-
Thema
-
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung von Abklingfunktionen und Lebensdauer-Bildern der Phosphoreszenz oder anderer langlebiger Lumineszenzprozesse mit Hilfe von Laser-Scanning-Systemen. Das Verfahren ist darüber hinaus in der Lage gleichzeitig, d. h. während des gleichen Scan-Prozesses, Fluoreszenz-Lifetime-Imaging (FLIM) Daten zu liefern. Das Verfahren kann in Verbindung mit konfokalen und nicht-konfokalen Scanning-Systemen sowie Scanning-Systemen mit Mehrphotonen-Anregung eingesetzt werden.
-
Stand der Technik
-
Als Technik zur Aufzeichnung von Fluorescence-Lifetime-Imaging-Daten (FLIM-Daten) biologischer Objekte hat sich besonders die Kombination von Laser-Scanning-Systemen, insbesondere von Laser-Scanning-Mikroskopen, mit der Methode der mehrdimensionalen zeitkorrelierten Einzelphotonenzählung (Time-Correlated Single-Photon Counting, TCSPC) verbreitet [2]. Die Methode ist eine Erweiterung der klassischen TCSPC-Technik [1] und beruht darauf, dass für die einzelnen Photonen des detektierten Signals eine Reihe von Parametern bestimmt werden, über denen Verteilungen der Photonendichte aufgebaut werden. Der Einsatz der Methode als FLIM-Technik in Verbindung mit Laser-Scannern hat eine Reihe von Vorteilen, die insbesondere zur Untersuchung biologischer Proben von Bedeutung sind:
TCSPC in Verbindung mit Laser-Scanning und konfokaler Detektion ermöglicht die Aufnahme von FLIM-Bildern aus definierten Ebenen der Probe. Durch zusätzliches Scannen in Z-Richtung werden dreidimensionale (3D) FLIM-Daten erhalten.
-
Laser Scanning in Verbindung mit Zweiphotonen- oder Multiphotonenanregung liefert Bilder aus tiefen Ebenen der Probe, und entsprechend tiefere 3D Daten.
-
Laser-Scanning in Verbindung mit Zweiphotonen- oder Multiphotonenanregung ist schonend für lebende Objekte, da die Anregung auf die unmittelbare Nähe der Fokalebene beschränkt ist.
-
Die Kombination von Laser-Scanning und TCSPC liefert eine nahezu ideale Effizienz der Lifetime-Messung, d. h. ein bestimmtes Signal-Rausch-Verhältnis wird mit der minimal möglichen Anzahl von Photonen erreicht.
-
Die Zeitauflösung der TCSPC-Technik ist im wesentlichen durch die Laufzeitunterschiede der Ladungsträger im Detektor bestimmt, nicht durch die Breite der 'Single-Electron Response'. Dadurch werden Zeitauflösungen im ps-Bereich erreicht.
-
Multi-exponentielle Fluoreszenz-Abklingprofile können gemessen und in ihre Bestandteile aufgelöst werden.
-
TCSPC-FLIM-Daten können gleichzeitig in mehreren Wellenlängen-Kanälen aufgezeichnet, d. h. spektral aufgelöst werden.
-
FLIM-Systeme, die auf der Kombination von Laser-Scanning und TCSPC beruhen, sind damit ausgezeichnet geeignet zur Bestimmung von Fluoreszenz-Lebensdauern im unteren ns und in ps Bereich, wie sie für organische Fluorophore typisch sind. Es existieren jedoch weitere Relaxationsmechanismen, die zu wesentlich längeren Lumineszenz-Lebensdauern führen. Die meisten dieser Vorgänge beruhen auf verbotenen Triplet-Übergängen und werden dann als Phosphoreszenz bezeichnet. Im folgenden soll unabhängig vom genauen Mechanismus der Begriff 'Phosphoreszenz' für alle langlebigen Lumineszenzvorgänge verwendet werden.
-
Die Bestimmung von Phosphoreszenz-Lebensdauern stößt insbesondere in Laser-Scanning-Systemen auf eine Reihe von Problemen. Offensichtlich ist, dass der zeitliche Abstand der Anregungsimpulse wesentlich länger sein muss als die Phosphoreszenz-Lebensdauer. Die Folgefrequenz der Anregungsimpulse muss deshalb um Größenordnungen geringer sein als bei Fluoreszenz-Lifetime-(FLIM)-Experimenten mit organischen Fluorophoren. Für eine gegebene Impulsleistung und zeitliche Breite der Anregungsimpulse wird dadurch die mittlere Anregungsleistung entsprechend gering. Der Verlust an mittlerer Anregungsleistung könnte im Prinzip durch eine Erhöhung der Impulsleistung oder eine Erhöhung der Impulsbreite ausgeglichen werden. Eine Erhöhung der Impulsleistung stößt aber an Materialgrenzen bei den verwendeten Laser. Darüber hinaus würden die notwendigen Impulsleistungen in Verbindung mit dem kleinen Anregungsvolumen im Laser-Scanning-Mikroskop zu unerwünschten nichtlinearen Effekten in der Probe führen, z. B. zur Anregung höherer Energiezustände, oder sogar zur Ionisation und damit zur direkten Zerstörung. Eine Erhöhung der Impulsbreite stößt wiederum auf das Problem, dass diese bei den meisten Laser durch das Laserprinzip bestimmt ist und somit nicht willkürlich gewählt werden kann. Weiterhin sind unter Umständen längere Impulse mit dem gewählten Anregungsmechanismus nicht vereinbar. Das gilt insbesondere für die Mehrphotonen-Anregung mit fs- und ps-Lasern.
-
Als weitere Schwierigkeit treten bei Phoshoreszenzmessungen unvermeidlich auch Fluoreszenzsignale auf. Die Verwendung von kurzen, intensiven Impulsen niedriger Folgefrequenz führt dazu, dass diese Fluoreszenzsignale extrem hohe Spitzenintensitäten haben. Die Fluoreszenzsignale können für längere Zeiten den Detektor sättigen, so dass die nach der Fluoreszenz emittierten Phosphoreszenz-Photonen nicht oder nicht ungestört detektierbar sind.
-
Die niedrige Folgefrequenz führt weiterhin dazu, dass die Probe sehr langsam gescannt werden muss. Die Pixel-Zeiten müssen ausreichend lang sein, damit die Lumineszenz innerhalb der Pixel-Zeit vollständig abklingt. Das gilt insbesondere für konfokale Systeme. Hier muss streng genommen gewährleistet sein, dass während der Lumineszenz-Lebensdauer die Änderung der Position klein bleibt gegen den Durchmesser des konfokalen Volumens. Außerdem muss gewährleistet bleiben, dass wenigstens einige hundert Anregungszyklen pro Pixel gemessen werden. Ist das nicht der Fall, gibt es Interferenzen zwischen der Laser-Wiederholfrequenz und der Pixel-Frequenz. Diese führen zu Moire-Effekten in den Bildern. Diese Anforderungen an die Länge der Pixel-Zeiten führen zu inakzeptabel langen Scan-Zeiten.
-
Aus den oben genannten Schwierigkeiten resultiert weiterhin, dass Fluoreszenz-Daten und Phosphoreszenz-Daten nicht gleichzeitig gemessen werden können. Es gibt aber durchaus Anwendungen, wo genau das erforderlich ist. Denkbar wäre z. B. die Messung der Fluoreszenz von NADH und FAD in biologischen Proben in Verbindung mit der Phosphoreszenz-Lebensdauer von Phosphoreszenzmarkern, die auf Verbindungen der seltenen Erden beruhen. Aus der Fluoreszenzintensität und der Fluoreszenzlebensdauer können NADH/FAD-Redox-Ratios und Bindungsverhältnisse, aus der Phosphoreszenz-Lebensdauer des Markers die Sauerstoff-Sättigung ermittelt werden. Diese Werte können dann unmittelbar verglichen und in ihrer gegenseitigen Abhängigkeit untersucht werden.
-
Zur Messung von Phosphoreszenz-Lebendauern in Laser-Scanning-Mikroskopen ist vorgeschlagen worden, in einem konfokalen System das Pinhole in Zeilenrichtung so gegen die Anregungsposition zu versetzen, dass die Phosphoreszenz verzögert gemessen wird [3]. Aus der Abnahme der Intensität mit dem Pinhole-Versatz kann dann die Lebensdauer ermittelt werden. Das Verfahren löst zwar im Prinzip des Problem der Messung langer Lebensdauern im Scanning-Mikroskop, erreicht aber weder eine gute Photonen-Effizienz, noch ist es in der Lage, gleichzeitig schnelle Fluorezenz-Lebensdauern zu bestimmen. Der größte Nachteil ist, dass die Resultate von den Parametern des Mikroskopobjektives und von den optischen Eigenschaften der Probe abhängen.
-
Ein anderes, in
DE 10 2008 018 475 A1 vorgeschlagenes Verfahren benutzt rechteckförmig moduliertes Anregungslicht von variabler Modulation-Impulsbreite. Zur Vermeidung von Bild-Artefakten wird auf die Möglichkeit der Synchronisation mit dem Scan-Vorgang hingewiesen. Die zeitaufgelöste Detektion erfolgt mit einer gegateten bzw. modulierten Kamera. Durch Anpassung der Impulsbreite lassen sich damit im Prinzip sowohl Fluoreszenz- als auch Phosphoreszenz-Lifetime-Daten aufzeichnen. Es ist jedoch nicht möglich, Fluoreszenz- und Phosphoreszenz-Lifetime-Daten gleichzeitig zu gewinnen. Als weitere Nachteil ist anzuführen, dass Fluoreszenz-Lifetime-Messungen mit rechteckförmiger Modulation prinzipiell eine geringere Genauigkeit der Fluoreszenz-Abklingparameter liefern als solche, die zur Anregung kurze Impulse verwenden. Das gilt insbesondere für multi-exponentielle Abklingvorgänge [2].
-
In der Druckschrift
DE 199 56 620 A1 wird die Bestimmung von Lumineszenz-Lifetimes durch eine Modulationstechnik beschrieben. Dazu wird (in bekannter Weise) die Anregungsstrahlung moduliert und die Phasenverschiebung und der Modulationsgrad der Lumieszenz gemessen. Die Signalaufzeichung erfolgt also in der Frequency-Domain. Eine gleichzeitige Messung von Fluoreszenz- und Phosphoreszenz-Lifetime-Bildern ist nicht möglich.
-
Die Offenlegungsschrift
DE 10 2008 018 476 A1 beschreibt Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) durch Photonenzählung mit ortsaufgelöstem Detektor. Das beschrieben Verfahren ist nicht zur gleichzeitigen Lifetime-Detektion in stark unterschiedlichen Zeitbereichen geeignet. Das Verfahren ist auch in Referenz [2] beschrieben.
-
Die Patentschrift
US 6,184,989 B1 beschreibt eine Möglichkeit zur dreidimensionalen räumlichen Auflösung einer Probe in einem speziellen Mikroskop (Laser Sheet Tomography). Die Laser-Intensität wird dabei mit dem Ziel moduliert, die Lichtintensität über ein Lock-in-Verfahren zu messen. Dieses beruht weder auf zeitkorrelierter Einzelphotonenzählung, noch liefert es Fluoreszenz- oder Phosphoreszenz-Lifetime-Bilder.
-
Beschreibung der Erfindung
-
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Aufzeichnung von FLIM-Bilder anzugeben, das den Einsatz von Luminophoren mit langen Lumineszenzlebendauern erlaubt und gleichzeitig 3D-Auflösung, hohe Photonen-Effizienz der Lebensdauerbestimmung sowie die Möglichkeit zur spektralen Auflösung bietet. Das Verfahren soll weiterhin die Anregung über Mehrphotonen-Prozesse erlauben, um Lifetime-Bilder aus tiefen Probenebenen zu gewinnen. Darüber hinaus soll das Verfahren in der Lage sein, in einer einzigen Messung gleichzeitig Phosphoreszenz-Daten im μs- und ms-Bereich als auch Fluoreszenz-Daten im ns- und/oder ps-Bereich aufzuzeichnen.
-
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß auf folgende Weise gelöst:
Es wird eine Kombination von Laser-Scanning mit mehrdimensionalem TCSPC verwendet. Zur Anregung der Lumineszenz wird ein hochfrequent gepulster Laser eingesetzt, dessen Emission jedoch im Unterschied zu bekannten Verfahren auf geeignete Weise moduliert, bzw. periodisch ein- und ausgeschaltet wird. Die Pulsperiode des Lasers selbst liegt im Bereich des zwei- bis zehnfachen der typischen Fluoreszenz-Lebensdauer von organischen Fluorophoren. Der Zeitverlauf der Modulation wird so gewählt, dass die Einschaltdauer kurz gegen die zu messende Phosphoreszenz-Abklingzeit, aber lang gegen die Pulsperiode des Lasers ist. Die Ausschaltdauer wird so gewählt, dass sie ein Vielfaches der Phosphoreszenz-Abklingzeit beträgt. Das gewählte Anregungsprinzip hat folgende Vorteile:
Zur Anregung der Phosphoreszenz werden keine Einzelimpulse, sondern Gruppen von vielen Impulsen verwendet. Die Phosphoreszenz baut sich über die Laserimpulse während der Einschaltdauer der Modulationsperiode hinweg auf. Das Abklingen der Phosphoreszenz wird über die Ausschaltdauer der Modulationsperiode hinweg gemessen. Das Verfahren verbessert das Verhältnis von Impulsleistung zu mittlerer Leistung entscheidend. Extrem hohe Impulsleistungen und/oder extrem niedrige mittlere Leistungen und die daraus resultierenden Probleme werden so vermieden. Insbesondere wird erreicht, dass das Verfahren für die Mehrphotonen-Anregung mit fs- und ps-Lasern einsetzbar ist.
-
Zur gleichzeitigen Messung der schnellen Fluoreszenz und der langsamen Phosphoreszenz wird die an sich bekannte Fähigkeit der mehrdimensionalen TCSPC-Technik benutzt, einem Photon gleichzeitig mehrere Parameter zuzuordnen [2]. Erfindungsgemäß wird jedem detektierten Photon, neben einigen anderen Parameter, eine Zeit in der Laserperiode und eine Zeit in der Modulationsperiode zugeordnet. Aus den Zeiten der Photonen innerhalb der Laserperiode wird das Abklingverhalten der Fluoreszenz, aus den Zeiten innerhalb der Modulationsperiode das Abklingverhalten der Phosphoreszenz aufgebaut. Fluoreszenz- bzw. Phosphoreszenz-Imaging-Daten werden durch den Aufbau von Photonenverteilungen über diesen Zeiten und den Ursprungskoordinaten der Photonen in der Scan-Fläche aufgebaut. Multi-Wavelength-FLIM- und Multi-Wavelength-Phosphorescence-Imaging-Daten entstehen durch den Aufbau von Photonenverteilungen über den Zeiten, den Koordinaten und der Wellenlänge der Photonen.
-
Das oben beschriebene Verfahren allein löst noch nicht das Problem möglicher Interferenzen der Anregungsimpulse mit der Pixel-Frequenz, und der daraus resultierenden Moire-Bildung. Dieses Problem wird dadurch gelöst, dass die Modulation des Lasers mit der Pixel-Frequenz des Scanners synchronisiert wird. Hier ergibt sich gegenüber der Anregung mit einzelnen Laserimpulsen ein zusätzlicher Vorteil: Eine Synchronisation der Impulsfolge des Lasers mit der Pixel-Frequenz wäre technisch schwierig, da sowohl der Laser als auch in vielen Fällen der Scanner mit eigenen, systembedingt festen Frequenzen arbeiten. Eine Synchronisation der Modulation mit der Pixel-Frequenz ist dagegen in einfacher Weise möglich, indem das Modulationssignal aus dem Pixel-Takt des Scanners abgeleitet wird.
-
Als weiterer Vorteil des hier beschriebenen Verfahrens sollte noch erwähnt werde, dass es sich problemlos in existierende Laser-Scanning-Mikroskope implementieren lässt. Zum 'Beam Blanking' während der Zeilen- und Bildrückläufe haben solche Mikroskope durchweg Möglichkeiten zur schnellen Modulation der verwendeten Laser. Die Modulation wird entweder durch optische Modulatoren, oder (bei Diodenlasern) durch direkte Modulation der Laser erreicht. Zur Anwendung des hier beschriebenen FLIM-Verfahrens ist es lediglich notwendig, die vorhandenen Modulationsmittel in modifizierter Weise zu steuern.
-
Eine besonders vorteilhafte Variante des beschrieben Verfahren ergibt sich, wenn es in einem Multiphotonen-Mikroskop mit 'Non-Descanned Detection' (auch 'Direct Detection' genannt) implementiert wird. In einem Mikroskop mit Non-Descanned Detection wird das von der Probe abgestrahlte Licht nicht, wie in einem konfokalen System, durch den Scanner zurück geführt, sondern möglichst direkt hinter dem Objektiv durch einen Strahlteiler von der Anregung getrennt und einem Detektor zugeführt. Bei dieser Art der Detektion ist das Detektionsvolumen nicht durch ein Pinhole begrenzt. Damit können nicht nur ballistische, sondern auch gestreute Photonen aus tiefen Ebenen der Probe effizient detektiert werden. In Verbindung mit dem hier vorgeschlagenen Verfahren wird erreicht, dass die Scan-Geschwindigkeit durch lange Lumineszenzlebensdauern wesentlich weniger eingeschränkt wird als bei konfokaler Detektion.
-
Ausführungsbeispiel
-
Das Verfahren soll nachfolgend anhand von 1 erläutert werden. Der Laserstrahl verweilt innerhalb eines Pixels für die Zeit Tpxl (1). Das Modulationssignal (2) schaltet den Laser für die Zeit Ton ein; für den Rest der Modulationsperiode, Toff, ist der Laser ausgeschaltet. Während der Zeit Ton emittiert der Laser eine Anzahl von Impulsen (3). Diese regen in der Probe sowohl kurzlebige Fluoreszenz als auch langlebige Phosphoreszenz an (4). Detektierte Photonen, p, werden sowohl mit der Zeit t1 innerhalb der Laserperiode als auch mit der Zeit t2 innerhalb der Modulationsperiode charakterisiert. Die TCSPC-Prozedur baut gleichzeitig zwei Photonenverteilungen auf. Eine Verteilung wird über der Zeit t1 und den Koordinaten der Scanner-Position in der Probe im Moment der Photonendetektion, die andere über der Zeit t2 und denselben Koordinaten aufgebaut. Die erste Verteilung ist ein Lifetime-Bild der Fluoreszenz, die zweite Verteilung ein Lifetime-Bild der Phosphoreszenz. Das FLIM-Bild der Fluoreszenz enthält einen geringen Anteil an Phosphoreszenz. Dieser ist in der Praxis jedoch tolerierbar, da die Spitzen-Amplitude der Fluoreszenz weitaus größer ist als die der Phosphoreszenz und der überwiegende Teil der Phosphoreszenz während der Zeit Toff emittiert wird, in der keine Fluoreszenz gemessen wird.
-
Modifikationen des Verfahrens sind möglich. So kann z. B. der Laser mehrmals innerhalb eines Pixels eingeschaltet werden, falls es die Phosphoreszenzlebensdauer erlaubt. Das kann dann erforderlich sein, wenn die Bilder 'undersampled' sind, d. h. die Pixelbreite größer ist als die Auflösung des optischen Systems. Der Laser kann auch ein gewöhnlicher CW-Laser sein. In diesem Falle werden keine Fluoreszenz-Lifetime-Bilder erzeugt, aber immerhin ein Fluoreszenzbild und ein Phosphoreszenz-Lifetime-Bild.
-
Es kann weiterhin der Fall eintreten, dass die Anregungswellenlängen der Fluoreszenz und der Phosphoreszenz deutlich verschieden sind. Das kann dann der Fall sein, wenn Fluoreszenz und Phosphoreszenz von verschiedenen Verbindungen herrühren. Es ist dann möglich, gleichzeitig zwei Laser verschiedener Wellenlängen zu verwenden und mit unterschiedlichen Signalen zu modulieren.
-
Spektral aufgelöste Fluoreszenz- und Phosphoreszenz-Lifetime-Bilder werden erhalten, indem die Wellenlänge der Photonen bestimmt und als zusätzlicher Parameter der entsprechenden Photonenverteilungen benutzt wird. Das Verfahren ist für die Fluoreszenz in [2] beschrieben und kann bei Anwendung des hier beschriebenen Anregungsprinzips sinngemäß auf die Phosphoreszenz übertragen werden.
