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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur räumlich hochauflösenden Untersuchung
von Proben, vorzugsweise unter Verwendung eines Laser-Raster-Fluoreszenzmikroskops,
wobei die zu untersuchende Probe eine Substanz umfasst, die wiederholt von
einem ersten Zustand in einen zweiten Zustand überführbar ist, wobei sich die ersten
und die zweiten Zustände
in mindestens einer optischen Eigenschaften voneinander unterscheiden,
umfassend die folgenden Schritte:
- a) Mittels
eines Schaltsignals wird die Substanz in einem zu erfassenden Probenbereich
in den ersten Zustand gebracht,
- b) mittels eines optischen Signals wird der zweite Zustand induziert,
wobei innerhalb des zu erfassenden Probenbereichs räumlich begrenzte
Teilbereiche gezielt ausgespart werden,
- c) mittels eines Testsignals werden die verbliebenen ersten
Zustände
ausgelesen, und
- d) die Schritte a) bis c) werden wiederholt, wobei das optische
Signal zur Rasterung der Probe bei jeder Wiederholung verschoben
wird.
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Verfahren
der eingangs genannten Art sind aus der Praxis bekannt. Grundsätzlich ist
gemäß dem Abbe'schen Gesetz der
räumlichen
Auflösung abbildender
optischer Verfahren durch die Beugungsgrenze eine theoretische Grenze
gesetzt, wobei die Beugungsgrenze von der Wellenlänge des verwendeten
Lichts abhängt.
Mit den hier in Rede stehenden Verfahren lassen sich allerdings
räumliche
Auflösungen
erzielen, die über
die nach Abbe bekannte theoretische Beugungsgrenze hinaus verbessert
sind.
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Bei
den bekannten Verfahren werden hierzu in zu untersuchenden Proben
Substanzen bereitgestellt, die wiederholt von einem ersten Zustand
in einen zweiten Zustand überführbar sind,
wobei sich die ersten und die zweiten Zustände in mindestens einer optischen
Eigenschaft voneinander unterscheiden. Bei den meisten bekannten
Verfahren handelt es sich bei dem ersten Zustand um einen fluoreszenzfähigen Zustand
(im Folgenden Zustand A genannt) und bei dem zweiten Zustand um
einen nicht fluoreszenzfähigen
Zustand (im Folgenden Zustand B). Nachdem die Substanz in einem
zu erfassenden Probenbereich mittels eines Schaltsignals in den
fluoreszenzfähigen
Zustand A gebracht worden ist, wird mittels eines optischen Signals
in räumlich
begrenzten Teilbereichen des zu erfassenden Probenbereichs Zustand
B induziert und somit eine Unterdrückung der Fluoreszenz von Fluores zenzmolekülen erzeugt.
Der physikalische Prozess der Fluoreszenzunterdrückung kann dabei sehr unterschiedlicher
Natur sein. So ist bspw. die stimulierte Emission aus dem zuvor angeregten
Zustand oder eine optisch induzierte Strukturänderung der Fluoreszenzmoleküle bekannt.
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Entscheidend
ist, dass der durch ein optisches Signal induzierte Übergang
von dem ersten in den zweiten Zustand im Probenvolumen in großen Bereichen
gesättigt,
d.h. vollständig,
stattfindet, und in mindestens einem Teilbereich des Probenvolumens
gerade nicht stattfindet, indem dort das optische Schaltsignal gezielt
nicht eingestrahlt wird. Dieser Effekt kann durch das Erzeugen einer
Intensitätsnullstelle
des optischen Signals erreicht werden. An der Nullstelle und in
deren unmittelbarer Umgebung findet kein Übergang in den zweiten Zustand
(im Allgemeinen der nicht fluoreszierende Zustand B) statt, so dass
der erste Zustand (im Allgemeinen der fluoreszierende Zustand A)
erhalten bleibt. Eine Sättigung
des Übergangs
A → B durch
das optische Signal führt
in den beleuchteten Bereichen des zu erfassenden Probenbereichs
bereits in naher Umgebung der Intensitäts-Nullstellen zu einem (nahezu)
vollständigen
Transfer in den Zustand B. Je stärker
der Prozess in die Sättigung
getrieben wird, d.h. je mehr Energie durch das optische Signal in
die Bereiche um die Nullstelle herum eingebracht wird, desto kleiner wird
der Bereich mit Fluoreszenzmolekülen
im fluoreszenzfähigen
Zustand A bzw. allgemein in einem „leuchtfähigen" Zustand. In Abhängigkeit vom Sättigungsgrad
in der unmittelbaren Nullstellen-Umgebung kann dieser Bereich prinzipiell
beliebig klein gemacht werden. Folglich lassen sich Regionen des
Zustands A markieren, die beliebig viel kleiner sind als die kleinsten
aufgrund der Beugungsgrenze möglichen
Regionen eines aufgebrachten optischen Signals. Wird der Bereich
des Zustands A anschließend ausgelesen,
z.B. durch Einstrahlen eines Testsignals, so stammt das (Fluoreszenz-)Messsignal aus einem
definierten Bereich, der kleiner sein kann als es die Beugungsgrenze
zulässt.
Wird die Probe auf die beschriebene Art Punkt für Punkt abgerastert, so entsteht
ein Bild mit einer Auflösung
die besser ist, als es die Beugungstheorie erlaubt.
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Verfahren,
der hier beschriebenen Art, bei denen als Unterschied zwischen zwei
Zuständen
die optische Eigenschaft fluoreszenzfähig/nicht fluoreszenzfähig ausgenutzt
wird, sind bspw. aus der
DE 103
25 459 A1 und der
DE
103 25 460 A1 bekannt. Bei diesen Verfahren werden Fluoreszenzmoleküle mit Hilfe
eines optischen Signals von einem Zustand A (fluoreszenzfähig) in
einen Zustand B (nicht fluoreszenzfähig) gebracht, wobei bei dem Übergang
A → B die
Sättigung
erreicht wird. Die in dem fluoreszenzfähigen Zustand A verbleibenden
Bereiche der Probe resultieren jeweils aus einem eine Nullstelle aufweisenden
Intensitätsminimum
des eingestrahlten optischen Signals. Die Intensitätsminima
sind Teil eines Interferenzmusters. Das Abrastern der Probe erfolgt
durch Verschiebung der Intensitätsminima
des optischen Signals, wobei die Verschiebung durch Phasenverschiebung
der interferierenden Strahlen bewirkt wird.
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Bei
den bekannten Verfahren ist nachteilig, dass ein Übersprechen,
bspw. zwischen dem Testsignal und dem optischen Signal oder zwischen
dem Testsignal und dem Schaltsignal, eine signifikante Reduktion
der Auflösung
zur Folge haben kann. So kann durch ein Übersprechen insbesondere eine
Intensitätsreduktion
des Fluoreszenzmesssignals bewirkt werden, oder es kann zu einer
Signaldetektion kommen, die keinem tatsächlichen Messsignal entspricht.
Darüber
hinaus ist bei den bekannten Verfahren die Einstrahlzeit für die einzelnen
Signale während
eines Zyklus limitiert, falls mit dem optischen Schaltsignal oder
dem Testsignal ein spontaner Übergang
konkurriert.
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Der
vorliegenden Erfindung liegt nunmehr die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren
der eingangs genannten Art anzugeben, wonach mit einfachen und kostengünstigen
Mitteln die negativen Folgen von Übersprechern weitestgehend
vermieden sind und wonach eine dauerhaft hohe Auflösung erreicht ist.
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Erfindungsgemäß ist die
voranstehende Aufgabe durch ein Verfahren mit den Merkmalen des
Patentanspruchs 1 gelöst.
Danach ist das Verfahren derart ausgestaltet und weitergebildet,
dass die einzelnen Schritte a) bis d) in einer an die jeweilige Messsituation
angepassten Reihenfolge durchgeführt
werden.
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In
erfindungsgemäßer Weise
ist zunächst
erkannt worden, dass sich das Auftreten von Übersprechern äußerst nachteilig
auf die maximal zu erreichende Auflösung auswirken kann. In einem
nächsten
Schritt ist erkannt worden, dass die Übersprecher aufgrund einer
gegenseitigen Beeinflussung der zyklisch eingestrahlten Signale
zur Folge haben können,
dass die Zustände
der Substanz innerhalb der Probe zur Erzielung einer maximalen Auflösung nicht optimal
eingestellt sind. Schließlich ist
erfindungsgemäß erkannt
worden, dass die beschriebenen Probleme in einfacher Weise dadurch
vermieden werden können,
dass die einzelnen Schritte a) bis d) anstelle einer starren zyklischen
Abfolge in einer an die jeweilige Messsituation angepassten Reihenfolge
durchgeführt
werden.
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Im
Rahmen einer konkreten Ausführungsform
kann bspw. vorgesehen sein, dass innerhalb des Gesamtzyklus, der
die Schritte a) bis d) umfasst, ein Teilzyklus wiederholt ausgeführt wird,
wobei der Teilzyklus lediglich eine Teilmenge der Schritte a) bis d)
umfasst. So kann bspw. ein Teilzyklus umfassend die Schritte b)
und c) wiederholt ausgeführt
werden. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn das Testsignal
nicht nur zur Aussendung eines Messsignals, sondern auch zu einem
Umschalten von zweiten Zuständen
in erste Zustände
führt.
Durch eine wiederholte Ausführung
der Schritte b) und c) kann dann sichergestellt werden, dass sich
die Probe in einem ausreichenden Maß im zweiten Zustand befindet.
Die Schrittabfolge findet demnach wie folgt statt: a), b), c), b),
c), b), c), ... d).
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In
einer anderen Messsituation wird bevorzugt ein Teilzyklus umfassend
die Schritte a), b) und c) wiederholt ausgeführt. Eine derartige Wiederholung
erweist sich als vorteilhaft, wenn das Testsignal nicht nur zur
Aussendung eines Messsignals, sondern auch zu einem Umschalten von
ersten Zuständen
in zweite Zustände
führt.
Durch die wiederholte Ausführung
eines Teilzyklus mit den Schritten a), b), c) kann dann sichergestellt
werden, dass sich die Probe ausreichend im ersten Zustand befindet.
Die zu durchlaufende Schrittabfolge lautet dementsprechend wie folgt:
a), b), c), a), b), c), a), b), c), ... d).
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In
weiter vorteilhafter Weise kann eine Anpassung derart erfolgen,
dass eine Detektion von Messsignalen, die aus dem Auslesen von ersten
Zuständen
resultieren, jeweils nur während
oder kurz nach Aussendung eines Testsignals durchgeführt wird.
Hierdurch kann berücksichtigt
werden, dass auch das Schaltsignal und/oder das optische Signal zur
Aussendung eines Messsignals führen
können. Eine
Detektion des Messsignals, das durch das Schaltsignal und/oder das
optische Signal ausgelöst wurde,
ist jedoch unerwünscht,
da es nicht aus den räumlich
eng begrenzten Bereichen stammt, die nach Einstrahlen des optischen
Signals im ersten Zustand verblieben sind. Ein solches Messsignal
weist demzufolge nicht die gewünschte
räumlich
hochaufgelöste
Information auf. Durch eine Detektion von Mess signalen ausschließlich während/oder
kurz nach Aussenden des Testsignals kann eine Detektion der genannten
unerwünschten
Messsignale wirksam unterdrückt
werden.
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Alternativ
oder zusätzlich
kann ein zum Nachweis der Messsignale eingesetzter Detektor mit der
jeweiligen Abfolge der Schritte synchronisiert werden. Ebenfalls
alternativ oder zusätzlich
kann vor dem Detektor ein Verschluss angeordnet werden, wobei der
Verschluss mit der jeweiligen Abfolge der Schritte synchronisiert
werden könnte.
Der Verschluss kann dabei bspw. als mechanischer oder elektronischer
Shutter ausgeführt
sein. Ebenso ist der Einsatz von akusto-optischen Shuttern denkbar.
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Der
Detektor kann als Kamera ausgeführt sein,
wobei es sich insbesondere um eine CCD- oder eine EMCCD-Kamera handeln
kann. Der Detektor kann auch ein Photomultiplier oder eine APD (Avalanche-Photodiode)
sein. Eine Ausführung
des Detektors als Detektor-Array, insbesondere in Form eines APD-Arrays,
ist ebenfalls möglich.
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Zur
Erzielung einer möglichst
hohen Auflösung
kann es in bestimmten Messsituationen sinnvoll sein, die Schritte
a), d.h. das Einstrahlen des Schaltsignals, und b), d.h. das Einstrahlen
des optischen Signals, gleichzeitig oder zumindest teilweise zeitlich überlappend
auszuführen.
Für eine
hohe Auflösung ist
es nämlich
wichtig, dass durch Einstrahlung des optischen Signals möglichst
kleine Bereiche innerhalb der Probe entstehen, in denen die Substanz
in dem ersten Zustand verbleibt. Dies soll möglichst vollständig geschehen,
d.h. innerhalb der Bereiche soll die Substanz möglichst vollständig im
ersten Zustand verbleiben. Wenn das optische Signal keine perfekten
Intensitätsnullstellen
besitzt, sondern lediglich mehr oder weniger stark ausgeprägte Intensitätsminima
aufweist, dann führt
die Einwirkung des optischen Signals auch in den Bereichen der Intensitätsminima
zu einem – ungewollten – Umschalten
der ersten Zustände
in den zweiten Zustand. Bei einem gleichzeitigen Einwirken des optischen
Signals und des Schaltsignals ist das Verhältnis Schaltsignal/optisches
Signal an den Intensitätsminima
des optischen Signals groß.
Demzufolge verbleiben diese Bereiche auch im Fall relativ schlecht
ausgebildeter Intensitätsminima
des optischen Signals vorwiegend im ersten Zustand, wodurch die
Auflösung
verbessert wird.
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Im
Rahmen einer bevorzugten Ausführungsform
wird auch die jeweilige Abfolge der Schritte mit dem Pixeltakt und/oder
den Vortrieben der Bildaufnahme synchronisiert. Mit anderen Worten
kann sowohl die Abfolge der Schritte in der Reihenfolge a), b),
c), d) bzw. eine Abfolge in einer modifizierten Reihenfolge als
auch die Messsignaldetektion und/oder die gleichzeitige Einstrahlung
des Schaltsignals und des optischen Signals mit dem Pixeltakt und/oder den
Vortrieben der Bildaufnahme synchronisiert werden. Insbesondere
kann eine Synchronisation mit den Vortrieben in den drei Raumrichtungen
(x-, y-, z-Bildvortrieb) vorgenommen werden. Die Vortriebe der Bildaufnahme
können
dabei bspw. mittels eines Galvanometerscanners, eines akusto-optischen-Deflektors,
eines mikro-elektro-mechanischen Systems (MEMS) oder mittels piezomechanischer
Elemente realisiert werden. Die Synchronisation kann vorzugsweise
mittels AOTFs (Acusto-Optical-Tunable-Filter), AOMs (Acusto-Optical-Modulator)
und/oder elektronisch und/oder mittels mechanischer Shutter realisiert
werden.
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In
weiter vorteilhafter Weise wird zwischen den einzelnen Schritten
eine vorgebbare Verzögerung
eingestellt. Diese kann fest, aber frei wählbar sein oder kann während des
Messvorgangs dynamisch an die jeweilige Messsituation angepasst
werden. Insbesondere ist es denkbar, dass die Verzögerungen
zwischen einzelnen Schritten unterschiedlich lang eingestellt werden.
Auch eine unterschiedlich lange Dauer der einzelnen Schritte selbst,
d.h. die Einstrahldauern der jeweiligen Signale, können unterschiedlich
sein. Vorzugsweise können
sowohl die Verzögerungen
als auch die einzelnen Schrittdauern, d.h. konkret die Signaleinstrahlzeiten
bzw. Detektorauslesezeiten, vorzugsweise so gewählt werden, dass sie für alle Probenstellen
gleich sind. Dies ist insbesondere im Hinblick auf eine einfache
Bildauswertung vorteilhaft, da Umrechnungen und unterschiedliche
Gewichtungen einzelner Bildbereiche entfallen.
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Es
gibt nun verschiedene Möglichkeiten,
die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten
und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die nachgeordneten Ansprüche, andererseits
auf die nachfolgende Erläuterung
eines bevorzugten Ausführungsbeispiels
des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur räumlich
hochauflösenden Untersuchung
von Proben zu verweisen. In Verbindung mit Erläuterungen des bevorzugten Ausführungsbeispiels
anhand der Zeichnung werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen
und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigt
die einzige
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Fig.
in einer schematischen Darstellung ein Ausführungsbeispiel eines Verfahrens
zur räumlich hochauflösenden Untersuchung
von Proben.
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Die
einzige Fig. zeigt schematisch die Schritte a) bis c) eines Verfahrens,
wie es zur räumlich hochauflösenden Untersuchung
von Proben jenseits der beugungslimitierten Auflösungsgrenze eingesetzt wird.
Gemäß Teil a)
der Fig. wird zunächst
im gesamten zu erfassenden Probenraum P eine in der Probe 1 bereitgestellte
Substanz, die wiederholt von einem ersten Zustand Z1 in einen zweiten
Zustand Z2 überführbar ist,
wobei sich die ersten und die zweiten Zustände Z1, Z2 in mindestens einer
optischen Eigenschaften voneinander unterscheiden, mittels eines
Schaltsignals 2 in den ersten Zustand Z1 gebracht. Im konkret
dargestellten Ausführungsbeispiel
handelt es bei dem ersten Zustand Z1 um einen fluoreszierenden Zustand
A und bei dem zweiten Zustand Z2 um einen nicht fluoreszierenden
Zustand B. Bei der in der Probe 1 bereitgestellten Substanz handelt
es sich in dem konkret dargestellten Beispiel um eine photochrome
Substanz, deren Moleküle durch
Bestrahlung mit Licht einer ersten Wellenlänge, dem Schaltsignal 2,
in den fluoreszenzfähigen Zustand
A gebracht werden. Dies geschieht in idealer Weise, indem die Probe 1 im
gesamten Probenraum P durch Beleuchtung durch ein Objektiv 3 mit
dem Schaltsignal 2 bestrahlt wird (Schritt a)).
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Im
Falle der Grundzustands-Entvölkerung (Ground
State Depletion, GSD) findet der Übergang in den fluoreszenzfähigen (Singlet)-Zustand üblicherweise
spontan statt. Das Einstrahlen optischer Schaltsignale erübrigt sich
somit in diesem Fall, es müssen
lediglich Wartezeiten von typischerweise 1 bis 100 μs (teilweise
auch ein wenig länger)
berücksichtigt
werden.
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In
einem nächsten
Schritt – Schritt
b), dargestellt in Teil b) der Fig. – wird Licht einer anderen
Wellenlänge,
das so genannte optische Signal 4, auf den zu erfassenden
Probenbereich P aufgebracht. Dies geschieht in Form einer Lichtstruktur
mit definierten Intensitäts-Nullstellen 5.
Das optische Signal 4 induziert gesättigt den Übergang A → B in allen mit Licht des optischen
Signals 4 beleuchteten Bereichen 6. Mit anderen
Worten verbleiben lediglich in unmittelbarer Umgebung der Intensitäts-Nullstellen 5 eng
definierte Bereiche der Substanz im Zustand A. Die verbleibenden
Bereiche A1, A2,
A3, ... der Substanz in Zustand A können viel
kleiner sein als die Dimensionen der Lichtstruktur des optischen
Signals 4 selbst, d.h. konkret viel kleiner als beugungslimitierte
Strukturen. Die Größe der im
Zustand A verbleibenden Bereiche A1, A2, A3, ... der Substanz
hängt ganz
maßgeblich
von der Qualität
der Intensitätsminima 5 und damit
vom erreichten Sättigungsgrad
des Übergangs A → B ab.
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In
Teil c) der Fig. ist schematisch der Auslesevorgang des Zustands
A dargestellt. Dazu wird ein optisches Testsignal 7 so
in den zu erfassenden Probebereich P eingestrahlt, dass diejenigen
gemäß Teil b)
der Fig. in Schritt b) präparierten
Bereiche, in denen die Substanz in Zustand A verblieben ist, erfasst werden.
Eventuell noch existierende Bereiche der Substanz im Zustand A,
die außerhalb
des zu erfassenden Probenbereichs P liegen, dürfen dabei nicht erfasst werden.
Das von der Substanz im Zustand A ausgehende Fluoreszenzlicht wird
als Messsignal 8 von einem Detektor (nicht gezeigt) erfasst,
wobei eine eindeutige Zuordnung der detektierten Messsignale 8 zu
den Einzelbereichen A1, A2,
A3, ... vorgenommen wird.
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Die
in der Fig. dargestellten Schritte a) bis c) werden wiederholt,
wobei das optische Signal 4 zur Rasterung der Probe 1 bei
jeder Wiederholung verschoben wird (Schritt d)). Erfindungsgemäß werden die
einzelnen Schritte a) bis d) nicht in einem starren Zyklus mit fest
vorgegebener Reihenfolge durchlaufen, sondern vielmehr in einer
an die jeweilige Messsituation angepassten Reihenfolge durchgeführt.
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Hinsichtlich
weiter vorteilhafter Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird zur Vermeidung von Wiederholungen auf den allgemeinen Teil
der Beschreibung sowie auf die beigefügten Patentansprüche verwiesen.
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Schließlich sei
ausdrücklich
darauf hingewiesen, dass das voranstehend beschriebene Ausführungsbeispiel
lediglich zur Erörterung
der beanspruchten Lehre dienen, diese jedoch nicht auf das Ausführungsbeispiel
einschränkt.