WO2001038856A1 - Verfahren zur erfassung von fluoreszenzerscheinungen in einem mikroskop - Google Patents

Verfahren zur erfassung von fluoreszenzerscheinungen in einem mikroskop Download PDF

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WO2001038856A1
WO2001038856A1 PCT/EP2000/011626 EP0011626W WO0138856A1 WO 2001038856 A1 WO2001038856 A1 WO 2001038856A1 EP 0011626 W EP0011626 W EP 0011626W WO 0138856 A1 WO0138856 A1 WO 0138856A1
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laser
modulated
detection
phase
fluorescence
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PCT/EP2000/011626
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Volker Gerstner
Ralf Wolleschensky
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Carl Zeiss Jena Gmbh
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence

Definitions

  • Time-resolved fluorescence or the use of the lifetime as a contrast parameter in confocal / 2-photon microscopy can be carried out in two different ways - by detection in time space (time-doamin detection) and detection in frequency space (frequency- domain detection).
  • a fluorescent sample is excited to fluoresce by means of a pulsed light source and the fluorescence emission either by means of time-correlated single-photon counting (TCSPC) [Müller] [Han ] or detection by means of an amplification time window in the detector (time-gated detection) [Schbg] [Cubeddu]] [Dowling].
  • TCSPC time-correlated single-photon counting
  • a fluorescent sample / preparation is excited with an actively modulated or (e.g. passively mode-coupled) pulsed light source. Since any modulation of the excitation by Fourier analysis breaks down into sinusoidal components, it is sufficient to consider a sinusoidal excitation.
  • the detection in the frequency space is based on the delay of the fluorescence emission by a phase f and a change in the modulation depth M compared to the excitation light as a function of the
  • the resulting fluorescence signal oscillates at the modulation frequency, but is out of phase and demodulated.
  • a frequency mixing process is used to acquire the signal. For mixing, e.g. each detection element with modulatable reinforcement.
  • ⁇ a G_ (homodyne)
  • the second harmonic and a frequency-independent component are generated by the mixing process of the "signals" Si and S 2 .
  • a low pass filter suppresses the components at ⁇ a and 2 ⁇ a . Only the DC background and the phase-dependent DC component is detected.
  • this frequency-independent (DC) signal is detected in several relative phases.
  • at least 3 different phase positions are necessary. With just two relative phase positions, the phase shift or demodulation induced by the fluorescence lifetime can be used as a contrast parameter. [Clegg].
  • the mixing process generates a high-frequency signal at the sum frequency and a signal at the cross-correlation frequency ⁇ .
  • the high-frequency components are suppressed again by a low-pass filter.
  • the difference frequency ⁇ is detected in the heterodyne detection.
  • the phase position and depth of modulation of the signal at the difference frequency enable the service life to be determined.
  • Typical cross-correlation frequencies are in the range from a few Hz to about 100 kHz.
  • the high-frequency change is reflected as it were on the low-frequency range.
  • the lifetimes determined from the depth of modulation and phase shift are different.
  • the excitation frequency must therefore be varied in order to measure the service life precisely [Gratton2].
  • the service life e.g. are generally not required as contrast parameters in an imaging process.
  • the representation of the phase shift or demodulation by the service life or the service lives calculated therewith at a fixed modulation frequency e.g. the representation of the phase shift or demodulation by the service life or the service lives calculated therewith at a fixed modulation frequency.
  • the confocal structure of an LSM is changed to reflect the service life in such a way that
  • the gain of the detector e.g. PMT
  • the gain of the detector e.g. PMT
  • RF frequencies in the range of 10-100 MHz are generated.
  • the output of the synthesizer S is connected on the one hand to a phase shifter / amplifier PA via a shielded high-frequency line (for example via a BNC cable).
  • the phase shifter / amplifier amplifies the high-frequency input signal of the synthesizer - in the implementation shown to a power of approx. 1.5 W with a resistance of 50 W.
  • the phase position of the amplified RF signal can be varied with the PA.
  • the relative phase of the PA can be set digitally via a control line - for example, by control via a serial interface of a PC.
  • the amplified RF signal becomes one modulatable PMT - for example the PMT module (H 6573) from Hamamatsu 1 - supplied.
  • the amplified RF voltage (approx. 25 V pp / 50 W) is fed to the 2nd Dynode in the PMT and used to modulate the amplification of the PMT.
  • the output signal of PMT 's using a standard low-pass (LP) filter to be smoothed.
  • the 3dB cut-off frequency f g of the LP filter should be selected so that
  • a second identical output of the synthesizer S is also connected to the control electronics of the light modulator M via a high-frequency line.
  • an acousto-optical modulator in the laser beam path (or else an electro-optical modulator) can be used as the modulator.
  • the light modulator is part of the laser module of the confocal laser scanning microscope.
  • the relative phase position of the PA and the light modulator M can be varied by such a construction.
  • the frequencies for M for modulating the laser light and the PMT boost voltage are the same.
  • the phase position is generally different.
  • At least the phase of an RF output can be set digitally in approximately 1 ° steps. In the case shown in Figure 1, the phase of the PMT modulation voltage is varied by the phase shifter in PA.
  • the light from the modulated / pulsed laser light source is focused into the object plane via the scanning mirror and the LSM scanning optics using the usual LSM structure.
  • the fluorescence is like in the confocal Zeiss LSM510 in
  • Image acquisition to create the lifetime contrast in a confocal microscopic image or to show the confocal lifetime distribution of dyes.
  • a first phase of the PMT detector is set digitally.
  • the setting is done as shown above with the electronic phase shifter / amplifier PA and the resulting DC signal of PMT 's (according to the usual currentistswandiung and analog - digital conversion) in synchronism with the scanner by means of conventional (LSM) evaluation electronics registered and by means of a storage medium stored in the PC.
  • LSM conventional
  • the at least two digital images are optionally displayed without further calculation.
  • the modulation depth r and the phase shift due to the lifetime ⁇ ⁇ can be determined by the Fourier coefficients be expressed.
  • the modulation depth / W is calculated pixel by pixel.
  • M and ⁇ are calculated using equations (9) and (10) and the Fourier coefficients a 0 , ai, bi determined using equation (8).
  • optimized algorithms can also be used, which are presented in a work by skil, Phase Evaluation by Folding, 1989.
  • a further realization of a confocal microscope with life time contrast or for measuring the life time distribution in a confocal sectional image can be done using pulse lasers.
  • pulse laser diodes or other fs laser systems Ti: sapphire laser
  • a frequency conversion unit connected downstream (eg frequency doubling / tripling).
  • the generation of the RF driver frequency by means of a synthesizer can be dispensed with.
  • an electronic diode signal of the pulse laser is made available (e.g. PD signal Out of the fs / ps NIR laser in Figure 1 or an equivalent structure by replacing / expanding the VIS laser module, e.g.
  • the RF signal of the (sufficiently fast) photodiode generated in this way is synchronized a priori with the laser excitation.
  • the RF signal can be used in the same way as the RF signal of a synthesizer, ie the phase shifter / amplifier PA unit is made available at the corresponding input (via an RF line).
  • the further method is analogous to implementation 1.
  • the use of a pulsed light source and the associated improvement in the signal / noise ratio in a lifetime contrast generated in this way are advantageous compared to the sinusoidal modulation of the laser excitation in implementation 1 and the omission of a synthesizer for generation the RF frequency.
  • the fluorescence is detected after a 1-photon excitation (linear in the excitation intensity).
  • the subject of this chapter is the combination of 2-photon microscopy with homodyne detection for lifespan imaging.
  • heterodyne technique an fs laser is used for fluorescence excitation in a 2-photon microscope and the PMT detector is operated with a slightly different modulation frequency.
  • the typical repetition rate of fs-Ti: Sapphire-Lasem is in the range of 80MHz.
  • a frequency of 80MHZ + 25kHz is used for the gain modulation of the PMT detector. This creates a beat.
  • This beat is digitized and scanned with an ADC card. This enables a pixel-by-pixel detection of the phase shift of excitation and fluorescence (heterodyne method).
  • phase shift is determined not pixel by pixel but image by frame, i.e. first an image is recorded and stored at a relative phase shift ⁇ 1. In at least one further step, an image is then generated at a further different relative phase ⁇ 2. (Homodyne procedure).
  • a colored or self-fluorescent sample is excited to fluoresce via a two-photon absorption.
  • the pulsed laser can be, for example, a Ti: sapphire laser (also possibly frequency doubled, frequency tripled sums or difference frequency mixed, etc.), a ps laser diode or a laser modulated, for example, by means of AOM or EOM.
  • the physical process is in 1.1. a 1-photon excitation in 1.2 a 2-photon excitation (or generally multiphoton excitation).
  • An fs-Ti: sapphire laser is used to excite the fluorescence in the implementation according to Figure 1.
  • the repetition rate of the fs laser is around 80 MHz (NLO-LSM, fluorescence detection).
  • a modulatable PMT detector from Hamamatsu (H6573) is used for the detection.
  • the sinusoidal modulation frequency is generated via an ECL logic circuit from a photodiode signal from the laser (fs-Mira, Coherent) and is amplified to an average power of 1.5 W @ 50 W by means of an RF amplifier integrated in the phase shifters / amplifiers PA Output RF out of the PA available.
  • the phase of the generated sine (and thus of the amplified sine) can be set to approximately 1 ° (as in Chapter 1.1).
  • the electronic jitter is ⁇ 100ps (( Figure 1), phase shifter / RF amplifier).
  • the amplified RF frequency is made available to the input of the PMT module referred to in FIG. 1 as "RF modulation in”.
  • the current at the output of the PMT detector is smoothed by a passive LP filter or otherwise integrated by an integration circuit.
  • the resulting DC signal is again made available to the detection unit of an LRM.
  • the further data acquisition and evaluation takes place analogously to chapter 1.1.
  • the difference to 1.1 is that in one case a 2-photon (NLO) LSM is combined with the lifetime map - i.e. the fluorescence excitation is done with an fs or ps pulse laser.
  • NLO 2-photon
  • An essential difference is the type of fluorescence excitation (here 2 or more multi-photons (> 2) excitation in general.
  • a second tube lens TL2 is used in a detection beam path DE with another modulatable PMT directly, i.e. not via the scanning beam path.
  • a major disadvantage of these detection devices is generally the higher sensitivity to room light. Since the room light is generally not / or is modulated differently from the excitation light, the use of phase-sensitive detection devices for suppressing the room light makes sense. This eliminates the complex encapsulation of the detection unit. Arrangements with 1 and 2 / multi photon excitation have already been described above and can be completely transferred to a phase-sensitive detector. However, in the case of phase-sensitive detection, the reference signal (excitation light) and the measurement signal (fluorescence signal) have the same modulation. For the most commonly used TiSa laser systems, this modulation is 80 MHz. Thus homodyne detection takes place. For phase-sensitive detection, both signals are multiplied together in a multiplier with a fixed, adjustable phase relationship. In an advantageous arrangement, the first dynode of a modulatable photomultiplier (H6573) acts as a multiplier.
  • H6573 modulatable photomultiplier
  • the reference signal is generated by the phase shifter / RF amplifier shown above.
  • the clock for the phase shifter is the photodiode signal of the pulse laser.
  • AOM or EOM, see Figure 1 the repetition rate (repetition rate) specified by the pulse laser can be extended to a variable beat frequency range.
  • the beat frequency is set by a synthesizer with an adjustable phase, which is controlled by trigger signals from the excitation light source (see Figure 1).
  • the phase relationship between reference and measurement signal is set so that the phase shift is zero.
  • the measured variable is thus demodulated.
  • a DC or low-frequency modulated measurement signal is thus obtained.
  • disturbances such as room light are strong after the multiplier modulated (like reference signal approx. 80 MHz).
  • the highly modulated components are filtered out and thus suppressed by the downstream low-pass filter.
  • An example of a low-pass filter is the detection electronics of a conventional LSM.

Abstract

Verfahren zur Erfassung von Fluoreszenzerscheinungen in einem Mikroskop, wobei die Probe von einer modulierten und/oder gepulsten Laserlichtquelle bestrahlt wird und die Detektion der Fluoreszenz mindestens in zwei unterschiedlichen Phasenlagen des Detektors erfolgt.

Description

Verfahren zur Erfassung von Fluoreszenzerscheinungen in einem Mikroskop
Das dargestellte Verfahren betrifft die konfokale und die 2-Photonen- Fluoreszenzmikroskopie [Goeppert][Wilson]. Beide Verfahren werden als bekannt vorausgesetzt.
Sowohl die konfokale Fluoreszenzmikroskopie als auch die 2-Photonen - Mikroskopie werden mit dem unten dargestellten Verfahren dahingehend verändert, daß ein zusätzlicher Kontrastparameter möglich wird: die Fluoreszenz- Lebensdauer.
Zeitaufgelöste Fluoreszenz bzw. die Nutzung der Lebensdauer als Kontrastparameter in der konfokalen/2-Photonen-Mikroskopie kann auf zwei verschiedene Arten durchgeführt werden - durch die Detektion im Zeit-Raum (time-doamin detection) und die Detektion im Frequenz-Raum (frequency-domain detection).
Bei der Time-domain Detektion [Wabnitz] [Gröbler] wird eine Fluoreszierende Probe mittels gepulster Lichtquelle zur Fluoreszenz angeregt und die Fluoreszenz- Emission entweder mittels Zeitkorrelierter Einzel-Photonenzählung (Time- Correlated-Single-Photon Counting, TCSPC) [Müller] [Han] oder Detektion mittels Verstärkungs-Zeitfenster im Detektor (Time-gated detection) [Schbg] [Cubeddu]] [Dowling] zeitaufgelöst detektiert.
Bei der Detektion im Frequenzraum wird eine fluoreszierende Probe/Präparat mit einer aktiv modulierten oder auch (z.B. passiv modengekoppelten) gepulsten Lichtquelle angeregt. Da jede beliebige Modulation der Anregung durch eine Fourieranalyse in sinusförmige Komponenten zerfällt, genügt die Betrachtung einer sinusförmigen Anregung. Die Detektion im Frequenz-Raum beruht auf der Verzögerung der Fluoreszenzemission um eine Phase f und einer Änderung der Modulationstiefe M verglichen mit dem Anregungslicht in Abhängigkeit von der
Modulationsfrequenz ω (=2 π fmod ) und der Lebensdauer τ. φ atan(ω r) (1 )
M = (2)
+ ω τ
Das resultierende Fluoreszenz-Signal oszilliert mit der Modulationsfrequenz, ist aber phasenverschoben und demoduliert. Für typische Fluoreszenz-Lebensdauern im Bereich τ = 1...10 ns sind Modulationsfrequenzen im Bereic+h fm0d = 10...100MHz ausreichend.
Da es im allgemeinen nicht sinnvoll ist das Fluoreszenzsignal bei solch hohen Modulationsfrequenzen abzutasten, verwendet man einen Frequenz- Mischungsprozeß zur Erfassung des Signals. Zum Mischen eignet sich z.B. jedes Nachweiselement mit modulierbarer Verstärkung.
Im wesentlichen werden zwei Vorgehensweisen unterschieden - der Homodyne und der Heterodyne - Nachweis.
Um das Prinzip zu verstehen betrachtet man allgemein zwei "Signale" S1r S2 (z.B. Si modulierte Anregung, S2 modulierte Verstärkung).
Figure imgf000004_0001
Multiplikation führt zu
S,S2 = A0B0 + AQBλ cos ωbt + ß) + 50_4, cos(_yαt + a) +
(4)
AlBl {cos((ωa + ωb)t + (a + ?)) + cos((ωα - ωb)t + (a - ß))
Homodyne-Nachweis
Ist ωa= G_ (homodyne) wird durch den Mischungsprozess der "Signale" Si and S2 die 2te Harmonische und eine frequenzunabhängige Komponente erzeugt. Ein Tiefpassfilter führt zur Unterdrückung der Komponenten bei ωa and 2 ωa . Nur der DC-Untergrund und die phasenabhängige DC-Komponente wird detektiert. Das mittels Tiefpass (LP= LowPass) gefilterte Signal lässt sich schreiben als
LP(S1S2 ) = A0B0 + AχB, cos(c. - ß) (5)
Bei der homodyne Detektion wird dieses frequenzunabhängige (DC-) Signal bei mehreren relativen Phasen detektiert. Um die Fluoreszenz Lebensdauer zu messen, sind mindestens 3 verschiedene Phasenstellungen notwendig. Bereits mit zwei relativen Phasenstellungen kann die durch die Fluoreszenz-Lebensdauer induzierte Phasenverschiebung bzw. die Demodulation als Kontrastparameter genutzt werden. [Clegg].
Heterodyne-Nachweis - Kreuzkorrelation
Ist co =ωa +Dw (heterodyne), dann wird durch den Mischungsprozess ein hochfrequentes Signal bei der Summenfrequenz und ein Signal bei der Kreuzkorrelationsfrequenz Δω erzeugt. Durch einen Tiefpassfilter werden wieder die Hochfrequenzkomponenten unterdrückt.
LP(S]S2 ) = A0B0 + AiB] cos(Aωt + - ß) (6)
Bei dem Heterodynenachweis wird die Differenzfrequenz Δω detektiert. Phasenlage und Modulationstiefe des Signals bei der Differenzfrequenz ermöglichen die Bestimmung der Lebensdauer. Typische Kreuzkorrelationsfrequenzen liegen im Bereich von einigen Hz bis zu etwa 100kHz.
Eine umfassendere Darstellung der Heterodyne-Technik findet man in Veröffentlichungen von E. Gratton et al. [Gratton][Gratton2]
Sowohl bei der homodyne als auch bei der heterodyne Detektion wird die hochfrequente Änderung gleichsam auf den niederfrequenten Frequenzbereich gespiegelt. Bei Multiexponentiellem Abklingverhalten der Fluoreszenzemission sind die aus der Modulationstiefe und Phasenverschiebung bestimmten Lebensdauern unterschiedlich. Zur präzisen Messung der Lebensdauer muss deshalb die Anregungsfrequenz variiert werden [Gratton2].
Soll hingegen die Lebensdauer z.B. in einem bildgebenden Verfahren als Kontrastparameter genutzt werden, ist dies im allgemeinen nicht erforderlich. Häufig genügt z.B. die Darstellung der Phasenverschiebung bzw. Demodulation durch die Lebensdauer bzw. die damit berechneten Lebensdauern bei einer festen Modulationsfrequenz.
1.1 Confocal lifetime imaging, homodyne
Der konfokale Aufbau eines LSM wird zur Lebensdauerabbildung dahingehend verändert, daß
• die Anregunglichtquelle moduliert wird oder eine Pulslaser eingesetzt wird
• die Verstärkung des Detektors (z.B. PMT) moduliert wird.
• ein elektronischer Phasenschieber eingesetzt wird, der die Einsteilung der relativen Phasenlage von Lichtanregung und Detektion erlaubt. Das Schema mit den verwendeten Komponenten ist in Abbildung 1 dargestellt.
Realisierung 1 :
Mittels eines Synthesizers S getrieben durch einen Quarzkristall werden RF- Frequenzen im Bereich 10-100 MHz erzeugt. Der Ausgang des Synthesizers S wird einerseits über eine geschirmte Hochfrequenzleitung (z.B. über ein BNC Kabel) mit einem Phaseshifter/ Amplifier PA verbunden. Der Phaseshifter / Amplifier verstärkt einerseits das hochfrequente Eingangssignal des Synthesizers - in der dargestellten Realisierung auf eine Leistung von ca. 1.5W bei einem Widerstand von 50 W . Des weiteren kann mit dem PA die Phasenlage des verstärkten RF Signals variiert werden. Über eine Steuerleitung kann die relative Phase des PA digital eingestellt werden - z.B. durch eine Ansteuerung über eine serielle Schnittstelle eines PC. Das verstärkte RF-Signal wird einem modulierbaren PMT - z.B. dem PMT-Modul (H 6573) der Firma Hamamatsu 1- zugeführt. Die verstärkte RF-Spannung (etwa 25 Vpp / 50 W ) wird im PMT zur 2. Dynode geführt und zur Modulation der Verstärkung des PMT benutzt. Zur Erzeugung eines definierten Tiefpaßfilters kann das Ausgangssignal des PMT's mittels handelsüblichem Low-Pass (LP) Filter geglättet werden. Die 3dB Grenzfrequenz fg des LP Filters ist dabei so zu wählen, daß
1/Pixel-Dwelltime « fg « fLaser
mit fLaSer = Laser-Modulationsfrequenz. Das so gefilterte Signal wird der Standard Detektionselektronik des LRM zugeführt, (zum Verständnis: prinzipiell z.B. einem ADC (Analog Digital Converter) der mit den xy- Scannern des LRM synchronisiert wird.)
Ein zweiter identischer Ausgang des Synthesizers S wird mit der Steuerungselektronik des Lichtmodulators M ebenfalls über eine Hochfrequenzleitung verbunden. Als Modulator kann beispielsweise ein akustooptischen Modulator im Laserstrahlengang (oder auch ein elektrooptischer Modulator) verwendet werden. Der Lichtmodulator ist Bestandteil des Lasermoduls des konfokalen Laser-Raster-Mikroskops. Durch einen solchen Aufbau kann die relative Phasenlage von PA und Lichtmodulator M variiert werden. Die Frequenzen für M zur Modulation des Laserlichts und der PMT Verstärkungsspannung sind gleich. Die Phasenlage ist im allgemeinen unterschiedlich. Mindestens die Phase eines RF-Ausgangs ist digital in etwa 1 ° Schritten einstellbar. In dem in Abbildung 1 dargestellten Fall wird die Phase der PMT Modulationsspannung durch den Phasenschieber in PA variiert.
Beschreibung der Funktionsweise und der damit verbundenen Vorteile der dargestellten Methode.
Mittels des üblichen LSM-Aufbaus wird das Licht der modulierten/gepulsten Laserlichtqueile über die Scanspiegel und der LSM-Scanoptik in die Objektebene fokussiert. Die Fluoreszenz wird wie beim konfokalen Zeiss LSM510 in
1 Eine detailliertere Darstellung der Funktionsweise ist als "Technical Information" zum H6573 der Fa. Hamamatsu erhaltlich. Reflektionsrichtung über Farbteiler, Fokussierlinse etc. auf das Detektionspinhole fokussiert. Durch rasterförmige Bewegung des Laserfokus über die Objektebene und synchronisierter Detektion im - jetzt modulierten - PMT entsteht ein konfokaies Abbild der Objektebene. Durch die Verwendung der homodyne Technik ist das PMT Signal am Ausgang des LP-Filters (Abbildung 1 ) ein DC-Signal, das nur in Abhängigkeit der LaserSpot Position (Pixel) variiert. Durch Wiederholen des Scanvorgangs bei mehreren unterschiedlichen relativen Phasen von Lichtmodulator und Detektormodulation wird die Detektion des Fluoreszenz-Lebensdauerkontrasts bzw. die Messung der Fluoreszenz-Lebensdauer möglich. Der wesentliche Vorteil besteht darin, daß die übliche Datenaufnahmeeinheit des LRM verwendet werden kann. Die Berechnung des Lebensdauerkontrasts geschieht Biidweise.
Bildaufnahme zur Erzeugung des Lebensdauerkonrasts in einer konfokalen mikroskopischen Abbildung bzw. zur Darstellung der konfokalen Lebensdauerverteilung von Farbstoffen.
• In einem ersten Schritt wird in der hier dargestellten Realisierung eine erste Phase des PMT-Detektors digital eingestellt. Die Einstellung geschieht wie oben dargestellt mit dem elektronischen Phasenschieber/Amplifier PA und das resultierende DC-Signal des PMT's (nach üblicher Strom-Spannungswandiung und Analog - Digital- Wandlung ) synchron mit dem Scanner mittels üblicher (LSM-) Auswertelektronik registriert und mittels eines Speichermediums im PC gespeichert.
• In mindestens einem zweiten Schritt wird das Vorgehen mit einer zweiten unterschiedlichen relativen Phasenlage wiederholt.
Mittels eines z.B. Computerbildschirms werden wahlweise die mindestens zwei digitalen Bilder ohne weitere Berechnung dargestellt.
Zur Darstellung werden auch die mit den nachfolgenden Algorithmen erzeugten Bilder auf dem Bildschirm dargestellt (Fourierentwicklung) Die Fourierentwicklung ist gegeben durch
Iφ + φτ ) = a0 + aλ • sin(< ) + bλ • cos(<p) (7)
Mit der Fluoreszenzintensität eines Pixels / und den entsprechenden Fourierkoeffizienten a0, a-i, bi.
- l ri 2π αn = I = — > / r+n —
Figure imgf000009_0001
2 ^ (2πn\ ( 2π b, = — > cos / φτ +n
Dabei sind ao, ai, b0 die Fourierkoeffizienten (per Pixel), N>=2 die Anzahl der gespeicherten Phasenbilder (bzw. Pixelintensitäten) l=l(φ) Die Modulationstiefe rund die Phasenverschiebung durch die Lebensdauer φτ können durch die Fourierkoeffizienten ausgedrückt werden.
Figure imgf000009_0002
φτ=-\-^T = ωτ (10)
Die Modulationstiefe /W wird pixelweise berechnet. M=M(i,j) = M,j. (i,j, Pixelindices). Ebenso die Phasenverschiebung φ= φ (i,j)= φv
Dargestellt wird auf dem Monitor das so pixelweise berechnete Abbild der Modulationstiefe MtJ und die Phasenverschiebung φΨ
Eine weitere Darstellungsart ist die τ - Abbildung, d.h. die durch Auflösung Gleichungen (9) bzw. (10) nach t berechneten Lebensdauern τ(M),j bzw. τ(φ) . [Clegg] :( ) = ■ - 1 (11 ) \ M
τ{φ) = —tan{φ) (12) ω
M bzw φ werden über Gleichung (9) bzw. (10) und die mit Gleichung (8) bestimmten Fourierkoeffizienten a0, a-i, bi berechnet. Zur Erhöhung der Genauigkeit bei der Bestimmung der Phase können auch optimierte Algorithmen verwendet werden, die in einer Arbeit von Küchel, Phasenauswertung durch Faltung, 1989 dargestellt sind.
Realisierung 2:
Eine weitere Realisierung eines konfokalen Mikroskops mit Lebensdauerkontrast bzw. zur Messung der Lebendauerverteilung in einem konfokalen Schnittbild kann unter Verwendung von Pulslasern erfolgen. Geeignet sind z.B. Pulslaserdioden oder andere z.B. fs-Lasersysteme (Ti:Saphir-Laser) z.B. mit nachgeschalteter Frequenzkonversionseinheit (z.B. Frequenzverdopplung/Verdreifachung). Bei Verwendung von Pulslasern kann auf die Erzeugung der RF-Treiberfrequenz mittels Synthesizer verzichtet werden. Stattdessen wird z.B. ein elektronisches Diodensignal des Pulslasers zur Verfügung gestellt (z.B. PD-Signal Out des fs/ps NIR-Lasers in Abbildung 1 oder ein äquivalenter Aufbau durch Austauch/Erweiterung des VIS-Lasermoduls z.B. mit einem ps-Diodenlaser etc.). Das so erzeugte RF-Signal der (ausreichend schnellen) Photodiode ist a priori synchronisiert mit der Laseranregung. Das RF-Signal kann analog dem RF-Signal eines Synthesizers verwendet werden, d.h. es wird der Phasenschieber/Amplifier PA Einheit am entsprechenden Eingang (über eine RF-Leitung) zur Verfügung gestellt. Das weitere Verfahren ist analog der Realisierung 1. Vorteilhaft ist hier einerseits die Verwendung einer pulsförmigen Lichtquelle und die damit einhergehende Verbesserung des Signal/Rauschverhältnisses in einem damit erzeugten Lebensdauerkontrasts im Vergleich zur sinusförmigen Modulation der Laseranregung in Realisierung 1 und der Verzicht auf einen Synthesizer zur Erzeugung der RF-Frequenz. Detektiert wird die Fluoreszenz nach einer 1- Photonen Anregung (linerar in der Anregungsintensität). 1.2 2-Photonen Confocal lifetime imaging, homodyne
Gegenstand dieses Kapitels ist die Kombination der 2-Photonen-Mikroskopie mit der Homodyne-Detektion zur Lebensdauerabbildung.
Die Kombination von Zeit-Auflösung und 2-Photonen-Mikroskopie wurde bereits von Gratton mit der sogenannte Heterodyne-Technik demonstriert [So]. Bei der Heterodyne Technik wird ein fs-Laser zur Fluoreszenz-Anregung in einem 2- Photonen-Mikroskop verwendet und der PMT-Detektor mit einer leicht unterschiedlichen Modulationsfrequenz betrieben. Die typische Wiederholrate von fs-Ti:Saphir-Lasem liegt im Bereich von 80MHz. In [So] wird zur Verstärkungsmodulation des PMT-Detektors eine Frequenz von 80MHZ+25kHz verwendet. Dadurch entsteht eine Schwebung. Diese Schwebung wird mit einer ADC-Karte digitalisiert und abgetastet. Dadurch ist eine Pixelweise Erfassung der Phasenverschiebung von Anregung und Fluoreszenz möglich (Heterodyne- Verfahren).
In dem hier dargestellten Aufbau wird im Unterschied zu [So] nicht pixelweise sondern Bildweise die Phasenverschiebung bestimmt, d.h. zuerst ein Bild bei einer relativen Phasenverschiebung φ1 aufgenommen und gespeichert. In mindestens einem weiteren Schritt wird danach bei einer weiteren unterschiedlichen relativen Phase φ2 ein Bild erzeugt. (Homodyne Verfahren).
Das Berechnen der diversen Bilder zur Darstellung des Kontrasts geschieht analog Kapitel 1.1.
Vorgehensweise
Eine gefärbte oder selbst fluoreszierende Probe wird zur Fluoreszenz über eine Zwei-Photonen-Absorption angeregt. Bei dem gepulsten Laser kann es sich z.B. um einen Ti:Saphir Laser (auch evtl. frequenzverdoppelt, frequenzverdreifacht Summen oder Diffrerenz frequenzgemischt etc. ),eine ps-Laserdiode oder um einen z.B. mittels AOM oder EOM pulsförmig modulierten Laser handeln. Der physikalische Prozess ist in 1.1. eine 1 -Photonenanregung in 1.2 eine 2- Photonenanregung (oder allgemein Multiphotonenanregung). Zur Anregung der Fluoreszenz in der Realisierung nach Abbildung 1 wird ein fs-Ti:Saphirlaser verwendet. Die Wiederholrate des fs-Lasers liegt bei etwa 80 MHz (NLO-LSM, Fluoreszenz-Detektion). Zur Detektion wird ein modulierbarer PMT-Detektor der Fa. Hamamatsu (H6573) verwendet. Die sinusförmige Modulationsfrequenz wird über eine ECL- Logikschaltung aus einem Photodiodensignal des Lasers (fs-Mira, Fa. Coherent) generiert und mittels eines im Phaseshifters/Amplifiers PA integrierten RF- Verstärkers auf eine mittlere Leistung von 1.5 W @ 50 W verstärkt und steht am Ausgang RF out des PA zur Verfügung. Die Phase des generierten Sinus (und damit des verstärkten Sinus) ist auf etwa 1 ° einstellbar (analog Kapitel 1.1 ). Der elektronische Jitter ist < 100ps ((Abbildung 1 ), Phasenschieber/RF Amplifier). Mit dem verstärkten Sinus mit der der Laserwiederholrate entsprechenden Frequenz (f.ep=fmod) wird die Verstärkung des PMT-Detektors moduliert. Dazu wird die verstärkte RF-Frequenz dem in Abbildung 1 als "RF-Modulation In" bezeichneten Eingangs des PMT-Moduls zur Verfügung gestellt. Der Strom am Ausgang des PMT-Detektors wird über einen passiven LP-Filter geglättet oder über eine Integrationsschaltung auf andere Art und Weise integriert. Das resultierende DC- Signal wird wieder der Detektionseinheit eines LRM zur Verfügung gestellt. Die weitere Datenaufnahme und Auswertung geschieht analog Kapitel 1.1.
Der Unterschied zu 1.1 liegt darin, daß in einem Fall ein 2-Photonen (NLO) LSM mit der Lebensdauerabbildung kombiniert wird - d.h. die Fluoreszenzanregung geschieht mit einem fs- oder ps- Pulslaser. Ein wesentlicher Unterschied besteht also durch die Art der Fluoreszenzanregung (hier 2 oder allgemein Mehr-Photonen (>2) Anregung.
1.3 Anordnung zur phasenempfindlichen Fluoreszenzdetektion in einem Laser Scanning Mikroskop
Bei einer 2 / multi Photonen-Anregung ist der Einsatz von effizienteren
Detektionseinrichtungen aufgrund der tiefendiskrimierten Anregung möglich. Diese sind in der Literatur unter dem Sammelbegriff der nicht-descannten Detektion beschrieben.
Dies ist schematisch in Abb.2 dargestellt, die an der Scanlinse SL und dem
Scanner von Abb.1 ansetzt und einen mikroskopischen Strahlengang darstellt, mit der Probe P , der Objektivlinse OL, dem Strahlteiler ST zur Einkoppiung der Beleuchtung/ Auskoppiung der von der Probe kommenden Strahlung sowie eine erste Tubuslinse TL1.
Über eine zweite Tubuslinse TL2 wird in einem Detektionsstrahlengang DE mit einem weiteren modulierbaren PMT direkt, d.h. nicht über den Scanstrahlengang , detektiert.
Dieser ist mit der Steuereinheit ST in Abb.1 und über diese mit weiteren Einheiten in Abb.1 verbunden.
Ein wesentlicher Nachteil dieser Detektionseinrichtungen besteht generell in der höheren Raumlichtempfindlichkeit. Da das Raumlicht im allgemeinen nicht/oder verschieden vom Anregungslicht moduliert ist, ist der Einsatz von phasenempfindlichen Nachweiseinrichtungen zur Unterdrückung des Raumlichtes sinnvoll. Somit entfällt die aufwendige Kapselung der Detektionseinheit. Anordnungen bei 1 und 2 / multi Photonen-Anregung wurden bereits oben beschrieben und sind vollständig auf einen phasenempfindlichen Detektor übertragbar. Jedoch besitzt beim phasenempfindlichen Nachweis das Referenzsignal (Anregungslicht) und das Meßsignal (Fluoreszenzsignal) die gleiche Modulation. Für die meist verwendeten TiSa Lasersysteme beträgt diese Modulation 80 Mhz. Somit findet eine homodyne Detektion statt. Zum phasenempfindlichen Nachweis werden beide Signale in einem Multiplikator mit einer festen einstellbaren Phasenbeziehung miteinander multipliziert. In einer vorteilhaften Anordnung fungiert als Multiplikator die erste Dynode eines modulierbaren Photomultipliers (H6573) .
Das Referenzsignal wird von dem oben dargestellten Phasenschieber/ RF Verstärker erzeugt. Die Clock für den Phasenschieber ist das Photodiodensignal des Pulslasers. Zuzsätzlich kann durch "Beaten" des Laserlichts mit einem optischen Modulator (AOM oder EOM, siehe Abbildung 1 ) die durch den Pulslaser vorgegebene Wiederholfrequenz (Repetitionsrate) auf einen variablen Beat- Frequenzbereich ausgedehnt werden Die Beat-Frequenz wird durch einem Synthesizer mit einstellbarer Phase, der durch Triggersignale der Anregungslichtquelle gesteuert wird, bereitgestellt (siehe Abbildung 1 ). Die Phasenbeziehung zwischen Referenz- und Meßsignal wird so eingestellt, daß die Phasenverschiebung null beträgt. Somit findet eine Demodulation der Meßgröße statt. Man erhält somit ein DC bzw. niederfrequent moduliertes Meßsignal. Störgrößen wie Raumlicht sind nach dem Multiplikator jedoch stark moduliert (wie Referenzsignal ca. 80 Mhz). Durch den nachgeschalteteπ Tiefpaßfilter werden die hochmodulierten Anteile (Störgrößen) herausgefiltert und somit unterdrückt. Beispiel für Tiefpaßfilter ist die Nachweiselektronik eines herkömmlichen LSM.
Der Vorteil der beschriebenen Anordnung besteht darin, daß die Elektronik auf der Detektionsseite nur für Niederfrequente Signale ausgelegt werden muß, da die Demodulation bereits im Photomultipier stattfindet.
Literaturverzeichnis
[Wabnitz] H. Wabnitz
Verfahren zur Bestimmung von Calciumionenkonzentration in Zellen Offeniegungsschrift DE 41 04 014, Anmeldetag 9.02.91
[Gröbler] B. Gröbler
Vorrichtung zur Analyse und bildlichen Darstellung des bei einer punktweisen Anregung eines Präparates durch Laserlicht entstehenden zeitlichen Intensitätsverlaufs der Fluoreszenzstrahlung
Patent DE 36 14 359 C2
[Müller] R. Müller, M. Sauer, C. Zander
System zur Unterscheidung fluoreszierender Molekülgruppen durch zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung Patent WO 98/09154
[Han] K-T Han, M. Köllner, M. Sauer, S. Seeger, J. Wolfrum, C. Schmitt,
A. Schulz
Verfahren zur optischen Sortierung von Kunststoffen mittels zeitaufgelöster Laserspektroskopie Offeniegungsschrift DE 42 31 477 A1 , Anmeldetag 19.09.92
[Schbg] H. Schneckenburger, K. König, T. Dienersberger R. Hahn
Time - gated microscopic imaging and spectroscopy in medical diagnosis and photobiology
Optoical Engineering 33 (8) 2600 (1994)
[Cubeddu]] R. Cubeddu, G. Canti, A. Pifferi, P. Taroni, G. Valentini A real time System for fluortescence lifetime imaging SPIE 2976 (1997) 98
[Dowling] K. Dowling, S.C.W. Hyde, N.P. Barry, J.C. Dainty, P.M.W. French
Two dimensional fluorescence lifetime imaging using a 5 kHz 110 ps gated image intensifier
(WWW)
[Clegg] P:C: Schneider, R.M. Clegg
Rapid acquisition, analysis and display of fluorescence lifetime- resolved images for real-time applications Rev. Sei. Instrum. 68 (11 ) 4107 (1997)
[Gratton] E. Gratton, M. Limkeman
A continuously variable frequency cross-correlation phase föuorometer with picosecond resolution
Biophys. J. 44 (1983) 315 [Gratton2] E. Gratton, D.M. Jameson, R.D. Hall Multifrequency phase and modulation fiuorometry Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 13 (1984) 105
[So] P.T.C So, T. French, W.M. Yu, K.K. Berland, CN. Dong, E. Gratton Time resolved fluorescence microscopy using two photon excitation Bioimaging 3 (1995) 49
[Goeppert] M. Göppert-Mayer
Ann. Physik 9, 273 (1931 ) [Wilson] T. Wilson
Theory and Practice of Scanning Optical Microscopy
Academic Press, 1984

Claims

Patentansprüche
1.
Verfahren zur Erfassung von Fiuoreszenzerscheinungen in einem Mikroskop, wobei die Probe von einer modulierten und/ oder gepulsten Laserlichtquelle bestrahlt wird, und die Detektion der Fluoreszenz mindestens in zwei unterschiedlichen
Phasenlagen des Detektors erfolgt.
2.
Verfahren nach Anspruch 1 , wobei für die Phasenlagen jeweils ein Bild erzeugt wird
3.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die erzeugten Bilder oder aus diesen Bildern berechnete Bilder auf einem Monitor dargestellt werden.
4.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei Beleuchtung und Detektion über ein Laser- Scanning - Mikroskop erfolgt.
5.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Detektion mit einem modulierbaren PMT erfolgt.
6.
Verfahren zur Erfassung von Fiuoreszenzerscheinungen in einem Mikroskop, wobei die Probe von einer modulierten und/ oder gepulsten Laserlichtquelle bestrahlt wird, wobei ein dem modulierten und/ oder gepulsten Laser entsprechendes Referenzsignal und ein einer modulierten Detektion entsprechendes Meßsignal mit einer fest einstellbaren Phasenbeziehung miteinander multipliziert werden und das
Ergebnis zur bildlichen Darstellung dient.
7.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Phasenbeziehung so eingestellt, daß die
Phasenverschiebung Null beträgt .
8.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 oder 7, mit nicht descannter Detektion.
9.
Anwendung eines Verfahrens gemäß einem der obengenannten Ansprüche auf die Mutiphotonen-Anregung von Fluoreszenzemission , insbesondere
Zweiphotonenanregung
10.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, unter Verwendung eines mittels akustooptischen Modulators (AOM) modulierten cw-Lasers.
11.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, unter Verwendung eines mittels Pockelszelle modulierten cw-Lasers.
12.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, unter Verwendung eines Pulslasers welcher zusätzlich moduliert wird.
13.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, unter Verwendung eines Pulslasers welcher zusätzlich mittels AOM moduliert wird.
14.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, unter Verwendung eines Pulslasers welcher zusätzlich mittels einer Pockelszelle moduliert wird.
15.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, unter Verwendung zur Zeitauflösung von Multiphotonenprozessen wie Second
Harmonie Generation an Oberflächen oder Zweiphotonenanregung.
16.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, unter Verwendung eines gepulsten Near Infrared (NIR) Lasers. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, unter Verwendung eines gepulsten Near Infrared (NIR) Lasers mit nachfolgender
Frequenzkonversion zur 1 -Photonen-Anregung.
18.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, unter Verwendung eines gepulsten Near Infrared (NIR) Lasers mit nachfolgender
Frequenzkonversion zur 1 -Photonen Anregung von Fluoreszenz
19.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, unter Verwendung des phasensensitiven Nachweises zur Verbesserung des
Signal/Rausch Verhältnisses.
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102005022880A1 (de) * 2005-05-18 2006-11-30 Olympus Soft Imaging Solutions Gmbh Trennung spektral oder farblich überlagerter Bildbeiträge in einem Mehrfarbbild, insbesondere in transmissionsmikroskopischen Mehrfarbbildern
DE102008018475A1 (de) * 2008-04-11 2009-10-15 Carl Zeiss Ag Vorrichtung und Verfahren zur Lumineszenzmessung
CN103257130A (zh) * 2013-05-31 2013-08-21 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 受激辐射损耗显微成像系统
DE102010035003B4 (de) * 2010-08-20 2015-08-06 PicoQuant GmbH. Unternehmen für optoelektronische Forschung und Entwicklung Räumlich und zeitlich hochauflösende Mikroskopie

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7041986B2 (en) * 2002-03-14 2006-05-09 University Of Maryland Baltimore County Device for discrimination of fluorescence lifetimes and uses therefor
DE10222359B4 (de) * 2002-05-21 2005-01-05 Max Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren zur spektral differenzierenden, bildgebenden Messung von Fluoreszenzlicht
DE10253108B4 (de) * 2002-11-13 2005-11-03 Leica Microsystems Heidelberg Gmbh Verfahren zur Detektion eines Objekts mit einem Rastermikroskop und Rastermikroskop zur Detektion eines Objekts
US7582882B2 (en) * 2003-01-23 2009-09-01 Horiba Jobin Yvon, Inc. Solid state multi frequency fluorometric measurements system and method
US7297962B2 (en) * 2003-01-23 2007-11-20 Horiba Jobin Yvon, Inc. Method for performing spacially coordinated high speed fluorometric measurements
US7317194B2 (en) * 2003-01-23 2008-01-08 Horiba Jobin Yuon, Inc. Microscope for performing multiple frequency fluorometric measurements
DE102004017956B4 (de) 2004-04-14 2022-07-07 Leica Microsystems Cms Gmbh Verfahren zur Untersuchung der Lebensdauer angeregter Zustände in einer Probe
US7332700B2 (en) * 2004-04-26 2008-02-19 Bruce Masato Ishimoto Photomultiplier tube with dynode modulation for photon-counting
DE102006046369A1 (de) * 2006-09-29 2008-04-03 Carl Zeiss Microimaging Gmbh Auflösungsgesteigerte Lumineszenzmikroskopie
DE102009029831A1 (de) 2009-06-17 2011-01-13 W.O.M. World Of Medicine Ag Vorrichtung und Verfahren für die Mehr-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie zur Gewinnung von Informationen aus biologischem Gewebe
AU2011217070B2 (en) * 2010-02-19 2014-12-11 Glysure Ltd Intravascular glucose sensor
DE102010016395B4 (de) * 2010-04-12 2015-08-20 Becker & Hickl Gmbh Verfahren zur Aufzeichnung von Phosphoreszenz- und Fluoreszenz-Lifetime-Bildern in Laser-Scanning-Systemen
DE102010019095B4 (de) * 2010-04-30 2016-12-08 Deutsches Zentrum für Luft- und Raumfahrt e.V. Verfahren und Vorrichtung zur Fluoreszenzlebensdauermessung
US8866107B2 (en) 2011-01-19 2014-10-21 Howard Hughes Medical Institute Wavefront compensation for deep tissue optical microscopy
JP6006053B2 (ja) * 2012-09-06 2016-10-12 アストロデザイン株式会社 レーザー走査蛍光顕微鏡装置
DE102012216164B4 (de) * 2012-09-12 2016-04-28 Forschungsverbund Berlin E.V. Vorrichtung mit einer Anordnung optischer Elemente
MX2017010141A (es) * 2015-02-06 2018-04-10 Unisensor Sensorsysteme Gmbh Metodo y aparato para identificar plasticos y/o los aditivos en los mismos.
US10928317B2 (en) 2016-06-22 2021-02-23 University Of Virginia Patent Foundation Fiber-optic based thermal reflectance material property measurement system and related methods
DE102018129833B4 (de) * 2017-12-04 2020-01-02 Leica Microsystems Cms Gmbh Mikroskopsystem, Detektionseinheit für Mikroskopsystem und Verfahren zur mikroskopischen Abbildung einer Probe
WO2020106972A1 (en) 2018-11-21 2020-05-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Wide-field nanosecond imaging methods using wide-field optical modulators
DE102022122092A1 (de) 2022-08-31 2024-02-29 Pyroscience Gmbh Referenz-Messung

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3614359A1 (de) * 1985-07-26 1987-02-05 Jenoptik Jena Gmbh Anordnung zur bildlichen darstellung und analyse von fluoreszenzsignalen
US5459323A (en) * 1990-01-12 1995-10-17 University Of Salford Measurement of luminescence
US5485530A (en) * 1991-01-24 1996-01-16 Joseph R. Lakowicz Method and apparatus for multi-dimensional phase fluorescence lifetime imaging

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5034613A (en) * 1989-11-14 1991-07-23 Cornell Research Foundation, Inc. Two-photon laser microscopy
DD292084A5 (de) 1990-02-16 1991-07-18 Friedrich-Schiller-Iniversitaet,De Verfahren zur rastermikroskopischen bestimmung von calciumionenkonzentration in zellen
DE69132273D1 (de) * 1990-10-10 2000-08-03 Univ Maryland Verfahren und vorrichtung zur bestimmung von lebensdauer von fluoreszenz in der durchflusscytometrie
DE4231477A1 (de) 1992-09-19 1994-03-24 Han Kyung Tae Verfahren zur optischen Sortierung von Kunststoffen mittels zeitaufgelöster Laserspektroskopie
DE19634873A1 (de) 1996-08-29 1998-03-12 Boehringer Mannheim Gmbh System zur Unterscheidung fluoreszierender Molekülgruppen durch zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3614359A1 (de) * 1985-07-26 1987-02-05 Jenoptik Jena Gmbh Anordnung zur bildlichen darstellung und analyse von fluoreszenzsignalen
US5459323A (en) * 1990-01-12 1995-10-17 University Of Salford Measurement of luminescence
US5485530A (en) * 1991-01-24 1996-01-16 Joseph R. Lakowicz Method and apparatus for multi-dimensional phase fluorescence lifetime imaging

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102005022880A1 (de) * 2005-05-18 2006-11-30 Olympus Soft Imaging Solutions Gmbh Trennung spektral oder farblich überlagerter Bildbeiträge in einem Mehrfarbbild, insbesondere in transmissionsmikroskopischen Mehrfarbbildern
DE102005022880B4 (de) * 2005-05-18 2010-12-30 Olympus Soft Imaging Solutions Gmbh Trennung spektral oder farblich überlagerter Bildbeiträge in einem Mehrfarbbild, insbesondere in transmissionsmikroskopischen Mehrfarbbildern
DE102008018475A1 (de) * 2008-04-11 2009-10-15 Carl Zeiss Ag Vorrichtung und Verfahren zur Lumineszenzmessung
US9007579B2 (en) 2008-04-11 2015-04-14 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Device and method for measuring luminescence
DE102010035003B4 (de) * 2010-08-20 2015-08-06 PicoQuant GmbH. Unternehmen für optoelektronische Forschung und Entwicklung Räumlich und zeitlich hochauflösende Mikroskopie
CN103257130A (zh) * 2013-05-31 2013-08-21 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 受激辐射损耗显微成像系统
CN103257130B (zh) * 2013-05-31 2015-04-01 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 受激辐射损耗显微成像系统

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JP2003515162A (ja) 2003-04-22

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