JP5655434B2 - 観察装置及び観察方法 - Google Patents

Description

本発明は、試料における特定種類の分子の分布を観察する観察装置及び観察方法に関する。

創薬等のバイオアッセイでは、多数の反応場を一括して管理するため、ウェルプレートの使用が一般的となっている。ウェルプレートは、微細な穴（ウェル）を高密度に配列した透明な培養容器である。

ウェルプレートの観察は、ウェルプレートリーダなどと呼ばれるスキャニング方式の観察装置により行われ（特許文献１等を参照）、通常は、ウェルプレート全体の蛍光強度分布をウェルの配列ピッチと同等又はそれ以上の空間分解能の結像光学系で検出する。結像光学系の分解能と焦点深度とはトレードオフの関係にあるので、ウェルの深さは、結像光学系の焦点深度内であることが要求される。

特開２００６−２３１７５号公報

近年、効率化の目的でウェルプレートの高集積化が進むにつれ、ウェル間の蛍光のクロストークが無視できなくなってきた。すなわち、ウェルプレートの集積化は、蛍光クロストークによるＳＮ比低下によって制限を受けることになる。

また、ウェルプレートの更なる集積化を実現したとしても、スキャニング方式を用いている限りにおいてはウェルプレートの面積分だけ測定時間がかかる。

また、ウェルサイズの微小化に伴い、結像光学系には更なる高分解能化が要求されるが、分解能と焦点深度とは常にトレードオフの関係にあるため、ウェルの深さは焦点深度内である必要性が生じ、集積化に伴い１ウェル内の被検物量は必然的に少なくなる。これにより、蛍光検出におけるＳＮのシグナル成分を稼ぐことが難しくなってくる。

そこで本発明は、試料の広範囲を短時間かつ詳細に観察するのに適した観察装置及び観察方法を提供することを目的とする。

本発明を例示する観察装置の一態様は、試料に含まれる特定種類の分子を励起状態に移行させるための平行光束である励起光を前記試料へ照射する励起手段と、励起状態にある前記分子から光を誘導放出させるための平行光束である誘起光を前記励起光と同じ側から前記試料へ照射する誘起手段と、前記誘起光の下流側へ向けて前記試料から射出した平行光束の強度分布を、結像光学系を介さずに検出する二次元撮像素子である画像検出手段と、前記励起手段及び前記誘起手段及び前記画像検出手段を制御することにより、前記分子から誘導放出された光の前記試料上の強度分布を計測する制御手段とを備える。

また、本発明を例示する観察方法の一態様は、試料に含まれる特定種類の分子を励起状態に移行させるための平行光束である励起光を前記試料へ照射する励起手順と、励起状態にある前記分子から光を誘導放出させるための平行光束である誘起光を前記励起光と同じ側から前記試料へ照射する誘起手順と、前記誘起光の下流側へ向けて前記試料から射出した平行光束の強度分布を、結像光学系を介さずに二次元撮像素子で検出する画像検出手順と、前記励起手順及び前記誘起手順及び前記画像検出手順を制御することにより、前記分子から誘導放出された光の前記試料上の強度分布を計測する制御手順とを含む。

本発明によれば、試料の広範囲を短時間かつ詳細に観察するのに適した観察装置及び観察方法が実現する。

第１実施形態の観察装置の構成図である。 ウェルプレート１６の断面の模式図である（自然放出光の様子）。 ウェルプレート１６の断面の模式図である（誘導放出光の様子）。 第１実施形態のコントローラ１８による観察処理の動作フローチャートである。 フレームデータｆ１の取得時におけるタイミングチャートである。 フレームデータｆ２の取得時におけるタイミングチャートである。 第２実施形態の観察装置の構成図である。 本実施形態のコントローラ１８による観察処理の動作フローチャートである。 フレームデータｆ３の取得時におけるタイミングチャートである。 フレームデータｆ５の取得時におけるタイミングチャートである。

［第１実施形態］
以下、本発明の第１実施形態として、誘導放出光観察方法の適用されたウェルプレートリーダ（以下、単に「観察装置」と称す。）を説明する。

図１は、本実施形態の観察装置の構成図である。図１に示すとおり観察装置には、フェムト秒パルスレーザ光源１０と、ビームスプリッタ１１と、移動鏡１２と、固定鏡１３と、ステージ１４と、ビームエキスパンダ１５と、二次元の撮像素子１７と、試料であるウェルプレート１６と、コントローラ１８とが配置される。なお、コントローラ１８には、不図示のモニタ及び入力器が接続される。

ウェルプレート１６は、数マイクロメートルサイズの微細なウェルを数百〜数千個、数マイクロメートルのピッチで二次元配列した透明基板である。個々のウェルの深さは、数マイクロメートル〜数ミリメートル程度と深く設定されている。個々のウェルには、蛍光染色された被検物または蛍光を発する被検物そのもの（蛍光分子）が収容されている。

フェムト秒パルスレーザ光源１０は、パルス幅がフェムト秒オーダーであるパルスレーザ光Ｌ０を発振する。パルスレーザ光Ｌ０の波長スペクトルは一定の波長幅を有しており、その波長スペクトルの波長範囲は、被検物の励起波長をカバーしている。パルスレーザ光Ｌ０のパルス波形（ピーク高さ及びパルス幅）と、パルスレーザ光Ｌ０の発振周期とは、コントローラ１８によって制御される。

撮像素子１７は、ウェルプレート１６の反光源側（下流側）に配置され、ウェルプレート１６の略全体をカバーできるサイズの撮像面を有しており、ウェルプレート１６におけるウェルの配列ピッチと同程度又はそれ以下のピッチで受光画素を二次元配列した撮像素子（例えばＣＣＤ撮像素子）である。撮像素子１７のフレーム周期と、撮像素子１７の１フレーム当たりの電荷蓄積時間とは、コントローラ１８によって制御される。

コントローラ１８は、撮像素子１７及びフェムト秒パルスレーザ光源１０の動作タイミングを制御する制御装置としての機能と、撮像素子１７から送出されるフレームデータを取り込んで処理する演算装置としての機能とを有する。

フェムト秒パルスレーザ光源１０から発振されたパルスレーザ光Ｌ０は、ビームスプリッタ１１を透過するパルスレーザ光Ａと、ビームスプリッタ１１を反射するパルスレーザ光Ｂとに分離される。

ビームスプリッタ１１を透過したパルスレーザ光Ａは、固定鏡１３へ正面から入射すると、固定鏡１３を反射して光路を折り返し、ビームスプリッタ１１へ再入射する。

ビームスプリッタ１１を反射したパルスレーザ光Ｂは、移動鏡１２へ正面から入射すると、移動鏡１２を反射して光路を折り返し、ビームスプリッタ１１へ再入射する。

ビームスプリッタ１１へ再入射したパルスレーザ光Ａ及びパルスレーザ光Ｂは、互いの光路を統合した後、ビームエキスパンダ１５を通過して径の太い平行光束となり、ウェルプレート１６の略全体を正面から略均一な照度で閃光照射する。

ウェルプレート１６へ入射したパルスレーザ光Ａ及びパルスレーザ光Ｂは、ウェルプレート１６を透過した後、撮像素子１７の撮像面へ正面から入射する。また、パルスレーザ光Ａ及びパルスレーザ光Ｂに応じてウェルプレート１６で発生した光も、撮像素子１７の撮像面へ入射する。撮像素子１７は、撮像面へ入射した光の強度分布（正確には強度分布の時間積分値）を示すフレームデータを取得し、そのフレームデータをコントローラ１８へ送出する。

以上の観察装置において、撮像素子１７のフレーム周期ΔＴは、パルスレーザ光Ｌ０のパルス幅（フェムト秒）と比して十分に長い（例えば１／３０秒）。なお、ここでは、撮像素子１７の１フレーム当たりの電荷蓄積時間は、撮像素子１７のフレーム周期ΔＴとほぼ同じに設定されたと仮定する。

また、パルスレーザ光Ｌ０のパルス波形は、ウェルプレート１６に照射されるパルスレーザ光Ａのエネルギー密度が、被検物を励起状態へ移行させるのに適したエネルギー密度となるよう設定され、パルスレーザ光Ｌ０の発振周期は、撮像素子１７のフレーム周期ΔＴの整数倍に設定される。なお、ここでは、パルスレーザ光Ｌ０の発振周期は、フレーム周期ΔＴと同じに設定されたと仮定する。

また、ビームスプリッタ１１の反射率と透過率との比は、ウェルプレート１６に照射されるパルスレーザ光Ｂのパワーが、ウェルプレート１６に照射されるパルスレーザ光Ａのパワーと同等又はそれ以下となるよう設定される。なお、ここでは、ビームスプリッタ１１の反射率と透過率との比は１：１に設定され、パルスレーザ光Ａのパワーとパルスレーザ光Ｂのパワーとが等しいものと仮定する。

また、移動鏡１２の光軸方向の位置は、ステージ１４によって調整可能であって、これによってパルスレーザ光Ａの光路長に対するパルスレーザ光Ｂの光路長の差（光路長差）、すなわち、パルスレーザ光Ａがウェルプレート１６へ照射されるタイミングからパルスレーザ光Ｂがウェルプレート１６へ照射されるタイミングまでのずれ（遅延時間）Δτが調整可能である。この遅延時間Δτは、パルスレーザ光Ｌ０のパルス幅（フェムト秒）より長く、かつ被検物の蛍光寿命（〜ナノ秒）よりも短く設定される。

なお、遅延時間Δτを以上のとおり設定した場合、パルスレーザ光Ａ、Ｂの照射により、ウェルプレート１６内の被検物は以下のとおり振る舞う。

先ず、パルスレーザ光Ａが閃光照射されると、ウェルプレート１６内の被検物は、一定の確率で励起状態へと移行する。励起状態となった被検物は、パルスレーザ光Ａの閃光照射後、〜ナノ秒の蛍光寿命を持つが、本実施形態の観察装置では、パルスレーザ光Ａによって励起状態が作られた直後にパルスレーザ光Ｂが閃光照射されるので、励起状態の被検物から蛍光の自然放出が起きる間もなく、蛍光の誘導放出のみが生起する。なお、ここでいう蛍光寿命とは、分子に励起光が照射されて分子のうち一定の割合（例えばＮ個）が励起状態になった後、自然放出による光緩和が起き、励起状態の分子数がＮ×１／ｅ個になるまでの時間を指す。

つまり、遅延時間Δτを以上のとおり設定した場合、最初に閃光照射されるパルスレーザ光Ａは、被検物を励起する励起光として作用し、次に閃光照射されるパルスレーザ光Ｂは、被検物から蛍光を誘導放出させる誘起光として作用する。よって、以下では、パルスレーザ光Ａを「励起光Ａ」と称し、パルスレーザ光Ｂを「誘起光Ｂ」と称す。

なお、被検物から誘導放出された蛍光（誘導放出光）は、被検物から自然放出された蛍光（自然放出光）とは性質が異なる。図２、図３は、ウェルプレート１６の断面の模式図である。ウェルプレート１６の表面に設けられた個々の凹部がウェルである。自然放出光は、図２に示すとおり被検物を起点として様々な方向へ向かって射出するが、誘導放出光は、図３に示すとおり被検物を起点として一方向にしか射出しない。しかも、その射出方向は、誘導放出を誘起した光（すなわち誘起光Ｂ）と同じ方向である。よって、誘導放出光を利用すれば、結像光学系を介さずとも、ウェルプレート１６の蛍光像を形成することが可能である。

図４は、本実施形態のコントローラ１８による観察処理の動作フローチャートである。以下、各ステップを順に説明する。

ステップＳ１１：コントローラ１８は、撮像素子１７及びフェムト秒パルスレーザ光源１０に対してそれぞれ適切な駆動信号を送出することで、図５に示すようなタイミング制御を行い、撮像素子１７からフレームデータｆ１を取り込む。

図５に示すとおり、フレームデータｆ１の電荷蓄積が開始されると（１）、励起光Ａの閃光照射が行われ（２）、誘起光Ｂの閃光照射が行われ（３）、誘導放出光Ｄの放出が開始され（４）、誘導放出光Ｄの放出が終了し（５）、フレームデータｆ１の電荷蓄積が終了する（６）。なお、励起光Ａの閃光照射（２）から誘起光Ｂの閃光照射（３）までの遅延時間Δτは蛍光寿命未満に設定されているので、フレームデータｆ１の電荷蓄積期間内に自然放出光は生起しない。

したがって、撮像素子１７が取得するフレームデータｆ１は、励起光Ａの照射強度分布の時間積分値と、誘起光Ｂの照射強度分布の時間積分値と、誘導放出光Ｄの放出強度分布の時間積分値との和を表す。よって、仮に、励起光Ａの照射強度分布の時間積分値と誘起光Ｂの照射強度分布の時間積分値との和が既知であるならば、フレームデータｆ１から誘導放出光Ｄの放出強度分布の時間積分値（すなわち誘導放出光Ｄによるウェルプレート１６の蛍光像）を求めることができる。以下、フレームデータｆ１を、「観察データｆ１」と称す。

ステップＳ１２：コントローラ１８は、撮像素子１７及びフェムト秒パルスレーザ光源１０の駆動を停止し、観察装置の光路からウェルプレート１６を離脱させるよう不図示のモニタへメッセージを表示する。オペレータは、このメッセージに促され、観察装置の光路からウェルプレート１６を離脱させると、不図示の入力器を介して続行指示をコントローラ１８へ入力する。なお、ここではウェルプレート１６の離脱が手動で行われることとしたが、ウェルプレート１６の離脱は自動で行われてもよい。

ステップＳ１３：コントローラ１８は、続行指示が入力されると、撮像素子１７及びフェムト秒パルスレーザ光源１０に対してそれぞれ適切な駆動信号を送出することで、図６に示すようなタイミング制御を行い、撮像素子１７からフレームデータｆ２を取り込む。

図６に示すとおり、フレームデータｆ２の電荷蓄積が開始されると（７）、励起光Ａの閃光照射が行われ（８）、誘起光Ｂの閃光照射が行われ（９）、フレームデータｆ２の電荷蓄積が終了する（１０）。なお、フレームデータｆ２の電荷蓄積期間には、ウェルプレート１６が光路から外されているので、この電荷蓄積期間内に自然放出光及び誘導放出光が発生することは無い。

したがって、撮像素子１７が取得するフレームデータｆ２は、励起光Ａの照射強度分布の時間積分値と、誘起光Ｂの照射強度分布の時間積分値との和を表す。このフレームデータｆ２は、観察装置に固有のデータであって、前述した観察データｆ１の補正時に使用される。以下、このフレームデータｆ２を「校正データｆ２」と称す。

ステップＳ１４：コントローラ１８は、観察データｆ１から校正データｆ２を差し引くことにより観察データｆ１を補正する。補正後の観察データｆ１は、誘導放出光Ｄの放射強度分布の時間積分値（すなわち誘導放出光Ｄによるウェルプレート１６の蛍光像）を表す。

ステップＳ１５：コントローラ１８は、補正後の観察データｆ１を不図示のモニタへ表示する。よって、オペレータは、誘導放出光によるウェルプレート１６の蛍光像をモニタ上で観察することができる。その後、オペレータは、必要に応じてコントローラ１８に対し補正後の観察データｆ１の保存指示を入力する。保存指示が入力されると、コントローラ１８は、補正後の観察データｆ１を画像ファイルとして保存し、フローを終了する。

以上、本実施形態の観察装置は、励起光Ａの閃光照射後、適当な遅延時間Δτの後に誘起光Ｂを閃光照射することで、励起状態の被検物から蛍光が自然放出されるより前に、励起状態の被検物から蛍光を誘導放出させている。したがって、本実施形態の観察装置は、誘導放出光による蛍光像を、自然放出光の影響を受けずに検知することができる。

しかも、図３に示したとおり誘導放出光は指向性を有しているため、本実施形態の観察装置では、ウェルプレート１６と撮像素子１７との間に結像光学系を介設する必要が無い。

したがって、本実施形態の観察装置では、撮像素子１７における画素の配置密度を向上させるだけで装置の高分解能化を図ることができ、撮像素子１７の撮像面のサイズを拡大するだけで装置の広視野化を図ることができる。

なお、装置を広視野化する際には、ビームエキスパンダ１５の倍率を向上させる必要の生じる場合もあるが、ビームエキスパンダ１５は結像光学系ほど設計上の制約が多くないため、倍率の向上は容易に実現する。

また、図３に示したとおり誘導放出光は指向性を有しているため、本実施形態の観察装置では、ウェルプレート１６と撮像素子１７との間隔に制約は無い。つまり、ウェルプレート１６と撮像素子１７との間隔を拡大しても、撮像素子１７上の蛍光像がボケることは無い。

したがって、本実施形態の観察装置では、ウェルプレート１６の周辺部品の配置自由度や、ウェルプレート１６の形状の自由度（例えばウェルの深さの自由度）が高いという利点もある。

したがって、本実施形態の観察装置は、高集積化されたウェルプレートの観察時であっても、ウェル間のクロストークの影響を受けず、しかも、広視野の像を短時間で取得可能であって、さらに、ウェルの深さに制限を課すことも無い。

なお、本実施形態の観察装置では、フレームデータｆ１の取得とフレームデータｆ２の取得とをこの順序で行ったが、反対の順序で行ってもよいことは言うまでもない。

また、本実施形態の観察装置では、校正データ（フレームデータｆ２）の取得を観察の度に行ったが、所定期間毎に行っても、光源パワーが変化する毎に行っても、装置の初期設定時にだけ行ってもよい。

また、本実施形態の観察装置では、励起光Ａ及び誘起光Ｂの閃光照射タイミングが観察データ（フレームデータｆ１）の電荷蓄積期間内に入っていたため、校正データ（フレームデータｆ２）を別途取得して観察データから差し引く必要があったが、それらのタイミングを電荷蓄積期間から外しておけば、校正データ（フレームデータｆ２）を別途取得する必要も、校正データを観察データから差し引く必要も、無くなる。

但し、誘起光Ｂの閃光照射タイミングと誘導放出光の放出開始タイミングとは近接しているので、誘導放出光の放出期間の多くを電荷蓄積期間内に収め、かつ、誘起光Ｂの閃光照射タイミングを電荷蓄積期間から外すために、電荷蓄積の開始タイミングは誘起光Ｂの閃光照射タイミングの直後とすることが望ましい。

また、本実施形態の観察装置では、誘起光Ｂのパワーを励起光Ａのパワーと等しい値に設定したが、励起光Ａのパワーと等しい値から励起光Ａのパワーの１／１０倍程度までの範囲内の何れかの値に設定してもよい。

［第２実施形態］
以下、本発明の第２実施形態として、誘導放出観察方法の適用された観察装置を説明する。ここでは、第１実施形態との相違点のみを説明する。

図７は、本実施形態の観察装置の構成図である。図７に示すとおり、相違点は、フェムト秒パルスレーザ光源の代わりにＣＷ発振型のレーザ光源１０’が配置され、ビームスプリッタ１１の代わりにビームスプリッタ１１’が配置され、移動鏡１２の代わりに固定鏡１２’が配置され、ビームスプリッタ１１’と固定鏡１２’との間にシャッター２１が配置され、ビームスプリッタ１１’と固定鏡１３との間にオプティカルチョッパー２０が配置された点にある。

シャッター２１は、入射光の光路を開放状態と閉鎖状態との間で切り替えるシャッターである。その切り替えのタイミングは、コントローラ１８によって制御される。

レーザ光源１０’は、強度が一定の連続波であるＣＷレーザ光Ｌ０を発振する。ＣＷレーザ光Ｌ０の波長スペクトルは狭帯化（単色化）されており、その波長スペクトルの中心波長は、前述した被検物の励起波長と略同じである。

オプティカルチョッパー２０は、所定の透過率分布を有したディスクを光路へ挿入しており、そのディスクを回転させることで、光路を通過する光の強度を時間方向に変調する。このオプティカルチョッパー２０の変調波形は矩形波であって、オプティカルチョッパー２０の変調周期は予め決められている。なお、オプティカルチョッパー２０は、コントローラ１８によって制御され、ここでは、オプティカルチョッパー２０の回転位置を所定位置に固定すると、光路が閉鎖状態に保たれるものとする。

レーザ光源１０’から射出したＣＷレーザ光Ｌ０は、ビームスプリッタ１１’を透過するＣＷレーザ光Ａと、ビームスプリッタ１１’を反射するＣＷレーザ光Ｂとに分離される。

ビームスプリッタ１１’を透過したＣＷレーザ光Ａは、オプティカルチョッパー２０を介して固定鏡１３へ正面から入射すると、固定鏡１３を反射して光路を折り返し、オプティカルチョッパー２０を介してビームスプリッタ１１’へ再入射する。

ビームスプリッタ１１’を反射したＣＷレーザ光Ｂは、シャッター２１を介して移動鏡１２へ正面から入射すると、固定鏡１２’を反射して光路を折り返し、シャッター２１を介してビームスプリッタ１１’へ再入射する。

ビームスプリッタ１１’へ再入射したＣＷレーザ光Ａ及びＣＷレーザ光Ｂは、互いの光路を統合した後、ビームエキスパンダ１５を通過して径の太い平行光束となり、ウェルプレート１６の略全体を正面から略均一な照度で連続照射する。

ウェルプレート１６へ入射したＣＷレーザ光Ａ及びＣＷレーザ光Ｂは、ウェルプレート１６を透過した後、撮像素子１７の撮像面へ正面から入射する。また、ＣＷレーザ光Ａ及びＣＷレーザ光Ｂに応じてマイクプレート１６で発生した光も、撮像素子１７の撮像面へ入射する。撮像素子１７は、撮像面へ入射した光の強度分布（正確には強度分布の時間積分値）を示すフレームデータを取得し、そのフレームデータをコントローラ１８へ送出する。

以上の観察装置において、撮像素子１７のフレーム周期ΔＴは、所定値（例えば１／３０秒）に設定される。なお、ここでは、撮像素子１７の１フレーム当たりの電荷蓄積時間は、撮像素子１７のフレーム周期ΔＴとほぼ同じに設定されたと仮定する。

また、ビームスプリッタ１１から固定鏡１２’までの間隔と、ビームスプリッタ１１から固定鏡１３までの間隔とは、予め等しく設定されている。

また、オプティカルチョッパー２０の変調周期は、撮像素子１７のフレーム周期ΔＴの整数倍に設定されている。ここでは簡単のため、ＣＷレーザ光Ａの変調周期は撮像素子１７のフレーム周期ΔＴと等しく設定されたと仮定する。

また、ビームスプリッタ１１’の反射率と透過率との比は、ウェルプレート１６に照射されるＣＷレーザ光Ｂのパワーが、ウェルプレート１６に照射されるＣＷレーザ光Ａのパワーの１／１０倍程度となるように設定されている。これによって、ＣＷレーザ光ＡとＣＷレーザ光Ｂとに異なる機能を付与することができる。

また、ＣＷレーザ光Ｌ０のパワーは、ウェルプレート１６に照射されるＣＷレーザ光Ａのエネルギー密度が、被検物を励起状態へ移行させるのに適したエネルギー密度となるよう設定されている。

なお、ＣＷレーザ光Ａ、Ｂのパワーを以上のとおり設定した場合、ＣＷレーザ光Ａ、Ｂの照射により、ウェルプレート１６内の被検物は以下のとおり振る舞う。

先ず、ＣＷレーザ光Ａが照射されると、ウェルプレート１６内の被検物は、一定の確率で励起状態へと移行する。しかし、ＣＷレーザ光Ｂが照射されても、そのＣＷレーザ光ＢのパワーはＣＷレーザ光Ａのパワーの１／１０倍程度に過ぎないため、ウェルプレート１６内の被検物は、励起状態へ移行することは無い。しかし、仮に、ＣＷレーザ光Ｂの照射時、ウェルプレート１６内に励起状態の被検物が存在していたならば、ＣＷレーザ光の照射により、その被検物から蛍光が誘導放出される可能性はある。

つまり、ＣＷレーザ光Ａ、Ｂのパワーを以上のとおり設定した場合、ＣＷレーザ光Ａは、被検物を励起する励起光として使用することが可能であり、ＣＷレーザ光Ｂは、励起状態の被検物から蛍光を誘導放出させる誘起光として使用することが可能である。よって、以下では、ＣＷレーザ光Ａを「励起光Ａ」と称し、ＣＷレーザ光Ｂを「誘起光Ｂ」と称す。

図８は、本実施形態のコントローラ１８による観察処理の動作フローチャートである。以下、各ステップを順に説明する。

ステップＳ１１’：コントローラ１８は、シャッター２１により誘起光Ｂの光路を開放した状態でレーザ光源１０’の駆動を開始し、撮像素子１７及びオプティカルチョッパー２０に対してそれぞれ適切な駆動信号を送出することで、図９の左側に示すようなタイミング制御を行い、撮像素子１７からフレームデータｆ３を取り込む。

図９の左側に示すとおり、フレームデータｆ３の電荷蓄積が開始された時点（１）では、誘起光Ｂの連続照射は既に開始されている。その後、励起光Ａの連続照射が開始され（２）、自然放出光Ｃの放出が開始され（３）、誘導放出光Ｄの放出が開始され（４）、励起光Ａの連続照射が終了し（５）、自然放出光Ｃの放出が終了し（６）、誘導放出光Ｄの放出が終了し（７）、その後、フレームデータｆ３の電荷蓄積が終了する（８）。

したがって、撮像素子１７が取得するフレームデータｆ３は、励起光Ａの照射強度分布の時間積分値と、誘起光Ｂの照射強度分布の時間積分値と、自然放出光Ｃの放出強度分布の時間積分値と、誘導放出光Ｄの放出強度分布の時間積分値との和を表す。

ステップＳ１１”：コントローラ１８は、シャッター２１により誘起光Ｂの光路を閉鎖してから、撮像素子１７及びオプティカルチョッパー２０に対してそれぞれ適切な駆動信号を送出することで、図９の右側に示すようなタイミング制御を行い、撮像素子１７からフレームデータｆ４を取り込む。

図９の右側に示すとおり、フレームデータｆ４の電荷蓄積が開始された時点（９）では、誘起光Ｂはオフされている。その後、励起光Ａの連続照射が開始され（１０）、自然放出光Ｃの放出が開始され（１１）、励起光Ａの連続照射が終了し（１２）、自然放出光Ｃの放出が終了し（１３）、その後、フレームデータｆ４の電荷蓄積が終了する（１４）。なお、このフレームデータｆ４の電荷蓄積期間に誘起光Ｂはオフされたままなので、フレームデータｆ４の電荷蓄積期間に誘導放出光は発生しない。

よって、撮像素子１７が取得するフレームデータｆ４は、励起光Ａの照射強度分布の時間積分値と、自然放出光Ｃの放出強度分布の時間積分値との和を表す。

ステップＳ１３’：コントローラ１８は、オプティカルチョッパー２０により励起光Ａの光路を閉鎖し、かつシャッター２１により誘起光Ｂの光路を開放してから、撮像素子１７に対して適切な駆動信号を送出することで、図１０に示すようなタイミング制御を行い、撮像素子１７からフレームデータｆ５を取り込む。なお、この際には、ウェルプレート１６を光路から外す必要は無い。

図１０に示すとおり、フレームデータｆ５の電荷蓄積が開始された時点（１５）では、励起光Ａはオフされており、また、誘起光Ｂの連続照射は既に開始されている。その後、フレームデータｆ５の電荷蓄積が終了する（１６）。なお、フレームデータｆ５の電荷蓄積期間に励起光Ａはオフされているので、その電荷蓄積期間内に励起される被検物は存在せず、自然放出光は発生しない。また、その電荷蓄積期間内には励起状態の被検物は存在しないため、電荷蓄積期間内に誘起光Ｂが連続照射されても、誘導放出光が発生することは無い。

したがって、撮像素子１７が取得するフレームデータｆ５は、誘起光Ｂの照射強度分布の時間積分値を表す。このフレームデータｆ５は、観察装置に固有のデータであって、後述する観察データｆ６の補正時に使用される。以下、このフレームデータｆ５を「校正データｆ５」と称す。

ステップＳ１４’：コントローラ１８は、フレームデータｆ３からフレームデータｆ４を差し引くことにより観察データｆ６を取得し、その観察データｆ６から校正データｆ５を差し引くことにより、観察データｆ６を補正する。補正後の観察データｆ６は、誘導放出光Ｄの放出強度分布の時間積分値（すなわち誘導放出光Ｄによるウェルプレート１６の蛍光像）を表す。

ステップＳ１５：コントローラ１８は、補正後の観察データｆ６を不図示のモニタへ表示する。よって、オペレータは、誘導放出光によるウェルプレート１６の蛍光像をモニタ上で観察することができる。その後、オペレータは、必要に応じてコントローラ１８に対し補正後の観察データｆ６の保存指示を入力する。保存指示が入力されると、コントローラ１８は、補正後の観察データｆ６を画像ファイルとして保存し、フローを終了する。

以上、本実施形態の観察装置は、励起光Ａと誘起光Ｂとのうち双方を照射する期間と、前者のみを照射する期間とを設けることで、誘導放出光による蛍光像と自然放出光による蛍光像とのうち双方を反映させたフレームデータｆ３と、後者のみを反映させたフレームデータｆ４とを取得している。これらのフレームデータｆ３、ｆ４の差（＝観察データｆ６）は、誘導放出光による蛍光像を表す。

また、本実施形態の観察装置では、光源としてフェムト秒パルスレーザ光源１０の代わりにＣＷ発振型のレーザ光源１０’を使用するので、第１実施形態の観察装置よりも安価に実現できる。

なお、本実施形態の観察装置では、フレームデータｆ３の取得とフレームデータｆ４の取得とフレームデータｆ５の取得とをこの順序で行ったが、異なる順序で行ってもよいことは言うまでもない。

また、本実施形態の観察装置では、校正データ（フレームデータｆ５）の取得を観察の度に行ったが、所定期間毎に行っても、光源パワーが変化する毎に行っても、装置の初期設定時にだけ行ってもよい。

１０…フェムト秒パルスレーザ光源、１０’…ＣＷ発振型のレーザ光源、１１、１１’…ビームスプリッタ、１３、１２’…固定鏡、１２…移動鏡、１４…ステージ、１５…ビームエキスパンダ、１７…撮像素子、１６…ウェルプレート、１８…コントローラ

Claims (8)

1. 試料に含まれる特定種類の分子を励起状態に移行させるための平行光束である励起光を前記試料へ照射する励起手段と、
   励起状態にある前記分子から光を誘導放出させるための平行光束である誘起光を前記励起光と同じ側から前記試料へ照射する誘起手段と、
   前記誘起光の下流側へ向けて前記試料から射出した平行光束の強度分布を、結像光学系を介さずに検出する二次元撮像素子である画像検出手段と、
   前記励起手段及び前記誘起手段及び前記画像検出手段を制御することにより、前記分子から誘導放出された光の前記試料上の強度分布を計測する制御手段と
   を備えることを特徴とする観察装置。
2. 請求項１に記載の観察装置において、
   前記制御手段は、
   前記励起光を前記試料へ閃光照射してから、前記分子の励起寿命未満の遅延時間をおいた後、前記誘起光を前記試料へ閃光照射すると共に、それら閃光照射に応じて前記試料で発生した平行光束の強度分布を、前記試料の観察データとして取得する
   ことを特徴とする観察装置。
3. 請求項２に記載の観察装置において、
   前記制御手段は、
   前記励起光及び前記誘起光による前記試料の照射強度分布のデータを前記観察装置の校正データとして取得する
   ことを特徴とする観察装置。
4. 請求項３に記載の観察装置において、
   前記制御手段は、
   前記観察データを前記校正データにより補正する
   ことを特徴とする観察装置。
5. 請求項１に記載の観察装置において、
   前記制御手段は、
   前記励起光及び前記誘起光のうち前者のみを前記試料へ照射する自然放出期間と、双方を前記試料へ照射する混合放出期間とを設定し、前記混合放出期間に前記試料で発生した平行光束の強度分布と、前記自然放出期間に前記試料で発生した平行光束の強度分布との差を、前記試料の観察データとして取得する
   ことを特徴とする観察装置。
6. 請求項５に記載の観察装置において、
   前記制御手段は、
   前記誘起光による前記試料の照射強度分布のデータを前記観察装置の校正データとして取得する
   ことを特徴とする観察装置。
7. 請求項６に記載の観察装置において、
   前記制御手段は、
   前記観察データを前記校正データにより補正する
   ことを特徴とする観察装置。
8. 試料に含まれる特定種類の分子を励起状態に移行させるための平行光束である励起光を前記試料へ照射する励起手順と、
   励起状態にある前記分子から光を誘導放出させるための平行光束である誘起光を前記励起光と同じ側から前記試料へ照射する誘起手順と、
   前記誘起光の下流側へ向けて前記試料から射出した平行光束の強度分布を、結像光学系を介さずに二次元撮像素子で検出する画像検出手順と、
   前記励起手順及び前記誘起手順及び前記画像検出手順を制御することにより、前記分子から誘導放出された光の前記試料上の強度分布を計測する制御手順と
   を含むことを特徴とする観察方法。

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