DE102008018475A1

DE102008018475A1 - Vorrichtung und Verfahren zur Lumineszenzmessung

Info

Publication number: DE102008018475A1
Application number: DE200810018475
Authority: DE
Inventors: Peter Westphal
Original assignee: Carl Zeiss AG
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2008-04-11
Filing date: 2008-04-11
Publication date: 2009-10-15
Also published as: WO2009124698A3; US20110122402A1; WO2009124698A2; US9007579B2

Abstract

Eine optische Vorrichtung zur Lumineszenzmessung umfasst einen Pulsgenerator (3) zur Erzeugung eines periodischen Modulationssignals mit rechteckförmigen Pulsen, wobei die Pulslänge der Pulse variabel einstellbar ist, Beleuchtungsmittel (18) zur Beleuchtung eines Untersuchungsobjekts (1) mit einer Anregungsstrahlung (A), welche abhängig von dem Modulationssignal pulsartig moduliert ist, und eine Laufzeitkamera (2) zur phasensensitiven Erfassung einer von dem Untersuchungsobjekt (1) in Reaktion auf die Anregungsstrahlung (A) abgegebenen Lumineszenzantwort (F), wobei der Laufzeitkamera (2) als Referenzsignal das Modulationssignal zugeführt ist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung sowie ein Verfahren zur Lumineszenzmessung, insbesondere zur Bestimmung von Lumineszenzlebensdauern, d. h. der Lebensdauer von elektronisch angeregten Zuständen von fluoreszierenden oder phosphoreszierenden Stoffen. Die Erfindung ist einsetzbar im Bereich der Weitfeldmikroskopie oder im Zusammenhang mit mikroskopartigen medizinischen Untersuchungssystemen, wie z. B. einer Funduskamera, oder einem Operationsmikroskop.
Bei Untersuchungsverfahren unter Verwendung von mikroskopartigen Anordnungen ist es bekannt, die Lumineszenzlebensdauer, insbesondere die Fluoreszenzlebensdauer, bestimmter Stoffe, sogenannter Fluorophore zu untersuchen, um auf diese Weise zusätzliche Informationen über das untersuchte Objekt, z. B. die nähere chemische Umgebung eines Fluorophors zu gewinnen. Im Bereich der Mikroskopie wird diese Technik üblicherweise mit FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, bildgebende Fluoreszenzlebenszeitmikroskopie) bezeichnet. Bildgebende Messungen der Fluoreszenzlebensdauer werden darüber hinaus im medizinischen Bereich verwendet, z. B. zur Diagnose am Auge, an der Haut sowie an anderen Organen. Beispielsweise werden zur medizinischen Diagnose am Auge Funduskameras eingesetzt. Andere medizinische Untersuchungsvorrichtungen, welche in diesem Zusammenhang Anwendung finden, sind Operationsmikroskope oder dergleichen. Auch wenn sich die genannten medizinischen Untersuchungsgeräte in ihrer Gestalt mitunter erheblich von herkömmlichen Mikroskopen unterscheiden, können sie allgemein als mikroskopartige optische Vorrichtungen bezeichnet werden.
FLIM-Messungen werden in der Regel alternativ oder ergänzend zu intensitätsbasierten Fluoreszenzmessungen durchgeführt, da aus ihnen zusätzliche Informationen über die Fluorophore und deren chemische Umgebung gewonnen werden kann. Beispielsweise können FLIM-Messungen vorteilhaft eingesetzt werden, wenn sich die Anregungs- und Emissionsspektren verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe nur wenig unterscheiden. Hier kann dann die Tatsache ausgenutzt werden, dass Fluoreszenzfarbstoffe mit sehr ähnlichen Spektren deutlich unterschiedliche Fluoreszenzlebensdauern aufweisen können. Weiterhin ist möglich, dass die zu untersuchenden Fluo reszenzsignale von unspezifischen Autofluoreszenzsignalen des untersuchten Materials überlagert werden. Da jedoch mit der Autofluoreszenz meistens eine deutlich kürzere Fluoreszenzlebensdauer verbunden ist als beispielsweise die Fluoreszenzlebensdauern von gezielt eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffen, kann durch FLIM-Messungen eine Unterscheidung zwischen Autofluoreszenz, beispielsweise einer Gewebeprobe, und der Fluoreszenz von in die Gewebeprobe eingebrachten Fluoreszenzfarbstoffen getroffen werden. Darüber hinaus ist es möglich, die Autofluoreszenz von biologischen Gewebeproben selbst zu untersuchen, beispielsweise um gesunde von krankhaft veränderten Gewebebereichen zu unterscheiden.
Weiterhin können FLIM-Messungen eingesetzt werden im Zusammenhang mit FREI-Experimenten (FREI: Fluorescence Resonance Energy Transfer), bei welchen die Energie eines angeregten Moleküls auf ein anderes Molekül übergehen kann.
Bei der Messung von Fluoreszenzlebensdauern ist es bekannt, Messverfahren einzusetzen, welche in der Zeitdomäne arbeiten, d. h. sogenannte „Time-Domain”-Verfahren, oder Verfahren, welche in der Frequenzdomäne arbeiten, d. h. sogenannte „Frequency-Domgin”-Verfahren.
Bei den Zeitdomänenverfahren wird als Quelle für die Anregungsstrahlung typischerweise ein gepulster Laser verwendet, welcher Pulse im Femtosekunden- bis Pikosekundenbereich aussendet. Es wird dann die Fluoreszenzabklingkurve an einem bestimmten Punkt der Probe ermittelt. Zu diesem Zweck wird die Probe über einen Zeitraum, welcher eine größere Anzahl von Laserpulsen umfasst, mit dem Laserlicht bestrahlt. Die Fluoreszenzantwort der Probe kann dann beispielsweise über ein Verfahren auf Basis von zeitkorrelierter Einzelphotonenzählung („Time-Correlated Single Photon Counting”) analysiert werden. Dabei wird für jedes Fluoreszenzphoton gemessen, wie lang die Zeit zwischen Anregungspuls und Detektion des Fluoreszenzphotons ist. Bei einer großen Anzahl von detektierten Fluoreszenzphotonen ergibt sich so ein Histogramm, welches die Fluoreszenzabklingkurve direkt wiedergibt. Dieses Verfahren kann beispielsweise in Verbindung mit einem konfokalem Laser-Scanning-Mikroskop eingesetzt werden, bei welchem die Probe zur Bildaufnahme abgerastert wird. Es ist jedoch auch möglich, das Verfahren in Verbindung mit einer Weitfeldbeleuchtung einzusetzen und eine zeitfenstergesteuerte Erfassung, eine sogenannte „Time-Gated Detection” zu verwenden. Hierbei wird z. B. eine Mikrokanalplatte vor einem CCD-Feld (CCD: Charge Coupled Device) angeordnet. Die Verstär kungseigenschaften der Mikrokanalplatte können durch zeitliche Variation von Beschleunigungsspannungen im Nanosekundenbereich beeinflusst werden. Auf diese Weise ist es möglich, Zeitfenster zur Erfassung der Fluoreszenzstrahlung zu definieren. Durch Verwendung von zwei verschiedenen Zeitfenstern ist es möglich, einen monoexponentiellen Abklingvorgang zu analysieren. Die technische Realisierung eines „Time-Domain”-Verfahrens ist jedoch typischerweise technisch komplex und kostenintensiv.
Bei den Frequenzdomänenverfahren wird die Anregungsstrahlung periodisch moduliert, wobei die Modulation meist sinusförmig mit Frequenzen im Kilohertzbereich bis Gigahertzbereich erfolgt. Zur Erzeugung der Anregungsstrahlung kann z. B. ein elektrooptischer Modulator oder ein akustooptischer Modulator in Verbindung mit einem CW-Laser (CW: Continuous Wave) verwendet werden. Alternativ kann ein im Pikosekundenbereich gepulster Laser verwendet werden.
Die beiden genannten Verfahrenstypen zur Messung von Fluoreszenzlebensdauern sind ausführlicher beschrieben in „Handbook of biological confocal microscopy", 2nd Edition 1995, Edited by James B. Poley, Plenum Press.
In der EP 1 162 827 A2 werden eine Messanordnung und ein Verfahren vorgeschlagen, bei welchen in den Detektionsprozess eines CCD-Sensors derart eingegriffen wird, dass eine phasensensitive Messung möglich ist. Zur Erzeugung der Anregungsstrahlung wird vorgeschlagen, eine Blau emittierende LED (LED: Light Emitting Diode, Leuchtdiode) zu verwenden, die mit Frequenzen im Kilohertzbereich moduliert ist. Der verwendete CCD-Sensor erfordert jedoch spezielle Modifikationen, welche für eine praktische Anwendung in der Mikroskopie oder medizinischen Diagnostik einen hohen Aufwand und hohe Kosten bedeuten.
In der US 2007/0057198 A1 wird ein Verfahren zur Messung von Fluoreszenzlebensdauern beschrieben, bei welchem die Intensität der Anregungsstrahlung periodisch gewechselt wird. Das Verfahren wird bevorzugt im Zusammenhang mit einem Laser-Scanning-Mikroskop eingesetzt.
In Schwarte, R., „Dynamic 3D-Vision", International Symposium an Electron Devices for Microwave and Optoelectronic Applications 2001, Vienna, Austria, 15–16 Nov. 2001 wird die Funktionsweise einer Laufzeitkamera beschrieben, welche als Photo nic-Mixer-Device (PMD) bezeichnet wird. Es wird darauf hingewiesen, dass solche Laufzeitkameras auch im Rahmen von FLIM-Messungen einsetzbar sind.
In der EP 1 746 410 A1 wird die Verwendung eines so genannten „Lock-In-Imagers” bei FLIM-Messungen vorgeschlagen. Die Funktionsweise dieses Lock-In-Imagers entspricht im Wesentlichen derjenigen einer Laufzeitkamera. Speziell wird vorgeschlagen, eine Mikroskopanordnung mit einer Dunkelfeldbeleuchtung zu verwenden. Die Anregungsstrahlung wird mittels einer Laserdiode oder mit LED erzeugt.
Bei den bekannten Verfahren zur Bestimmung von Fluoreszenzlebensdauern bestehen jedoch Probleme dahingehend, dass in einem Untersuchungsobjekt häufig mehrere Quellen von Fluoreszenzstrahlung vorhanden sind, deren Fluoreszenzantwort sich bei der Messung überlagert. In der Regel kann daher häufig lediglich eine mittlere Fluoreszenzlebensdauer aller beteiligten Fluorophore bestimmt werden.
Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, eine verbesserte Vorrichtung sowie ein verbessertes Verfahren zur bildgebenden Lumineszenzmessung zu schaffen, bei welchen eine zuverlässige Messung von Lumineszenzlebensdauern, insbesondere Fluoreszenzlebensdauern möglich ist, auch wenn sich beispielsweise in der erfassten Lumineszenzstrahlung mehrere unterschiedliche Abklingvorgänge überlagern.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch eine Vorrichtung gemäß Patentanspruch 1 sowie durch ein Verfahren gemäß Patentanspruch 21. Die abhängigen Patentansprüche definieren bevorzugte und vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung.
Erfindungsgemäß werden somit eine Vorrichtung und ein Verfahren zur bildgebenden Lumineszenzmessung bereitgestellt. Bei der Vorrichtung kann es sich insbesondere um eine mikroskopartige optische Vorrichtung handeln, z. B. um ein Weitfeldmikroskop, ein Operationsmikroskop oder eine Funduskamera.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfasst einen elektronischen Pulsgenerator zur Erzeugung eines periodischen Modulationssignals mit rechteckförmigen Pulsen, wobei die Pulslänge der Pulse variabel einstellbar ist. Weiterhin umfasst die Vorrichtung Beleuchtungsmittel zur Beleuchtung eines Untersuchungsobjekts mit einer Anregungsstrahlung, wobei die Beleuchtungsmittel mit dem Modulationssignal angesteuert sind, um die Anregungsstrahlung abhängig von dem Modulationssignal pulsartig zu modulieren. Weiterhin umfasst die Vorrichtung eine Laufzeitkamera zur phasensensitiven Erfassung einer von dem Untersuchungsobjekt in Reaktion auf die Anregungsstrahlung abgegebenen Lumineszenzantwort, wobei der Laufzeitkamera als Referenzsignal das Modulationssignal zugeführt ist. Bei der Lumineszenzantwort kann es sich insbesondere um von einem in dem Untersuchungsobjekt enthaltenen Stoff ausgesendete Fluoreszenzstrahlung, d. h. eine Fluoreszenzantwort, handeln. Es ist jedoch auch möglich, dass es sich um von einem in dem Untersuchungsobjekt vorhandenen Stoff ausgesendete Phosphoreszenzstrahlung, d. h. eine Phosphoreszenzantwort, handelt.
Durch Verwendung einer variabel einstellbaren Pulslänge des Modulationssignals wird ermöglicht, die Lumineszenzantwort für verschiedene Pulslängen zu erfassen und damit den Parameterraum zur Auswertung der Lumineszenzantwort zu erweitern. Auf diese Weise können sich überlagernde Lumineszenzantworten mit unterschiedlicher Lumineszenzlebensdauer besser voneinander getrennt werden. Bei entsprechender Ausgestaltung der Auswertung ist es sogar möglich, die jeweiligen Lumineszenzlebensdauern getrennt voneinander zu berechnen.
In diesem Zusammenhang umfasst die Vorrichtung vorzugsweise Auswertungsmittel, welche zur Berechnung der Lumineszenzlebensdauer wenigstens eines in dem Untersuchungsobjekt enthaltenen Stoffes abhängig von einer über die Laufzeitkamera erfassten Signalstärke der Lumineszenzantwort für eine Vielzahl von Pulslängen des Modulationssignals ausgestaltet ist. Zu diesem Zweck wird vorzugsweise anhand einer für verschiedene Pulslängen des Modulationssignals bestimmten normierten Modulationstiefe der Lumineszenzantwort wenigstens eine Lumineszenzlebensdauer berechnet. Wenn in dem Untersuchungsobjekt mehrere Stoffe mit unbekannter Lumineszenzlebensdauer vorhanden sind, können mehrere dieser Lumineszenzlebensdauern oder alle Lumineszenzlebensdauern berechnet werden. Bei dieser Auswertung kann auch eine über die Laufzeitkamera erfasste Phasenlage der Lumineszenzantwort berücksichtigt werden, z. B. als Randbedingung. Die Anzahl der für die Auswertung verwendeten Pulslängen beträgt wenigstens 2, liegt jedoch vorzugsweise im Bereich der Anzahl der zu bestimmenden Lumineszenzlebensdauer oder darüber. Allgemein kann durch Erhöhung der Anzahl der verwendeten Pulslängen die Genauigkeit bei der Bestimmung der Lumineszenzlebensdauern erhöht werden.
Die bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung eingesetzten Beleuchtungsmittel umfassen vorzugsweise wenigstens eine halbleiterbasierte Strahlungsquelle, insbesondere eine LED. Vorzugsweise werden mehrere halbleiterbasierte Strahlungsquellen eingesetzt, deren Ausgangsstrahlung in einen einzigen Strahlengang für die Anregungsstrahlung eingekoppelt wird. Zu diesem Zweck umfasst die Vorrichtung vorzugsweise Mittel zur Einkopplung der jeweiligen Ausgangsstrahlung der halbleiterbasierten Strahlungsquellen in den gemeinsamen Strahlengang, welche bevorzugt durch eine Vielzahl von Farbteilern gebildet sind. Alternativ kann jedoch auch ein mechanisch betriebener Drehspiegel zum Einsatz kommen.
Die Beleuchtungsmittel sind vorzugsweise dazu ausgestaltet, das Untersuchungsobjekt flächenartig zu beleuchten, d. h. es findet eine flächenhafte Weitfeldbeleuchtung statt. Die Laufzeitkamera umfasst in diesem Fall vorzugsweise eine Vielzahl von gitterartig angeordneten Detektorelementen, so dass eine ortsaufgelöste Erfassung der Lumineszenzantwort möglich ist. Alternativ können die Beleuchtungsmittel jedoch auch für eine linienartige Beleuchtung des Untersuchungsobjekts ausgestaltet sein, wobei in diesem Fall in der Laufzeitkamera lediglich eine linienartige Anordnung von Detektorelementen vorgesehen sein kann, so dass der linienartige beleuchtete Bereich des Untersuchungsobjekts ortsaufgelöst erfasst werden kann. Die linienartige Beleuchtung kann beispielsweise durch Ausgestaltung der Beleuchtungsmittel in Form eines Linienscanners erreicht werden. Beispielsweise kann ein Laserstrahl durch bekannte Verfahren zu einer schmalen Linie geformt werden und mit Hilfe von Scanner-Spiegeln zeilenartig über die Probe geführt werden. Es versteht sich jedoch, dass auch bei einer solchen Ausgestaltung der Beleuchtungsmittel die Laufzeitkamera mit einer gitterartigen Anordnung von Detektorelementen versehen sein kann, um eine Ortsauflösung über einen ausgedehnten Flächenbereich zu ermöglichen. Weiterhin können die Beleuchtungsmittel dazu ausgestaltet sein, das Untersuchungsobjekt mit einem Lichtblatt zu beleuchten, dessen Ebene senkrecht zu der Ebene eines zur Erfassung der Lumineszenzantwort verwendeten Objektivs ausgerichtet ist. Diese Beleuchtungsvariante wird auch bezeichnet als SPIM (Selective Plane Illumination Microscopy, Mikroskopie mit selektiver Beleuchtung einer Ebene). Das Lichtblatt kann dabei auch durch einen periodisch bewegten Laserstrahl nachgebildet werden und/oder räumlich strukturiert sein.
Bei einer flächenhaften Beleuchtung des Untersuchungsobjekts umfasst die Vorrichtung vorzugsweise einen Strahlungshomogenisator, um die Anregungsstrahlung räumlich zu homogenisieren, so dass eine gleichmäßige Ausleuchtung gewährleistet ist. Zu diesem Zweck kann beispielsweise ein innen verspiegelter Hohlstab mit quadratischem Querschnitt verwendet werden. Alternativ können ein Glasstab mit quadra tischem Querschnitt oder eine oder mehrere Mikrolinsenanordnungen verwendet werden. Der Strahlungshomogenisator ist vorzugsweise derart ausgestaltet, dass alle geometrischen Strahlen von der Strahlungsquelle bis zu der untersuchten Objektebene an dem Untersuchungsobjekt den gleichen Wert haben, so dass für die Anregungsstrahlung eine homogene Laufzeit gewährleistet ist. Auf diese Weise kann eine zeitliche Verschmierung der Pulse der Anregungsstrahlung vermieden werden. Die Genauigkeit bei der Auswertung der Lumineszenzantwort wird auf diese Weise erhöht.
Darüber hinaus umfasst die Vorrichtung vorzugsweise wenigstens ein Multibandfilter zur Filterung der Anregungsstrahlung und/oder der Lumineszenzantwort. Insbesondere kann es sich hierbei um ein im Strahlengang der Anregungsstrahlung angebrachtes Anregungsfilter und ein im Strahlengang der Lumineszenzantwort angebrachtes Lumineszenzfilter handeln. Durch diese Filter kann sichergestellt werden, dass lediglich die zur Anregung benötigte Strahlung auf die Probe eingestrahlt wird und dass lediglich Strahlung im Bereich der erwarteten Lumineszenzantwort die Laufzeitkamera erreicht. Störungen bei der Erfassung der Lumineszenzantwort durch die Anregungsstrahlung, z. B. durch Blendeffekte, können so vermieden werden. Durch Verwendung von Multibandfiltern, welche mehrere Durchlassbereiche aufweisen, kann die Vorrichtung an verschiedene von den Beleuchtungsmitteln erzeugte Schwerpunktwellenlängen angepasst werden, ohne dass ein mechanischer Filterwechsel erforderlich ist.
Vorzugsweise umfasst die Vorrichtung auch Kalibrierungsmittel, welche anstelle des Untersuchungsobjekts in den Strahlengang der Anregungsstrahlung und Lumineszenzantwort einbringbar sind und eine Antwortstrahlung mit einer vorbestimmten Phasenverschiebung zu der Anregungsstrahlung erzeugen. Insbesondere können die Kalibrierungsmittel eine halbleiterbasierte Strahlungsquelle und einen Fotodetektor umfassen, wobei die halbleiterbasierte Strahlungsquelle derart angesteuert ist, dass sie eine vorbestimmte Verzögerungszeit, nachdem der Fotodetektor einen Puls der Anregungsstrahlung erfasst hat, einen Puls der Antwortstrahlung erzeugt. Vorzugsweise ist die halbleiterbasierte Strahlungsquelle zu diesem Zweck transparent und beispielsweise auf Basis einer OLED (OLED: Organic Light Emitting Diode, organische Leuchtdiode) realisiert. In diesem Fall kann der Fotodetektor bezüglich des Strahlengangs der Anregungsstrahlung hinter der halbleiterbasierten Strahlungsquelle positioniert werden, so dass ein ortsnahes Erfassen von Pulsen der Anregungs strahlung und Aussenden von Pulsen der Antwortstrahlung ermöglicht wird. Weiterhin wird die Genauigkeit der Kalibrierung erhöht.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Lumineszenzmessung umfasst die folgenden Schritte: Erzeugung eines periodischen Modulationssignals mit rechteckförmigen Pulsen, Erzeugung einer Anregungsstrahlung, welche abhängig von dem Modulationssignal pulsartig moduliert ist, Beleuchtung eines Untersuchungsobjekts mit der Anregungsstrahlung, Zuführen des Modulationssignals als Referenzsignal an eine Laufzeitkamera und phasensensitive Erfassung einer von dem Untersuchungsobjekt in Reaktion auf die Anregungsstrahlung abgegebenen Lumineszenzantwort für verschiedene Pulslängen des Modulationssignals mit der Laufzeitkamera. Das Verfahren umfasst vorzugsweise darüber hinaus die oben zum Betrieb der erfindungsgemäßen Vorrichtung beschriebenen Vorgehenswiesen.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert.
1 veranschaulicht schematisch eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur Lumineszenzmessung in Form eines Weitfeldmikroskops.
2 veranschaulicht schematisch eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur Lumineszenzmessung in Form einer Funduskamera.
3 veranschaulicht schematisch Signalformen einer Anregungsstrahlung und einer Lumineszenzantwort bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Lumineszenzmessung.
4 veranschaulicht die spektralen Transmissionseigenschaften von Farbteilern in den Vorrichtungen gemäß 1 und 2.
5 veranschaulicht schematisch eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur Lumineszenzmessung mit SPIM-Beleuchtung.
6 veranschaulicht einen beispielhaften zeitlichen Verlauf eines Pulses einer Lumineszenzantwort bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Lumineszenzmessung.
7 veranschaulicht einen beispielhaften Verlauf der normierten Modulationstiefe abhängig von der Pulslänge bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Lumineszenzmessung.
8 zeigt ein Flussdiagramm zur Veranschaulichung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Lumineszenzmessung.
9 veranschaulicht schematisch eine Kalibrierungsvorrichtung zur Verwendung im Zusammenhang mit einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Lumineszenzmessung.
10 veranschaulicht schematisch die zeitliche Lage eines Pulses der Anregungsstrahlung im Verhältnis zu einem Puls der Antwortstrahlung bei einem erfindungsgemäßen Kalibrierungsverfahren.
11 zeigt ein Flussdiagramm zur Veranschaulichung eines Kalibrierungsverfahrens bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Lumineszenzmessung.
Die Erfindung wird nachfolgend näher anhand von Ausführungsbeispielen erläutert. Diese Ausführungsbeispiele beziehen sich auf ein Weitfeldmikroskop, eine Funduskamera sowie eine Mikroskopanordnung mit SPIM-Beleuchtung. Es versteht sich jedoch, dass die beschriebenen Konzepte auch bei anderen mikroskopartigen Anordnungen anwendbar sind, beispielsweise bei anderen Arten von Forschungs- und Diagnosemikroskopen, Operationsmikroskopen oder dergleichen. Auch wenn in den nachfolgenden Ausführungen des Öfteren auf den Spezialfall von Fluoreszenz Bezug genommen wird, versteht es sich, dass die Ausführungen in entsprechender Weise auch für andere Formen der Lumineszenz gelten.
1 zeigt eine optische Vorrichtung zur Lumineszenzmessung gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung. Die Vorrichtung ist als aufrechtes Weitfeldmikroskop ausgestaltet und dient der Untersuchung eines Untersuchungsobjekts 1, z. B. einer biologischen oder einer nicht biologischen Probe. Insbesondere kann es sich bei dem Untersuchungsobjekt 1 bzw. der Probe um biologische Zellen oder Zellbestandteile, DNA, Proteine, Gewebe, menschliche oder tierische Organe, Pflanzenbestandteile oder Materialoberflächen handeln. Bei der Vorrichtung von 1 ist das Untersuchungsobjekt 1 auf einem Mikroskoptisch 16 angeordnet, welcher beispielsweise auf herkömmliche Weise in mehreren Raumrichtungen bewegbar ist.
Die Vorrichtung umfasst weiterhin Beleuchtungsmittel, welche im dargestellten Fall auf vier halbleiterbasierten Strahlungsquellen 18 mit jeweils einer LED basieren. Jeder der halbleiterbasierten Strahlungsquellen 18 erzeugt eine Ausgangstrahlung mit einer unterschiedlichen Schwerpunktwellenlänge. Die Ausgangsstrahlung der halbleiterbasierten Strahlungsquellen 18 ist jeweils über eine Kollimationslinse 19, ein lokales Anregungsfilter 20 sowie einen Farbteiler 22 in einen gemeinsamen Strahlengang für eine Anregungsstrahlung A eingekoppelt. Bei den Kollimationslinsen 19 handelt es sich bevorzugt um asphärische Linsen mit weniger als 20 mm Brennweite. Durch die Kollimationslinsen 10 wird die Ausgangstrahlung der halbleiterbasierten Strahlungsquellen 18 parallelisiert. Durch die lokalen Anregungsfilter 20 werden unerwünschte spektrale Ausläufer der Ausgangsstrahlung abgeschnitten werden. Insbesondere können zu diesem Zweck Bandpassfilter verwendet werden, so dass spektrales Übersprechen durch überlappende Spektren der Ausgangsstrahlung vermieden werden kann. Die halbleiterbasierten Strahlungsquellen 18 umfassen darüber hinaus jeweils einen Stromtreiber, welcher abhängig von einem Eingangssignal den erforderlichen Betriebsstrom zur Erzeugung der Ausgangsstrahlung erzeugt.
Die Anregungsstrahlung A ist über eine Eingangslinse 24 einem Strahlungshomogenisator 25 zugeführt und wird über eine Ausgangslinse 26 aus dem Strahlungshomogenisator 25 ausgekoppelt. Bei dem Strahlungshomogenisator 25 kann es sich um einen innen verspiegelten Hohlstab mit quadratischem Querschnitt handeln. Alternativ können auch ein Glasstab mit quadratischem Querschnitt oder eine Mikrolinsenanordnung verwendet werden. Die Anordnung des Strahlungshomogenisators 25 und der halbleiterbasierten Strahlungsquellen 18 ist derart ausgestaltet, dass sich für alle geometrischen Strahlen von den halbleiterbasierten Strahlungsquellen 18 bis zu der untersuchten Objektebene der Probe 1 im Wesentlichen der gleiche Lichtweg ergibt, so dass keine Laufzeitunterschiede auftreten. Auf diese Weise kann eine zeitliche Verschmierung von Pulsen der Anregungsstrahlung A vermieden werden.
Die aus dem Strahlungshomogenisator 25 ausgekoppelte Anregungsstrahlung A ist über ein Anregungsfilter 34 einem dichroitischen Strahlteiler 10 zugeführt, welcher die Anregungsstrahlung A über ein Objektiv 11 auf die Probe 1 lenkt.
Über das Objektiv 11 wird weiterhin eine von der Probe 1 in Reaktion auf die Anregungsstrahlung ausgesandte Lumineszenzantwort F aufgenommen und über den dichroitischen Strahlteiler 10, ein Emissionsfilter 35, eine Detektionstubusoptik 12 einer Laufzeitkamera 2 zugeführt. Zwischen dem dichroitischen Strahlteiler 10 und der Probe 1 besteht somit ein gemeinsamer Strahlengang 6 der Anregungsstrahlung A und der Lumineszenzantwort F.
Die Laufzeitkamera 2 verfügt über eine flächenhaft ausgebildete Anordnung von Detektorelementen, welche jeweils als Pixel bezeichnet werden und eine ortsaufgelöste Erfassung der Lumineszenzantwort F ermöglichen. Die Anordnung in Form eines regelmäßigen Gitters oder einer Matrix umfasst wenigstens 100 Pixel, typischerweise 128 × 128 oder 256 × 256 Pixel. Die Anzahl der Pixel kann abhängig von der gewünschten Ortsauflösung gewählt werden.
Jedes der Detektorelemente der Laufzeitkamera 2, d. h. jedes Pixel, ist ausgestaltet zur phasensensitiven Erfassung der Lumineszenzantwort. Dies bedeutet, dass die Phasenlage der Lumineszenzantwort bezüglich eines Referenzsignals und typischerweise auch die Modulationsamplitude der Lumineszenzantwort bei der Frequenz des Referenzsignals erfasst werden. Bei der Laufzeitkamera 2 kann es sich um eine kommerziell verfügbare Laufzeitkamera handeln, welche für jedes Pixel einen Entfernungswert und eine der Modulationsamplitude entsprechende Intensität ausgibt. Durch Verwendung einer kommerziell verfügbaren Laufzeitkamera 2 können die Kosten für die Gesamtanordnung reduziert werden.
Weiterhin umfasst die Vorrichtung einen elektronischen Pulsgenerator 3, welcher in 1 in unmittelbarer Nachbarschaft zu der Laufzeitkamera 2 angeordnet ist. Der Pulgenerator 3 erzeugt ein periodisches Modulationssignal mit rechteckförmigen Pulsen. Das Modulationssignal 3 ist der Laufzeitkamera 2 als Referenzsignal zugeführt. Darüber hinaus wird das Modulationssignal über hochfrequenztaugliche Signalleitungen 5 den halbleiterbasierten Strahlungsquellen 18 zugeführt, welche auf diese Weise über das Modulationssignal angesteuert werden. Bei den Signalleitungen 5 kann es sich beispielsweise um Koaxialleitungen handeln. Der Pulsgenerator 3 ist beispielsweise mittels eines elektronischen Bausteins realisiert, z. B. ein FPGA-Baustein (FPGA: Field Programmable Gate Array) oder CPLD-Baustein (CPLD: Complex Programmalbe Logic Device).
Die Stromtreiber der halbleiterbasierten Strahlungsquellen 18 nehmen über die Signalleitungen 5 das Modulationssignal auf und erzeugen den Betriebsstrom für die jeweilige LED derart, dass die Ausgangsstrahlung der halbleiterbasierten Strahlungsquellen 18 ebenfalls Pulse umfasst, deren Länge und Form im Wesentlichen derjenigen des Modulationssignals entspricht. Alternativ könnten die Stromtreiber für die halbleiterbasierten Strahlungsquellen 18 auch innerhalb des Signalgenerators 3 angeordnet sein. Die Anordnung der Stromtreiber innerhalb der halbleiterbasierten Strahlungsquellen 18 bietet jedoch den Vorteil, dass nur Signale geringer Leistung über größere Strecken übertragen werden müssen: Die Anforderungen an die Signalleitungen 5 können folglich herabgesetzt werden. Die halbleiterbasierten Strahlungsquellen 18 sind hinsichtlich ihrer dynamischen Kapazität derart ausgelegt, dass sie mit Anstiegszeiten von weniger als 1 μs, vorzugsweise weniger als 10 ns moduliert werden können. die abgegebene Strahlungsleistung liegt dabei zeitliche gemittelt bei mindestens 10 mW, vorzugsweise wenigstens 100 mW.
Die Vorrichtung umfasst darüber hinaus eine Steuer- und Auswertevorrichtung 4, welche die Steuerung der wesentlichen Funktionen der Vorrichtung bewerkstelligt. Insbesondere steuert die Steuer- und Auswertevorrichtung 4 die Funktionen der Laufzeitkamera 2 und des Pulsgenerators 3 über entsprechende Steuersignale. Weiterhin empfängt die Steuer- und Auswertevorrichtung 4 zu Auswertungszwecken die von der Laufzeitkamera 2 erfassten Signale, insbesondere ein Entfernungssignal sowie ein Intensitätssignal für jedes Pixel der Laufzeitkamera 2. Darüber hinaus kann die Steuer- und Auswertevorrichtung 4 noch weitere Funktionen der Vorrichtung steuern, beispielsweise einen automatischen Antrieb des Mikroskoptischs 16 sowie eine automatische Fokussierung des Objektivs 11. Bei der Steuer- und Auswertevorrichtung kann es sich um ein mikroprozessorbasiertes System handeln, insbesondere um ein Computersystem mit entsprechenden Ein- und Ausgabegeräten und Speichergeräten. Die Steuer- und Auswertevorrichtung 4 kann auch zur Bedienung der Vorrichtung über eine grafische Benutzeroberfläche ausgestaltet sein.
Die Ansteuerung der halbleiterbasierten Strahlungsquellen 18 über den Pulsgenerator 3 erfolgt derart, dass jede der halbleiterbasierten Strahlungsquellen 18 einzeln mit variabel einstellbarer Intensität und variabel einstellbarer Pulslänge angesteuert werden kann. Die Verwendung von variabel einstellbaren Pulslängen bei der Auswertung von Lumineszenzlebensdauern wird weiter unten näher erläutert. Die Pulslängen liegen vorzugsweise im Bereich von unter 100 ms bis zu unter 1 ns insbesondere im Bereich von 1 ns bis 100 μs. Die Modulationsfrequenz beträgt typischerweise wenigstens 1 MHz, vorzugsweise etwa 10 MHz.
Die Schwerpunktwellenlängen der vier in 1 dargestellten Halbleiterstrahlungsquellen können beispielsweise derart gewählt sein, dass eine erste halbleiterbasierte Strahlungsquelle eine Schwerpunktwellenlänge im Bereich von 600–650 nm aufweist, eine zweite halbleiterbasierte Strahlungsquelle 18 eine Schwerpunktwellenlänge im Bereich von 500–550 nm aufweist, eine dritte halbleiterbasierte Strahlungsquelle 18 eine Schwerpunktwellenlänge im Bereich von 450–490 nm aufweist und eine vierte halbleiterbasierte Strahlungsquelle eine Schwerpunktwellenlänge im Bereich von 350–410 nm aufweist. Bei diesen Schwerpunktwellenlängen sind jeweils leistungsfähige LEDs verfügbar, und ein großer Teil der bekannten Fluoreszenzfarbstoffe kann abgedeckt werden. Die Verwendung von anderen Schwerpunktwellenlängen, z. B. im Bereich zwischen 200 nm und 2000 nm, ist jedoch ebenfalls vorstellbar.
Bei der Vorrichtung von 1 wird die Ausgangsstrahlung der halbleiterbasierten Strahlungsquellen 18 über die drei Farbteiler 22 in einen einzigen Strahlengang eingekoppelt. Bei einer vergrößerten oder verkleinerten Anzahl von halbleiterbasierten Strahlungsquellen ist die Anzahl der verwendeten Farbteiler 22 entsprechend anzupassen. Allgemein ist zur Einkopplung der Ausgangsstrahlung von n halbleiterbasierten Strahlungsquellen 18 eine Anzahl von n – 1 Farbteilern 22 erforderlich.
Die halbleiterbasierten Strahlungsquellen 18 können jeweils einzeln mit einer variabel einstellbaren Intensität angesteuert werden, so dass durch Mischen der jeweiligen Ausgangsstrahlung der halbleiterbasierten Strahlungsquellen 18 ein flexibel einstellbares Spektrum der Anregungsstrahlung erreicht werden kann.
Die Transmissionsspektren der Farbteiler 22 sind vorzugsweise derart an die Schwerpunktwellenlängen der halbleiterbasierten Strahlungsquellen 18 angepasst, dass ein Maximum an Strahlungsleistung in den gemeinsamen Strahlengang eingekoppelt wird. Im Falle der Farbteiler 22 können beispielsweise einfache Dichroiten für einen Einstrahlwinkel von 45° verwendet werden, so dass für jeden Farbteiler im Wesentlichen eine Kante des Übergangs von maximaler Reflexion zu maximaler Transmission anzupassen ist. Die Verwendung anderer Farbteiler mit anderen Einstrahlwinkeln und/oder mehreren Kanten ist jedoch ebenfalls vorstellbar.
Alternativ zu der Einkopplung der jeweiligen Ausgangsstrahlung der halbleiterbasierten Strahlungsquellen 18 in den gemeinsamen Strahlengang können die halbleiterbasierten Strahlungsquellen 18 auch auf einem Kreis angeordnet werden, in dessen Zentrum sich ein Drehspiegel befindet. Die Strahlung jeder halbleiterbasierten Strahlungsquelle 18 kann dann durch entsprechende Positionierung des Drehspiegels in den gemeinsamen Strahlengang eingekoppelt werden. In diesem Fall kann jedoch stets nur die Ausgangsstrahlung einer halbleiterbasierten Strahlungsquelle 18 zur Anregung der Probe 1 verwendet werden. Weiterhin kann bei Verwendung der Farbteiler 22 eine schnellere, elektronische Umschaltung zwischen verschiedenen Anregungsspektren vorgenommen werden. Eine kombinierte Lösung aus Drehspiegel und Farbteiler ist jedoch ebenfalls vorstellbar.
Bei der Vorrichtung von 1 umfassen die halbleiterbasierten Strahlungsquellen 18 jeweils eine LED. Es ist jedoch auch möglich andere Halbleiterlichtquellen zu verwenden, beispielsweise Halbleiterlaser. Bei Verwendung eines Halbleiterlasers für eine flächenhafte Weitfeldbeleuchtung kann im Strahlengang der Anregungsstrahlung eine rotierende Streuscheibe oder ein äquivalentes Element vorgesehen sein, um bei der Weitfeldbeleuchtung so genannte Speckle-Strukturen zu vermeiden.
Die Vorrichtung kann darüber hinaus noch weitere Lichtquellen umfassen, welche in 1 nicht dargestellt sind, insbesondere eine Lichtquelle zur Erzeugung von im Wesentlichen weißem Licht, z. B. eine weiße LED, einen weißen Laser, eine Blitzlampe, eine Halogenlampe oder eine Bogenlampe. Die Ausgangsstrahlung dieser weiteren Lichtquelle kann beispielsweise vor dem Strahlungshomogenisator 25 mit Hilfe eines schwenkbaren Spiegels eingekoppelt werden. Die weitere Lichtquelle kann beispielsweise dann vorteilhaft eingesetzt werden, wenn die benötigte Schwerpunktwellenlänge für eine Lumineszenzanregung von den halbleiterbasierten Strahlungsquellen 18 nicht mit ausreichender Leistung geliefert werden kann. In dem Fall, dass die weitere Lichtquelle beispielsweise eine Halogenlampe oder eine Bogenlampe umfasst und elektronisch nicht schnell modulierbar ist, kann für diese weitere Lichtquelle ein zusätzlicher Lichtmodulator vorgesehen sein, z. B. in Form eines elektrooptischen Modulators oder eines akustooptischen Modulators. Dieser Modulator wäre dann ebenfalls mit dem von dem Pulsgenerator 3 erzeugten Modulationssignal angesteuert. In diesem Zusammenhang ist es auch möglich, die von der weiteren Lichtquelle abgegebene Ausgangsstrahlung über eine Lichtleitfaser, ein Faserbündel oder einen Flüssigkeitslichtleiter einzukoppeln. Auf diese Weise können beispielsweise Probleme aufgrund einer übermäßigen Wärmeentwicklung durch die weitere Lichtquelle vermieden werden.
2 veranschaulicht schematisch eine Vorrichtung gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung. Die Vorrichtung von 2 entspricht hinsichtlich ihrer Komponenten im Wesentlichen der Vorrichtung von 1, so dass diesbezüglich auf die entsprechenden Ausführungen zu 1 verwiesen werden kann. Im Unterschied zu der Vorrichtung von 1 ist jedoch die Vorrichtung von 2 nicht als Weitfeldmikroskop, sondern als Funduskamera ausgestaltet. Eine Funduskamera dient üblicherweise der Untersuchung des Augenhintergrunds, d. h. bei dem Untersuchungsobjekt beziehungsweise der Probe 1' handelt es sich in diesem Fall z. B. um ein menschliches Auge.
Im Fall der Funduskamera von 2 sind die Schwerpunktwellenlängen der halbleiterbasierten Strahlungsquellen 18 vorzugsweise derart gewählt, dass eine halbleiterbasierte Strahlungsquelle eine Schwerpunktwellenlänge im Bereich von 750–800 nm aufweist, z. B. zur Anregung von Indocyaningrün, dass eine halbleiterbasierte Strahlungsquelle 18 eine Schwerpunktwellenlänge im Bereich von 500–550 nm aufweist, z. B. zur Anregung von Gewebe-Autofluoreszenz, dass eine halbleiterbasierte Strahlungsquelle 18 eine Schwerpunktwellenlänge im Bereich von 450–500 nm aufweist, z. B. zur Anregung von Fluorescein oder Melanin, und das eine halbleiterbasierte Strahlungsquelle 18 eine Schwerpunktwellenlänge im Bereich von 400–490 nm aufweist, z. B. zur Anregung von Lipofuszin. Diese Auswahl der Schwerpunktwellenlängen ist jedoch nur beispielhaft, und es versteht sich, dass die Schwerpunktwellenlängen jeweils auf die zu untersuchenden endogenen oder exogenen Fluorophore abgestimmt werden kann. Typische exogene Fluorophore zur Fluoreszenzangiografie am Auge sind Fluorescein und Indocyaningrün. Eine Übersicht zu endogenen Fluorophoren im Auge und deren klinischer Bedeutung findet sich z. B. in „Tau mapping of the autofluorescence of the human ocular fundus", Schweitzer et al., Proc. SPIE Vol. 4164, p. 79–89, Laser Microscopy, Karsten Koenig; Hans J. Tanke; Herbert Schneckenburger; Eds.
Ein für klinische Untersuchungen relevantes Krankheitsbild ist zum Beispiel die altersbedingte Makula-Degeneration, bei welcher die Konzentration von Lipofuszin im Augenhintergrund ein wichtiger Indikator ist.
3 veranschaulicht beispielhaft Signalverläufe für die Anregungsstrahlung A und die Lumineszenzantwort F. In 3 ist die Zeitachse mit t bezeichnet. In 3 ist insbesondere zu erkennen, dass die Lumineszenzantwort F mit der gleichen Frequenz moduliert ist wie die Anregungsstrahlung A, jedoch die Pulse der Lumineszenzantwort F im Verhältnis zu den rechteckförmigen Pulsen der Anregungsstrahlung A verformt sind. Insbesondere ergibt sich eine Schwerpunktverschiebung der Pulse in Richtung der Zeitachse, was einer effektiven Verzögerung entspricht. Diese Verzöge rung sowie die zugehörige Modulationsamplitude der Lumineszenzantwort F sind über die Laufzeitkamera 2 der in 1 und 2 dargestellten Vorrichtungen erfassbar.
4 veranschaulicht schematisch beispielhafte Transmissionsspektren T der Farbteiler 22 in den Vorrichtungen von 1 und 2. Weiterhin dargestellt sind beispielhafte Spektralverteilungen der von den halbleiterbasierten Strahlungsquellen 18 ausgesendeten Ausgangsstrahlung. In 4(A) ist die Kante des Farbteilers 22 derart angeordnet, dass lediglich für die halbleiterbasierte Strahlungsquelle mit der größten Schwerpunktwellenlänge die Spektralverteilung der Ausgangsstrahlung im Durchlassbereich des Farbteilers 22 liegt. In 4(B) ist die Kante des Farbteilers 22 derart angeordnet ist, dass für die beiden halbleiterbasierten Strahlungsquellen mit den höchsten Schwerpunktwellenlängen die Spektralverteilungen der Ausgangsstrahlung innerhalb des Durchlassbereichs des Farbteilers 22 liegen. In 4(C) ist die Kante des Farbteilers 22 derart angeordnet, dass für die halbleiterbasierten Strahlungsquellen 18 mit den drei höchsten Schwerpunktwellenlängen die Spektralverteilungen der Ausgangsstrahlung innerhalb des Durchlassbereichs des Farbteilers 22 liegen. Die jeweilige Ausgangsstrahlung der halbleiterbasierten Strahlungsquellen kann somit effektiv in den gemeinsamen Strahlengang für die Anregungsstrahlung A eingekoppelt werden. Nicht transmittierte spektrale Anteile werden von den Farbteilern 22 weitgehend vollständig reflektiert.
5 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel einer Vorrichtung zur Lumineszenzmessung in Form eines Mikroskops mit SPIM-Beleuchtung. Komponenten der Vorrichtung von 5, welche denjenigen der Vorrichtungen von 1 und 2 entsprechen wurden mit den gleichen Bezugszeichen bezeichnet, und auf deren nähere Erläuterung wird an dieser Stelle verzichtet. Vielmehr wird auf die entsprechenden Ausführungen zu 1 und 2 verwiesen.
Die Vorrichtung von 5 verwendet abweichend von den Vorrichtungen von 1 und 2 eine SPIM-Beleuchtung. In diesem Fall werden halbleiterbasierte Strahlungsquellen 27 verwendet, welche Laserdioden 29 umfassen. Weiterhin umfassen die halbleiterbasierten Strahlungsquellen 27 jeweils einen Stromtreiber 28 mit einer auf einer Fotodiode basierenden Rückkopplungsvorrichtung. Die halbleiterbasierten Strahlungsquellen 27 der Vorrichtung von 5 sind auf ähnliche Weise angeordnet wie die halbleiterbasierten Strahlungsquellen 18 der Vorrichtungen von 1 und 2, und ihre Ausgangsstrahlung wird über entsprechend angepasste Kollimationslinsen 30 und Farbteiler 22 in einen gemeinsamen Strahlengang für die Anregungsstrahlung A eingekoppelt.
In diesem Strahlengang befindet sich eine Teleskopoptik 32, welche eine Verringerung des Strahlquerschnitts der Laserstrahlung bewirkt. Die Verringerung in Richtung der Achse des Objektivs 11 ist dabei wesentlich stärker als senkrecht zu der Achse, so dass ein Lichtblatt erzeugt wird. Zu diesem Zweck enthält die Teleskopoptik ein anamorphotisches Linsensystem. Weiterhin ist ein Hohlspiegel 33 vorgesehen, durch welchen das Lichtblatt der Anregungsstrahlung in sich zurückgespiegelt wird. Auf diese Weise kann die Symmetrie der Beleuchtung erhöht werden. Alternativ ist es möglich, die Anregungsstrahlung mit Strahlteilern aufzuspalten und von mehreren Seiten auf das Untersuchungsobjekt einzustrahlen.
Die Probe, bei welcher es sich auch um lebende Mikroorganismen handeln kann, ist typischerweise in einem zylinderförmigen Gel eingebettet, wobei die Zylinderachse typischerweise im Wesentlichen senkrecht zu der Achse des Objektivs 11 liegt. Um zu vermeiden, dass das Gel austrocknet, kann der Zylinder in einer wässrigen Lösung gehalten werden, welche sich in einem Tank 17 befindet.
Die Lumineszenzantwort F wird wiederum über das Objektiv 11 erfasst und über den Emissionsfilter 35 und die Detektionstubusoptik 12 der Laufzeitkamera 2 zugeführt.
Die Stromtreiber 28 der halbleiterbasierten Strahlungsquellen 27 sind vorzugsweise derart ausgestaltet, dass sie eine sehr geringe Stromanstiegszeit von ungefähr 1 ns oder weniger aufweisen. Um zu vermeiden, dass die Laserdioden 29 der halbleiterbasierten Strahlungsquellen 27 bei schnellen periodischen Schaftvorgängen nicht vollständig stromlos geschaltet werden, umfassen die Stromtreiber 27 jeweils auch eine Fotodiode oder einen anderen Fotodetektor, über welche die von der Laserdiode 29 abgestrahlte optische Leistung erfasst wird. Das Ausgangssignal der Fotodiode wird als Rückkopplungssignal zur Steuerung der Ausgangsleistung der Laserdiode 29 verwendet.
Weiterhin ist bei der Vorrichtung von 5 die Laufzeitkamera 2 über eine Signalleitung 5' mit dem Pulsgenerator 3 verbunden. Auf diese Weise können die Signalleitungen 5 zu den halbleiterbasierten Stromquellen 27, von welchen mehrere erforderlich sind, verkürzt werden. Selbstverständlich kann jedoch auch wie in 1 und 2 dargestellt der Pulsgenerator 3 unmittelbar an der Laufzeitkamera 2 angebracht wer den. Umgekehrt kann auch bei den Vorrichtungen von 1 und 2 der Pulsgenerator 3 näher an den halbleiterbasierten Strahlungsquellen 18 angeordnet sein und eine weitere hochfrequenztaugliche Signalleitung 5' verwendet werden, wie es in 5 dargestellt ist. Die weitere hochfrequenztaugliche Leitung 5' kann beispielsweise eine Koaxialleitung sein.
Im Folgenden wird ein Verfahren zur Auswertung von Lumineszenzlebensdauern, insbesondere Fluoreszenzlebensdauern, gemäß einem Ausführungsbeispiel näher erläutert.
Wie bereits erwähnt, liefert die Laufzeitkamera zwei der in 1, 2 und 5 dargestellten Vorrichtungen für jeden Pixel einen Entfernungswert X. Dieser Entfernungswert wird abgeleitet aus der Phasenlage der erfassten Lumineszenzantwort im Verhältnis zu dem der Laufzeitkamera 2 zugeführten Referenzsignal. Insbesondere gilt für die ausgegebene Entfernung der folgende Zusammenhang:
wobei Δφ die Phasenverschiebung, c₀ die Vakuumlichtgeschwindigkeit und T die Periodendauer des Referenzsignals bezeichnet.
Dieser Entfernungswert wird gemäß der Beziehung
in eine Laufzeit t_R umgerechnet werden.
Bei den obigen Zusammenhängen wurde vereinfachend angenommen, dass die Anregungsstrahlung A und die Lumineszenzantwort F sich im Vakuum ausbreiten. Im Allgemeinen ist diese Annahme jedoch nicht erfüllt, da sich die Anregungsstrahlung A und die Lumineszenzantwort F im Strahlengang einer mikroskopartigen Anordnung ausbreiten. In diesem Fall wird die Ausbreitungsgeschwindigkeit von den verwendeten optischen Elementen, wie z. B. Linsen, Strahlteilern, Farbteilern, usw. beeinflusst. Dies kann im Rahmen einer Kalibrierung berücksichtigt werden, was unten näher erläutert wird.
Bei dem Verfahren wird zunächst ein Laufzeitversatz t_off bestimmt, welcher sämtliche Phasenverschiebungen beinhaltet, die nicht der Lumineszenzlebensdauer zuzuordnen sind. Insbesondere wird der Laufzeitversatz zum Teil durch die Signalleitungen 5 zwischen dem Pulsgenerator 3 und den halbleiterbasierten Strahlungsquellen 18, 27 und durch die optischen Wege in der mikroskopartigen Anordnung verursacht. Zur Bestimmung des Laufzeitversatzes kann beispielsweise anstelle der Probe 1, 1' ein Spiegel oder eine dünne, typischerweise wenige Mikrometer starke, fluoreszierende Schicht mit genau bekannter Fluoreszenzlebensdauer in den Strahlengang der Anregungsstrahlung A und der Lumineszenzantwort F, insbesondere in die Objektebene eingebracht werden. Als Kalibrierproben mit bekannter Fluoreszenzlebensdauer können stark verdünnte Lösungen der Farbstoffe R6G oder Cy5 herangezogen werden, welche in einer Schicht von wenigen Mikrometer Dicke in die Objektebene eingebracht werden. Bei Verwendung eines Spiegels muss gegebenenfalls das Emissionsfilter 35 entfernt werden. Mit dieser Kalibrierungsanordnung kann die Laufzeit für jedes Pixel der Laufzeitkamera 2 gemessen werden. Bei Verwendung eines Spiegels ergibt sich der Laufzeitversatz t_off unmittelbar aus der auf diese Weise gemessenen Laufzeit. Bei Verwendung einer fluoreszierenden Schicht ist der Laufzeitversatz gleich der gemessenen Laufzeit abzüglich der bekannten Fluoreszenzlebensdauer.
Bei einer Lumineszenzmessung an einer fluoreszierenden oder phosphoreszierenden Probe wird nun die mittlere Fluoreszenzlebensdauer τ bestimmt anhand der Beziehung τ = tR – toff (3)
Bei einem monoexponentiellen Abklingvorgang der Fluoreszenz kann die auf diese Weise bestimmte mittlere Fluoreszenzlebensdauer als Endergebnis für die Fluoreszenzlebensdauer herangezogen werden.
In dem Fall eines multiexponentiellen Abklingvorgangs der Lumineszenz, welcher typisch ist bei Vorhandensein mehrerer Fluorophore oder luminiszierender Stoffe, deren Luminiszenzstrahlung sich in der Luminiszenzantwort F überlagert, kann die Luminiszenzlebensdauer jedoch nicht anhand des einfachen Zusammenhangs von Gleichung (3) bestimmt werden. Ein beispielhafter multiexponentieller Abklingvorgang einer Fluoreszenzantwort ist in 6 dargestellt.
Insbesondere zeigt 6 die einzelnen Fluoreszenzantworten von drei verschiedenen Fluorophoren in Form einer gestrichelten, einer gepunkteten und einer strichpunktierten Linie sowie die zusammengesetzte Gesamfluoreszenzantwort in Form einer durchgezogenen Linie. Die dargestellten zeitlichen Signalverläufe können modelliert werden mit Hilfe von stückweise zusammengesetzten Exponentialfunktionen:
Ein im Wesentlichen rechteckförmiger Puls der Anregungsstrahlung A kann modelliert werden durch
wobei Φ(t – Δt) die Einheitsstufenfunktion darstellt und τ_E sehr klein gewählt ist, um die steilen Flanken des rechteckförmigen Pulses nachzubilden. Beispielsweise kann hier ein Wert von τ_E von 0,01 ns gewählt werden. Mit Δt ist die Pulslänge bezeichnet.
Auf entsprechende Weise können die Fluoreszenzantworten F der drei verschiedenen Fluorophore modelliert werden durch die Ausdrücke
Hierbei bedeutet τ₁ Fluoreszenzlebensdauer des ersten Fluorophors, τ₂ Fluoreszenzlebensdauer des zweiten Fluorophors und τ₃ die Fluoreszenzlebensdauer des dritten Fluorophors. Die Fluoreszenzamplituden sind jeweils durch F₁, F₂ und F₃ angegeben.
Als normierte zusammengesetzte Gesamtfluoreszenzantwort ergibt sich folglich
Dieser Gesamtfluoreszenzantwort ist eine mittlere Lebensdauer zugeordnet, welche einem gewichteten Mittelwert der drei einzelnen Fluoreszenzlebensdauern τ₁, τ₂ und τ₃ mit den einzelnen Fluoreszenzamplituden F₁, F₂ und F₃ als Gewichtungsfaktoren entspricht:
Allgemein, für eine beliebige Anzahl von verschiedenen Fluorophoren oder lumineszierenden Stoffen lässt sich die mittlere Lumineszenzlebensdauer somit ausdrücken als
Die Fluoreszenzamplituden F₁, F₂ und F₃ hängen ab von der Konzentration des Fluorophors, dem Extinktionskoeffizienten, der Quanteneffizienz der Fluoreszenz, sowie der Detektionsempfindlichkeit der Gesamtanordnung. Wie aus Gleichungen (4)–(7) ersichtlich, ist unter Fluoreszenzamplitude in diesem Fall die Maximalauslenkung der Fluoreszenzantwort im stationären Zustand zu verstehen, d. h. für eine Anregung mit einer Anregungsstrahlung konstanter Intensität. Bei Verwendung von pulsartig modulierter Anregungsstrahlung wird dieser Maximalwert jedoch nicht erreicht, so dass die tatsächlich in der Fluoreszenzantwort auftretende Signalauslenkung kleiner ist als die maximale Fluoreszenzamplitude. Es kann daher durch das Verhältnis der tatsächlichen Auslenkung der Fluoreszenzantwort zu der maximalen Fluoreszenzamplitude eine normierte Modulationstiefe bestimmt werden, welche für endliche Pulslängen der Anregungsstrahlung immer kleiner als eins ist.
Mathematisch lässt es sich nun zeigen, dass die gemessene mittlere Lumineszenzlebensdauer unabhängig von der Pulslänge der Anregungsstrahlung ist. Es wird daher zur Bestimmung der einzelnen Lumineszenzlebensdauern ein Verfahren vorgeschlagen, welches zunächst auf eine Auswertung der von der Laufzeitkamera 2 er fassten Signalstärke oder Intensität, d. h. der Auslenkung der Lumineszenzantwort basiert.
Für die Auslenkungen der Fluoreszenzantwort in Abhängigkeit der Pulslänge ergeben sich für die einzelnen Fluorophore von 6 die folgenden Zusammenhänge
Allgemein, für eine beliebige Anzahl von Fluorophoren oder lumineszierenden Stoffen, kann die Auslenkung der Lumineszenzantwort somit angegeben werden durch
Für die tatsächlich messbare, gesamte Fluoreszenzantwort ist die maximale Auslenkung folglich gegeben durch PAmax(Δt) = PA1max(Δt) + PA2max(Δt) + PA3max(Δt) (15),oder allgemeiner für eine beliebige Anzahl von Fluorophoren oder lumineszierenden Stoffen
Die normierte Modulationstiefe der gesamten Lumineszenzantwort kann somit angenähert werden durch
wobei PA_max(ΔT) die Auslenkung der gesamten Lumineszenzantwort für eine Pulslänge bedeutet, welche wesentlich größer als die maximal zu erwartende Fluoreszenzlebensdauer. Beispielsweise kann die Pulslänge ΔT mehrere Größenordnungen über der maximal erwarteten Lumineszenzlebensdauer, z. B. im Bereich von Mikrosekunden bis Millisekunden gewählt werden.
Ein beispielhafter Verlauf der normierten Modulationstiefe in Abhängigkeit der Pulslänge ist in 7 dargestellt. Dieser Verlauf ist charakteristisch für die zugrundeliegenden Lumineszenzlebensdauern und Lumineszenzamplituden. Bei ausreichend genauer Messung des Verlaufs der normierten Modulationstiefe in Abhängigkeit der Pulslänge können daher die gesuchten Parameter, insbesondere die gesuchten Lumineszenzlebensdauern, bestimmt werden.
8 zeigt ein Flussdiagramm, welches schematisch ein Verfahren zur Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauern durch Auswertung der Lumineszenzantwort für verschiedene Pulslängen veranschaulicht.
Im Schritt 110 wird die Auslenkung der Lumineszenzantwort im quasi-stationären Zustand gemessen, d. h. mit einer Pulslänge ΔT, welche wesentlich größer ist als die zu erwartenden Fluoreszenzlebensdauern. Ergebnis dieser Messung ist somit die gesamte Lumineszenzamplitude, d. h. die Summe der einzelnen Lumineszenzamplituden. Für das anhand von 6 und 7 erläuterte Beispiel entspricht diese Größe der Summe F₁ + F₂ + F₃.
Im Schritt 120 wird nun für das Modulationssignal eine Pulslänge im Bereich der zu erwartenden Lumineszenzlebensdauern gewählt und die Auslenkung der Lumineszenzantwort gemessen.
In Schritt 130 wird die auf diese Weise gemessene Auslenkung auf die gemessene gesamte Lumineszenzamplitude normiert, d. h. es wird die normierte Modulationstiefe bestimmt.
In Schritt 140 wird eine andere Pulslänge gewählt und in Schritt 150 werden die Schritte 120 bis 140 für eine vorgegebene Anzahl von Pulslängen wiederholt. Es hat sich gezeigt, dass eine Anzahl von Wiederholungen vorteilhaft ist, welche im Wesentlichen der Anzahl von unbekannten zu bestimmenden Lumineszenzlebensdauern entspricht. Durch eine darüber hinaus erhöhte Anzahl von Wiederholungen kann jedoch die Genauigkeit der Auswertung weiter erhöht werden.
In Schritt 160 erfolgt eine numerische Anpassung der auf diese Weise bestimmten Modulationstiefen anhand der Gleichungen (16) und (17). In diesem Zusammenhang können verschiedene geeignete numerische Anpassungsverfahren zum Einsatz kommen, bei welchen die Parameter τ_i und F_i variiert werden, bis eine vorgegebene Übereinstimmung mit den berechneten Werten der Modulationstiefe erzielt wird. Dieses Verfahren kann z. B. als Kriterium zur Bewertung der Übereinstimmung verwenden, dass die Summe der quadrierten Abweichungen minimal wird bzw. unter einen vorgegebenen relativen oder absoluten Schwellenwert fällt.
Die Genauigkeit des beschriebenen Verfahrens kann weiter verbessert werden, wenn verfügbare Zusatzinformationen in die Gleichungen (16) und (17) eingefügt werden, beispielsweise bekannte Lumineszenzlebensdauern τ_i oder bekannte Lumineszenzamplituden. Darüber hinaus kann auch die gemessene mittlere Lumineszenzlebensdauer τ gemäß Gleichung (9) als Randbedingung verwendet werden.
Bei dem Verfahren kann bei Variation der Pulslänge die Pulswiederholfrequenz konstant gehalten werden oder ebenfalls variiert werden. Es ist jedoch vorteilhaft, die Pulswiederholfrequenz bei abnehmender Pulslänge zu erhöhen, so dass die Ausbeute an Lumineszenzphotonen in der Lumineszenzantwort erhöht wird. Die Zeit zwischen zwei Pulsen der Anregungsstrahlung sollte länger sein als die größte erwartete Lumineszenzlebensdauer. Es ist daher besonders vorteilhaft, wenn nicht nur die Pulslänge des von dem Pulsgenerator 3 erzeugten Modulationssignals variabel einstellbar ist, sondern auch die Frequenz oder das Tastverhältnis.
9 zeigt eine im Zusammenhang mit den oben beschriebenen Konzepten verwendbare Kalibriervorrichtung. Die Kalibriervorrichtung ist dazu ausgestaltet, anstelle des Untersuchungsobjekts 1, 1' in den Strahlengang von Anregungsstrahlung A und Lumineszenzantwort eingebracht zu werden. Insbesondere ist diese Vorrichtung einsetzbar bei den anhand von 1 und 2 erläuterten Vorrichtungen. Sie kann jedoch auch für eine Verwendung mit der in 5 dargestellten Vorrichtung angepasst werden.
Die Kalibriervorrichtung 50 von 9 umfasst eine halbleiterbasierte Strahlungsquelle 52, welche vorzugsweise auf Basis einer transparenten OLED realisiert ist und die Form einer dünnen Schicht aufweist. Es handelt sich somit um eine dünne elektronisch ansteuerbare Strahlungsquelle. Die Schichtdicke beträgt vorzugsweise 1 μm oder weniger. Mit Bezug auf den Strahlengang hinter der halbleiterbasierten Strahlungsquelle 52 angeordnet umfasst die Kalibriervorrichtung 50 weiterhin einen Fotodetektor, welcher beispielsweise eine Fotodiode 54 und einen entsprechenden Signalverstärker 56 umfassen kann. Ein Ausgangssignal des Fotodetektors ist einer Steuereinheit 58 zugeführt, welche das Ausgangssignal des Fotodetektors auswertet und abhängig davon ein Steuersignal an die halbleiterbasierte Strahlungsquelle 52 liefert. Insbesondere ist die Steuereinheit 58 derart ausgestaltet, dass sie nach einer einstellbaren vorbestimmten Verzögerungszeit nach Erfassen eines Pulses der Anregungsstrahlung A durch den Fotodetektor die halbleiterbasierte Strahlungsquelle 52 zur Abgabe eines Pulses einer Antwortstrahlung B ansteuert.
Die zeitliche Abfolge von Pulsen der Anregungsstrahlung A und Pulsen der Antwortstrahlung B ist schematisch in 10 dargestellt, wobei t wiederum die Zeit bezeichnet. Die einstellbare Verzögerungszeit ist mit t_D bezeichnet.
Der Vorteil bei der Verwendung der anhand von 9 dargestellten Kalibriervorrichtung liegt darin, dass für eine effiziente und präzise Kalibrierung keine lumineszierende Referenzprobe benötigt wird. Es werden somit auch Probleme hinsichtlich einer Empfindlichkeit von Referenzproben gegenüber den Umgebungsbedingungen, wie z. B. pH-Wert, verwendetes Lösungsmittel, Temperatur, usw., vermieden.
Bei Verwendung einer OLED in der halbleiterbasierten Strahlungsquelle 52 ergibt sich darüber hinaus noch als Vorteil, dass die Strahlung aus einer sehr dünnen Schicht abgegeben wird, was den typischen untersuchten Proben sehr ähnlich ist. Darüber hinaus kann mit einer OLED eine sehr homogene flächige Abstrahlung erreicht werden, was die Kalibrierung in einer mikroskopartigen optischen Vorrichtung mit flächenhafter Erfassung der Lumineszenzantwort auch eine hohe ortsabhängige Homogenität der Kalibrierung gewährleistet. Die verwendete halbleiterbasierte Strahlungsquelle 52 wird vorzugsweise derart ausgewählt, dass sie ein Wellenlängenspektrum aussendet, das von dem verwendeten Emissionsfilter 35 transmittiert wird. Es kann daher vermieden werden, für den Kalibriervorgang das Emissionsfilter 35 aus dem Strahlengang zu entfernen.
Ein auf den oben dargestellten Konzepten und auf der in 9 dargestellten Kalibriervorrichtung 50 basierendes Kalibrierverfahren ist schematisch durch das Flussdiagram von 11 dargestellt.
In Schritt 210 wird von einer oder mehrerer der zur Erzeugung der Anregungsstrahlung A vorgesehenen halbleiterbasierten Strahlungsquellen 18, 27 eine pulsastig modulierte Anregungsstrahlung A abgegeben. Die pulsartig modulierte Anregungsstrahlung A wird auf die Kalibriervorrichtung 50 gelenkt, welche sich an der Position befindet, an welcher sich im normalen Messbetrieb die zu untersuchende Probe 1, 1' befindet.
In Schritt 220 wird ein Puls der Anregungsstrahlung A durch den Fotodetektor erfasst, beispielsweise anhand seiner negativen Flanke. Die Steuereinheit 58 bewirkt nun, dass nach der eingestellten Verzögerungszeit t_D ein Puls der Antwortstrahlung B abgegeben wird, der eine zeitverzögerte Lumineszenzantwort simuliert. Zu diesem Zweck hat der Puls der Antwortstrahlung B vorzugsweise dieselbe Länge wie der Puls der Anregungsstrahlung A. Die Verzögerungszeit t_D kann im Bereich von etwa 0,1 ns bis 50 ns gewählt werden und entspricht einer simulierten mittleren Lumineszenzlebensdauer. Für die Messung einer Lumineszenzantwort aus metastabilen Zuständen kann für die Kalibriermessung die Verzögerungszeit t_D auch bis in den Bereich von 1 ms oder mehr erhöht werden.
In Schritt 230 wird der Puls der Antwortstrahlung B von der Laufzeitkamera 2 erfasst und zur Ermittlung einer simulierten Lumineszenzlebensdauer verwendet.
In Schritt 240 werden die Schritte 210 bis 230 wiederholt, bis durch Mittelung eine gewünschte Messgenauigkeit für die simulierte Lumineszenzlebensdauer erreicht ist. Beispielsweise können hier 10000 Wiederholungen verwendet werden.
In Schritt 250 werden die Schritte 210 bis 240 für andere eingestellte Verzögerungszeiten t_D wiederholt. Auf diese Weise können beispielsweise Nichtlinearitäten der Laufzeitmessung rechnerisch eliminiert werden.
Bei der in 9 dargestellten Kalibriervorrichtung 50 kann anstelle einer OLED auch eine LED oder eine Laserdiode verwendet werden. Da diese jedoch in der Regel nicht transparent sind, ist es dann vorteilhaft, einen transparenten Teilbereich durch Perforation mit einem Loch oder mehreren Löchern herzustellen, so dass der Fotodetektor auf die oben dargestellte Weise die Anregungsstrahlung erfassen kann.
Im Fall einer Funduskamera wie in 2 dargestellt kann die Kalibriervorrichtung von 9 auch weitere Merkmale des Untersuchungsobjekts nachbilden, d. h. einem Auge nachempfunden sein, so dass auch der Strahlengang im Auge bei der Kalibrierung berücksichtigt werden kann.
Die im vorangegangenen dargestellten Ausführungsbeispiele der Erfindung und einzelne Merkmale davon können vom Fachmann entsprechend den Erfordernissen der speziellen Anwendung modifiziert werden und miteinander kombiniert werden. Beispielsweise können von den genannten Beispielen abweichende mikroskopartige Anordnungen zum Einsatz kommen. Weiterhin können die verwendeten optischen Elemente entsprechend den Erfordernissen angepasst werden. Auch können anstelle von herkömmlichen LEDs und Laserdioden als halbleiterbasierte Strahlungsquellen auch VCSEL (Vertical Cavity Surface Emitting Laser, oberflächenemittierender Laser mit vertikaler Kavität), VECSEL (oberflächenemittierender Laser mit externer vertikaler Kavität) oder SLD (Superlumineszenzdioden) verwendet werden.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

- EP 1162827 A2 [0009]
- US 2007/0057198 A1 [0010]
- EP 1746410 A1 [0012]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- „Handbook of biological confocal microscopy”, 2nd Edition 1995, Edited by James B. Poley, Plenum Press [0008]
- Schwarte, R., „Dynamic 3D-Vision”, International Symposium an Electron Devices for Microwave and Optoelectronic Applications 2001, Vienna, Austria, 15–16 Nov. 2001 [0011]
- „Tau mapping of the autofluorescence of the human ocular fundus”, Schweitzer et al., Proc. SPIE Vol. 4164, p. 79–89, Laser Microscopy, Karsten Koenig; Hans J. Tanke; Herbert Schneckenburger; Eds. [0058]

Claims

Vorrichtung zur Lumineszenzmessung, umfassend: einen elektronischen Pulsgenerator (3) zur Erzeugung eines periodischen Modulationssignals mit rechteckförmigen Pulsen, wobei eine Pulslänge der Pulse variabel einstellbar ist, Beleuchtungsmittel (18; 27) zur Beleuchtung eines Untersuchungsobjekts (1; 1') mit einer Anregungsstrahlung (A), wobei die Beleuchtungsmittel (18; 27) mit dem Modulationssignal angesteuert sind, um die Anregungsstrahlung (A) abhängig von dem Modulationssignal pulsartig zu modulieren, und eine Laufzeitkamera (2) zur phasensensitiven Erfassung einer von dem Untersuchungsobjekt (1; 1') in Reaktion auf die Anregungsstrahlung (A) abgegebenen Lumineszenzantwort (F), wobei der Laufzeitkamera (2) als Referenzsignal das Modulationssignal zugeführt ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Beleuchtungsmittel (18; 27) dazu ausgestaltet sind, das Untersuchungsobjekt linienartig zu beleuchten.
Vorrichtung nach Anspruch 2, wobei die Laufzeitkamera (2) eine Vielzahl von Detektorelementen umfasst, welche in einer Linienanordnung angeordnet sind.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Beleuchtungsmittel (18) dazu ausgestaltet sind, das Untersuchungsobjekt (1; 1') flächenartig zu beleuchten.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Beleuchtungsmittel (27) dazu ausgestaltet sind, das Untersuchungsobjekt mit einem Lichtblatt zu beleuchten, dessen Ebene im Wesentlichen senkrecht zu der Ebene eines zur Erfassung der Lumineszenzantwort verwendeten Objektivs (11) ausgerichtet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 4 oder 5, wobei die Laufzeitkamera (2) eine Vielzahl von Detektorelementen umfasst, welche in einer Gitteranordnung angeordnet sind.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend: Auswertungsmittel (4) zur Berechnung einer Lumineszenzlebensdauer wenigstens eines in dem Untersuchungsobjekt (1; 1') enthaltenen Stoffes abhängig von einer über die Laufzeitkamera (2) erfassten Signalstärke der Lumineszenzantwort für eine Vielzahl von Pulslängen des Modulationssignals.
Vorrichtung nach Anspruch 7, wobei die Auswertungsmittel (4) weiterhin dazu ausgestaltet sind, die Lumineszenzlebensdauer abhängig von einer über die Laufzeitkamera (2) erfassten Phasenlage der Lumineszenzantwort zu berechnen.
Vorrichtung nach Anspruch 7 oder 8, wobei die Auswertungsmittel (4) dazu ausgestaltet sind, die Lumineszenzlebensdauer anhand einer für verschiedene Pulsängen bestimmten normierten Modulationstiefe der Lumineszenzantwort zu bestimmen.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Beleuchtungsmittel (18; 27) wenigstens eine halbleiterbasierte Strahlungsquelle umfassen.
Vorrichtung nach Anspruch 10, wobei die halbleiterbasierte Strahlungsquelle (18; 27) einen Stromtreiber (28) zur Erzeugung eines Betriebsstroms abhängig von dem Modulationssignal umfasst.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Beleuchtungsmittel (18; 27) eine Vielzahl von halbleiterbasierten Strahlungsquellen umfassen, und wobei die Vorrichtung Mittel (22) zur Einkopplung der jeweiligen Ausgangsstrahlung der halbleiterbasierten Strahlungsquellen (18; 27) in einen einzigen Strahlengang umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei die Mittel zur Einkopplung eine Vielzahl von Farbteilern (22) und/oder einen Drehspiegel umfassen.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vorrichtung wenigstens einen gemeinsamen Strahlengang (6) für die Anregungsstrahlung (A) und die Lumineszenzantwort (F) umfasst.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vorrichtung einen Strahlungshomogenisator (25) zur Homogenisierung der Anregungsstrahlung (A) umfasst.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vorrichtung wenigstens ein Multibandfilter (34, 35) zur Filterung der Anregungsstrahlung (A) und/oder der Lumineszenzantwort (F) umfasst.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vorrichtung Kalibrierungsmittel (50) umfasst, welche anstelle des Untersuchungsobjekts (1; 1') in den Strahlengang der Anregungsstrahlung (A) und Lumineszenzantwort (F) einbringbar sind und eine Antwortstrahlung (B) mit einer vorbestimmten Phasenverschiebung erzeugen.
Vorrichtung nach Anspruch 17, wobei die Kalibrierungsmittel (50) eine halbleiterbasierte Strahlungsquelle (52) und einen Fotodetektor (54, 56) umfassen, wobei die halbleiterbasierte Strahlungsquelle (52) derart angesteuert ist, dass sie eine vorbestimmte Verzögerungszeit (t_D) nach Erfassen eines Pulses der Anregungsstrahlung (A) über den Fotodetektor (54, 56) einen Puls der Antwortstrahlung (B) erzeugt.
Vorrichtung nach Anspruch 17 oder 18, wobei die vorbestimmte Phasenverschiebung (t_D) der Antwortstrahlung (B) variabel einstellbar ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Frequenz des Modulationssignals wenigstens 1 MHz beträgt.
Verfahren zur Lumineszenzmessung, umfassend: Erzeugung eines periodischen Modulationssignals mit rechteckförmigen Pulsen, Erzeugung einer Anregungsstrahlung (A), welche abhängig von dem Modulationssignal pulsartig moduliert ist, Beleuchtung eines Untersuchungsobjekts (1; 1') mit der Anregungsstrahlung (A), Zuführen des Modulationssignals als Referenzsignal an eine Laufzeitkamera (2), und phasensensitive Erfassung einer von dem Untersuchungsobjekt (1; 1') in Reaktion auf die Anregungsstrahlung abgegebenen Lumineszenzantwort (F) für verschiedene Pulslängen des Modulationssignals mit der Laufzeitkamera (2).
Verfahren nach Anspruch 21, umfassend: Berechnung einer Lumineszenzlebensdauer wenigstens eines in dem Untersuchungsobjekt (1; 1') enthaltenen Stoffes abhängig von einer über die Laufzeitkamera (2) erfassten Signalstärke der Lumineszenzantwort (F) für eine Vielzahl von Pulslängen des Modulationssignals.
Verfahren nach Anspruch 22, umfassend: Berechnung der Lumineszenzlebensdauer abhängig von einer über die Laufzeitkamera (2) erfassten Phasenlage der Lumineszenzantwort (F).
Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, umfassend: Berechnung der Lumineszenzlebensdauer anhand einer für die verschiedenen Pulslängen bestimmten normierten Modulationstiefe der Lumineszenzantwort (F).
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 24, umfassend: Berechnung der jeweiligen Lumineszenzlebensdauer von wenigstens zwei in dem Untersuchungsobjekt (1; 1') enthaltenen Stoffen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 25, wobei eine der Pulslängen, für welche die Lumineszenzantwort (F) erfasst wird, wesentlich größer gewählt ist als eine maximal erwartete Lumineszenzlebensdauer.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 26, umfassend: Einbringen einer halbleiterbasierten Strahlungsquelle (52) und eines Fotodetektors (54, 56) in den Strahlengang der Anregungsstrahlung (A) und der Lumineszenzantwort (F), Erfassung eines Pulses der Anregungsstrahlung (A) mit dem Fotodetektor (54, 56), Ansteuerung der halbleiterbasierten Strahlungsquelle (53) zur Abgabe einer pulsförmigen Antwortstrahlung (B) nach einer vorbestimmten Verzögerungszeit (t_D) nach Erfassung des Pulses der Anregungsstrahlung (A), Erfassung der Antwortstrahlung (B) mit der Laufzeitkamera (2), und Kalibrierung einer über die Laufzeitkamera (2) erfassten Laufzeit anhand der vorbestimmten Verzögerungszeit (t_D).