DE102005022880A1

DE102005022880A1 - Trennung spektral oder farblich überlagerter Bildbeiträge in einem Mehrfarbbild, insbesondere in transmissionsmikroskopischen Mehrfarbbildern

Info

Publication number: DE102005022880A1
Application number: DE102005022880A
Authority: DE
Inventors: Peter Dipl.-Phys. Messler
Original assignee: Olympus Soft Imaging Solutions GmbH
Current assignee: EVIDENT TECHNOLOGY CENTER EUROPE GMBH, DE
Priority date: 2005-05-18
Filing date: 2005-05-18
Publication date: 2006-11-30
Anticipated expiration: 2025-05-19
Also published as: GB0719365D0; JP2008541179A; WO2006122810A1; DE102005022880B4; US20090103801A1; GB2439025A

Abstract

Die Erfindung betrifft nach einem Aspekt ein Verfahren zur Generation mehrerer Einfarbbilder aus einem durch Intensitätspixel (I¶alpha¶(x,y), I¶beta¶(x,y), I¶gamma¶(x,y)) wenigstens zweier Farbkanäle (alpha, beta, gamma) definierten Mehrfarbbild einer Probe oder eines Objekts, zur Identifizierung von Eigenschaften oder Strukturen des Objekts bzw. der Probe und/oder zur Identifizierung von inhärent vorhandenen oder durch eine Färbebehandlung hinzugefügten Farbstoffen des Objekts bzw. der Probe, wobei die Einfarbbilder durch Intensitätspixel nur eines der Farbkanäle oder durch Intensitätspixel mehrerer der Farbkanäle mit für alle Intensitätspixel gleichem Intensitätsverhältnis zwischen den Farbkanälen oder durch Intensitätspixel nur eines einer definierten Kombination der Farbkanäle entsprechenden resultierenden Farbkanals definiert sind, wobei das Mehrfarbbild zumindest für die Intensitätspixel wenigstens einer Gruppe von Intensitätspixeln jeweils auf einer Überlagerung von verschiedenen Ursprungsfarben zugeordneten Überlagerungsbeiträgen, insbesondere zumindest näherungsweise additiven Intensitätsbeiträgen oder Intensitätsanteilen oder/und zumindest näherungsweise subtraktiven Intensitätsbeiträgen oder Intensitätsanteilen. Es wird vorgeschlagen, dass die Einfarbbilder verschiedenen Ursprungsfarben zugeordnete Überlagerungsbeiträge repräsentieren und auf Grundlage von angenommenen oder vorgegebenen oder aus einer Kalibrierung erhaltenen oder aus dem Mehrfarbbild abgeleiteten ...

Description

Die Erfindung bezieht sich allgemein auf die Trennung einander spektral oder farblich in einem Mehrfarbbild überlagerter bzw. miteinander gemischter Bildbeiträge, beispielsweise verschiedenfarbiger Objekte oder Objektbereiche im insbesondere mikroskopischen Transmissionsbildern.
Rechnerische Verfahren zur spektralen Trennung von Bilddaten sind schon länger in verschienenen Zusammenhängen erwogen worden oder zum Einsatz gekommen. Ein aus dem Jahr 1989 (Boardman 1989) stammendes Verfahren betrifft die Analyse von Luftaufnahmen mittels so genannter „singular value decomposition". Bekannte Spektren werden mittels mathematischer Methoden an das gemessene „gemischte Spektrum" einer unbekannt zusammengesetzten Probe angenähert, um die Beiträge der einzelnen Komponenten zu bestimmen.

Derartige Verfahren sind auch in der Fluoreszenzmikroskopie angewendet worden. Eine Anwendung speziell im Zusammenhang mit einem Imaging-Fourierspektrometer beschreiben Malik et al. in einem im Jahre 1996 publizierten Artikel (Malik, Z. et al.: Fourier transform multipixel spectroscopy for quantitative cytology, J. Microsc 182: 133–140, 1996). In einem Übersichtsartikel aus dem Jahre 1998 (Farkas, D.L. et al.: Non-invasive image acquisition and advanced processing in bioimaging: Computerized Medical Imaging and Graphics 22, 89–102, 1988) wird ein derartiges als „linear-unmixing" bezeichnetes Verfahren als eine Methode zur spektralen Trennung beschrieben. Es werden verschiedene Verfahren und Einrichtungen zur Erzeugung spektral verschiedener Bilder (wie Bandbassfilter, Akusto-optische Filter, Flüssig-Kristallfilter, Interferometer) sowie Analyseverfahren behandelt.

Derartige Methoden zur spektralen Trennung sind auch in der konfokalen Mikroskopie üblich, vgl. etwa kommerzielle Anwendungen der Firmen Zeiss, Olympus, Leica und Biorad. Verwiesen werden kann speziell auf Darstellungen der Anwendung in der konfokalen Mikroskopie in Veröffentlichungen der Firma Zeiss sowie auf die folgenden Veröffentlichungen: H. Bauch: 3D Deconvolution in Microscopic Applications, Imaging & Microscopy 1/10, 1999; R.M. Levenson and C.C. Hoyt: Spectral imaging and microscopy, Am. Lab. 32: 26–34, 2000; M.E. Dickinson, G. Bearman, S. Tille, R. Lansford and S. E. Fraser: Multi-Spectral Imaging and Linear Unmixing Add a Whole New Dimension to Laser Scanning Fluorescence Microscopy, Bio Techniques 31: 1272–1278, 2001.

Die DE 199 15 137 C2 betrifft ein „Verfahren zur Quantifizierung mehrerer Fluorochrome in einer mehrfach gefärbten Probe bei der Fluoreszenzmikroskopie und Verwendungen des Verfahrens". Dieses Patent, das sich ausdrücklich von herkömmlich verwendeten „Ratio-Verfahren" absetzt, ist auf eine spezielle mathematische Trennung relativer Beiträge einzelner Fluorochrome aus aufgenommenen Fluoreszenzintensitäten gerichtet, nämlich durch Anwendung einer multivariaten linearen Regressionsanalyse. Ein insoweit gemäß der Darstellung in DE 199 15 137 C2 herkömmliches „Ratio-Verfahren" ist in der US 4,603,209 beschrieben. Die Separation von vier verschiedenen Fluorochromen bei der Fluoreszenz-gestützten DNA-Sequenzierung auf insoweit herkömmliche Weise durch Lösen eines linearen Gleichungssystems ist in EP 0 294 524 A1 beschrieben.

Zum technischen Hintergrund bzw. speziellen Anwendungen derartiger Verfahren kann ferner verwiesen werden auf: Ellenberg, J., Lippingcott-Schwartz, J. Presley, J. F: Two-color green fluorescent protein time-lapse imaging, Biotechniques 25; 183–846, 1998; Ellenberg, J., Lippincott-Schwartz J, Presley JF: Dual-colour imaging with GFP variants, Trends Cell Biol., 9(2): 52–56, 1999; Farkas, D.L. et al.: Optical image Acquisition, analysis and processing for biomedical applications, in 9^th International Conference on Image Analysis and Processing, Florence, Italy 1997, 11663–11671; Garini Y et al.: Signal to noise analysis of multiple color fluorescence imaging microscopy, Cytometry 35(3): 214–226, 1999; Levenson, M. R., Hoyt C.C: Spectral Imaging and microscopy, American Laboratory 2000: pp 1–4 und Speicher MR, Ward DC: The coloring of cytogenetics, Nature Med. 2: 1046–1048, 846, 1996.

Insoweit zumindest als technischer Hintergrund und allgemein betreffend „Fluoreszenzbasierte Mess- und Analyseverfahren" von Interesse sein könnten ferner die Schriften EP 0 899 558 A2 ; WO 94/18547; EP 0 814 594 A2 ; WO 97/19342; EP 0 967 477 A1 ; EP 1 091 205 A2 ; EP 1 248 132 A2 ; WO 95/13527; WO 96/28084; WO 97/32197; WO 01/13079 A1; WO 01/25779 A2; WO 01/38856 A1 und WO 02/08732 A1.

Durch die Firma Olympus BioSystems GmbH wurde erstmals in einer kommerziellen Anwendung ein derartiges rechnerisches Verfahren zur spektralen Trennung von verschiedenen Fluoreszenzbeiträgen in der Wide-Field-Fluoreszenzmikroskopie angewendet. Typischerweise wird bei Wide-Field-Imaging das ganze Bildfeld mit einer geeigneten Wellenlänge beleuchtet und es wird dann mit einer Kamera, insbesondere CCD-Kamera, die gesamte emittierte Fluoreszenz des Bildes in einer „Aufnahme" festgehalten. Wie auch bei den anderen Anwendungen in anderen Zusammenhängen wird eine spektrale Mischung verschiedener Fluoreszenzbeiträge von verschiedenen Stoffen durch ein rechnerisches Verfahren getrennt (solche Verfahren sind in den verschiedenen einschlägigen Publikationen unter anderem durch die Begriffe „pixel unmixing", „spectral unmixing", „spectral deconvolution" usw. angesprochen). Grundsätzlich müssen Referenzspektren der einzelnen fluoreszierenden Stoffe vorliegen, auf deren Grundlage dann aufgenommene gemischte Spektren "entmischt" werden können.

Ermöglicht wird, Farbstoffe mit stark überlappenden Emissionsspektren gemeinsam aufzunehmen, dann aber die Beiträge der einzelnen Fluorochrome zur Gesamtfluoreszenz zu berechnen. Im Folgenden wird ein Beispiel für eine geeignete Verfahrensführung bei der Wide-Field-Fluoreszenzmikroskopie an biologischen Proben und die spektrale Auswertung anhand der Fluorochrom-Kombination GFP und YFP (bzw. eGFP und eYFP) gegeben:

1. Aufnahme von Referenz/Kalibrierbildern:

Es werden bei gleicher Anregung (z. B. 480 nm für die GFP/YFP-Kombination) bei zwei Emissionswellenbändern (mit Bandpassfiltern, z. B. 510 nm +/– 10 nm, 540 nm +/– 10 nm) jeweils ein Bild für nur „GFP-gelabelte" und für nur „YFP-gelabelte" Zellen aufgenommen. Es entstehen also Bilder GFP_em1, GFP_em2, YFP_em1, YFP_em2. Hieraus lassen sich die Verhältnisse K_GFP = GFP_em1/GFP_em2 und K_YFP = YFP_em1/YFP_em2 berechnen. Diese Verhältnisse sind eine reine Fluorochrome-Eigenschaft und auch bei stark überlappenden Anregungs/Emissionsspektren der beteiligten Fluorochrome in sehr guter Näherung unabhängig von der Anwesenheit eines weiteren Farbstoffs oder Labels. Alternativ können auch verschiedene Anregungswellenlängen und gleiche Emissionsbänder verwendet werden.

2. Aufnahme der interessierenden Bilder im eigentlichen Experiment

Es werden Bilder mit gleichzeitig vorhandenen Fluorochromen GFP und YFP) in den unter 1. genannten Emissionsbändern bzw. – wenn die Verschiedenheit der Fluoreszenz-Response durch unterschiedliche Anregungsbedingungen erzeugt wurde – im gemeinsamen Emissionsband aufgenommen. Man erhält jeweils eine Mischung aus den Fluoreszenzen beider Fluorochrome, EM_1, EM_2: EM_1 = GFP_em1 + YFP_em2 EM_2 = GFP_em2 + YFP_em2

Man kann nun mittels der unter 1. beschriebenen Koeffizienten K_GFP und K_YFP die einzelnen Beiträge GFP_em1, YFP_em1, GFP_em2 und YFP_em2 berechnen. Folgendes lässt sich herleiten: GFP_em1 = K_GFP·(EM_1 – K_YFP·EM_2)/(K_GFP – K_YFP)

In dieser Gleichung sind auf der rechten Seite nur noch gemessene Größen vorhanden, so dass sich GFP_em1 einfach berechnen lässt. Entsprechende Formeln lassen sich auch für die anderen Größen: GFP_em2, YFP_em1, YFP_em2 angeben. Die jeweilige Gesamtintensität berechnet sich dann einfach aus GFP_em1 + GFP_em2, bzw. YFP_em1 + YFP_em2.

3. Mögliche Vereinfachung der Methode:

Sind in den unter 2. beschriebenen Bildern Regionen vorhanden, in denen sicher nur einer der Fluorochrome vorhanden ist, könnte man daran denken, die notwendigen Koeffizienten K_GFP, K_YFP aus diesen Regionen zu bestimmen. Eine Aufnahme von Referenzbildern wäre dann nicht notwendig.

4. Mögliche Erweiterung der Methode:

Diese Methode lässt sich im Prinzip einfach erweitern auf z. B. 3 oder mehr (theoretisch N) Farbstoffe: Es müssten entsprechend Bilder bei z. B. 3 oder mehr (theoretisch N) Emissionswellenlängen aufgenommen werden.

5. Einschränkung/Anwendungsbereich:

Die einzige Eigenschaft eines Fluorochromes, die in die Berechnung eingeht, ist das Verhältnis verschiedener Fluoreszenzen des Fluorochromes. Die Verschiedenheit kann entweder durch die Wahl verschiedener Emissionswellenlängenbänder (Bänder im engeren Sinne, durch Bandpassselektion [z. B. mittels Langpassfilter] oder im weiteren Sinn durch LP-Selektion [z. B. mittels Langpassfilter]) oder verschiedene Anregungswellenbänder erzeugt werden. Wichtig für die Trennung verschiedener Fluorochrome ist, dass sich die entsprechenden Quotienten voneinander unterscheiden. Selbst für teilweise stark überlappenden Fluorochrome sollte sich allerdings recht problemlos ein Anregungs- und/oder Emissionswellenlängenbandpaar finden lassen.

Die sachlich sehr gut zutreffende Prämisse dieses hiermit erstmals im Detail in Bezug auf die Wide-Field-Fluoreszenzmikroskope vorgestellten Analyseverfahrens und der verschiedenen herkömmlichen Implementationen im Stand der Technik in anderen Zusammenhängen ist, dass die Fluoreszenzintensitäten additiv in die Detektion und Analyse eingehen, mit einem linearen Zusammenhang zwischen Intensität der Anregungswellenlängen, den resultierenden Fluoreszenzintensitäten und den detektierten, Fluoreszenzbeiträge von mehreren Fluorochromen enthaltenden Intensitäten. Sättigungseffekte bei der Detektion und bei der Anregung und Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Fluorochromen sind zwar denkbar, spielen in der Praxis aber keine wesentliche Rolle. Das „spektrale Entmischen" gibt deswegen nicht nur qualitative Informationen, sondern ermöglicht eine Quantifizierung der spektral überlappenden Fluorochrome.

Soweit man fluoreszenzmikroskopisch aufgenommene Bilder, die Beiträge mehrerer Fluorochrome zeigen (vgl. Punkt 2. der vorstehenden Darstellung) und aus der „Entmischung" resultierende, nur die Fluoreszenzemission eines jeweiligen Fluorochroms zeigenden Bilder in Falschfarbendarstellung auf einem Bildschirm dargestellt hat, so erfolgte die Entmischung auf Grundlage mehrerer bei verschiedenen Anregungswellenlängen oder Detektionswellenlängen aufgenommenen, nur eine pixelweise Intensitätsinformation in Bezug auf ein Detektionswellenlängenband enthaltenden und insoweit im Falle einer Falschfarbendarstellung als Einfarbbild bezeichenbaren Bildern. Eine die Einfarbbilder einander überlagernde Zusammenführung derartiger Einfarbbilder in einem auf einem Bildschirm anzuzeigenden Mehrfarbbild, das durch Intensitätspixel wenigstens zweier Farbkanäle, insbesondere dreier Farbkanäle, definiert ist, dürfte höchstens für Übersichtszwecke in Betracht kommen. Die Entmischung der von verschiedenen Fluorochromen stammenden Fluoreszenzbeiträge würde in einem solchen Fall zur Vermeidung zusätzlichen Aufwands und im Hinblick auf Informationsverlusten im Mehrfarbbild gegenüber den Ursprungsbildern gemäß den Ansätzen des Standes der Technik auf jeden Fall auf Grundlage der ursprünglichen Einfarbbilder erfolgen.

Der Erfinder hat demgegenüber erkannt, dass auch in Bezug auf ein durch Intensitätspixel wenigstens zweier Farbkanäle definiertes Mehrfarbbild eines Objekts bzw. einer Probe zur Identifizierung von Eigenschaften oder Strukturen des Objekts bzw. der Probe oder/und zur Identifizierung von inhärent vorhandenen oder durch eine Färbebehandlung hinzu gefügten Farbstoffen des Objekts bzw. der Probe eine Art von spektraler oder farblicher Entmischung in Betracht kommt, nämlich wenn das Mehrfarbbild zumindest für die Intensitätspixel wenigstens einer Gruppe von Intensitätspixeln jeweils auf eine Überlagerung von verschiedenen Ursprungsfarben zugeordneten Überlagerungsbeiträgen im Sinne einer Art additiven oder subtraktiven Farbmischung, konkreter insbesondere im Falle zumindest näherungsweise additiven Intensitätsbeiträgen oder Intensitätsanteilen oder/und zumindest näherungsweise subtraktiven Intensitätsbeiträgen oder Intensitätsanteilen und hieraus resultierenden Farben und Farbintensitäten im Mehrfarbbild, beruht, wobei es letztlich unerheblich ist, auf welche Art und Weise das Mehrfarbbild entstanden ist, etwa durch eine fluoreszenzmikroskopische Untersuchung oder durch eine transmissionsmikroskopische oder lichtmikroskopische Untersuchung, etwa mit Hellfeld-Beleuchtung, Dunkelfeld-Beleuchtung oder einer anderen einschlägigen Beleuchtungsart.

Zur Gewinnung von zumindest qualitativen zusätzlichen Informationen aus einem Mehrfarbbild stellt die Erfindung nach einem ersten Aspekt allgemein bereit ein Verfahren zur Generation mehrerer Einfarbbilder aus einem durch Intensitätspixel (I_α(x, y), I_β(x, y), I_γ(x, y)) wenigstens zweier Farbkanäle (α, β, γ) definierten Mehrfarbbild einer Probe oder eines Objekts, zur Identifizierung von Eigenschaften oder Strukturen des Objekts bzw. der Probe oder/und zur Identifizierung von inhärent vorhandenen oder durch eine Färbebehandlung hinzugefügten Farbstoffen des Objekts bzw. der Probe, wobei die Einfarbbilder durch Intensitätspixel nur eines der Farbkanäle oder durch Intensitätspixel mehrerer der Farbkanäle mit für alle Intensitätspixel gleichem Intensitätsverhältnis zwischen den Farbkanälen oder durch Intensitätspixel nur eines einer definierten Kombination der Farbkanäle entsprechenden resultierenden Farbkanals definiert sind, wobei das Mehrfarbbild zumindest für die Intensitätspixel wenigstens einer Gruppe von Intensitätspixeln jeweils auf einer Überlagerung von verschiedenen Ursprungsfarben zugeordneten Überlagerungsbeiträgen, insbesondere zumindest näherungsweise additiven Intensitätsbeiträgen oder Intensitätsanteilen oder/und zumindest näherungsweise subtraktiven Intensitätsbeiträgen oder Intensitätsanteilen, beruht. Erfindungsgemäß wird vorgeschlagen, dass die Einfarbbilder verschiedenen Ursprungsfarben zugeordnete Überlagerungsbeiträge repräsentieren und auf Grundlage von angenommenen oder vorgegebenen oder aus einer Kalibrierung erhaltenen oder aus dem Mehrfarbbild abgeleiteten charakteristischen Intensitätsverhältnissen generiert werden, die Verhältnisse zwischen wenigstens zwei jeweils einem anderen der Farbkanäle zugeordneten Intensitätsbeiträgen oder Intensitätsanteilen, die der gleichen Eigenschaft bzw. Struktur des Objekts bzw. der Probe bzw. dem gleichen Farbstoff der des Objekts bzw. der Probe zugeordnet sind, repräsentieren.

Es wurde hier unterstellt, dass auch herkömmlich schon Einfarbbilder aus Mehrfarbbildern generiert wurden, nämlich zumindest in der Form von Farbauszügen zum Drucken des Mehrfarbbilds durch einen Farbdrucker. Derartige Farbauszüge geben normalerweise keine zusätzliche Information gegenüber dem Mehrfarbbild wie etwa auf einem Bildschirm dargestellt.

Die Erfindung stellt nach einem zweiten spezielleren Aspekt ferner bereit ein Verfahren zur Objekt- oder Probenuntersuchung, bei dem von wenigstens einem Objekt oder wenigstens einer Probe ausgehende oder durch das Objekt oder die Probe durchgelassene optische Strahlung ortsaufgelöst detektiert wird und auf Grundlage der Detektion ein durch Intensitätspixel (I_α(x, y), I_β(x, y), I_γ(x, y)) wenigstens zweier Farbkanäle (α, β, γ) definiertes Mehrfarbbildes des Objekts bzw. der Probe generiert wird, derart, dass das Mehrfarbbild zumindest für die Intensitätspixel wenigstens einer Gruppe von Intensitätspixeln jeweils beruht a) auf einer simultan, ggf. in der Detektion, oder sukzessiv erfolgenden Überlagerung von wenigstens zwei jeweils mindestens einer Eigenschaft oder Struktur des Objekts bzw. der Probe oder/und wenigstens einem inhärent vorhandenen oder durch eine Färbebehandlung hinzugefügten Farbstoff des Objekts bzw. der Probe zugeordneten oder zumindest näherungsweise zuordenbaren Ursprungsfarben, die Überlagerung erfolgend im Sinne einer subtraktiven Farbmischung oder/und auf Grundlage einer bei einer Beleuchtung des Objekts bzw. der Probe mit optischer Strahlung erfolgenden Absorption oder/und Reflektion oder/und Streuung verschiedener spektraler Beiträge optischer Strahlung und dann gleichzeitig oder/und zeitlich aufeinanderfolgenden Detektion verschiedener, ggf. durch ein jeweiliges Detektionswellenlängenband bestimmter, in der optischen Strahlung nach der Absorption oder Reflektion oder Streuung in Transmission verbliebener spektraler Beiträge optischer Strahlung oder/und verschiedener, ggf. durch ein jeweiliges Detektionswellenlängenband bestimmter, von dem Objekt bzw. der Probe reflektierter oder gestreuter spektraler Beiträge optischer Strahlung, wobei die Ursprungsfarben absorbierten oder detektierten Beiträgen optischer Strahlung zugeordnet oder zuordenbar sind im Sinne einer dem jeweiligen Beitrag optischer Strahlung jeweils zugeordneten Fehlfarbe oder im Sinne eines aus einer hypothetischen oder tatsächlichen visuellen Wahrnehmung des jeweiligen Beitrags optischer Strahlung jeweils resultierenden visuellen Farbeindrucks, und b) auf einer einer pixelweisen Repräsentation von aus der Überlagerung der Ursprungsfarben resultierenden Mischfarben durch die Intensitätspixel der Farbkanäle. Erfindungsgemäß wird vorgeschlagen, dass das Verfahren den Schritt umfasst, zur Identifizierung von Eigenschaften oder Strukturen des Objekts bzw. der Probe oder/und zur Identifizierung von inhärent vorhandenen oder durch die Färbebehandlung hinzugefügten Farbstoffen des Objekts bzw. der Probe aus dem durch die Intensitätspixel (I_α(x, y), I_β(x, y), I_γ(x, y)) der wenigstens zwei Farbkanäle (α, β, γ) definierten Mehrfarbbild des Objekts bzw. der Probe mehrere jeweils die pixelweisen Überlagerungsbeiträge einer Ursprungsfarbe für wenigstens einen Farbkanal repräsentierende Einfarbbilder zu generieren, die jeweils durch Intensitätspixel nur eines der Farbkanäle oder durch Intensitätspixel mehrerer der Farbkanäle mit für alle Intensitätspixel gleichem Intensitätsverhältnis zwischen den Farbkanälen oder durch Intensitätspixel nur eines einer definierten Kombination der Farbkanäle entsprechenden resultierenden Farbkanals definiert sind, wobei die Generation der Einfarbbilder auf Grundlage von angenommenen oder vorgegebenen oder aus einer Kalibrierung erhaltenen oder aus dem Mehrfarbbild abgeleiteten charakteristischen Intensitätsverhältnissen erfolgt, die Verhältnisse zwischen wenigstens zwei jeweils einem anderen der Farbkanäle zugeordneten, vorzugsweise additiven oder subtraktiven Intensitätsbeiträgen oder Intensitätsanteilen der Ursprungsfarben entsprechend einer pixelweisen Repräsentation der Ursprungsfarbe durch die Intensitätspixel oder in den Intensitätspixeln der Farbkanäle repräsentieren.

Konkreter wird nach einem zweiten Aspekt insbesondere vorgeschlagen ein Verfahren zur Objekt- oder oder Probenuntersuchung, bei dem von wenigstens einem Objekt oder wenigstens einer Probe ausgehende oder durch das Objekt oder die Probe durchgelassene optische Strahlung ortsaufgelöst detektiert wird und auf Grundlage der Detektion ein durch Intensitätspixel (I_α(x, y), I_β(x, y), I_γ(x, y)) wenigstens zweier Farbkanäle (α, β, γ) definiertes Mehrfarbbildes des Objekts bzw. der Probe generiert wird, derart, dass das Mehrfarbbild zumindest für die Intensitätspixel wenigstens einer Gruppe von Intensitätspixeln jeweils beruht a) auf einer simultan, ggf. in der Detektion, oder sukzessiv erfolgenden Überlagerung von wenigstens zwei jeweils mindestens einer Eigenschaft oder Struktur des Objekts bzw. der Probe oder/und wenigstens einem inhärent vorhandenen oder durch eine Färbebehandlung hinzugefügten Farbstoff des Objekts bzw. der Probe zugeordneten oder zumindest näherungsweise zuordenbaren farbkanalbezogenen Ursprungs-Intensitätswerten, die Überlagerung erfolgend auf Grundlage einer bei einer Beleuchtung des Objekts bzw. der Probe mit optischer Strahlung erfolgenden Absorption oder/und Reflektion oder/und Streuung verschiedener spektraler Beiträge optischer Strahlung und dann gleichzeitig oder/und zeitlich aufeinanderfolgenden Detektion verschiedener, ggf. durch ein jeweiliges Detektionswellenlängenband bestimmter, in der optischen Strahlung nach der Absorption oder Reflektion oder Streuung in Transmission verbliebener spektraler Beiträge optischer Strahlung oder/und verschiedener, ggf. durch ein jeweiliges Detektionswellenlängenband bestimmter, von dem Objekt bzw. der Probe reflektierter oder gestreuter spektraler Beiträge optischer Strahlung, wobei die vorzugsweise zumindest näherungsweise additiv oder subtraktiv in die Überlagerung eingehenden Ursprungs-Intensitätswerte absorbierte oder detektierte Beiträge optischer Strahlung repräsentieren, und b) auf einer einer pixelweisen Repräsentation von aus der Überlagerung der Ursprungs-Intensitätswerte resultierenden farbkanalbezogenen Folge-Intensitätswerten durch die Intensitätspixel der Farbkanäle. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass das Verfahren den Schritt umfasst, zur Identifizierung von Eigenschaften oder Strukturen des Objekts bzw. der Probe oder/und zur Identifizierung von inhärent vorhandenen oder durch die Färbebehandlung hinzugefügten Farbstoffen des Objekts bzw. der Probe aus dem durch die Intensitätspixel (I_α(x, y), I_β(x, y), I_γ(x, y)) der wenigstens zwei Farbkanäle (α, β, γ) definierten Mehrfarbbild des Objekts bzw. der Probe mehrere jeweils die pixelweisen Überlagerungsbeiträge durch die Ursprungs-Intensitätswerte für wenigstens einen Farbkanal repräsentierende Einfarbbilder zu generieren, die jeweils durch Intensitätspixel nur eines der Farbkanäle oder durch Intensitätspixel mehrerer der Farbkanäle mit für alle Intensitätspixel gleichem Intensitätsverhältnis zwischen den Farbkanälen oder durch Intensitätspixel nur eines einer definierten Kombination der Farbkanäle entsprechenden resultierenden Farbkanals definiert sind, wobei die Generation der Einfarbbilder auf Grundlage von angenommenen oder vorgegebenen oder aus einer Kalibrierung erhaltenen oder aus dem Mehrfarbbild abgeleiteten charakteristischen Intensitätsverhältnissen erfolgt, die Verhältnisse zwischen wenigstens zwei jeweils einem anderen der Farbkanäle zugeordneten Ursprungs-Intensitätswerten, die der gleichen Eigenschaft bzw. Struktur des Objekts bzw. der Probe bzw. dem gleichen Farbstoff des Objekts bzw. der Probe zugeordnet sind, repräsentieren.

Nach einem weiteren spezielleren, dritten Aspekt stellt die Erfindung ferner bereit ein Verfahren zur Objekt- oder Probenuntersuchung, bei dem von wenigstens einem Objekt oder wenigstens einer Probe ausgehende oder durch das Objekt oder die Probe durchgelassene optische Strahlung ortsaufgelöst detektiert wird und auf Grundlage der Detektion ein durch Intensitätspixel (I_α(x, y), I_β(x, y), I_γ(x, y)) wenigstens zweier Farbkanäle (α, β, γ) definiertes Mehrfarbbildes des Objekts bzw. der Probe generiert wird, derart, dass das Mehrfarbbild zumindest für die Intensitätspixel wenigstens einer Gruppe von Intensitätspixeln jeweils beruht a') auf einer simultan, ggf. in der Detektion, oder sukzessiv erfolgenden Überlagerung von wenigstens zwei jeweils mindestens einer Eigenschaft oder Struktur des Objekts bzw. der Probe oder/und wenigstens einem inhärent vorhandenen oder durch eine Färbebehandlung hinzugefügten Farbstoff des Objekts bzw. der Probe zugeordneten oder zumindest näherungsweise zuordenbaren Ursprungsfarben, die Überlagerung erfolgend im Sinne einer additiven Farbmischung der Ursprungsfarben oder/und auf Grundlage einer von dem Objekt bzw. der Probe ausgehenden Emission und dann gleichzeitig oder/und zeitlich aufeinanderfolgenden Detektion verschiedener, ggf. durch ein jeweiliges Detektionswellenlängenband bestimmter spektraler Beiträge optischer Strahlung, wobei die Ursprungsfarben detektierten Beiträgen optischer Strahlung zugeordnet oder zuordenbar sind im Sinne einer dem jeweiligen Beitrag optischer Strahlung jeweils zugeordneten Fehlfarbe oder im Sinne eines aus einer hypothetischen oder tatsächlichen visuellen Wahrnehmung des jeweiligen Beitrags optischer Strahlung jeweils resultierenden visuellen Farbeindrucks, und b) auf einer einer pixelweisen Repräsentation von aus der Überlagerung der Ursprungsfarben resultierenden Mischfarben durch die Intensitätspixel der Farbkanäle. Erfindungsgemäß wird vorgeschlagen, dass das Verfahren den Schritt umfasst, zur Identifizierung von Eigenschaften oder Strukturen des Objekts bzw. der Probe oder/und zur Identifizierung von inhärent vorhandenen oder durch die Färbebehandlung hinzugefügten Farbstoffen des Objekts bzw. der Probe aus dem durch die Intensitätspixel (I_α(x, y), I_β(x, y), I_γ(x, y)) der wenigstens zwei Farbkanäle (α, β, γ) definierten Mehrfarbbild des Objekts bzw. der Probe mehrere jeweils die pixelweisen Überlagerungsbeiträge einer Ursprungsfarbe für wenigstens einen Farbkanal repräsentierende Einfarbbilder zu generieren, die jeweils durch Intensitätspixel nur eines der Farbkanäle oder durch Intensitätspixel mehrerer der Farbkanäle mit für alle Intensitätspixel gleichem Intensitätsverhältnis zwischen den Farbkanälen oder durch Intensitätspixel nur eines einer definierten Kombination der Farbkanäle entsprechenden resultierenden Farbkanals definiert sind, wobei die Generation der Einfarbbilder auf Grundlage von angenommenen oder vorgegebenen oder aus einer Kalibrierung erhaltenen oder aus dem Mehrfarbbild abgeleiteten charakteristischen Intensitätsverhältnissen erfolgt, die Verhältnisse zwischen wenigstens zwei jeweils einem anderen der Farbkanäle zugeordneten, vorzugsweise additiven Intensitätsbeiträgen oder Intensitätsanteilen der Ursprungsfarben entsprechend einer pixelweisen Repräsentation der Ursprungsfarbe durch die Intensitätspixel oder in den Intensitätspixeln der Farbkanäle repräsentieren.

Konkreter wird nach dem dritten Aspekt insbesondere vorgeschlagen ein Verfahren zur Objekt- oder Probenuntersuchung, bei dem von wenigstens einem Objekt oder wenigstens einer Probe ausgehende oder durch das Objekt oder die Probe durchgelassene optische Strahlung ortsaufgelöst detektiert wird und auf Grundlage der Detektion ein durch Intensitätspixel (I_α(x, y), I_β(x, y), I_γ(x, y)) wenigstens zweier Farbkanäle (α, β, γ) definiertes Mehrfarbbildes des Objekts bzw. der Probe generiert wird, derart, dass das Mehrfarbbild zumindest für die Intensitätspixel wenigstens einer Gruppe von Intensitätspixeln jeweils beruht a') auf einer simultan, ggf. in der Detektion, oder sukzessiv erfolgenden Überlagerung von wenigstens zwei jeweils mindestens einer Eigenschaft oder Struktur des Objekts bzw. der Probe oder/und wenigstens einem inhärent vorhandenen oder durch eine Färbebehandlung hinzugefügten Farbstoff des Objekts bzw. der Probe zugeordneten oder zumindest näherungsweise zuordenbaren farbkanalbezogenen Ursprungs-Intensitätswerten, die Überlagerung erfolgend auf Grundlage einer von dem Objekt bzw. der Probe ausgehenden Emission und dann gleichzeitig oder/und zeitlich aufeinanderfolgenden Detektion verschiedener, ggf. durch ein jeweiliges Detektionswellenlängenband bestimmter spektraler Beiträge optischer Strahlung, wobei die vorzugsweise zumindest näherungsweise additiv in die Überlagerung eingehenden Ursprungs-Intensitätswerte detektierte Beiträge optischer Strahlung repräsentieren, und b) auf einer einer pixelweisen Repräsentation von aus der Überlagerung der Ursprungs-Intensitätswerte resultierenden farbkanalbezogenen Folge-Intensitätswerten durch die Intensitätspixel der Farbkanäle. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass das Verfahren den Schritt umfasst, zur Identifizierung von Eigenschaften oder Strukturen des Objekts bzw. der Probe oder/und zur Identifizierung von inhärent vorhandenen oder durch die Färbebehandlung hinzugefügten Farbstoffen des Objekts bzw. der Probe aus dem durch die Intensitätspixel (I_α(x, y), I_β(x, y), I_γ(x, y)) der wenigstens zwei Farbkanäle (α, β, γ) definierten Mehrfarbbild des Objekts bzw. der Probe mehrere jeweils die pixelweisen Überlagerungsbeiträge durch die Ursprungs-Intensitätswerte für wenigstens einen Farbkanal repräsentierende Einfarbbilder zu generieren, die jeweils durch Intensitätspixel nur eines der Farbkanäle oder durch Intensitätspixel mehrerer der Farbkanäle mit für alle Intensitätspixel gleichem Intensitätsverhältnis zwischen den Farbkanälen oder durch Intensitätspixel nur eines einer definierten Kombination der Farbkanäle entsprechenden resultierenden Farbkanals definiert sind, wobei die Generation der Einfarbbilder auf Grundlage von angenommenen oder vorgegebenen oder aus einer Kalibrierung erhaltenen oder aus dem Mehrfarbbild abgeleiteten charakteristischen Intensitätsverhältnissen erfolgt, die Verhältnisse zwischen wenigstens zwei jeweils einem anderen der Farbkanäle zugeordneten Ursprungs-Intensitätswerten, die der gleichen Eigenschaft bzw. Struktur des Objekts bzw. der Probe bzw. dem gleichen Farbstoff des Objekts bzw. der Probe zugeordnet sind, repräsentieren.

Die im Zusammenhang mit dem dritten Aspekt in Betracht gezogene Anwendung der Erfindung bei fluoreszenzbasierten Untersuchungen, insbesondere in der Fluoreszenzmikroskopie (speziell auch der Wide-Field-Fluoreszenzmikroskopie), bietet gegenüber dem eingangs diskutierten Stand der Technik normalerweise eher Nachteile, da das dem erfindungsgemäßen „Entmischen" zugrunde liegende Mehrfarbbild aus den detektierten, in einer Falschfarbendarstellung darstellbaren Intensitätsbildern für die ortsaufgelöst detektierte Fluoreszenzintensität in einem Detektionswellenlängenband erst noch generiert werden müsste, wobei je nach gewählten Falschfarben eine resultierende zusätzliche Farbmischung berücksichtigt werden müsste, die zu Informationsverlusten und erhöhtem Entmischungsaufwand führen kann. Es erscheint aber nicht ausgeschlossen, dass in speziellen Untersuchungs-Arbeitsabläufen trotzdem die Anwendung der Erfindung auf solche fluoreszenzbasierte Mehrfarbbilddaten in Betracht kommt. Demgegenüber dürfte von größerem Interesse die Anwendung der Erfindung auf mehrfarbige Bilddaten sein, die gewissermaßen in der Farbe versteckte Überlagerungsbeiträge aufgrund mehrerer verschiedener Überlagerungsmechanismen enthält, beispielsweise eine transmissions- oder Durchlicht-mikroskopische Untersuchung, etwa eine Hellfeld-mikroskopische Untersuchung oder eine andere transmissionsmikroskopische oder lichtmikroskopische Untersuchung beliebiger Beleuchtungsart, mit zusätzlichen Fluoreszenzstrahlungsbeiträgen aufgrund einer gleichzeitigen Anregung von im sichtbaren Wellenlängenbereich emittierenden Fluorophoren. Es wird deswegen bezogen auf die Erfindung nach dem ersten Aspekt weiterbildend vorgeschlagen, dass das Mehrfarbbild zumindest für die Intensitätspixel wenigstens einer Teilgruppe der wenigstens einen Gruppe von Intensitätspixeln jeweils ferner beruht a') auf einer simultan, ggf. in der Detektion, oder sukzessiv erfolgenden Überlagerung von wenigstens zwei jeweils mindestens einer Eigenschaft oder Struktur des Objekts bzw. der Probe oder/und wenigstens einem inhärent vorhandenen oder durch eine Färbebehandlung hinzugefügten Farbstoff des Objekts bzw. der Probe zugeordneten oder zumindest näherungsweise zuordenbaren Ursprungsfarben, die Überlagerung erfolgend im Sinne einer additiven Farbmischung der Ursprungsfarben oder/und auf Grundlage einer von dem Objekt bzw. der Probe ausgehenden Emission und dann gleichzeitig oder/und zeitlich aufeinanderfolgenden Detektion verschiedener, ggf. durch ein jeweiliges Detektionswellenlängenband bestimmter spektraler Beiträge optischer Strahlung, wobei die Ursprungsfarben detektierten Beiträgen optischer Strahlung zugeordnet oder zuordenbar sind im Sinne einer dem jeweiligen Beitrag optischer Strahlung jeweils zugeordneten Fehlfarbe oder im Sinne eines aus einer hypothetischen oder tatsächlichen visuellen Wahrnehmung des jeweiligen Beitrags optischer Strahlung jeweils resultierenden visuellen Farbeindrucks.

Konkreter wird weiterbildend insbesondere vorgeschlagen, dass das Mehrfarbbild zumindest für die Intensitätspixel wenigstens einer Teilgruppe der wenigstens einen Gruppe von Intensitätspixeln jeweils ferner beruht a') auf einer simultan, ggf. in der Detektion, oder sukzessiv erfolgenden Überlagerung von wenigstens zwei jeweils mindestens einer Eigenschaft oder Struktur des Objekts bzw. der Probe oder/und wenigstens einem inhärent vorhandenen oder durch eine Färbebehandlung hinzugefügten Farbstoff des Objekts bzw. der Probe zugeordneten oder zumindest näherungsweise zuordenbaren farbkanalbezogenen Ursprungs-Intensitätswerten, die Überlagerung erfolgend auf Grundlage einer von dem Objekt bzw. der Probe ausgehenden Emission und dann gleichzeitig oder/und zeitlich aufeinanderfolgenden Detektion verschiedener, ggf. durch ein jeweiliges Detektionswellenlängenband bestimmter spektraler Beiträge optischer Strahlung, wobei die Ursprungs-Intensitätswerte detektierte Beiträge optischer Strahlung repräsentieren.

Es wird vor allem daran gedacht, dass ein jeweiliger Überlagerungsbeitrag als Intensitätsanteil oder Intensitätsbeitrag für einen jeweiligen Farbkanal aufzufassen ist, welcher Intensitätsanteil bzw. Intensitätsbeitrag auf Grundlage eines linearen, subtraktiven oder additiven Ansatzes in der Überlagerung auf eine jeweilige Eigenschaften bzw. Struktur bzw. einen jeweiligen Farbstoff des Objekts bzw. der Probe zurückführbar ist. Insbesondere wird daran gedacht, dass ein jeweiliger Überlagerungsbeitrag auf Grundlage eines linearen, subtraktiven Ansatzes als in Transmission durch Absorption in Folge einer jeweiligen Eigenschaft bzw. durch eine jeweilige Struktur bzw. einen jeweiligen Farbstoff des Objekts bzw. der Probe aus der optischen Strahlung entfernter Intensitätsanteil für einen jeweiligen Farbkanal aufzufassen ist.

Ferner kommt es in Betracht, dass ein jeweiliger Überlagerungsbeitrag auf Grundlage eines linearen, additiven Ansatzes als in Folge einer jeweilige Eigenschaft vom Objekt bzw. der Probe bzw. von einer jeweiligen Struktur bzw. einem jeweiligen Farbstoff des Objekts bzw. der Probe ausgehender additiver Intensitätsbeitrag für einen jeweiligen Farbkanal aufzufassen ist. In diesem Zusammenhang wird speziell daran gedacht, das ein jeweiliger Überlagerungsbeitrag als additiver Intensitätsbeitrag in Folge einer Anregung eines Farbstoffs und hieraus resultierender Emission optischer Strahlung durch den Farbstoff für den jeweiligen Farbkanal aufzufassen ist.

Man kann vorsehen, dass für eine jeweilige Ursprungsfarbe mehrere jeweils die Überlagerungsbeiträge der Ursprungsfarbe für einen anderen der Farbkanäle repräsentierende Einfarbbilder generiert werden oder/und dass für eine jeweilige Ursprungsfarbe ein Gesamt-Überlagerungsbeiträge der Ursprungsfarbe zu den Farbkanälen repräsentierendes Einfarbbild generiert wird, welches einer pixelweisen Kombination der Intensitätspixel der jeweils die Überlagerungsbeiträge der Ursprungsfarbe für die Farbkanäle repräsentierenden Einfarbbilder, insbesondere einer pixelweisen Kombination enthaltend eine Summation der Intensitätswerte der Intensitätspixel der jeweils den Überlagerungsbeitrag der Ursprungsfarbe für die Farbkanäle repräsentierenden Einfarbbilder, entspricht. Konkreter kann man insbesondere vorsehen, dass bezogen auf eine jeweilige Eigenschaft bzw. Struktur des Objekts bzw. der Probe bzw. auf einen jeweiligen Farbstoff des Objekts bzw. der Probe mehrere jeweils die Überlagerungsbeiträge durch die Ursprungs-Intensitätswerte für einen anderen Farbkanäle repräsentierende Einfarbbilder generiert werden oder/und dass bezogen auf eine jeweilige Eigenschaft bzw. Struktur des Objekts bzw. der Probe bzw. auf einen jeweiligen Farbstoff des Objekts bzw. der Probe ein Gesamt-Überlagerungsbeiträge zu den Farbkanälen repräsentierendes Einfarbbild generiert wird, welches einer pixelweisen Kombination der Intensitätspixel der jeweils die Überlagerungsbeiträge durch die Ursprungs-Intensitätswerte repräsentierenden Einfarbbilder, insbesondere einer pixelweisen Kombination enthaltend eine Summation von Ursprungs-Intensitätswerten für die Farbkanäle, entspricht.

Das Mehrfarbbild des Objekts bzw. der Probe wird in der Regel durch Intensitätspixel (I_α(x, y), I_β(x, y), I_γ(x, y)) wenigstens dreier Farbkanäle (α, β, γ) definiert sein, vor allem durch Intensitätspixel genau dreier Farbkanäle. Es kann sich um übliche Farbkanäle wie für eine computergestützte Darstellung auf einem elektronischen Bildschirm handeln.

Es wird unter anderem daran gedacht, dass die optische Strahlung zeitgleich oder zeitlich aufeinanderfolgend in wenigstens zwei, vorzugsweise wenigstens drei verschiedenen, spektral gegeneinander versetzten, ggf. sich spektral überlappenden Detektionswellenlängenbändern einer Detektoranordnung detektiert wird. Dabei kann man vorsehen, dass die Detektionswellenlängenbänder jeweils einem von mehreren Detektionsfarbkanälen der als Farbbild-Detektoranordung ausgeführten Detektoranordnung zugeordnet sind, wobei die Detektionsfarbkanäle verschiedenen mit den Detektionswellenlängenbändern korrespondierenden Primärfarben zugeordnet sind, aus denen nach Maßgabe eines für den jeweiligen Detektionsfarbkanal pixelweise detektierten Intensitätwerts eine für den jeweiligen Pixel oder eine Gruppe von jeweils einem der Farbkanäle zugeordnete Pixeln detektierte Farbe additiv mischbar ist. Weiterbildend wird vorgeschlagen, dass die Farbkanäle der Detektoranordnung den Farbkanälen entsprechen, auf deren Grundlage das Mehrfarbbild definiert ist, so dass die Detektoranordnung unmittelbar das Mehrfarbbild bereitstellt oder wenigstens ein Zwischen-Mehrfarbbild bereitstellt, aus dem das Mehrfarbbild ohne Umrechnung zu einer Farbdarstellung auf Grundlage anderer Primärfarben generiert wird. Alternativ kann man vorsehen, dass die Farbkanäle der Detektoranordnung von den Farbkanälen abweichen, auf deren Grundlage das Mehrfarbbild definiert ist, so dass die Detektoranordnung wenigstens ein Zwischen-Mehrfarbbild bereitstellt, aus dem das Mehrfarbbild unter Umrechnung zu einer Farbdarstellung auf Grundlage von der Repräsentation der Überlagerung, insbesondere der Repräsentation der Mischfarben bzw. Folge-Intensitätswerten zugrundeliegenden Primärfarben generiert wird.

Es wird unter anderem daran gedacht, dass die Überlagerung eine gleichzeitige Emission mehrerer verschiedener spektraler Beiträge optischer Strahlung und dann eine gleichzeitige Detektion dieser Beiträge umfasst. Es kommt aber durchaus auch in Betracht, dass die Überlagerung eine zeitlich aufeinander folgende Emission verschiedener spektraler Beiträge optischer Strahlung und dementsprechend dann eine zeitlich aufeinander folgende Detektion dieser Beträge und dann eine pixelweise Überlagerung mehrerer aus der Detektion jeweils erhaltener Zwischen-Einfarbbilder oder Zwischen-Mehrfarbbilder zu dem Mehrfarbbild umfasst. Dabei kann vorgesehen sein, dass wenigstens eines der Zwischen-Einfarbbilder oder Zwischen-Mehrfarbbilder selbst auf einer Überlagerung beruht, die eine gleichzeitige Emission mehrerer verschiedener spektraler Beiträge optischer Strahlung und dann eine gleichzeitige Detektion dieser Beiträge umfasst.

Wie schon angedeutet, kann die oben angesprochene Emission der spektralen Beiträge optischer Strahlung auf einer optischen Anregung durch optische Anregungsstrahlung beruhen. Dabei ist es möglich, dass die Emission der spektralen Beiträge auf einer optischen Anregung durch verschiedene, ggf. durch ein jeweiliges Anregungswellenlängenband bestimmte spektrale Beiträge optischer Anregungsstrahlung beruht. Es wird allgemein in diesem Zusammenhang daran gedacht, dass verschiedenen Eigenschaften bzw. Strukturen des Objekts bzw. der Probe bzw. verschiedenen Farbstoffen, insbesondere Flurochromen, des Objekts bzw. der Probe verschiedene Detektionswellenlängenbänder oder/und verschiedene Anregungswellenlängenbänder zugeordnet sind. Speziell kann man zweckmäßigerweise vorsehen, dass verschiedenen Eigenschaften bzw. Strukturen des Objekts bzw. der Probe bzw. verschiedenen Farbstoffen, insbesondere Flurochromen, des Objekts bzw. der Probe verschiedene Detektionswellenlängenbänder und gleiche Anregungswellenlängenbänder oder gleiche Detektionswellenlängenbänder und verschiedene Anregungswellenlängenbänder zugeordnet sind.

Im Zusammenhang mit einer konkreten Anwendung der Erfindung wird vor allem daran gedacht, dass die Überlagerung eine gleichzeitige oder nacheinander erfolgende Detektion verschiedener spektraler Beiträge optischer Strahlung basierend auf der gleichen Beleuchtung des Objekts bzw. der Probe mit optischer Strahlung umfasst, insbesondere eine Untersuchung des Objekts bzw. der Probe in Transmission (Durchlicht). In Betracht kommen insbesondere transmissionsmikroskopische, etwa Hellfeld-transmissionsmikroskopische oder Dunkelfeld-transmissionsmikroskopische Anwendungen.

Weiterbildend wird vorgeschlagen, dass die Überlagerung eine gleichzeitige oder nacheinander erfolgende Detektion verschiedener spektraler Beiträge optischer Strahlung basierend auf der gleichen Beleuchtung des Objekts bzw. der Probe mit multispektraler, vorzugsweise breitbandiger optischer Strahlung, höchstvorzugsweise Weißlicht, umfasst. In dem Mehrfarbbild resultierende Farbinformation beruht dann vor allem auf spektral-selektiver Absorption, etwa durch inhärent vorhandene oder durch eine Färbebehandlung eingebrachte Farbstoffe.

Allgemein wird daran gedacht, dass innerhalb der Detektionswellenlängenbändern der Detektoranordnung für die spektralen Beiträge optischer Strahlung einander zugeordnete einzelne spektrale Teilbeiträge eines jeweiligen Beitrags der optischen Strahlung oder aus einer Überlagerung mehrerer spektraler Beiträge optischer Strahlung resultierende spektrale Überlagerungs-Teilbeiträge, die einer Überlagerung jeweiliger spektraler Teilbeiträge der einander überlagerten spektralen Beiträge optischer Strahlung entsprechen, pixelweise detektiert werden. In diesem Zusammenhang wird ferner daran gedacht, dass aus den Teilbeiträgen nach Maßgabe eines für den jeweiligen Detektionsfarbkanal pixelweise detektierten Intensitätwerts eine für den jeweiligen Pixel oder eine Gruppe von jeweils einem der Farbkanäle zugeordnete Pixeln detektierte Farbe, insbesondere Ursprungsfarbe oder zur Ursprungsfarbe komplementäre Farbe, additiv mischbar ist bzw. dass aus den Überlagerungs-Teilbeiträgen nach Maßgabe eines für den jeweiligen Detektionsfarbkanal pixelweise detektierten Intensitätwerts eine für den jeweiligen Pixel oder eine Gruppe von jeweils einem der Farbkanäle zugeordnete Pixeln detektierte Farbe, insbesondere aus der Überlagerung von Ursprungsfarben oder von hierzu komplementären Farben resultierende Mischfarbe, additiv mischbar ist.

Gemäß einer besonders zweckmäßigen Ausgestaltung der Erfindung in ihren verschiedenen Aspekten ist vorgesehen, dass die Generation der die Überlagerungsbeiträge repräsentierenden Einfarbbilder für jeden Pixel der Gruppe bzw. Teilgruppe mathematische Operationen umfasst, die die Lösung eines linearen Gleichungssystem mit mehreren Unbekannten durch Methoden der linearen Algebra oder Ratio-Verfahren umfassen oder mathematisch der exakten oder approximativen Lösung eines solchen Gleichungssystems entsprechen. Dabei wird vor allem daran gedacht, dass die Zahl der linearen Gleichungen pro Pixel maximal der Zahl der Farbkanäle entspricht. Es können dann normalerweise drei verschiedene, jeweils einen farblichen oder intensitätsmäßigen Mischungsbeitrag zeigende, voneinander unabhängige Einfarbbilder generiert werden, die beispielsweise die Mischungsbeiträge von drei verschiedenen Farben oder Färbungen des Objekts bzw. der Probe zeigen. Die mathematischen Operationen umfassen in diesem Fall die Lösung eines linearen Gleichungssystems von drei Gleichungen mit drei Unbekannten durch Methoden der linearen Algebra oder Ratio-Verfahren oder entsprechen mathematisch der exakten oder approximativen Lösung eines solchen Gleichungssystems.

Es wird in diesem Zusammenhang, speziell auch (aber nicht ausschließlich) unter Bezugnahme auf den dritten Aspekt der Erfindung, daran gedacht, dass die Generation der Einfarbbilder auf einem Gleichungssystem beruht, dessen Gleichungen für drei Farbkanäle allgemein die folgende Form haben oder in die folgende Form bringbar sind: Iα(x, y) = Iα(x, y, f1) + Iα(x, y, f2) + Iα(x, y, f3) Iβ(x, y) = Iβ(x, y, f1) + Iβ(x, y, f2) + Iβ(x, y, f3) Iγ(x, y) = Iγ(x, y, f1) + Iγ(x, y, f2) + Iγ(x, y,f3),wobei I_α(x, y), I_β(x, y), I_γ(x, y) die Intensitätswerte der Intensitätspixel des Mehrfarbbilds für die drei Farbkanäle α, β und γ sind, die Koordinaten x, y einen jeweiligen Pixel identifizieren und die Terme rechts der Gleichheitszeichen jeweils einen additiven Überlagerungsbeitrag zum Intensitätswert des jeweiligen Farbkanals α bzw. β bzw. γ in Folge einer Eigenschaft bzw. Struktur oder eines Farbstoffs f1 bzw. f2 bzw. f3 der Probe bzw. des Objekts angeben.

Ferner wird in diesem Zusammenhang, speziell auch (aber nicht ausschließlich) unter Bezugnahme auf den zweiten Aspekt der Erfindung, daran gedacht, dass die Generation der Einfarbbilder auf einem Gleichungssystem beruht, dessen Gleichungen für drei Farbkanäle allgemein die folgende Form haben oder in die folgende Form bringbar sind: Iα(x, y) = Iα MAX – Iα(x, y, f1) – Iα(x, y, f2) – Iα(x, y, f3) Iβ(x, y) = Iβ MAX – Iβ(x, y, f1) – Iβ(x, y, f2) – Iβ(x, y, f3) Iγ(x, y) = Iγ MAX – Iγ(x, y, f1) – Iγ(x, y, f2) – Iγ(x, y, f3),wobei I_α(x, y), I_β(x, y), I_γ(x, y) die Intensitätswerte der Intensitätspixel des Mehrfarbbilds für die drei Farbkanäle α, β und γ sind, die Koordinaten x, y einen jeweiligen Pixel identifizieren, die Terme I_α ^MAX, I_β ^MAX, I_γ ^MAX einen für eine gegebene Untersuchungssituation maximal möglichen Intensitätswert für den jeweiligen Farbkanal α bzw. β bzw. γ angeben und die übrigen Terme rechts der Gleichheitszeichen jeweils einen subtraktiven Überlagerungsbeitrag zum Intensitätswert des jeweiligen Farbkanals α bzw. β bzw. γ in Folge einer Eigenschaft bzw. Struktur oder eines Farbstoffs f1 bzw. f2 bzw. f3 der Probe bzw. des Objekts angeben. Betreffend die einen maximal möglichen Intensitätswert für die Farbkanäle α, β und γ angebenden Therme I_α ^MAX, I_β ^MAX, I_γ ^MAX wird daran gedacht, dass diese vorgegeben sind. Demgegenüber wird als besonders bevorzugt daran gedacht, dass diese Therme aus dem Mehrfarbbild bestimmt werden, vorzugsweise durch Bestimmung einer maximalen Pixelintensität für den jeweiligen Farbkanal aus allen Intensitätspixeln.

Eine besonders bevorzugte Durchführung der spektralen bzw. farblichen Entmischung sieht vor, dass das jeweilige Gleichungssystem für die Terme I_α(x, y, f1), I_β(x, y, f1), I_γ(x, y, f1) oder/und für die Terme I_α(x, y, f2), I_β(x, y, f2), I_γ(x, y, f2) oder/und für die Terme I_α(x, y, f3), I_β(x, y, f3), I_γ(x, y, f3) gelöst wird auf Grundlage von charakteristischen Intensitätsverhältnissen Rαβ(f1) = Iα(f1)/Iβ(f1) Rαγ(f1) = Iα(f1)/Iγ(f1) Rαβ(f2) = Iα(f2)/Iβ(f2) Rαγ(f2) = Iα(f2)/Iγ(f2) Rαβ(f3) = Iα(f3)/Iβ(f3) Rαγ(f3) = Iα(f3)/Iγ(f3)oder hieraus ableitbaren charakteristischen Intensitätsverhältnissen, die das Verhältnis zwischen zwei zu verschiedenen Farbkanälen a, b additiv oder subtraktiv beitragenden Überlagerungsbeiträgen I_a(), I_b() in Folge der gleichen Eigenschaft bzw. Struktur oder des gleichen Farbstoffs f1 bzw. f2 bzw. f3 der Probe bzw. des Objekts angeben, wobei a, b jeweils auf zwei verschiedene der Farbkanäle α, β, γ verweisen.

Dabei kann man vorteilhaft vorsehen, dass die charakteristischen Intensitätsverhältnisse aus dem Mehrfarbbild bestimmt werden, vorzugsweise auf Grundlage einer Identifizierung von Bildbereichen, die ohne Überlagerung mehrerer additiver oder substraktiver Überlagerungsbeiträge für einen jeweiligen Farbkanal nur auf additiven oder subtraktiven Intensitätsbeiträgen I_α(x, y, f1), I_β(x, y, f1), I_β(x, y, f1) bzw. I_α(x, y, f2), I_β(x, y, f2), I_γ(x, y, f2) bzw. I_α(x, y, f3), I_β(x, y, f3), I_γ(x, y, f3) in Folge genau einer Eigenschaft bzw. Struktur oder genau eines Farbstoffs f1 bzw. f2 bzw. f3 der Probe bzw. des Objekts beruhen. Gesonderte Kalibrierungs- oder Referenzmessungen sind dann entbehrlich. Dies wird aber nicht immer möglich sein. Deswegen wird als Alternative vorgeschlagen, dass die charakteristischen Intensitätsverhältnisse aus für Kalibrier-Proben oder Kalibrier-Objekte generierten Kalibrier-Mehrfarbbildern bestimmt werden, wobei die Kalibrier-Proben oder Kalibrier-Objekte derart gewählt oder präpariert sind, dass sie zumindest in einem Bildbereich des Kalibrier-Mehrfarbbilds ohne Überlagerung mehrerer additiver oder substraktiver Überlagerungsbeiträge für einen jeweiligen Farbkanal nur auf additiven oder subtraktiven Intensitätsbeiträgen I_α(x, y, f1), I_β(x, y, f1), I_γ(x, y, f1) bzw. I_α(x, y, f2), I_β(x, y, f2), I_γ(x, y, f2) bzw. I_α(x, y, f3), I_β(x, y, f3), I_γ(x, y, f3) in Folge genau einer Eigenschaft bzw. Struktur oder genau eines Farbstoffs f1 bzw. f2 bzw. f3 der für die Probe insoweit repräsentativen Kalibrier-Probe bzw. des in soweit für das Objekt repräsentativen Kalibrier-Objekts beruhen.

Nach einem mit der Erfindung nach dem zweiten Aspekt in Zusammenhang stehenden vierten Aspekt stellt die Erfindung ferner bereit ein Verfahren zur Objekt- oder Probenuntersuchung, bei dem von einem Objekt oder einer Probe in Transmission für mehrere verschiedene, spektral gegeneinander versetzte Detektionswellenlängenbänder jeweils ein in ortsaufgelöst erfassten Intensitätswerten eine Abschwächung von durch das Objekt bzw. die Probe hindurchgehender optischer Strahlung im jeweiligen Detektionswellenlängenband aufgrund von Absorption angebendes Bild des Objekts bzw. der Probe aufgenommen wird und bei dem auf Grundlage von angenommenen oder vorgegebenen oder aus einer Kalibrierung erhaltenen oder aus mehreren der Bilder abgeleiteten charakteristischen Intensitätsverhältnissen aus den Bildern resultierende Bilder generiert werden, die Absorptionsanteile auf Grund verschiedener, die optische Strahlung absorbierender Eigenschaften oder/und Strukturen des Objekts bzw. der Probe oder/und auf Grund verschiedener, die optische Strahlung absorbierender Farbstoffe des Objekts bzw. der Probe repräsentieren.

Das vorgeschlagene Verfahren ist gegenüber dem Verfahren nach dem zweiten Aspekt insoweit verallgemeinert, als dass allgemein auf Detektionswellenlängenbänder Bezug genommen wird, die nicht unbedingt Farbkanälen einer Bilddarstellung entsprechen müssen. Soweit der oben schon in Bezug auf die Erfindung nach dem zweiten Aspekt angesprochene lineare, subtraktive Ansatz für die in Transmission aufgenommenen Bilder hinsichtlich der Absorptionsanteile aufgrund verschiedener Eigenschaften bzw. Strukturen bzw. Farbstoffen des Objekts bzw. der Probe zumindest näherungsweise hält, kann quantitative oder zumindest qualitative Information über die jeweiligen Absorptionsanteile aus den aufgenommenen Bildern extrahiert werden, indem die aufgenommenen Bilder gewissermaßen entmischt werden, um die resultierenden Bilder zu generieren.

Es ist denkbar, dass verschiedene Detektionswellenlängenbänder farblich nicht so eindeutig unterscheidbar sind, dass sie als verschiedene Farbkanäle auffassbar sind. Ansonsten gelten die vorangehenden Ausführungen zu der Erfindung nach dem zweiten Aspekt betreffend subtraktive Überlagerungsbeiträge (subtraktive Intensitätsanteile bzw. Intensitätsbeiträge in einem linearen subtraktiven Ansatz) entsprechend. Es wird demgemäß insbesondere daran gedacht, dass die Generation der resultierenden Bilder mathematische Operationen umfasst, die die Lösung eines linearen Gleichungssystem mit mehreren Unbekannten durch Methoden der linearen Algebra oder Ratio-Verfahren umfassen oder mathematisch der exakten oder approximativen Lösung eines solchen Gleichungssystems entsprechen. Gegenüber dem Fall von drei Farbkanälen wird dementsprechend verallgemeinert weiterbildend vorgeschlagen, dass die Generation der resultierenden Bilder auf einem Gleichungssystem beruht, dessen Gleichungen für N Detektionswellenlängenbänder D1 bis DN allgemein die folgende Form haben oder in die folgende Form bringbar sind:

wobei I_D1(x, y), ..., I_DN(x, y) die ortsaufgelöst erfassten Intensitätswerte eines jeweiligen der aufgenommenen Bilder sind, x, y Ortskoordinaten sind oder einen jeweiligen Pixel des aufgenommenen Bilds identifizieren, die Terme I_D1 ^MAX, ..., I_DN ^MAX einen für eine gegebene Untersuchungssituation maximal möglichen Intensitätswert für das jeweilige Detektionswellenlängenband D1 bis DN angeben und die übrigen Terme rechts der Gleichheitszeichen jeweils einen subtraktiven Überlagerungsbeitrag zum Intensitätswert des jeweiligen aufgenommenen Bilds in Folge einer Eigenschaft bzw. Struktur oder eines Farbstoffs verschiedener Farbstoff f1 bis fN der Probe bzw. des Objekts angeben. Unter Umständen sind mehr als drei verschiedene Farbstoffe auf Grundlage von mehr als drei in verschiedenen Detektionswellenlängenbändern aufgenommenen Bildern separierbar.

Insbesondere wird daran gedacht, dass die einen maximal möglichen Intensitätswert für die Detektionswellenlängenbänder D1 bis DN angebenden Terme I_D1 ^MAX, ..., I_DN ^MAX aus dem jeweiligen aufgenommenen Bild bestimmt werden, vorzugsweise durch Bestimmung eines Intensitätsmaximums. Vorzugsweise wird das Gleichungssystem gelöst auf Grundlage von charakteristischen Intensitätsverhältnissen

oder hieraus ableitbaren charakteristischen Intensitätsverhältnissen, die das Verhältnis zwischen zwei zu verschiedenen Detektionswellenlängenbändern subtraktiv beitragenden Absorptionsanteilen in Folge der gleichen Eigenschaft bzw. Struktur oder des gleichen Farbstoffs der Probe bzw. des Objekts angeben.

Es wird in diesem Zusammenhang vorgeschlagen, dass die charakteristischen Intensitätsverhältnisse aus jeweils zwei der aufgenommenen Bilder bestimmt werden, vorzugsweise auf Grundlage einer Identifizierung von Bildbereichen, die nur auf Absorptionsanteilen in Folge genau einer Eigenschaft bzw. Struktur oder genau eines Farbstoffs der Probe bzw. des Objekts beruhen. Soweit dies nicht möglich oder zweckmäßig ist, können die charakteristischen Intensitätsverhältnisse aus für Kalibrier-Proben oder Kalibrier-Objekte aufgenommenen Kalibrier-Bildern bestimmt werden, wobei die Kalibrier-Proben oder Kalibrier-Objekte derart gewählt oder präpariert sind, dass sie zumindest in einem Bildbereich des Kalibrier-Bilds nur auf Absorptionsanteilen in Folge genau einer Eigenschaft bzw. Struktur oder genau eines Farbstoffs der für die Probe insoweit repräsentativen Kalibrier-Probe bzw. des in soweit für das Objekt repräsentativen Kalibrier-Objekts.

Aus den vorstehenden Erläuterungen, insbesondere auch im Zusammenhang mit den Ausführungen zur Erfindung nach dem zweiten Aspekt folgt klar, dass die Erfindung nach dem vierten Aspekt konkret als Verfahren in Übereinstimmung mit der Erfindung nach dem zweiten Aspekt implementierbar ist. Dies gilt insbesondere dann, wenn die Detektionswellenlängenbänder Farbkanälen einer Detektoranordnung entsprechen oder wenn die Detektionswellenlängenbänder auf Farbkanäle einer Mehrfarbbilddarstellung eindeutig abbildbar sind, beispielsweise als einander überlagerte Falschfarbendarstellung der aufgenommenen Bilder. In entsprechender Weise kann die Generierung der resultierenden Bilder in Übereinstimmung mit der Erfindung nach dem ersten Aspekt implementiert werden. Die obigen Erläuterungen von in Frage kommenden Ausführungs- und Weiterbildungsmöglichkeiten der Erfindung nach dem ersten bzw. zweiten Aspekt lassen sich dementsprechend auch auf die Erfindung nach dem vierten Aspekt anwenden.

Betreffend die erfindungsgemäßen Verfahren zur Objekt- oder Probenuntersuchung wird vor allem daran gedacht, dass die optische Strahlung ortsaufgelöst mittels eines Mikroskops detektiert wird. Demgemäß kann das Mehrfarbbild eine mikroskopische Aufnahme sein oder auf mindestens einer mikroskopischen Aufnahme beruhen. Es wird insbesondere daran gedacht, dass das Mehrfarbbild ein mikroskopisches Transmissions-Mehrfarbbild oder Hellfeld-Mehrfarbbild oder Dunkelfeld-Mehrfarbbild des Objekts bzw. der Probe ist oder auf wenigstens einem mikroskopischen Transmissions-Mehrfarbbild oder Hellfeld-Mehrfarbbild oder Dunkelfeld-Mehrfarbbild des Objekts bzw. der Probe oder mehreren mikroskopischen Transmissions-Bildern oder Hellfeld-Bildern oder Dunkelfeld-Bildern, ggf. Einfarb- oder Schwarzweiß-Bildern, des Objekts bzw. der Probe beruht. Im Falle der Erfindung nach dem vierten Aspekt können die aufgenommenen Bilder mikroskopische Transmissions-Bilder oder Hellfeld-Bilder bzw. Dunkelfeld-Bilder des Objekts bzw. der Probe sein. Hinsichtlich der Beleuchtungsmethode bei transmissionsmikroskopischen oder lichtmikroskopischen Untersuchungen bzw. hieraus resultierenden Bildern bestehen grundsätzlich keine Einschränkungen; die angesprochenen Methoden „Hellfeld" und „Dunkelfeld" stellen nur Beispiele dar.

Betreffend die Probe bzw. Proben bzw. des Objekts wird vor allem daran gedacht, dass es sich um eine biologische Probe bzw. biologische Proben bzw. ein biologisches Objekt handelt. Ein Beispiel ist ein histologischer Schnitt, bei dem die Erfindung besonders zweckmäßig zur Extraktion von Informationen zum Einsatz kommen kann.

Wie schon angesprochen, können die erfindungsgemäßen Verfahren zur Objekt- oder Probenuntersuchung den Schritt der Einfärbung wenigstens einer Struktur der Probe bzw. des Objekts mit wenigstens einem Farbstoff umfassen. Ferner wird daran gedacht, dass es sich bei Farbstoffen der Probe um inhärent vorhandene Farbstoffe handelt, etwa natürlich vorhandene Farbstoffe oder aufgrund von Genmanipulationen resultierende Farbstoffe.

In der Regel wird es zweckmäßig sein, wenn die Farbkanäle bzw. Detektionswellenlängenbänder Farbkanälen für eine Darstellung des Mehrfarbbilds bzw. der aufgenommenen Bilder auf einem elektronischen Bildschirn, etwa RGB-Farbkanälen, entsprechen.

Die Erfindung stellt nach einem fünften Aspekt ferner eine Einrichtung zum Durchführen des erfindungsgemäßen Verfahrens nach den verschiedenen Aspekten der Erfindung, einschließlich der verschiedenen Weiterbildungen des Verfahrens, bereit. Die erfindungsgemäße Einrichtung umfasst: einen Bildspeicher zur Speicherung durch Intensitätspixel (I_α(x, y), I_β(x, y), I_γ(x, y)) wenigstens zweier Farbkanäle (α, β, γ) definierten Mehrfarbbildes einer Probe oder eines Objekts, wobei das Mehrfarbbild zumindest für die Intensitätspixel wenigstens einer Gruppe von Intensitätspixeln jeweils auf einer Überlagerung von verschiedenen Ursprungsfarben zugeordneten Überlagerungsbeiträgen, insbesondere zumindest näherungsweise additiven Intensitätsbeiträgen oder Intensitätsanteilen oder/und zumindest näherungsweise subtraktiven Intensitätsbeiträgen oder Intensitätsanteilen, beruht, eine Bildverarbeitungseinheit, die auf den Intensitätspixeln des Mehrfarbbilds arbeitet und das Mehrfarbbild in Einfarbbilder zerlegt und diese im Bildspeicher abspeichert, wobei Einfarbbild durch Intensitätspixel nur eines der Farbkanäle oder durch Intensitätspixel mehrerer der Farbkanäle mit für alle Intensitätspixel gleichem Intensitätsverhältnis zwischen den Farbkanälen oder durch Intensitätspixel nur eines einer definierten Kombination der Farbkanäle entsprechenden resultierenden Farbkanals definiert sind. Erfindungsgemäß wird vorgeschlagen, dass die Bildverarbeitungseinheit dafür ausgeführt oder programmiert ist, die verschiedenen Urprungsfarben zugeordnete Überlagerungsbeiträge repräsentierenden Einfarbbilder auf Grundlage von angenommenen oder vorgegebenen oder aus einer Kalibrierung erhaltenen oder aus dem Mehrfarbbild abgeleiteten charakteristischen Intensitätsverhältnissen, die Verhältnisse zwischen wenigstens zwei jeweils einem anderen der Farbkanäle zugeordneten Intensitätsbeiträgen oder Intensitätsanteilen, die der gleichen Eigenschaft bzw. Struktur des Objekts bzw. der Probe bzw. dem gleichen Farbstoff der des Objekts bzw. der Probe zugeordnet sind, repräsentieren, zu generierten.

Die erfindungsgemäße Einrichtung kann ferner Mittel zur Erzeugung des Mehrfarbbilds erfassen, beispielsweise ein Mikroskop und eine ortsauflösende Detektoranordnung.

Die Erfindung stellt ferner bereit ein Computerprogrammprodukt, beispielsweise in Form eines auf einem Datenträger gespeicherten oder von einem Server, etwa über das Internet, herabladbaren Programms, welches durch einen Computer ausführbar ist und auf Grundlage eines in einer Speichereinrichtung des Computers gespeicherten Mehrfarbbildes beim Ausführen des Programms durch eine Prozessoreinrichtung des Computers das Verfahren nach dem ersten Aspekt bzw. die Generation der Einfarbbilder aus dem Mehrfarbbild bei den Verfahren nach dem zweiten und dritten Aspekt der Erfindung durchführt, vorzugsweise einschließlich der verschiedenen, sich auf die Generation der Einfarbbilder beziehenden Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Verfahrens nach den verschiedenen Aspekten der Erfindung.

Die Erfindung wird im Folgenden anhand von in den Figuren gezeigten Ausführungsbeispielen und einem exemplarisch angegebenen, ebenfalls als Ausführungsbeispiel aufzufassenden Verfahren („Entmischungsmethode") weiter erläutert.
1 zeigt ein Beispiel für eine erfindungsgemäße Objekt- oder Probenuntersuchungseinrichtung auf Grundlage eines Transmissions-Mikroskops und eines Bilddaten von einer Farbkamera des Mikroskops auswertenden und die Bilddaten „entmischenden" Recheneinheit, beispielsweise in Form eines entsprechend programmierten Computers.
2 zeigt schematisch ein Beispiel für ein mittels der Farbkamera des Mikroskops aufgenommenes Mehrfarbbild eines Objekts mit drei sich bereichsweise überlagernden, verschiedenfarbigen Strukturen, wobei das Mehrfarbbild durch Intensitätspixel von drei Farbkanälen dargestellt ist.
3 zeigt schematisch ein Einfarbbild, das durch Entmischen der Farbinformation des Mehrfarbbilds gemäß 2 gewonnen ist und eine erste der drei Strukturen zeigt.
4 zeigt schematisch ein weiteres Einfarbbild, das durch Entmischen der Farbinformation des Mehrfarbbilds gemäß 2 gewonnen ist und eine zweite der drei Strukturen zeigt.
5 zeigt schematisch ein weiteres Einfarbbild, das durch Entmischen der Farbinformation des Mehrfarbbilds gemäß 2 gewonnen ist und eine dritte der drei Strukturen zeigt.
6 zeigt eine mehrfarbige transmissionsmikroskopische Aufnahme eines gefärbten Klematis-Schnitts in Schwarzweiß/Graustufendarstellung.
7 ist ein aus dem Mehrfarbbild gemäß 6 durch farbliches Entmischen gewonnenes Einfarbbild in einer Schwarzweiß/Graustufen-Darstellung, das die Absorptionbeiträge aufgrund eines ersten Farbstoffes des Klematis-Schnitts zeigt.
8 zeigt ein weiteres aus dem Mehrfarbbild gemäß 6 durch farbliches Entmischen gewonnenes Einfarbbild in einer Schwarzweiß/Graustufen-Darstellung, das die Absorptionbeiträge aufgrund eines zweiten Farbstoffes des Klematis-Schnitts zeigt.
9 zeigt ein weiteres aus dem Mehrfarbbild gemäß 6 durch farbliches Entmischen gewonnenes Einfarbbild in einer Schwarzweiß/Graustufen-Darstellung, das die Absorptionbeiträge aufgrund eines dritten Farbstoffes des Klematis-Schnitts zeigt.
1 zeigt ein Beispiel für eine Einrichtung 10 für transmissionsmikroskopische Untersuchungen von Proben oder Objekten, insbesondere biologischen Proben wie gefärbten oder Eigenfarbe aufweisenden Schnitten. Ein optisches Transmissionsmikroskop 12 mit Mikroskopobjektiv 14 auf der Probenseite und einer CCD-Farbkamera 16 auf der Bildseite dient dazu, auf einem Probentisch 18 beispielsweise auf einem Objektträger 20 angeordnete Proben zu untersuchen, indem auf Grundlage von durch das Objekt hindurch gehender, von einer Durchlicht-Beleuchtungseinheit 22 bereitgestellter optischer Strahlung, insbesondere Weißlicht von einer Weißlichtquelle 24, ein vergrößertes Bild des Objekts durch das Mikroskop auf wenigstens ein Detektorteld 26 der Kamera abgebildet wird. Das vergrößerte mikroskopische Bild wird in drei Farbkanälen der Kamera ortsaufgelöst pixelweise detektiert. Ein so aufgenommenes, Intensitätspixel von drei Farbkanälen aufweisendes Mehrfarbbild wird von einem zur Einrichtung 10 zugehörigen Computer 30 aufgenommen und in einer Speichereinheit 32 des Computers abgespeichert. Das Mehrfarbbild kann auf einem Bildschirm 34 angezeigt werden. Eine Prozessoreinheit 36 des Computers dient dazu, das aufgenommene Mehrfarbbild weiter zu verarbeiten. Erfindungsgemäß erzeugt die Prozessoreinheit 36 auf Grundlage des in der Speichereinheit 32 abgespeicherten Mehrfarbbilds oder auf Grundlage des unmittelbar von der Farbkamera empfangenden Mehrfarbbilds drei Einfarbbilder, die farbliche Mischungsbeiträge auf Grundlage von drei verschiedenen Färbungen oder Farbstoffen der Probe repräsentieren. Die Entmischung des Mehrfarbbilds zu drei Einfarbbildern ist in dem Umfang quantitativ, zumindest jedenfalls aber qualitativ möglich, wie ein subtraktiver linearer Ansatz für die im Mehrfarbbild aufgrund der Färbungen der Probe resultierenden Farben näherungsweise einigermaßen Gültigkeit hat.
Ausführungsbeispiel und Ausführungsvarianten eines rechnerischen Verfahrens zur farblichen bzw. spektralen Entmischung von Mehrfarbbildern
Im Folgenden wird exemplarisch eine Methode zur Trennung verschiedenfarbiger Objekte in beispielsweise mikroskopischen Transmissionsbildern beschrieben.
Entstehung von Transmissionsfarbbildern:
Das von vornherein oder nach einer Färbebehandlung mehrfarbige Objekt wird mit multispektralem, insbesondere weißem Licht durchleuchtet. Die Farben, die mit dem Auge oder einer Farbkamera, etwa einer CCD-Kamera, wahrgenommen werden, entstehen durch selektive Absorption im Objekt. Wird z.B. vom Objekt rot (ca. 600–650 nm) absorbiert, so erscheint das Objekt grün (Mischung aus 400–600 nm).
Detektion eines jeweiligen Transmissionsfarbbilds:
Ohne Beschränkung der Allgemeinheit wird eine simultane Detektion mit einer drei Farbkanäle aufweisenden digitalen Kamera angenommen, insbesondere einer RGB-Kamera mit den Farbkanälen R (rot), G (grün) und B (blau). Eine solche Kamera ist üblicherweise als CCD-Kamera ausgeführt und weist wenigstens ein CCD-Detektorfeld auf, so dass sich für jeden Farbkanal ein rechteckiges Feld von Bildpunkten (Pixeln) ergibt. Beispielsweise ist ein einziges, für die Farbkanäle gemeinsames Detektorfeld vorgesehen, welches mit einem Filterbereiche für die drei Farbkanäle aufweisenden Mosaikfarbfilter bedeckt ist, um die Detektionspixel jeweils einem der Farbkanäle zuzuordnen und auf das jeweilige Detektionspixel nur Licht innerhalb eines jeweiligen, dem Farbkanal entsprechenden Detektionswellenlängenband fallen zu lassen. In der Regel sind die Detektionswellenlängenbänder stark überlappend, so dass ein für den Menschen „nur" rot erscheinendes Objekt zu einem, teilweise zwar nur geringen, Signal auch im grünen Kanal führt. Entsprechendes gilt für die anderen Kanäle und für die Farben grün und blau. Erst recht geben detektierte Mischfarben wesentliche Beiträge in mehreren der Farbkanäle. So enthält beispielsweise die Mischfarbe gelb starke Anteile an grün und rot.
Um eine dem menschlichen Empfinden gleichkommende Farbdetektion zu ermöglichen, besteht an einer computergestützten Messstation bzw. einem zur Verarbeitung aufgenommener Bilder dienender Computer häufig die Möglichkeit, einen „Weißabgleich" durchzuführen. Dabei ermittelt eine Software einen „weißen" Bereich (automatischer Weissabgleich) im Bild, bzw. der Benutzter definiert einen Bereich im Bild als „weiss". Die mit der Kamera aufgenommen Bilder und auf einem Monitor dargestellten Bilder eines Objekts sehen dann idealerweise so aus wie mit dem Auge wahrgenommen.
Farbliche Entmischung von Transmissions-Mehrfarbbildern für drei Farbstoffe bzw. drei Farbkanäle
Das mit drei Farbstoffen (ggf. drei Fluorochromen) f1, f2 und f3 gefärbte Präparat wird in drei verschiedenen Wellenlängenbereichen α, β und γ erfasst, die drei Farbkanälen α, β und γ einer pixelweisen Darstellung eines resultierenden Mehrfarbbilds entsprechen. Die Farbstoff haben sich beispielsweise an drei verschiedenen Strukturen S1, S2 und S3 des Präparats angelagert. Ohne Beschränkung der Allgemeinheit kann angenommen werden, dass es sich bei den drei Farbkanälen um RGB-Farbkanäle handelt, beispielsweise α = R (rot), β = G (grün) und γ = B (blau).
Die Absorption von Licht durch Materie wird mathematisch durch das Lambert-Beer-Gesetz beschrieben: I = I0·e–β·x
Dabei beschreibt β den Absorptionskoeffizient und x die Eindringtiefe. Die Reihenentwicklung der e-Funktion bis zum ersten Glied ergibt einen linearen Zusammenhang zwischen der Absorption und Konzentration, bzw. Schichtdicke der vorhandenen Farbstoffe und damit der pixelweise für drei den Wellenlängenbereichen α, β und γ zugeordnete Farbkanäle α, β und γ detektierten Intensität: Iα = Beleuchtungα – Iα(f1) – Iα(f2) – Iα(f3) Iβ = Beleuchtungβ – Iβ(f1) – Iβ(f2) – Iβ(f3) Iγ = Beleuchtungγ – Iγ(f1) – Iγ(f2) – Iγ(f3) (Gleichungen 1) Beleuchtung_α = I_α ^MAX; Beleuchtung_β = I_β ^MAX; Beleuchtung_γ = I_γ ^MAX:
ist die Beleuchtungsstärke im Wellenlängenbereich α bzw. β bzw. γ oder – genauer – der bei gegebener Situation maximal mögliche Intensitätswert für den dem Wellenlängenbereich entsprechenden Farbkanal α bzw. β bzw. γ, kann angenähert durch Maximumbildung über das Bild ermittelt werden. Dabei wird vorausgesetzt, dass für mindestens einen Pixel keinerlei oder zumindest nur vernachlässigbare Absorption im entsprechenden Wellenlängenbereich auftritt.
I_α(f₁); I_β(f₁); I_γ(f₁):
ist ein Maß für Absorption (und damit für die Konzentration/Schichtdicke des Farbstoffs f1) im Wellenlängenbereich α bzw. β bzw. γ verursacht durch den Farbstoff f1 bzw. durch die Struktur S1, die aufgrund der Färbebehandlung den Farbstoff f1 aufweist (alternativ könnte f1 ein inhärent vorhandener Farbstoff des Präparats sein).
I_α(f₂); I_β(f₂); I_γ(f₂):
ist ein Maß für Absorption (und damit für die Konzentration/Schichtdicke des Farbstoffs f2) im Wellenlängenbereich α bzw. β bzw. γ verursacht durch den Farbstoff f2 bzw. durch die Struktur S2, die aufgrund der Färbebehandlung den Farbstoff f2 aufweist (alternativ könnte f2 ein inhärent vorhandener Farbstoff des Präparats sein).
I_α(f₃); I_β(f₃); I_γ(f₃):
ist ein Maß für Absorption (und damit für die Konzentration/Schichtdicke des Farbstoffs f3) im Wellenlängenbereich α bzw. β bzw. γ, verursacht durch den Farbstoff f3 bzw. durch die Struktur S3, die aufgrund der Färbebehandlung den Farbstoff f3 aufweist (alternativ könnte f3 ein inhärent vorhandener Farbstoff des Präparats sein).
Die interessante Information liegt nun nicht in der direkt messbaren Summe der von den verschiedenen Fluorochromen bzw. Farbstoffen stammenden, das Maß an Absorption angebenden, gewissermaßen subtraktiv in die für die Farbkanäle detektierten Intensitäten eingehenden Intensitätsanteilen in einem Wellenlängenbereich, sondern in den einzelnen subtraktiven Intensitätsanteilen für einen jeweiligen Farbstoff oder in der Summe der von einem jeweiligen Farbstoff f1, f2 bzw. f2 (bzw. einer jeweiligen Struktur S1, S2 bzw. S3) resultierenden subtraktiven Intensitätsanteilen: If1 = Iα(f1) + Iβ(f1) + Iγ(f1) If2 = Iα(f2) + Iβ(f2) + Iγ(f2) If3 = Iα(f3) + Iβ(f3) + Iγ(f3)
Es wird angenommen, dass die folgenden sechs Ratiowerte bekannt sind. Diese Ratiowerte können jedenfalls mittels Kalibrierproben oder auch aus dem aufgenommenen Mehrfarbbild selbst bestimmt werden. Rαβ(f1) = Iα(f1)/Iβ(f1) Rαγ(f1) = Iα(f1)/Iγ(f1) Rαβ(f2) = Iα(f2)/Iβ(f2) Rαγ(f2) = Iα(f2)/Iγ(f2) Rαβ(f3) = Iα(f3)/Iβ(f3) Rαγ(f3) = Iα(f3)/Iγ(f3)
Damit lassen sich die Gleichungen 1 in der folgenden Darstellung schreiben: Iα = Beleuchtungα – Iα(f1) – Iα(f2) – Iα(f3) Iα = Beleuchtungβ – Iα(f1)/Rαβ(f1) – Iα(f2)/Rαβ(f2) – Iα(f3)/Rαβ(f3) Iγ = Beleuchtungγ – Iα(f1)/Rαγ(f1) – Iα(f2)/Rαγ(f2) – Iα(f3)/Rαγ(f3)
In Matrixschreibweise lautet dieses:
Durch Inversion der Matrix M und entsprechender Anwendung ergibt sich das gewünschte Ergebnis:
Da die betrachteten Farbstoffe bzw. Fluorochrome und Detektoren eine sehr große spektrale Bandbreite aufweisen ist eine Matrixinversion in aller Regel möglich.
Analoge Matrizen M_β und M_γ
und damit auch analoge Matrixgleichungen lassen sich für die restlichen Komponenten aufstellen, zur entsprechenden Berechnung von
Die Matrixgleichungen 2 können mittels eines leicht programmmäßig implementierbaren Algorithmus pixelweise gelöst werden, um die farbliche Entmischung des aufgenommenen Mehrfarbbilds zu die Absorptionsbeiträge der Farbstoffe f1, f2 und f3 jeweils gesondert zeigenden Einfarbbildern zu erreichen.
Die Gleichungen 1 lassen sich auch schreiben als Beleuchtungα – Iα = Iα* = Iα(f1) + Iα(f2) + Iα(f3) Beleuchtungβ – Iβ = Iβ* = Iβ(f1) + Iβ(f2) + Iβ(f3) Beleuchtungγ – Iγ = Iγ* = Iγ(f1) + Iγ(f2) + Iγ(f3) (Gleichungen 3)
Diese Gleichungen entsprechen formal dem für eine „spektrale Entmischung" von 3-farbigen Fluoreszenzbildern zu lösenden linearen Gleichungssystem, so dass alternativ ein zur spektralen Entmischung von Fluroreszenzbildern mit spektralen Beiträgen von wenigstens drei verschiedenen Fluorochromen vorgesehener Algorithmus verwendet werden kann, um das aufgenommene Transmissions-Mehrfarbbild farblich zu entmischen. In diesen Algorithmus gehen dann die durch Differenzbildung aus den detektierten Intensitäten I_α, I_β und I_γ und den maximal möglichen Intensitätswerten I_α ^MAX, I_β ^MAX und I_γ ^MAX bestimmbaren Größen I_α*, I_β* und I_γ* als pixelweise für die Farbkanäle detektierte fiktive Intensitäten ein.
Anwendungsmöglichkeiten der Methode
Es lassen sich mit der beschriebenen Methode beispielsweise Bilder von biologischen Objekten, welche mit verschiedenen spektralen Komponenten aufgenommen wurden, trennen. Es wird beispielsweise gedacht an verschieden angefärbte oder eigenfarbige Strukturen in histologischen Schnitten, welche mit etwa einer digitalen Farbkamera aufgenommen wurden, oder verschiedene Emissionswellenlängen, die mit Hilfe von Farbfiltern aufgezeichnet wurden, oder verschiedene Beleuchtungsfarben, die beispielsweise mit einer Schwarz/Weiß-Kamera aufgenommen wurden, oder eine Kombination dieser Arten der Bildgenerierung.
Die Methode lässt sich zweckmäßig für eine Bildverarbeitung im Sinne eines „Vorverarbeitung" für automatische Zellerkennung, Zählung, usw. einsetzen.
Einschränkungen der Methode
Kolokalisationen
Im Gegensatz zu fluoreszierenden Strukturen sind gefärbte oder eigenfarbige Strukturen in der Regel nicht transparent für darunter bzw. darüber liegende andersfarbige Strukturen. Dadurch ist detektierte Farbinformation einer Struktur abhängig vom Vorhandensein anderer farbiger Strukturen an gleicher Stelle. Nur für den Fall, dass dieser Effekt vernachlässigt werden kann, ist eine quantitative Auswertung der „entmischten" Bilder möglich. Dieses wird allerdings in den meisten Fällen nicht möglich sein. In der Regel ist der der Methode zugrundeliegende linear-subtraktive Ansatz zumindest eine so gute Näherung der tatsächlichen Verhältnisse, dass sich wenigstens die für viele Anwendungen besonders wichtigen morphologischen Eigenschaften einer farbigen Struktur bzw. einander überlagernder verschiedenfarbiger Strukturen darstellen lassen. Man kann dem „entmischten" Bild also in der Regel zusätzliche Informationen entnehmen oder die Auswertung des Mehrfarbbilds auf Grundlage der enthaltenen Farbinformation wird zumindest deutlich erleichtert. Häufig kommt es gerade auch nur auf die Feststellung von Kolokalisationen an, was mittels der Methode jedenfalls erleichtert wird.
Begrenzung der Anzahl von entmischbaren „Ursprungsfarben"
In der Regel können nur für drei verschiedene Farbkanäle nur drei verschiedene Ursprungsfarben durch die beschriebene Entmischungsmethode aus einem Mehrfarbbild extrahiert werden, da auf Grundlage der für drei Farbkanäle detektierten Intensitäten nur ein lineares Gleichungssystem mit drei linear unabhängigen Gleichungen aufstellbar ist. Diese Grenze ist überwindbar durch Verwendung einer speziellen Detektoranordnung, die mehr als drei Farbkanäle aufweist, die spektral einander nicht oder nur unwesentlich überlappen, so dass sich mehr als drei linear unabhängige Gleichungen aufstellen lassen. Eine andere Möglichkeit die Aufnahme mehrerer Einfarbbilder in Durchlicht jeweils unter Verwendung von schmalbandigem Beleuchtungslicht bei unterschiedlichen Beleuchtungswellenlängen, so dass gewissermaßen spektral selektiv die Absorption bei verschiedenen Wellenlängen erfasst wird und die resultierenden Einfarbbilder jeweils einem unabhängigen Farbkanal entsprechen, so dass sich auf Grundlage von mehr als drei derartigen Einfarbbildern wiederum mehr als drei linear voneinander unabhängige Gleichungen aufstellen lassen.
Auf Grundlage von drei normalerweise bei einer Farbkamera vorhandenen Farbkanälen lassen sich also in einer Farbaufnahme drei verschiedenfarbig Strukturen von einander trennen. Der für die Überwindung dieser Grenze erforderliche apparative Aufwand dürfte in der Regel in einem Missverhältnis zu den durch Kolokalisationen bedingten Grenzen der Methode stehen. Sind mehr als drei Strukturen voneinander zu trennen, bieten sich demgegenüber fluoreszenzbasierte Untersuchungsverfahren an, insbesondere die Wide-Field-Fluoreszenzmikroskopie.
Beispielhafte Entmischungsergebnisse
Bezug nehmend auf das Ausführungsbeispiel gemäß 1 repräsentiert 2 ein von der Farbkamera 16 aufgenommenes transmissionsmikroskopisches Mehrfarbbild, das durch drei Farbkanäle pixelweise dargestellt ist. Es sind drei verschiedenfarbige Strukturen S1, S2 und S3 erkennbar, die sich überlappen, so dass sind in den Überlappungsbereichen Mischfarben bilden. Die verschiedenen Farben sind durch unterschiedliche Schraffuren repräsentiert. Die Strukturen sind so transparent, dass auch im Überlappungsbereich alle Strukturen erkennbar sind.
Die 3, 4 und 5 zeigen aus der Entmischung des Mehrfarbbilds gemäß 2 mittels der im Vorstehenden angegeben Methode resultierende Einfarbbilder. Die Einfarbbilder zeigen die jeweilige Struktur S1 bzw. S2 und S3 zur besseren Vergleichbarkeit mit dem Mehrfarbbild selbst in der gleichen Farbe wie im Mehrfarbbild außerhalb des Überlappungsbereiches, und die Darstellung entspricht wiederum einer Hellfeld-transmissionsmikroskopischen Aufnahme, bei der sich die Struktur vor einem hellen Hintergrund zeigt. Die Abnahme der Bildintensität vom hellen Hintergrund zur Abbildung der Struktur ist das Maß für die auftretende Absorption. Man könnte die Einfarbbilder alternativ auch in der Art fiktiver Fluoreszenzbilder darstellen, bei denen die Struktur vor einem dunklen Hintergrund abgebildet ist, wobei die Intensitätszunahme vom dunklen Hintergrund zur Abbildung der Struktur die erfolgte Absorption repräsentiert.
Für das hier gezeigte schematische Beispiel wurde angenommen, dass der lineare subtraktive Ansatz sehr gut Gültigkeit hat, so dass die drei Strukturen S1, S2 und S3 optimal trennbar sind und dementsprechend die Einfarbbilder nur jeweils eine der Strukturen zeigen.
6 ist eine Graustufendarstellung einer transmissionsmikroskopischen Aufnahme eines gefärbten Klematis-Schnitts. Die vor einem hellen Hintergrund hauptsächlich auftretenden Farben sind blau/blau-türkis, rot und dunkelblau.
Durch farbliches Entmischen gemäß der vorstehend erläuterten Methode resultieren die Einfarbbilder gemäß den 7, 8 und 9. 7 zeigt das Entmischungsergebnis in Bezug auf die in 6 rot erscheinenden Farbbeiträge, dargestellt in der gleichen roten Farbe vor einem hellen Hintergrund und hier als Graustufenbild wiedergegeben.
8 zeigt das Entmischungsergebnis in Bezug auf die in 6 hell bis mittelblau erscheinenden Farbbeiträge, dargestellt im gleichen Blauton vor einem hellen Hintergrund und hier als Graustufenbild wiedergegeben.
9 zeigt das Entmischungsergebnis in Bezug auf dunkelblaue Farbbeiträge in 6, dargestellt im gleichen Blauton vor einem hellen Hintergrund und hier als Graustufenbild wiedergegeben.
Die beschriebene und an Beispielen erläuterte Entmischung von Ursprungsfarben eines Mehrfarbbildes erleichtert die Identifizierung von Strukturen eines zu untersuchenden Objekts und gibt häufig Zusatzinformationen, die sich dem ursprünglichen Mehrfarbbild nicht oder nur schwer entnehmen lassen. Die Erfindung ist auch auf aus fluoreszenzbasierten Untersuchungen erhaltene, insbesondere aus fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen generierte Mehrfarbbilder anwendbar.

Claims

Verfahren zur Objekt- oder Probenuntersuchung, bei dem von wenigstens einem Objekt oder wenigstens einer Probe ausgehende oder durch das Objekt oder die Probe durchgelassene optische Strahlung ortsaufgelöst detektiert wird und auf Grundlage der Detektion ein durch Intensitätspixel (I_α(x, y), I_β(x, y), I_γ(x, y)) wenigstens zweier Farbkanäle (α, β, γ) definiertes Mehrfarbbildes des Objekts bzw. der Probe generiert wird, derart, dass das Mehrfarbbild zumindest für die Intensitätspixel wenigstens einer Gruppe von Intensitätspixeln jeweils beruht a) auf einer simultan, ggf. in der Detektion, oder sukzessiv erfolgenden Überlagerung von wenigstens zwei jeweils mindestens einer Eigenschaft oder Struktur des Objekts bzw. der Probe oder/und wenigstens einem inhärent vorhandenen oder durch eine Färbebehandlung hinzugefügten Farbstoff des Objekts bzw. der Probe zugeordneten oder zumindest näherungsweise zuordenbaren Ursprungsfarben, die Überlagerung erfolgend – im Sinne einer subtraktiven Farbmischung oder/und auf Grundlage einer bei einer Beleuchtung des Objekts bzw. der Probe mit optischer Strahlung erfolgenden Absorption oder/und Reflektion oder/und Streuung verschiedener spektraler Beiträge optischer Strahlung und dann gleichzeitig oder/und zeitlich aufeinanderfolgenden Detektion verschiedener, ggf. durch ein jeweiliges Detektionswellenlängenband bestimmter, in der optischen Strahlung nach der Absorption oder Reflektion oder Streuung in Transmission verbliebener spektraler Beiträge optischer Strahlung oder/und verschiedener, ggf. durch ein jeweiliges Detektionswellenlängenband bestimmter, von dem Objekt bzw. der Probe reflektierter oder gestreuter spektraler Beiträge optischer Strahlung, wobei die Ursprungsfarben absorbierten oder detektierten Beiträgen optischer Strahlung zugeordnet oder zuordenbar sind im Sinne einer dem jeweiligen Beitrag optischer Strahlung jeweils zugeordneten Fehlfarbe oder im Sinne eines aus einer hypothetischen oder tatsächlichen visuellen Wahrnehmung des jeweiligen Beitrags optischer Strahlung jeweils resultierenden visuellen Farbeindrucks, und b) auf einer einer pixelweisen Repräsentation von aus der Überlagerung der Ursprungsfarben resultierenden Mischfarben durch die Intensitätspixel der Farbkanäle; dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren den Schritt umfasst, zur Identifizierung von Eigenschaften oder Strukturen des Objekts bzw. der Probe oder/und zur Identifizierung von inhärent vorhandenen oder durch die Färbebehandlung hinzugefügten Farbstoffen des Objekts bzw. der Probe aus dem durch die Intensitätspixel (I_α(x, y), I_β(x, y), I_γ(x, y)) der wenigstens zwei Farbkanäle (α, β, γ) definierten Mehrfarbbild des Objekts bzw. der Probe mehrere jeweils die pixelweisen Überlagerungsbeiträge einer Ursprungsfarbe für wenigstens einen Farbkanal repräsentierende Einfarbbilder zu generieren, die jeweils durch Intensitätspixel nur eines der Farbkanäle oder durch Intensitätspixel mehrerer der Farbkanäle mit für alle Intensitätspixel gleichem Intensitätsverhältnis zwischen den Farbkanälen oder durch Intensitätspixel nur eines einer definierten Kombination der Farbkanäle entsprechenden resultierenden Farbkanals definiert sind, wobei die Generation der Einfarbbilder auf Grundlage von angenommenen oder vorgegebenen oder aus einer Kalibrierung erhaltenen oder aus dem Mehrfarbbild abgeleiteten charakteristischen Intensitätsverhältnissen erfolgt, die Verhältnisse zwischen wenigstens zwei jeweils einem anderen der Farbkanäle zugeordneten, vorzugsweise additiven oder subtraktiven Intensitätsbeiträgen oder Intensitätsanteilen der Ursprungsfarben entsprechend einer pixelweisen Repräsentation der Ursprungsfarbe durch die Intensitätspixel oder in den Intensitätspixeln der Farbkanäle repräsentieren.
Verfahren zur Objekt- oder Probenuntersuchung, bei dem von wenigstens einem Objekt oder wenigstens einer Probe ausgehende oder durch das Objekt oder die Probe durchgelassene optische Strahlung ortsaufgelöst detektiert wird und auf Grundlage der Detektion ein durch Intensitätspixel (I_α(x, y), I_β(x, y), I_γ(x, y)) wenigstens zweier Farbkanäle (α, β, γ) definiertes Mehrfarbbildes des Objekts bzw. der Probe generiert wird, derart, dass das Mehrfarbbild zumindest für die Intensitätspixel wenigstens einer Gruppe von Intensitätspixeln jeweils beruht a) auf einer simultan, ggf. in der Detektion, oder sukzessiv erfolgenden Überlagerung von wenigstens zwei jeweils mindestens einer Eigenschaft oder Struktur des Objekts bzw. der Probe oder/und wenigstens einem inhärent vorhandenen oder durch eine Färbebehandlung hinzugefügten Farbstoff des Objekts bzw. der Probe zugeordneten oder zumindest näherungsweise zuordenbaren farbkanalbezogenen Ursprungs-Intensitätswerten, die Überlagerung erfolgend – auf Grundlage einer bei einer Beleuchtung des Objekts bzw. der Probe mit optischer Strahlung erfolgenden Absorption oder/und Reflektion oder/und Streuung verschiedener spektraler Beiträge optischer Strahlung und dann gleichzeitig oder/und zeitlich aufeinanderfolgenden Detektion verschiedener, ggf. durch ein jeweiliges Detektionswellenlängenband bestimmter, in der optischen Strahlung nach der Absorption oder Reflektion oder Streuung in Transmission verbliebener spektraler Beiträge optischer Strahlung oder/und verschiedener, ggf. durch ein jeweiliges Detektionswellenlängenband bestimmter, von dem Objekt bzw. der Probe reflektierter oder gestreuter spektraler Beiträge optischer Strahlung, wobei die vorzugsweise zumindest näherungsweise additiv oder subtraktiv in die Überlagerung eingehenden Ursprungs-Intensitätswerte absorbierte oder detektierte Beiträge optischer Strahlung repräsentieren, und b) auf einer einer pixelweisen Repräsentation von aus der Überlagerung der Ursprungs-Intensitätswerte resultierenden farbkanalbezogenen Folge-Intensitätswerten durch die Intensitätspixel der Farbkanäle; dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren den Schritt umfasst, zur Identifizierung von Eigenschaften oder Strukturen des Objekts bzw. der Probe oder/und zur Identifizierung von inhärent vorhandenen oder durch die Färbebehandlung hinzugefügten Farbstoffen des Objekts bzw. der Probe aus dem durch die Intensitätspixel (I_α(x, y), I_β(x, y), I_γ(x, y)) der wenigstens zwei Farbkanäle (α, β, γ) definierten Mehrfarbbild des Objekts bzw. der Probe mehrere jeweils die pixelweisen Überlagerungsbeiträge durch die Ursprungs-Intensitätswerte für wenigstens einen Farbkanal repräsentierende Einfarbbilder zu generieren, die jeweils durch Intensitätspixel nur eines der Farbkanäle oder durch Intensitätspixel mehrerer der Farbkanäle mit für alle Intensitätspixel gleichem Intensitätsverhältnis zwischen den Farbkanälen oder durch Intensitätspixel nur eines einer definierten Kombination der Farbkanäle entsprechenden resultierenden Farbkanals definiert sind, wobei die Generation der Einfarbbilder auf Grundlage von angenommenen oder vorgegebenen oder aus einer Kalibrierung erhaltenen oder aus dem Mehrfarbbild abgeleiteten charakteristischen Intensitätsverhältnissen erfolgt, die Verhältnisse zwischen wenigstens zwei jeweils einem anderen der Farbkanäle zugeordneten Ursprungs-Intensitätswerten, die der gleichen Eigenschaft bzw. Struktur des Objekts bzw. der Probe bzw. dem gleichen Farbstoff des Objekts bzw. der Probe zugeordnet sind, repräsentieren.
Verfahren zur Objekt- oder Probenuntersuchung, bei dem von wenigstens einem Objekt oder wenigstens einer Probe ausgehende oder durch das Objekt oder die Probe durchgelassene optische Strahlung ortsaufgelöst detektiert wird und auf Grundlage der Detektion ein durch Intensitätspixel (I_α(x, y), I_β(x, y), I_γ(x, y)) wenigstens zweier Farbkanäle (α, β, γ) definiertes Mehrfarbbildes des Objekts bzw. der Probe generiert wird, derart, dass das Mehrfarbbild zumindest für die Intensitätspixel wenigstens einer Gruppe von Intensitätspixeln jeweils beruht a') auf einer simultan, ggf. in der Detektion, oder sukzessiv erfolgenden Überlagerung von wenigstens zwei jeweils mindestens einer Eigenschaft oder Struktur des Objekts bzw. der Probe oder/und wenigstens einem inhärent vorhandenen oder durch eine Färbebehandlung hinzugefügten Farbstoff des Objekts bzw. der Probe zugeordneten oder zumindest näherungsweise zuordenbaren Ursprungsfarben, die Überlagerung erfolgend – im Sinne einer additiven Farbmischung der Ursprungsfarben oder/und auf Grundlage einer von dem Objekt bzw. der Probe ausgehenden Emission und dann gleichzeitig oder/und zeitlich aufeinanderfolgenden Detektion verschiedener, ggf. durch ein jeweiliges Detektionswellenlängenband bestimmter spektraler Beiträge optischer Strahlung, wobei die Ursprungsfarben detektierten Beiträgen optischer Strahlung zugeordnet oder zuordenbar sind im Sinne einer dem jeweiligen Beitrag optischer Strahlung jeweils zugeordneten Fehlfarbe oder im Sinne eines aus einer hypothetischen oder tatsächlichen visuellen Wahrnehmung des jeweiligen Beitrags optischer Strahlung jeweils resultierenden visuellen Farbeindrucks, und b) auf einer einer pixelweisen Repräsentation von aus der Überlagerung der Ursprungsfarben resultierenden Mischfarben durch die Intensitätspixel der Farbkanäle; dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren den Schritt umfasst, zur Identifizierung von Eigenschaften oder Strukturen des Objekts bzw. der Probe oder/und zur Identifizierung von inhärent vorhandenen oder durch die Färbebehandlung hinzugefügten Farbstoffen des Objekts bzw. der Probe aus dem durch die Intensitätspixel (I_α(x, y), I_β(x, y), I_γ(x, y)) der wenigstens zwei Farbkanäle (α, β, γ) definierten Mehrfarbbild des Objekts bzw. der Probe mehrere jeweils die pixelweisen Überlagerungsbeiträge einer Ursprungsfarbe für wenigstens einen Farbkanal repräsentierende Einfarbbilder zu generieren, die jeweils durch Intensitätspixel nur eines der Farbkanäle oder durch Intensitätspixel mehrerer der Farbkanäle mit für alle Intensitätspixel gleichem Intensitätsverhältnis zwischen den Farbkanälen oder durch Intensitätspixel nur eines einer definierten Kombination der Farbkanäle entsprechenden resultierenden Farbkanals definiert sind, wobei die Generation der Einfarbbilder auf Grundlage von angenommenen oder vorgegebenen oder aus einer Kalibrierung erhaltenen oder aus dem Mehrfarbbild abgeleiteten charakteristischen Intensitätsverhältnissen erfolgt, die Verhältnisse zwischen wenigstens zwei jeweils einem anderen der Farbkanäle zugeordneten, vorzugsweise additiven Intensitätsbeiträgen oder Intensitätsanteilen der Ursprungsfarben entsprechend einer pixelweisen Repräsentation der Ursprungsfarbe durch die Intensitätspixel oder in den Intensitätspixeln der Farbkanäle repräsentieren.
Verfahren zur Objekt- oder Probenuntersuchung, bei dem von wenigstens einem Objekt oder wenigstens einer Probe ausgehende oder durch das Objekt oder die Probe durchgelassene optische Strahlung ortsaufgelöst detektiert wird und auf Grundlage der Detektion ein durch Intensitätspixel (I_α(x, y), I_β(x, y), I_γ(x, y)) wenigstens zweier Farbkanäle (α, β, γ) definiertes Mehrfarbbildes des Objekts bzw. der Probe generiert wird, derart, dass das Mehrfarbbild zumindest für die Intensitätspixel wenigstens einer Gruppe von Intensitätspixeln jeweils beruht a') auf einer simultan, ggf. in der Detektion, oder sukzessiv erfolgenden Überlagerung von wenigstens zwei jeweils mindestens einer Eigenschaft oder Struktur des Objekts bzw. der Probe oder/und wenigstens einem inhärent vorhandenen oder durch eine Färbebehandlung hinzugefügten Farbstoff des Objekts bzw. der Probe zugeordneten oder zumindest näherungsweise zuordenbaren farbkanalbezogenen Ursprungs-Intensitätswerten, die Überlagerung erfolgend – auf Grundlage einer von dem Objekt bzw. der Probe ausgehenden Emission und dann gleichzeitig oder/und zeitlich aufeinanderfolgenden Detektion verschiedener, ggf. durch ein jeweiliges Detektionswellenlängenband bestimmter spektraler Beiträge optischer Strahlung, wobei die vorzugsweise zumindest näherungsweise additiv in die Überlagerung eingehenden Ursprungs-Intensitätswerte detektierte Beiträge optischer Strahlung repräsentieren, und b) auf einer einer pixelweisen Repräsentation von aus der Überlagerung der Ursprungs-Intensitätswerte resultierenden farbkanalbezogenen Folge-Intensitätswerten durch die Intensitätspixel der Farbkanäle; dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren den Schritt umfasst, zur Identifizierung von Eigenschaften oder Strukturen des Objekts bzw. der Probe oder/und zur Identifizierung von inhärent vorhandenen oder durch die Färbebehandlung hinzugefügten Farbstoffen des Objekts bzw. der Probe aus dem durch die Intensitätspixel (I_α(x, y), I_β(x, y), I_γ(x, y)) der wenigstens zwei Farbkanäle (α, β, γ) definierten Mehrfarbbild des Objekts bzw. der Probe mehrere jeweils die pixelweisen Überlagerungsbeiträge durch die Ursprungs-Intensitätswerte für wenigstens einen Farbkanal repräsentierende Einfarbbilder zu generieren, die jeweils durch Intensitätspixel nur eines der Farbkanäle oder durch Intensitätspixel mehrerer der Farbkanäle mit für alle Intensitätspixel gleichem Intensitätsverhältnis zwischen den Farbkanälen oder durch Intensitätspixel nur eines einer definierten Kombination der Farbkanäle entsprechenden resultierenden Farbkanals definiert sind, wobei die Generation der Einfarbbilder auf Grundlage von angenommenen oder vorgegebenen oder aus einer Kalibrierung erhaltenen oder aus dem Mehrfarbbild abgeleiteten charakteristischen Intensitätsverhältnissen erfolgt, die Verhältnisse zwischen wenigstens zwei jeweils einem anderen der Farbkanäle zugeordneten Ursprungs-Intensitätswerten, die der gleichen Eigenschaft bzw. Struktur des Objekts bzw. der Probe bzw. dem gleichen Farbstoff des Objekts bzw. der Probe zugeordnet sind, repräsentieren.
Verfahren zur Generation mehrerer Einfarbbilder aus einem durch Intensitätspixel (I_α(x, y), I_β(x, y), I_γ(x, y)) wenigstens zweier Farbkanäle (α, β, γ) definierten Mehrfarbbild einer Probe oder eines Objekts, zur Identifizierung von Eigenschaften oder Strukturen des Objekts bzw. der Probe oder/und zur Identifizierung von inhärent vorhandenen oder durch eine Färbebehandlung hinzugefügten Farbstoffen des Objekts bzw. der Probe, wobei die Einfarbbilder durch Intensitätspixel nur eines der Farbkanäle oder durch Intensitätspixel mehrerer der Farbkanäle mit für alle Intensitätspixel gleichem Intensitätsverhältnis zwischen den Farbkanälen oder durch Intensitätspixel nur eines einer definierten Kombination der Farbkanäle entsprechenden resultierenden Farbkanals definiert sind, wobei das Mehrfarbbild zumindest für die Intensitätspixel wenigstens einer Gruppe von Intensitätspixeln jeweils auf einer Überlagerung von verschiedenen Ursprungsfarben zugeordneten Überlagerungsbeiträgen, insbesondere zumindest näherungsweise additiven Intensitätsbeiträgen oder Intensitätsanteilen oder/und zumindest näherungsweise subtraktiven Intensitätsbeiträgen oder Intensitätsanteilen, beruht, das Mehrfarbbild insbesondere erhalten gemäß dem Oberbegriff wenigstens eines der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Einfarbbilder verschiedenen Ursprungsfarben zugeordnete Überlagerungsbeiträge repräsentieren und auf Grundlage von angenommenen oder vorgegebenen oder aus einer Kalibrierung erhaltenen oder aus dem Mehrfarbbild abgeleiteten charakteristischen Intensitätsverhältnissen generiert werden, die Verhältnisse zwischen wenigstens zwei jeweils einem anderen der Farbkanäle zugeordneten Intensitätsbeiträgen oder Intensitätsanteilen, die der gleichen Eigenschaft bzw. Struktur des Objekts bzw. der Probe bzw. dem gleichen Farbstoff der des Objekts bzw. der Probe zugeordnet sind, repräsentieren.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Einfarbbilder gemäß dem Kennzeichen wenigstens eines der Ansprüche 1 bis 4 generiert werden.
Verfahren nach wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein jeweiliger Überlagerungsbeitrag als Intensitätsanteil oder Intensitätsbeitrag für einen jeweiligen Farbkanal aufzufassen ist, welcher Intensitätsanteil bzw. Intensitätsbeitrag auf Grundlage eines linearen, subtraktiven oder additiven Ansatzes in der Überlagerung auf eine jeweilige Eigenschaften bzw. Struktur bzw. einen jeweiligen Farbstoff des Objekts bzw. der Probe zurückführbar ist.
Verfahren nach Anspruch 7, insbesondere rückbezogen zumindest auf Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein jeweiliger Überlagerungsbeitrag auf Grundlage eines linearen, subtraktiven Ansatzes als in Transmission durch Absorption in Folge einer jeweiligen Eigenschaft bzw. durch eine jeweilige Struktur bzw. einen jeweiligen Farbstoff des Objekts bzw. der Probe aus der optischen Strahlung entfernter Intensitätsanteil für einen jeweiligen Farbkanal aufzufassen ist.
Verfahren nach Anspruch 7, insbesondere rückbezogen zumindest auf Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass ein jeweiliger Überlagerungsbeitrag auf Grundlage eines linearen, additiven Ansatzes als in Folge einer jeweilige Eigenschaft vom Objekt bzw. der Probe bzw. von einer jeweiligen Struktur bzw. einem jeweiligen Farbstoff des Objekts bzw. der Probe ausgehender additiver Intensitätsbeitrag für einen jeweiligen Farbkanal aufzufassen ist, ggf. als additiver Intensitätsbeitrag in Folge einer Anregung eines Farbstoffs und hieraus resultierender Emission optischer Strahlung durch den Farbstoff für den jeweiligen Farbkanal aufzufassen ist.
Verfahren nach wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Mehrfarbbild des Objekts bzw. der Probe durch Intensitätspixel (I_α(x, y), I_β(x, y), I_γ(x, y)) wenigstens dreier Farbkanäle (α, β, γ) definiert ist.
Verfahren nach wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche, zumindest rückbezogen auf einen der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Strahlung zeitgleich oder zeitlich aufeinanderfolgend in wenigstens zwei, vorzugsweise wenigstens drei verschiedenen, spektral gegeneinander versetzten, ggf. sich spektral überlappenden Detektionswellenlängenbändern einer Detektoranordnung detektiert wird.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionswellenlängenbänder jeweils einem von mehreren Detektionsfarbkanälen der als Farbbild-Detektoranordung ausgeführten Detektoranordnung zugeordnet sind, wobei die Detektionsfarbkanäle verschiedenen mit den Detektionswellenlängenbändern korrespondierenden Primärfarben zugeordnet sind, aus denen nach Maßgabe eines für den jeweiligen Detektionsfarbkanal pixelweise detektierten Intensitätwerts eine für den jeweiligen Pixel oder eine Gruppe von jeweils einem der Farbkanäle zugeordnete Pixeln detektierte Farbe additiv mischbar ist.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Farbkanäle der Detektoranordnung den Farbkanälen entsprechen, auf deren Grundlage das Mehrfarbbild definiert ist, so dass die Detektoranordnung unmittelbar das Mehrfarbbild bereitstellt oder wenigstens ein Zwischen-Mehrfarbbild bereitstellt, aus dem das Mehrfarbbild ohne Umrechnung zu einer Farbdarstellung auf Grundlage anderer Primärfarben generiert wird.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Farbkanäle der Detektoranordnung von den Farbkanälen abweichen, auf deren Grundlage das Mehrfarbbild definiert ist, so dass die Detektoranordnung wenigstens ein Zwischen-Mehrfarbbild bereitstellt, aus dem das Mehrfarbbild unter Umrechnung zu einer Farbdarstellung auf Grundlage von der Repräsentation der Überlagerung, insbesondere der Repräsentation der Mischfarben bzw. Folge-Intensitätswerten, zugrundeliegenden Primärfarben generiert wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Überlagerung eine gleichzeitige oder nacheinander erfolgende Detektion verschiedener spektraler Beiträge optischer Strahlung basierend auf der gleichen Beleuchtung des Objekts bzw. der Probe mit optischer Strahlung umfasst, insbesondere für eine Untersuchung des Objekts bzw. der Probe in Transmission.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Überlagerung eine gleichzeitige oder nacheinander erfolgende Detektion verschiedener spektraler Beiträge optischer Strahlung basierend auf der gleichen Beleuchtung des Objekts bzw. der Probe mit multispektraler, vorzugsweise breitbandiger optischer Strahlung, höchstvorzugsweise Weißlicht, umfasst.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Generation der die Überlagerungsbeiträge repräsentierenden Einfarbbilder für jeden Pixel der Gruppe bzw. Teilgruppe mathematische Operationen umfasst, die die Lösung eines linearen Gleichungssystem mit mehreren Unbekannten durch Methoden der linearen Algebra oder Ratio-Verfahren umfassen oder mathematisch der exakten oder approximativen Lösung eines solchen Gleichungssystems entsprechen.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Zahl der linearen Gleichungen pro Pixel maximal der Zahl der Farbkanäle entspricht.
Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Generation der Einfarbbilder auf einem Gleichungssystem beruht, dessen Gleichungen für drei Farbkanäle allgemein die folgende Form haben oder in die folgende Form bringbar sind: Iα(x, y) = Iα(x, y, f1) + Iα(x, y, f2) + Iα(x, y, f3) Iß(x, y) = Iα(x, y, f1) + Iβ(x, y, f2) + Iβ(x, y, f3) Iγ(x, y) = Iγ(x, y, f1) + Iγ(x, Y, f2) + Iγ(x, y, f3),wobei I_α(x, y), I_β(x, y), I_γ(x, y) die Intensitätswerte der Intensitätspixel des Mehrfarbbilds für die drei Farbkanäle α, β und γ sind, die Koordinaten x, y einen jeweiligen Pixel identifizieren und die Terme rechts der Gleichheitszeichen jeweils einen additiven Überlagerungsbeitrag zum Intensitätswert des jeweiligen Farbkanals α bzw. β bzw. γ in Folge einer Eigenschaft bzw. Struktur oder eines Farbstoffs f1 bzw. f2 bzw. f3 der Probe bzw. des Objekts angeben.
Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass Generation der Einfarbbilder auf einem Gleichungssystem beruht, dessen Gleichungen für drei Farbkanäle allgemein die folgende Form haben oder in die folgende Form bringbar sind: Iα(x, y) = Iα MAX – Iα(x, y, f1) – Iα(x, y, f2) – Iα(x, y, f3) Iβ(x, y) = Iβ MAX – Iβ(x, y, f1) – Iβ(x, y, f2) – Iβ(x, y, f3) Iγ(x, y) = Iγ MAX – Iγ(x, y, f1) – Iγ(x, y, f2) – Iγ(x, y, f3),wobei I_α(x, y), I_β(x, y), I_γ(x, y) die Intensitätswerte der Intensitätspixel des Mehrfarbbilds für die drei Farbkanäle α, β und γ sind, die Koordinaten x, y einen jeweiligen Pixel identifizieren, die Terme I_α ^MAX, I_β ^MAX, I_γ ^MAX einen für eine gegebene Untersuchungssituation maximal möglichen Intensitätswert für den jeweiligen Farbkanal α bzw. β bzw. γ angeben und die übrigen Terme rechts der Gleichheitszeichen jeweils einen subtraktiven Überlagerungsbeitrag zum Intensitätswert des jeweiligen Farbkanals α bzw. β bzw. γ in Folge einer Eigenschaft bzw. Struktur oder eines Farbstoffs f1 bzw. f2 bzw. f3 der Probe bzw. des Objekts angeben.
Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die einen maximal möglichen Intensitätswert für die Farbkanäle α, β und γ angebenden Terme I_α ^MAX, I_β ^MAX, I_γ ^MAX aus dem Mehrfarbbild bestimmt werden, vorzugsweise durch Bestimmung einer maximalen Pixelintensität für den jeweiligen Farbkanal aus allen Intensitätspixeln.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Gleichungssystem für die Terme I_α(x, y, f1), I_β(x, y, f1), I_γ(x, y, f1) oder/und für die Terme I_α(x, y, f2), I_β(x, y, f2), I_γ(x, y, f2) oder/und für die Terme I_α(x, y, f3), I_β(x, y, f3), I_γ(x, y, f3) gelöst wird auf Grundlage von charakteristischen Intensitätsverhältnissen Rαβ(f1) = Iα(f1)/Iβ(f1) Rαγ(f1) = Iα(f1)/Iγ(f1) Rαβ(f2) = Iα(f2)/Iβ(f2) Rαγ(f2) = Iα(f2)/Iγ(f2) Rαβ(f3) = Iα(f3)/Iβ(f3) Rαγ(f3) = Iα(f3)/Iγ(f3)oder hieraus ableitbaren charakteristischen Intensitätsverhältnissen, die das Verhältnis zwischen zwei zu verschiedenen Farbkanälen a, b additiv oder subtraktiv beitragenden Überlagerungsbeiträgen I_a(), I_b() in Folge der gleichen Eigenschaft bzw. Struktur oder des gleichen Farbstoffs f1 bzw. f2 bzw. f3 der Probe bzw. des Objekts angeben, wobei a, b jeweils auf zwei verschiedene der Farbkanäle α, β, γ verweisen.
Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die charakteristischen Intensitätsverhältnisse aus dem Mehrfarbbild bestimmt werden, vorzugsweise auf Grundlage einer Identifizierung von Bildbereichen, die ohne Überlagerung mehrerer additiver oder substraktiver Überlagerungsbeiträge für einen jeweiligen Farbkanal nur auf additiven oder subtraktiven Intensitätsbeiträgen I_α(x, y, f1), I_β(x, y, f1), I_γ(x, y, f1) bzw. I_α(x, y, f2), I_β(x, y, f2), I_γ(x, y, f2) bzw. I_α(x, y, f3), I_β(x, y, f3),I_γ(x, y, f3) in Folge genau einer Eigenschaft bzw. Struktur oder genau eines Farbstoffs f1 bzw. f2 bzw. f3 der Probe bzw. des Objekts beruhen.
Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die charakteristischen Intensitätsverhältnisse aus für Kalibrier-Proben oder Kalibrier-Objekte generierten Kalibrier-Mehrfarbbildern bestimmt werden, wobei die Kalibrier-Proben oder Kalibrier-Objekte derart gewählt oder präpariert sind, dass sie zumindest in einem Bildbereich des Kalibrier-Mehrfarbbilds ohne Überlagerung mehrerer additiver oder substraktiver Überlagerungsbeiträge für einen jeweiligen Farbkanal nur auf additiven oder subtraktiven Intensitätsbeiträgen I_α(x, y, f1), I_β(x, y, f1), I_γ(x, y, f1) bzw. I_α(x, y, f2), I_β(x, y, f2), I_γ(x, y, f2) bzw. I_α(x, y, f3), I_β(x, y, f3), I_γ(x, y, f3) in Folge genau einer Eigenschaft bzw. Struktur oder genau eines Farbstoffs f1 bzw. f2 bzw. f3 der für die Probe insoweit repräsentativen Kalibrier-Probe bzw. des in soweit für das Objekt repräsentativen Kalibrier-Objekts beruhen.
Verfahren zur Objekt- oder Probenuntersuchung, bei dem von einem Objekt oder einer Probe in Transmission für mehrere verschiedene, spektral gegeneinander versetzte Detektionswellenlängenbänder jeweils ein in ortsaufgelöst erfassten Intensitätswerten eine Abschwächung von durch das Objekt bzw. die Probe hindurchgehender optischer Strahlung im jeweiligen Detektionswellenlängenband aufgrund von Absorption angebendes Bild des Objekts bzw. der Probe aufgenommen wird und bei dem auf Grundlage von angenommenen oder vorgegebenen oder aus einer Kalibrierung erhaltenen oder aus mehreren der Bilder abgeleiteten charakteristischen Intensitätsverhältnissen aus den Bildern resultierende Bilder generiert werden, die Absorptionsanteile auf Grund verschiedener, die optische Strahlung absorbierender Eigenschaften oder/und Strukturen des Objekts bzw. der Probe oder/und auf Grund verschiedener, die optische Strahlung absorbierender Farbstoffe des Objekts bzw. der Probe repräsentieren.
Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Generation der resultierenden Bilder mathematische Operationen umfasst, die die Lösung eines linearen Gleichungssystem mit mehreren Unbekannten durch Methoden der linearen Algebra oder Ratio-Verfahren umfassen oder mathematisch der exakten oder approximativen Lösung eines solchen Gleichungssystems entsprechen.
Verfahren nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, dass Generation der resultierenden Bilder auf einem Gleichungssystem beruht, dessen Gleichungen für N Detektionswellenlängenbänder D1 bis DN allgemein die folgende Form haben oder in die folgende Form bringbar sind:
wobei I_D1(x, y), ..., I_DN(x, y) die ortsaufgelöst erfassten Intensitätswerte eines jeweiligen der aufgenommenen Bilder sind, x, y Ortskoordinaten sind oder einen jeweiligen Pixel des aufgenommenen Bilds identifizieren, die Terme I_D1 ^MAX, ..., I_DN ^MAX einen für eine gegebene Untersuchungssituation maximal möglichen Intensitätswert für das jeweilige Detektionswellenlängenband D1 bis DN angeben und die übrigen Terme rechts der Gleichheitszeichen jeweils einen subtraktiven Überlagerungsbeitrag zum Intensitätswert des jeweiligen aufgenommenen Bilds in Folge einer Eigenschaft bzw. Struktur oder eines Farbstoffs verschiedener Farbstoff f1 bis fN der Probe bzw. des Objekts angeben.
Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die einen maximal möglichen Intensitätswert für die Detektionswellenlängenbänder D1 bis DN angebenden Terme I_D1 ^MAX, ..., I_DN ^MAX aus dem jeweiligen aufgenommenen Bild bestimmt werden, vorzugsweise durch Bestimmung eines Intensitätsmaximums.
Verfahren nach Anspruch 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, dass das Gleichungssystem gelöst wird auf Grundlage von charakteristischen Intensitätsverhältnissen
oder hieraus ableitbaren charakteristischen Intensitätsverhältnissen, die das Verhältnis zwischen zwei zu verschiedenen Detektionswellenlängenbänder subtraktiv beitragenden Absorptionsanteilen in Folge der gleichen Eigenschaft bzw. Struktur oder des gleichen Farbstoffs der Probe bzw. des Objekts angeben.
Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass die charakteristischen Intensitätsverhältnisse aus jeweils zwei der aufgenommenen Bildern bestimmt werden, vorzugsweise auf Grundlage einer Identifizierung von Bildbereichen, die nur auf Absorptionsanteilen in Folge genau einer Eigenschaft bzw. Struktur oder genau eines Farbstoffs der Probe bzw. des Objekts beruhen.
Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass die charakteristischen Intensitätsverhältnisse aus für Kalibrier-Proben oder Kalibrier-Objekte aufgenommenen Kalibrier-Bildern bestimmt werden, wobei die Kalibrier-Proben oder Kalibrier-Objekte derart gewählt oder präpariert sind, dass sie zumindest in einem Bildbereich des Kalibrier-Bilds nur auf Absorptionsanteilen in Folge genau einer Eigenschaft bzw. Struktur oder genau eines Farbstoffs der für die Probe insoweit repräsentativen Kalibrier-Probe bzw. des in soweit für das Objekt repräsentativen Kalibrier-Objekts.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, zumindest rückbezogen auf einen der Ansprüche 1 bis 4 oder auf Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Strahlung ortsaufgelöst mittels eines Mikroskops detektiert wird.
Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass das Mehrfarbbild ein mikroskopisches Transmissions-Mehrfarbbild oder Hellfeld-Mehrfarbbild oder Dunkelfeld-Mehrfarbbild des Objekts bzw. der Probe ist oder auf wenigstens einem mikroskopischen Transmissions-Mehrfarbbild oder Hellfeld-Mehrfarbbild oder Dunkelfeld-Mehrfarbbild des Objekts bzw. der Probe oder mehreren mikroskopischen Transmissions-Mehrfarbbildern oder Hellfeld-Bildern oder Dunkelfeld-Bildern, ggf. Einfarb- oder Schwarzweiß-Bildern, des Objekts bzw. der Probe beruht, bzw. dass die aufgenommenen Bilder mikroskopische Transmissions-Bilder oder Hellfeld-Bilder oder Dunkelfeld-Bilder des Objekts bzw. der Probe sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe eine biologische Probe, beispielsweise ein histologischer Schnitt, bzw. ein biologisches Objekt ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, zumindest rückbezogen auf einen der Ansprüche 1 bis 4 oder auf Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, das das Verfahren den Schritt der Einfärbung wenigstens einer Struktur der Probe bzw. des Objekts mit wenigstens einem Farbstoff umfasst.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Farbkanäle bzw. Detektionswellenlängenbänder Farbkanälen für eine Darstellung des Mehrfarbbilds bzw. der aufgenommenen Bilder auf einem elektronischen Bildschirm, etwa RGB-Farbkanälen, entsprechen.
Einrichtung (10) zum Durchführen des Verfahren nach wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend: – einen Bildspeicher (32) zur Speicherung durch Intensitätspixel (I_α(x, y), I_β(x, y), I_γ(x, y)) wenigstens zweier Farbkanäle (α, β, γ) definierten Mehrfarbbildes einer Probe oder eines Objekts, wobei das Mehrfarbbild zumindest für die Intensitätspixel wenigstens einer Gruppe von Intensitätspixeln jeweils auf einer Überlagerung von verschiedenen Ursprungsfarben zugeordneten Überlagerungsbeiträgen, insbesondere zumindest näherungsweise additiven Intensitätsbeiträgen oder Intensitätsanteilen oder/und zumindest näherungsweise subtraktiven Intensitätsbeiträgen oder Intensitätsanteilen, beruht, – eine Bildverarbeitungseinheit (36), die auf den Intensitätspixeln des Mehrfarbbilds arbeitet und das Mehrfarbbild in Einfarbbilder zerlegt und diese im Bildspeicher abspeichert, wobei Einfarbbild durch Intensitätspixel nur eines der Farbkanäle oder durch Intensitätspixel mehrerer der Farbkanäle mit für alle Intensitätspixel gleichem Intensitätsverhältnis zwischen den Farbkanälen oder durch Intensitätspixel nur eines einer definierten Kombination der Farbkanäle entsprechenden resultierenden Farbkanals definiert sind, dadurch gekennzeichnet, dass die Bildverarbeitungseinheit (36) dafür ausgeführt oder programmiert ist, die verschiedenen Urprungsfarben zugeordnete Überlagerungsbeiträge repräsentierenden Einfarbbilder auf Grundlage von angenommenen oder vorgegebenen oder aus einer Kalibrierung erhaltenen oder aus dem Mehrfarbbild abgeleiteten charakteristischen Intensitätsverhältnissen, die Verhältnisse zwischen wenigstens zwei jeweils einem anderen der Farbkanäle zugeordneten Intensitätsbeiträgen oder Intensitätsanteilen, die der gleichen Eigenschaft bzw. Struktur des Objekts bzw. der Probe bzw. dem gleichen Farbstoff der des Objekts bzw. der Probe zugeordnet sind, repräsentieren, zu generierten.
Einrichtung nach Anspruch 37, gekennzeichnet durch Mittel zur Erzeugung des Mehrfarbbilds.
Einrichtung nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel ein Mikroskop und eine ortsauflösende Detektoranordnung umfassen.
Computerprogrammprodukt zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 36.
Computerprogrammprodukt nach Anspruch 40, insbesondere in Form eines auf einem Datenträger gespeicherten oder von einem Server, etwa über das Internet, herabladbaren Programms, welches durch einen Computer ausführbar ist und auf Grundlage eines in einer Speichereinrichtung (32) des Computers gespeicherten Mehrfarbbildes beim Ausführen des Programms durch eine Prozessoreinrichtung (36) des Computers das Verfahren nach Anspruch 5 bzw. die Generation der Einfarbbilder aus dem Mehrfarbbild gemäß Kennzeichen wenigstens eines der Ansprüche 1 bis 4 durchführt.