２（自己変調型）であった場合、パワー制御部２０５は、ＡＯＴＦ５へ制御信号を与える代わりにレーザ光源２へ制御信号を与えればよい。
また、上述した速度検出部２０３、パワー演算部２０４、パワー制御部２０５は、パワー制御の応答性を高めるため、制御部２０１とは別に用意された回路としてコントローラ２０に搭載されることが望ましいが、制御部２０１の演算速度が十分に高い場合には、制御部２０１が実行するソフトウエアとしてコントローラ２０に搭載されてもよい。

また、上述した顕微鏡本体１００では、ポジションセンサを搭載したガルバノスキャナ１１を使用したが、速度計を搭載したガルバノスキャナを使用してもよい。その場合、ガルバノスキャナから速度信号が出力されるので、速度検出部２０３は不要となる。
また、上述した顕微鏡本体１００では、ポジションセンサ又は速度計を内蔵したガルバノスキャナを使用したが、ポジションセンサも速度計も内蔵されていないガルバノスキャナを使用してもよい。その場合、ポジションセンサ又は速度計を用意して、ガルバノスキャナ１１へ搭載すればよい。

また、上述した顕微鏡本体１００では、ガルバノスキャナ１１の運動からレーザ光の走査速度を間接的に検出したが、レーザ光の走査速度を直接検出してもよい。
また、上述した顕微鏡本体１００では、光源ユニット１に搭載される光源を２種類としたが、１種類又は３種類以上としてもよい。
また、上述した顕微鏡本体１００には、ガルバノスキャナ１１として、走査範囲Ａを設定可能な制御型のガルバノスキャナが使用されたが、走査範囲の固定された共振型ガルバノスキャナを使用してもよい。その場合であっても、走査軌跡上のエネルギー密度を均一化することができる。

また、上述した顕微鏡本体１００は、蛍光検出の機能と共焦点検出の機能との双方を搭載したレーザ走査顕微鏡であったが、蛍光検出の機能と共焦点検出の機能の一方又は双方を搭載しないレーザ走査顕微鏡にも本発明は適用可能である。

実施形態のシステムの構成図である。 パワー制御に関するコントローラ２０の機能ブロック図である。 本システムの動作を説明する図である。

符号の説明

１…レーザユニット，５…ＡＯＴＦ，７…光ファイバ，１４…リレーレンズ，１５…対物レンズ，１６…標本，１７…集光レンズ，１８…ピンホール絞り，１９…光検出器，１１…ガルバノスキャナ，２０…コントローラ，２１…コンピュータ

Claims (2)

1. レーザ光で被観察面上を走査するスキャナと、
   前記走査の速度変化を検出する検出手段と、
   前記検出された前記速度変化に応じて前記レーザ光のパワーを変化させるパワー制御手段と
   を備えたことを特徴とするレーザ走査顕微鏡。
2. 前記速度変化は、前記スキャナのポジション信号から算出する
   ことを特徴とする請求項１に記載のレーザ走査顕微鏡。
   

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