JP2007232713A - 試料を高い空間分解能で検査するための方法 - Google Patents
試料を高い空間分解能で検査するための方法 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】レーザ走査型蛍光顕微鏡を用いた高空間分解能検査方法の提供。
【解決手段】検査される試料(1)が、第1状態(Z1、A)から第2状態(Z2、B)へと繰り返し遷移可能な物質を含み、第1状態及び第2状態が少なくとも1つの光学的性質で互いに相違しており、 a)記録される試料領域(P)内で、切換信号(2)により物質が第1状態に移されるステップ、 b)光学信号(4)によって第2状態が誘導されて、記録される試料領域(P)内で、空間的に限定された部分領域が明確に除外されるステップ、 c)試験信号(7)によって、残存する第1状態(Z1、A1、A2、A3)が読取られるステップ、 d)ステップa)〜c)が繰り返され、試料(1)を走査するために光学信号(4)が繰返しのたびに変位されるステップを含むものにおいて、個別の測定状況に適合された順序で個々のステップa)〜d)を実行する。
【選択図】図1
【解決手段】検査される試料(1)が、第1状態(Z1、A)から第2状態(Z2、B)へと繰り返し遷移可能な物質を含み、第1状態及び第2状態が少なくとも1つの光学的性質で互いに相違しており、 a)記録される試料領域(P)内で、切換信号(2)により物質が第1状態に移されるステップ、 b)光学信号(4)によって第2状態が誘導されて、記録される試料領域(P)内で、空間的に限定された部分領域が明確に除外されるステップ、 c)試験信号(7)によって、残存する第1状態(Z1、A1、A2、A3)が読取られるステップ、 d)ステップa)〜c)が繰り返され、試料(1)を走査するために光学信号(4)が繰返しのたびに変位されるステップを含むものにおいて、個別の測定状況に適合された順序で個々のステップa)〜d)を実行する。
【選択図】図1
Description
本発明は、好ましくはレーザ走査型蛍光顕微鏡を用いて試料を高い空間分解能で検査するための方法であって、検査される試料が、第1状態から第2状態へと繰り返し遷移可能な物質を含み、第1状態及び第2状態が少なくとも1つの光学的性質で互いに相違しており、
a)記録される試料領域内で、切換信号により物質が第1状態に移されるステップ、
b)光学信号によって第2状態へ誘導されて、記録される試料領域内で、空間的に限定された部分領域が明確に除外されるステップ、
c)試験信号によって、残存する第1状態が読取られるステップ、
d)ステップa)〜c)が繰り返され、試料を走査するために光学信号が繰返しのたびに変位されるステップを含むものに関する。
a)記録される試料領域内で、切換信号により物質が第1状態に移されるステップ、
b)光学信号によって第2状態へ誘導されて、記録される試料領域内で、空間的に限定された部分領域が明確に除外されるステップ、
c)試験信号によって、残存する第1状態が読取られるステップ、
d)ステップa)〜c)が繰り返され、試料を走査するために光学信号が繰返しのたびに変位されるステップを含むものに関する。
冒頭に指摘した種類の方法は実務において公知である。
基本的にアッベの法則によれば結像光学法の空間分解能には回折限界によって理論的限界があり、回折限界は使用される光の波長に依存している。
しかしながら、ここで説明する方法によれば、アッベにより公知の理論的な回折限界を超えて改善される空間分解能が達成できる。
基本的にアッベの法則によれば結像光学法の空間分解能には回折限界によって理論的限界があり、回折限界は使用される光の波長に依存している。
しかしながら、ここで説明する方法によれば、アッベにより公知の理論的な回折限界を超えて改善される空間分解能が達成できる。
公知の方法ではこのため、記録される試料内に、第1状態から第2状態へと繰り返し遷移可能な物質が提供され、第1状態及び第2状態は少なくとも1つの光学的性質で互いに相違している。
大抵の公知の方法では、第1状態が蛍光性状態(fluorescence-capable state)(以下「蛍光性状態A」という)、第2状態が非蛍光性状態(nonfluorescence-capable state)(以下「非蛍光性状態B」という)である。
記録される試料領域内で物質が切換信号によって蛍光性状態Aに移された後、記録される試料領域の空間的に限定された部分領域内で光学信号によって非蛍光性状態Bへ誘導され、それとともに蛍光分子の蛍光抑制がもたらされる。
この場合、蛍光抑制の物理的プロセスは、多様なもので有り得る。
例えば、事前に励起された状態からの誘導放出、または、蛍光分子内の光学的に誘導された構造変化が知られている。
大抵の公知の方法では、第1状態が蛍光性状態(fluorescence-capable state)(以下「蛍光性状態A」という)、第2状態が非蛍光性状態(nonfluorescence-capable state)(以下「非蛍光性状態B」という)である。
記録される試料領域内で物質が切換信号によって蛍光性状態Aに移された後、記録される試料領域の空間的に限定された部分領域内で光学信号によって非蛍光性状態Bへ誘導され、それとともに蛍光分子の蛍光抑制がもたらされる。
この場合、蛍光抑制の物理的プロセスは、多様なもので有り得る。
例えば、事前に励起された状態からの誘導放出、または、蛍光分子内の光学的に誘導された構造変化が知られている。
明白なのは、試料体積内における第1状態から第2状態への遷移は、飽和するやり方(saturated fashion)で生じることであり、すなわち、試料体積の少なくとも1つの部分領域では光学的な切換信号が適切にそこに照射されないことで、そうした遷移はまさに生じないことである。
この効果は、光学信号の強度零地点を生成することによって達成することができる。
この強度零地点とその近傍では第2状態(非蛍光性状態B)への遷移が起きず、第1状態(蛍光性状態A)が維持される。
光学信号によるA→B遷移の飽和(saturation)は、記録される試料領域の照射領域において強度零地点に近接する周囲で非蛍光性状態Bへの(ほぼ)完全な遷移をもたらす。
飽和(saturation)へ導くプロセスが強ければ強いほど、すなわち、強度零地点の周囲領域に光学信号によって加えられるエネルギーが多ければ多いほど、蛍光性状態Aもしくは一般に「発光性(luminous)」状態にある蛍光分子を有する領域は一層小さくなる。
この領域は、強度零地点の近傍における飽和度(degree of saturation)に基づいて原則として任意に小さくすることができる。
従って、加えられる光学信号の、回折限界に基づいて可能な最小領域よりもはるかに任意に小さい蛍光性状態Aの領域にマークを付けることができる。
その後、例えば、試験信号の照射によって蛍光性状態Aの領域が読取られると、回折限界が許容するよりも小さくできる限定された領域から(蛍光)測定信号が生じる。
試料が前記のように逐一走査されると、回折理論により許容される分解能よりも良好な分解能で画像が得られる。
この効果は、光学信号の強度零地点を生成することによって達成することができる。
この強度零地点とその近傍では第2状態(非蛍光性状態B)への遷移が起きず、第1状態(蛍光性状態A)が維持される。
光学信号によるA→B遷移の飽和(saturation)は、記録される試料領域の照射領域において強度零地点に近接する周囲で非蛍光性状態Bへの(ほぼ)完全な遷移をもたらす。
飽和(saturation)へ導くプロセスが強ければ強いほど、すなわち、強度零地点の周囲領域に光学信号によって加えられるエネルギーが多ければ多いほど、蛍光性状態Aもしくは一般に「発光性(luminous)」状態にある蛍光分子を有する領域は一層小さくなる。
この領域は、強度零地点の近傍における飽和度(degree of saturation)に基づいて原則として任意に小さくすることができる。
従って、加えられる光学信号の、回折限界に基づいて可能な最小領域よりもはるかに任意に小さい蛍光性状態Aの領域にマークを付けることができる。
その後、例えば、試験信号の照射によって蛍光性状態Aの領域が読取られると、回折限界が許容するよりも小さくできる限定された領域から(蛍光)測定信号が生じる。
試料が前記のように逐一走査されると、回折理論により許容される分解能よりも良好な分解能で画像が得られる。
2つの状態の間の相違として蛍光性/非蛍光性の光学的性質が用いられる前記種類の方法は、例えば、特許文献1および特許文献2により開示されている。
これらの方法では、光学信号によって蛍光分子が蛍光性状態Aから非蛍光性状態Bに移され、A→B遷移で飽和(saturation)が達成される。
蛍光性状態Aのまま残る試料領域は、照射される光学信号の強度零地点を有する最小強度からそれぞれ生じる。
最小強度は、干渉パターンの一部である。
試料の走査は、光学信号の最小強度を変位させることによって行われ、変位は干渉光線の移相によって引き起こされる。
独国特許出願公開第10325459号明細書
独国特許出願公開第10325460号明細書
これらの方法では、光学信号によって蛍光分子が蛍光性状態Aから非蛍光性状態Bに移され、A→B遷移で飽和(saturation)が達成される。
蛍光性状態Aのまま残る試料領域は、照射される光学信号の強度零地点を有する最小強度からそれぞれ生じる。
最小強度は、干渉パターンの一部である。
試料の走査は、光学信号の最小強度を変位させることによって行われ、変位は干渉光線の移相によって引き起こされる。
公知の方法では欠点として、例えば、試験信号と光学信号との間または試験信号と切換信号との間の混信が、分解能の顕著な低下を導く可能性がある。
すなわち、このような混信は、蛍光の測定信号の強度低下を引き起こす可能性があり、また、現実の測定信号に一致しない信号検出がもたらされる可能性がある。
さらに公知の方法では、自発的な遷移が光学的な切換信号または試験信号と競合する場合、1サイクル中における個々の信号の照射時間が限定されている。
すなわち、このような混信は、蛍光の測定信号の強度低下を引き起こす可能性があり、また、現実の測定信号に一致しない信号検出がもたらされる可能性がある。
さらに公知の方法では、自発的な遷移が光学的な切換信号または試験信号と競合する場合、1サイクル中における個々の信号の照射時間が限定されている。
そこで本発明は、簡単かつ安価な手段で混信による欠点を可能な限り防止し、高い分解能が持続される、冒頭に指摘した種類の方法を開示することを目的とするものである。
本発明の目的は、請求項1の特徴を有する方法によって達成される。
本発明の方法は、個別の測定状況に適合された順序で個々のステップa)〜ステップd)が実行されるように構成されかつ展開される。
本発明の方法は、個別の測定状況に適合された順序で個々のステップa)〜ステップd)が実行されるように構成されかつ展開される。
発明を検討する場合にまず認識されたのは、混信の発生が、達成可能な最大の分解能にきわめて不利に作用し得ることであった。
次の段階で認識されたのは、周期的に照射される信号の相互作用に基づいて、混信は、最大の分解能を達成するために試料内部の物質の状態が最適に調整されていない結果をもたらす可能性があることであった。
最後に本発明によれば、決められた順序の繰返しの代わりに、個別の測定状況に適合された順序で個々のステップa)〜ステップd)が実行されることによって、前述した諸問題は簡単に回避できることが認識された。
次の段階で認識されたのは、周期的に照射される信号の相互作用に基づいて、混信は、最大の分解能を達成するために試料内部の物質の状態が最適に調整されていない結果をもたらす可能性があることであった。
最後に本発明によれば、決められた順序の繰返しの代わりに、個別の測定状況に適合された順序で個々のステップa)〜ステップd)が実行されることによって、前述した諸問題は簡単に回避できることが認識された。
具体的な実施形態では、例えば、ステップa)〜d)を含むサイクル全体の中で部分サイクルが繰り返し実行されるように設定しておくことができ、この部分サイクルは、ステップa)〜ステップd)の一部のみを含んでいる。
例えば、ステップb)とc)を含む部分サイクルを繰り返し実行することができる。
この方法は、試験信号が測定信号の放射を引き起こす場合だけでなく、第2状態から第1状態への転換を引き起こす場合にも都合がよい。
その場合、ステップb)とc)を繰り返し実行することによって、試料が十分な程度に第2状態になることを確保することができる。
従って、一連のステップは、a)、b)、c)、b)、c)、b)、c)、…d)のように生じる。
例えば、ステップb)とc)を含む部分サイクルを繰り返し実行することができる。
この方法は、試験信号が測定信号の放射を引き起こす場合だけでなく、第2状態から第1状態への転換を引き起こす場合にも都合がよい。
その場合、ステップb)とc)を繰り返し実行することによって、試料が十分な程度に第2状態になることを確保することができる。
従って、一連のステップは、a)、b)、c)、b)、c)、b)、c)、…d)のように生じる。
別の測定状況では、好ましくは、ステップa)、b)、c)を含む部分サイクルが繰り返し実行される。
このような繰返しは、試験信号が測定信号の放射を引き起こす場合だけではなく、第1状態から第2状態への転換を引き起こす場合にも都合がよい。
その場合、ステップa)、b)、c)を含む部分サイクルを繰り返し実行することによって、試料が十分に第1状態になることを確保することができる。
従って、実行すべき一連のステップは、a)、b)、c)、a)、b)、c)、a)、b)、c)、…d)のように生じる。
このような繰返しは、試験信号が測定信号の放射を引き起こす場合だけではなく、第1状態から第2状態への転換を引き起こす場合にも都合がよい。
その場合、ステップa)、b)、c)を含む部分サイクルを繰り返し実行することによって、試料が十分に第1状態になることを確保することができる。
従って、実行すべき一連のステップは、a)、b)、c)、a)、b)、c)、a)、b)、c)、…d)のように生じる。
さらに有利な点としては、第1状態の読取りから得られる測定信号が、試験信号の照射の間のみまたは照射直後にのみそれぞれ検出されるように改良することができる。
これにより、切換信号および/または光学信号が、測定信号の放射を引き起こすことを考慮することができる。
切換信号および/または光学信号によって引き起こされた測定信号の検出は、望ましくない。
というのも、このような測定信号は、光学信号の照射後に第1状態のまま残った空間的に狭く限定された領域から生じるのではないからである。
従って、このような測定信号は、所望する高い空間分解能の情報を有していない。
専ら試験信号の照射の間または照射直後に測定信号を検出することによって、上述した望ましくない測定信号の検出を効果的に抑制することができる。
これにより、切換信号および/または光学信号が、測定信号の放射を引き起こすことを考慮することができる。
切換信号および/または光学信号によって引き起こされた測定信号の検出は、望ましくない。
というのも、このような測定信号は、光学信号の照射後に第1状態のまま残った空間的に狭く限定された領域から生じるのではないからである。
従って、このような測定信号は、所望する高い空間分解能の情報を有していない。
専ら試験信号の照射の間または照射直後に測定信号を検出することによって、上述した望ましくない測定信号の検出を効果的に抑制することができる。
選択的または付加的に、測定信号の検出に使用される検出器は、個別の一連のステップと同期化することができる。
同様に、選択的または付加的に、検出器の上流側にシャッタを配置することができ、このシャッタは、個別の一連のステップと同期化することができる。
シャッタは、例えば、機械的または電子的なシャッタを用いることができる。
同様に、音響光学的なシャッタの使用も考えられる。
同様に、選択的または付加的に、検出器の上流側にシャッタを配置することができ、このシャッタは、個別の一連のステップと同期化することができる。
シャッタは、例えば、機械的または電子的なシャッタを用いることができる。
同様に、音響光学的なシャッタの使用も考えられる。
検出器は、カメラを用いることができ、特に、CCDカメラまたはEMCCDカメラを用いることができる。
検出器は、光電子増倍管またはAPD(アバランシェフォトダイオード)を用いることもできる。
検出器アレイ、特に、APDアレイの態様のものを検出器として用いることも同様に可能である。
検出器は、光電子増倍管またはAPD(アバランシェフォトダイオード)を用いることもできる。
検出器アレイ、特に、APDアレイの態様のものを検出器として用いることも同様に可能である。
可能な限り高い分解能を達成するために、特定の測定状況のとき、ステップa)のような切換信号の照射と、ステップb)のような光学信号の照射とを同時に、または少なくとも一部で時間的に重なるように実行することは有意義である。
つまり、高い分解能にとって重要なのは、光学信号の照射によって試料領域内に、物質が第1状態のまま残る領域をできるだけ小さくすることである。
これは、可能な限り完全に行われねばならない。
すなわち、この領域内で物質は可能な限り完全に第1状態のまま残らねばならない。
光学信号が完全な強度零地点を有するのでなく、多少とも強く表れる最小強度のみを示す場合、光学信号の作用は最小強度の領域でも、第1状態から第2状態への(望ましくない)転換を引き起こす。
光学信号及び切換信号が同時に作用すると、切換信号/光学信号比は、光学信号の最小強度付近で大きくなる。
従って、これらの領域は、光学信号の最小強度が比較的に不十分である場合でもかなり第1状態のまま残り、結果として分解能が改善される。
つまり、高い分解能にとって重要なのは、光学信号の照射によって試料領域内に、物質が第1状態のまま残る領域をできるだけ小さくすることである。
これは、可能な限り完全に行われねばならない。
すなわち、この領域内で物質は可能な限り完全に第1状態のまま残らねばならない。
光学信号が完全な強度零地点を有するのでなく、多少とも強く表れる最小強度のみを示す場合、光学信号の作用は最小強度の領域でも、第1状態から第2状態への(望ましくない)転換を引き起こす。
光学信号及び切換信号が同時に作用すると、切換信号/光学信号比は、光学信号の最小強度付近で大きくなる。
従って、これらの領域は、光学信号の最小強度が比較的に不十分である場合でもかなり第1状態のまま残り、結果として分解能が改善される。
好ましい実施形態としては、個別の一連のステップも画素クロック(pixel clock)および/または撮像の進行(advancement of imaging)と同期化される。
換言するなら、a)、b)、c)及びd)の順の一連のステップ又はその順序が変更された場合でも、測定信号の検出および/または切換信号と光学信号との同時照射も、画素クロックおよび/または撮像の進行と同期化することができる。
特に、3つの空間方向における進行(x方向、y方向、z方向のそれぞれの撮像の進行)との同期化を行うことができる。
撮像の進行は、例えば、検流計スキャナ、音響光学偏向器、微小電気機械システム(MEMS)または圧電機械素子によって実行することができる。
同期化は、主に、AOTF(Acousto Optical Tunable Filter)、AOM(Acousto Optical Modulator)によって、および/または電子的なおよび/または機械的なシャッタによって、実行することができる。
換言するなら、a)、b)、c)及びd)の順の一連のステップ又はその順序が変更された場合でも、測定信号の検出および/または切換信号と光学信号との同時照射も、画素クロックおよび/または撮像の進行と同期化することができる。
特に、3つの空間方向における進行(x方向、y方向、z方向のそれぞれの撮像の進行)との同期化を行うことができる。
撮像の進行は、例えば、検流計スキャナ、音響光学偏向器、微小電気機械システム(MEMS)または圧電機械素子によって実行することができる。
同期化は、主に、AOTF(Acousto Optical Tunable Filter)、AOM(Acousto Optical Modulator)によって、および/または電子的なおよび/または機械的なシャッタによって、実行することができる。
さらに有利な点としては、個々のステップの間に、指定可能な遅延が設定される。
この遅延は、固定でき、一方では自由に選択でき、または測定作業の間、個別の測定状況に動的に適合することができる。
特に、個々のステップの間の遅延は、異なる長さに調整することが考えられる。
個々のステップ自体の異なる長さの持続時間、すなわち、各信号の照射持続時間も、異なるものとすることができる。
遅延及び個々のステップ持続時間、すなわち、信号照射時間及び検出器読取り時間は、好ましくは試料のすべての個所に対してそれらが同一であるように選択される。
これは、個々の像領域の換算および異なる重み付けが省かれるので、像評価の単純化に関して有利である。
この遅延は、固定でき、一方では自由に選択でき、または測定作業の間、個別の測定状況に動的に適合することができる。
特に、個々のステップの間の遅延は、異なる長さに調整することが考えられる。
個々のステップ自体の異なる長さの持続時間、すなわち、各信号の照射持続時間も、異なるものとすることができる。
遅延及び個々のステップ持続時間、すなわち、信号照射時間及び検出器読取り時間は、好ましくは試料のすべての個所に対してそれらが同一であるように選択される。
これは、個々の像領域の換算および異なる重み付けが省かれるので、像評価の単純化に関して有利である。
ところで、本発明の構成を有利なやり方で構成しかつ展開する様々な可能性がある。
そのため、一方で従属請求項を参照し、他方で試料を高い空間分解能で検査するための本発明に係る方法の好ましい実施形態についての以下の説明を参照されたい。
図面を基にした好ましい実施形態の説明と関連して、本発明の構成に関する好ましい諸構成および諸展開もまた全般に説明される。
そのため、一方で従属請求項を参照し、他方で試料を高い空間分解能で検査するための本発明に係る方法の好ましい実施形態についての以下の説明を参照されたい。
図面を基にした好ましい実施形態の説明と関連して、本発明の構成に関する好ましい諸構成および諸展開もまた全般に説明される。
図1は、回折による分解能限界を越えて試料を高い空間分解能で検査するのに用いられる方法のステップa)〜c)に関する概略を示す。
図1の(a)によれば、まず記録される試料領域Pの全体において、試料1内に付与されているとともに第1状態Z1から第2状態Z2へと繰り返し遷移可能な物質が切換信号2によって第1状態Z1に移される。
第1状態Z1と第2状態Z2は、少なくとも1つの光学的性質で相互に相違している。
具体的な実施形態では、第1状態Z1は、蛍光性状態Aであり、第2状態Z2は、非蛍光性状態Bである。
試料1内に付与される物質は、具体的には、フォトクロミック物質であり、その分子は、第1波長の光である切換信号2の照射によって蛍光性状態Aに移される。
これは、理想的には、試料1が試料領域Pの全体に対物レンズ3を通じた照明によって切換信号2で照射されることによって行われる(ステップa)。
図1の(a)によれば、まず記録される試料領域Pの全体において、試料1内に付与されているとともに第1状態Z1から第2状態Z2へと繰り返し遷移可能な物質が切換信号2によって第1状態Z1に移される。
第1状態Z1と第2状態Z2は、少なくとも1つの光学的性質で相互に相違している。
具体的な実施形態では、第1状態Z1は、蛍光性状態Aであり、第2状態Z2は、非蛍光性状態Bである。
試料1内に付与される物質は、具体的には、フォトクロミック物質であり、その分子は、第1波長の光である切換信号2の照射によって蛍光性状態Aに移される。
これは、理想的には、試料1が試料領域Pの全体に対物レンズ3を通じた照明によって切換信号2で照射されることによって行われる(ステップa)。
基底状態の減衰(Ground State Depletion、GSD)の場合、蛍光性(シングル(single))状態への遷移は、通常自発的に生じる。
そのため、こうした場合、光学的な切換信号の照射は不要である。
一般的に、1〜100μs(一部ではそれより若干長い)の待機時間を考慮すればよいだけである。
そのため、こうした場合、光学的な切換信号の照射は不要である。
一般的に、1〜100μs(一部ではそれより若干長い)の待機時間を考慮すればよいだけである。
次のステップである図1の(b)に示すステップb)では、別の波長の光、いわゆる、光学信号4が、記録される試料領域Pに加えられる。
これは、はっきりした強度零地点5を有する光構造の態様で行われる。
光学信号4は、光学信号4の光で照明されたすべての領域6においてA→B遷移を飽和誘導(saturated fashion)する。
換言するなら、強度零地点5の近傍の狭く限定された物質領域のみが蛍光性状態Aのまま残る。
蛍光性状態Aのまま残る物質領域A1、A2、A3、…は、光学信号4自体の光構造の大きさよりもはるかに小さくすることができ、具体的には回折限界の構造よりもはるかに小さくすることができる。
蛍光性状態Aのまま残る物質領域A1、A2、A3、…のサイズは、最小強度5の特性に、したがってA→B遷移の達成される飽和度(degree of saturation)に基づいて専ら決定される。
これは、はっきりした強度零地点5を有する光構造の態様で行われる。
光学信号4は、光学信号4の光で照明されたすべての領域6においてA→B遷移を飽和誘導(saturated fashion)する。
換言するなら、強度零地点5の近傍の狭く限定された物質領域のみが蛍光性状態Aのまま残る。
蛍光性状態Aのまま残る物質領域A1、A2、A3、…は、光学信号4自体の光構造の大きさよりもはるかに小さくすることができ、具体的には回折限界の構造よりもはるかに小さくすることができる。
蛍光性状態Aのまま残る物質領域A1、A2、A3、…のサイズは、最小強度5の特性に、したがってA→B遷移の達成される飽和度(degree of saturation)に基づいて専ら決定される。
図1(c)には、蛍光性状態Aの読取り状態が略示されている。
この目的のために、図1(b)に示すステップb)で処理されて物質が蛍光性状態Aのまま残った領域を検出するように、光学的な試験信号7が、記録される試料領域Pに照射される。
この場合、記録される試料領域Pの外側にあって依然として蛍光性状態Aで存在する物質領域が記録されてはならない。
蛍光性状態Aの物質から放射する蛍光は、測定信号8として検出器(図示せず)によって検出され、個々の領域A1、A2、A3、…に対して検出されたそれぞれの測定信号8の割当てが明確に行われる。
この目的のために、図1(b)に示すステップb)で処理されて物質が蛍光性状態Aのまま残った領域を検出するように、光学的な試験信号7が、記録される試料領域Pに照射される。
この場合、記録される試料領域Pの外側にあって依然として蛍光性状態Aで存在する物質領域が記録されてはならない。
蛍光性状態Aの物質から放射する蛍光は、測定信号8として検出器(図示せず)によって検出され、個々の領域A1、A2、A3、…に対して検出されたそれぞれの測定信号8の割当てが明確に行われる。
図1に示したステップa)〜c)が繰り返され、試料1を走査するために光学信号4は繰返しのたびに変位される(ステップd))。
本発明によれば、個々のステップa)〜d)は、永続的に規定された順序で固定したサイクルにより行われるのでなく、個別の測定状況に適合された順序で実行される。
本発明によれば、個々のステップa)〜d)は、永続的に規定された順序で固定したサイクルにより行われるのでなく、個別の測定状況に適合された順序で実行される。
本発明に係る方法のさらに有利な諸構成に関しては、繰返しを避けるために明細書全体と添付した特許請求の範囲とを参照されたい。
最後に、以上述べた好ましい実施形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の構成を解説するのに役立つにすぎず、本発明の構成を本実施形態に限定するものではない。
1 ・・・試料
2 ・・・切換信号
3 ・・・対物レンズ
4 ・・・光学信号
5 ・・・強度零地点
6 ・・・領域
7 ・・・試験信号
8 ・・・測定信号
A ・・・蛍光性状態
A1、A2、A3 ・・・個別領域
B ・・・非蛍光性状態
Z1 ・・・第1状態
Z2 ・・・第2状態
2 ・・・切換信号
3 ・・・対物レンズ
4 ・・・光学信号
5 ・・・強度零地点
6 ・・・領域
7 ・・・試験信号
8 ・・・測定信号
A ・・・蛍光性状態
A1、A2、A3 ・・・個別領域
B ・・・非蛍光性状態
Z1 ・・・第1状態
Z2 ・・・第2状態
Claims (16)
- 好ましくはレーザ走査型蛍光顕微鏡を用いて試料を高い空間分解能で検査するための方法であって、検査される試料(1)が、第1状態(Z1、A)から第2状態(Z2、B)へと繰り返し遷移可能な物質を含み、第1状態(Z1、A)及び第2状態(Z2、B)が少なくとも1つの光学的性質で互いに相違しており、
a)記録される試料領域(P)内で、切換信号(2)により物質が第1状態(Z1、A)に移されるステップ、
b)光学信号(4)によって第2状態(Z2、B)へ誘導されて、記録される試料領域(P)内で、空間的に限定された部分領域が明確に除外されるステップ、
c)試験信号(7)によって、残存する第1状態(Z1、A1、A2、A3)が読取られるステップ、
d)ステップa)〜c)が繰り返され、試料(1)を走査するために光学信号(4)が繰返しのたびに変位されるステップを含むものにおいて、個別の測定状況に適合された順序で個々のステップa)〜d)が実行されることを特徴とする方法。 - 前記ステップa)〜d)を含むサイクル全体の中で、ステップa)〜d)の一部を含む部分サイクルが繰り返し実行されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記繰り返し実行される部分サイクルが、前記ステップb)及びc)を含んでいることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 前記繰り返し実行される部分サイクルが、前記ステップa)、b)及びc)を含んでいることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 前記第1状態(Z1、A1、A2、A3)の読取りから得られる測定信号(8)が、試験信号(7)の照射の間にのみおよび/または照射直後まで実行されることを特徴とする請求項1乃至請求項4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記測定信号(8)を検出するための検出器が、個別の一連のステップと同期化されることを特徴とする請求項1乃至請求項5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記測定信号(8)を検出するための検出器の上流側に配置されるシャッタが、個別の一連のステップと同期化されることを特徴とする請求項1乃至請求項6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記検出器として、CCDカメラまたはEMCCDカメラが使用されていることを特徴とする請求項6または請求項7に記載の方法。
- 前記検出器として、光電子増倍管またはアバランシェフォトダイオード(APD)が使用されていることを特徴とする請求項6または請求項7に記載の方法。
- 前記検出器として、検出器アレイ、好ましくは、APDアレイが使用されていることを特徴とする請求項6または請求項7に記載の方法。
- 前記ステップa)とb)が、同時に、または、少なくとも一部で時間的に重なるように実行されることを特徴とする請求項1乃至請求項10のいずれか1項に記載の方法。
- 撮像の進行が、検流計スキャナ、音響光学偏向器、MEMS、または、圧電機械素子によって行われることを特徴とする請求項1乃至請求項11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記個別の一連のステップが、画素クロックおよび/または撮像進行と同期化されることを特徴とする請求項12に記載の方法。
- 前記同期化が、AOTFおよび/またはAOMによって、および/または電子的に、および/または機械的なシャッタによって、実行されることを特徴とする請求項13に記載の方法。
- 前記個々のステップの間に、指定可能な遅延が設定されることを特徴とする請求項1乃至請求項14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記個々のステップの間の遅延、および/または個々のステップ自体の持続時間が、異なる長さに調整されることを特徴とする請求項15に記載の方法。
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