JP5153171B2 - 顕微鏡装置とその制御方法 - Google Patents
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Description
本発明は、レーザ光を射出する光源と、該光源からのレーザ光の強度変調を行う強度変調器と、該強度変調器により強度変調されたレーザ光を走査するスキャナと、該スキャナにより走査されたレーザ光を標本に集光する一方、標本において発生した蛍光を集光する対物レンズと、該対物レンズにより集光された蛍光を検出する光検出器と、前記強度変調器と前記対物レンズとの間に配置され、前記光源からのレーザ光の位置ズレを検出するレーザ位置検出部と、該レーザ位置検出機構による検出結果に基づいてレーザ光の位置ズレを補正するレーザ位置補正部と、これらを制御する制御部とを備え、該制御部が、前記強度変調器を安定させるのに要する時間と、レーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正に要する時間との和を記憶する記憶部と、前記光検出器およびスキャナを作動させる蛍光検出開始時刻から、前記記憶部で記憶した前記強度変調器を安定させるのに要する時間と、レーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正に要する時間との和だけ遡った時刻を計算する計算部とを有し、前記計算部で計算された時刻より前に強度変調器を作動させるよう制御する顕微鏡装置を提供する。
このようにすることで、2回目以降の蛍光検出に先立って、強度変調器の安定を待つことなくレーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正を行うことができ、長時間にわたって行われる顕微鏡観察においてもレーザ光の光軸ずれを精度よく補正して、標本に精度よく照射することができる。
このようにすることで、蛍光検出開始時刻前のレーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正時には、シャッタの作動により光路が遮断されることによって、レーザ光が標本に照射されることが防止される。これにより、レーザ光による標本の褪色等の発生を未然に防止し、標本の健全性を向上することができる。また、蛍光検出開始時刻から蛍光検出終了時刻までの間で光路を開放することにより、精度よく位置ズレが補正されたレーザ光を標本に照射することができる。
このようにすることで、蛍光検出開始時刻前のレーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正時には、光路が遮断されることによって、レーザ光が標本に照射されることが防止される。これにより、レーザ光による標本の褪色等の発生を未然に防止し、標本の健全性を向上することができる。また、蛍光検出開始時刻から蛍光検出終了時刻までの間で光路を開放することにより、精度よく位置ズレが補正されたレーザ光を標本に照射することができる。
本実施形態に係る顕微鏡装置1は、図1に示されるように、多光子励起用の短パルスレーザ光Lを出射する光源ユニット2と、該光源ユニット2から出射された短パルスレーザ光Lを標本Aに照射して蛍光を検出する顕微鏡本体3と、これらを制御する制御部4と、顕微鏡本体3により取得された画像を表示する表示部5と、観察条件を入力する入力部6とを備えている。
前記光検出器17は、例えば、光電子増倍管である。
制御部4は、入力部6から入力される観察条件に従って、以下の処理を行うようになっている。
Tstart=Tnext−Tmax
また、制御部4は、音響光学素子8の作動開始から音響光学素子8を安定させるために要する時間Taoが経過した時点で、位置ズレ検出器11を作動させて短パルスレーザ光Lの光軸の位置ズレを検出し、ビームシフタ10を作動させて光軸の位置ズレを補正するようになっている。
その後、音響光学素子8によるブランキング動作を開始させ、スキャナ14および光検出器17を作動させて、標本Aの所定範囲の2次元的な蛍光の輝度情報を取得するようになっている。これにより1回の観察動作が終了するので、観察条件において入力された画像取得回数だけ、上記ステップを繰り返すようになっている。
光検出器17により検出された標本Aの輝度情報は、スキャナ14の走査位置情報に対応づけて記憶部19に記憶され、制御部4により蛍光画像が作成されて表示部5により表示されるようになっている。
本実施形態に係る顕微鏡装置1を用いて、標本Aの長時間観察(長時間タイムラプス観察)を行うには、まず、入力部6から撮像条件を入力する(ステップS1)。
そして、時刻Tが補正処理開始時刻Tstartに達したか否かが判断され(ステップS3)、達した場合には、シャッタ12が作動されて顕微鏡本体3への光路が遮断される(ステップS4)。
顕微鏡本体3に入射された短パルスレーザ光Lはスキャナ14によって2次元的に走査され、対物レンズ15によって標本Aに集光され、集光位置において多光子励起効果により蛍光を発生させる。発生した蛍光は、対物レンズ15により集光された後、ダイクロイックミラー16によって短パルスレーザ光Lの光路から分岐されて光検出器17により検出される(ステップS11)。
本実施形態の説明において上述した第1の実施形態に係る顕微鏡装置1と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。
また、記憶部19には、位置ズレ補正に要する時間Tali、位置ズレ検出に要する時間Texm、音響光学素子8が安定するのに要する時間Tao、レーザ光源7が波長切り替え後に安定するまでに要する時間Tlaserが記憶されている。ここで、波長変化の幅Δλが増大すると、波長切り替え時の待機時間Tlaserが増大することが知られている。例えば、ΔλとTlaserとの関係は、例えば、図8のような分布を示す。したがってシステム固有の分布を予め記憶部19に記憶しておくことが好ましい。
この実施形態において、長時間タイムラプス観察は、ほぼ同時期に、短パルスレーザ光Lの波長を切り替えながら、標本Aからの蛍光を検出する一群の観察動作(図7では、第1の波長λAによる観察動作と、第2の波長λBによる観察動作)を、時間間隔をあけて長時間にわたって複数回行い、標本Aの経時的な変化を観察する観察方法である。
まず、選択された短パルスレーザ光Lの波長λに基づいて、記憶部19から位置ズレ補正値が読み出される(ステップS31)。その後、ビームシフタ10の作動により、プレスキャンにおいて求められた位置ズレ補正値に基づいて短パルスレーザ光Lの波長に依存する位置ズレ補正が行われる(ステップS32)。
Tstart=Tnext−(Tali+Texm+Tlaser)
これにより、観察動作が終了する。
このようにすることで、波長を切り替えることに光軸の位置ズレ検出を行う必要がないので、波長切り替えに伴う待機時間を短縮することができる。
これにより、複数の波長を切り替えて行う複数回の観察動作を互いに極力近接させて行うことができ、一群の観察動作における同時性を高めることができる。
L 短パルスレーザ光(レーザ光)
Tao 強度変調器を安定させるのに要する時間
Tali、Tali+Texm レーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正に要する時間
Tnext 蛍光検出開始時刻
1 顕微鏡装置
4 制御部
7 レーザ光源(光源)
8 音響光学素子(強度変調器)
10 ビームシフタ(レーザ位置補正部)
11 レーザ位置検出部
12 シャッタ
14 スキャナ
15 対物レンズ
17 光検出器
Claims (10)
- レーザ光を射出する光源と、
該光源からのレーザ光の強度変調を行う強度変調器と、
該強度変調器により強度変調されたレーザ光を走査するスキャナと、
該スキャナにより走査されたレーザ光を標本に集光する一方、標本において発生した蛍光を集光する対物レンズと、
該対物レンズにより集光された蛍光を検出する光検出器と、
前記強度変調器と前記対物レンズとの間に配置され、前記光源からのレーザ光の位置ズレを検出するレーザ位置検出部と、
該レーザ位置検出部による検出結果に基づいてレーザ光の位置ズレを補正するレーザ位置補正部と、
これらを制御する制御部とを備え、
該制御部が、
前記強度変調器を安定させるのに要する時間と、レーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正に要する時間との和を記憶する記憶部と、
前記光検出器およびスキャナを作動させる蛍光検出開始時刻から、前記記憶部で記憶した前記強度変調器を安定させるのに要する時間と、レーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正に要する時間との和だけ遡った時刻を計算する計算部とを有し、
前記計算部で計算された時刻より前に強度変調器を作動させるよう制御する顕微鏡装置。 - 前記制御部は、複数設定された蛍光検出開始時刻が、前記強度変調器を安定させるのに要する時間とレーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正に要する時間との和より近接している場合に、これらの蛍光検出開始時刻間において強度変調器を作動停止しないよう制御する請求項1に記載の顕微鏡装置。
- 前記光源が、複数波長のレーザ光を出射可能であり、
前記制御部は、レーザ光の波長が切り替えられる場合に、前記スキャナおよび光検出器を作動させる蛍光検出開始時刻から前記光源を安定させるのに要する時間と、レーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正に要する時間との和だけ遡った時刻より前にレーザ光の波長の切り替えを開始するよう制御する請求項1に記載の顕微鏡装置。 - 前記光源が、複数波長のレーザ光を出射可能であり、
前記制御部は、波長を切り替えて同時期に行う一群の観察前に、先頭波長におけるレーザ光の光軸に対する位置ズレ量を他の波長について波長毎に記憶しておき、
先頭波長による観察時には、前記光検出器および前記スキャナを作動させる蛍光検出開始時刻から前記光源を安定させるのに要する時間と、レーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正に要する時間との和だけ遡った時刻より前にレーザ光の波長の切り替えを開始させ、
残りの波長による観察時には、前記光検出器および前記スキャナを作動させる蛍光検出開始時刻から前記強度変調器を安定させるのに要する時間より前に強度変調器を作動させ、前記光源を安定させるのに要する時間より前にレーザ光の波長の切り替えを開始させ、これらの時間の間に記憶されている位置ズレ量だけ位置ズレ補正を行うよう制御する請求項1に記載の顕微鏡装置。 - 前記対物レンズの前段において光路を遮断し、前記光検出器による蛍光検出開始時刻から蛍光検出終了時刻までの間で光路を開放するシャッタを備える請求項1から請求項4のいずれかに記載の顕微鏡装置。
- 光源から射出されるレーザ光の強度を強度変調器により変調し、レーザ光の光軸の位置ズレを検出して補正し、補正されたレーザ光を標本上において走査し、標本において発生した蛍光を検出する顕微鏡装置の制御方法であって、
前記強度変調器を安定させるのに要する時間と、レーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正に要する時間との和を記憶し、予め設定された蛍光検出開始時刻から、記憶した前記和だけ遡った時刻を計算し、計算された前記時刻より前に強度変調器を作動させるよう制御する顕微鏡装置の制御方法。 - 複数設定された蛍光検出開始時刻が、前記強度変調器を安定させるのに要する時間とレーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正に要する時間との和より近接している場合に、これらの蛍光検出開始時刻間において強度変調器を作動停止しないよう制御する請求項6に記載の顕微鏡装置の制御方法。
- 前記光源が、複数波長のレーザ光を出射可能であり、
レーザ光の波長が切り替えられる場合に、前記スキャナおよび光検出器を作動させる蛍光検出開始時刻から前記光源を安定させるのに要する時間と、レーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正に要する時間との和だけ遡った時刻より前にレーザ光の波長の切り替えを開始するよう制御する請求項6に記載の顕微鏡装置の制御方法。 - 前記光源が、複数波長のレーザ光を出射可能であり、
波長を切り替えて同時期に行う一群の観察前に、先頭波長におけるレーザ光の光軸に対する位置ズレ量を他の波長について波長毎に記憶しておき、
先頭波長による観察時には、前記光検出器および前記スキャナを作動させる蛍光検出開始時刻から前記光源を安定させるのに要する時間と、レーザ光の位置ズレ検出および位置ズレ補正に要する時間との和だけ遡った時刻より前にレーザ光の波長の切り替えを開始させ、
残りの波長による観察時には、前記光検出器および前記スキャナを作動させる蛍光検出開始時刻から前記強度変調器を安定させるのに要する時間より前に強度変調器を作動させ、前記光源を安定させるのに要する時間より前にレーザ光の波長の切り替えを開始させ、これらの時間の間に記憶されている位置ズレ量だけ位置ズレ補正を行うよう制御する請求項6に記載の顕微鏡装置の制御方法。 - 蛍光検出開始時刻から蛍光検出終了時刻までの間で光路を開放し、それ以外において光路を遮断する請求項6から請求項9のいずれかに記載の顕微鏡装置の制御方法。
。
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JP2008233227A JP2008233227A (ja) | 2008-10-02 |
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CN112368625B (zh) | 2018-07-02 | 2023-10-24 | 巴塞罗纳大学 | 多点照明器、共焦滤光器、共焦显微镜及其操作方法 |
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JP4855007B2 (ja) * | 2005-08-10 | 2012-01-18 | オリンパス株式会社 | 走査型レーザ顕微鏡 |
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