WO1995013527A1 - Vorrichtung zur mehrfarbbeleuchtung von präparaten - Google Patents

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WO1995013527A1
WO1995013527A1 PCT/DE1994/001318 DE9401318W WO9513527A1 WO 1995013527 A1 WO1995013527 A1 WO 1995013527A1 DE 9401318 W DE9401318 W DE 9401318W WO 9513527 A1 WO9513527 A1 WO 9513527A1
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light
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beam splitter
modulation
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PCT/DE1994/001318
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Johann Engelhardt
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Leica Lasertechnik Gmbh
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
    • G01J3/00—Spectrometry; Spectrophotometry; Monochromators; Measuring colours
    • G01J3/02—Details
    • G01J3/10—Arrangements of light sources specially adapted for spectrometry or colorimetry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
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    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G01N2021/6419—Excitation at two or more wavelengths

Definitions

  • the invention relates to a device for multi-color illumination of specimens in the context of — preferably fluorometric — measurements in which the specimen is successively illuminated with light of different, defined wavelengths, with at least one light source and modulation means.
  • the determination of the calcium ion concentration in cells or the change in the calcium ion concentration therefore provides essential insights into biological processes a precisely defined spatial be limited range, namely to individual cells or even only to cell compartments.
  • the tissue is usually dyed with a fluorescent dye.
  • fluorescent dyes In addition to pH dependencies, many fluorescent dyes also show specific dependencies on other ions. In certain concentration ranges, the absorption or emission properties depend on the surrounding medium. The fluorescence yield can change depending on the concentration or the spectral sensitivity in the absorption or emission can change.
  • the concentration-dependent absorption at different wavelengths can be used to determine the ion concentration.
  • These dyes have an isosbestic point which corresponds to a wavelength at which the absorption of the dye is almost independent of the ion concentration. This wavelength is used for reference measurements. The actual measurement is carried out at a different wavelength. With “ratio measurement” absolutely calibratable measurements are possible.
  • Still other dyes emit concentration-dependent at different wavelengths, so that the absolute ion concentration can be determined by ratio measurements at two different wavelengths.
  • the preparation must be illuminated with light of different wavelengths in a rapid sequence lying in the submillisecond range.
  • HE ATZBLATT Mercury (high pressure) lamp is a fast rotating filter wheel arranged as a modulation means. Modulation of the illuminating drug
  • the known device is problematic in practice, since the filter wheel rotating at high frequency causes vibrations in the entire measuring device. On the one hand, this can lead to a misalignment of the preparation with respect to the measuring device. On the other hand, such vibrations limit the maximum permissible measuring frequency. In addition, there is a dead time each time the filter is changed, during which no measurement can take place.
  • the invention is therefore based on the object of designing and developing a device for multi-color illumination of preparations in the context of — preferably fluorometric — measurements such that the light emitted by the light source is modulated without mechanical aids. No mechanically movable parts should therefore be used as modulation means.
  • the device according to the invention for multi-color illumination of preparations in the context of — preferably fluorometric — measurements achieves the above object by the features of patent claim 1.
  • a device of the type in question is designed in such a way that the modulation means are mechanically fixed and electro- or magneto- act optically.
  • ATZBLATT It was first recognized that the movement of parts of a measuring device during the measurement in principle represents an additional influencing factor which affects the measurement result and should therefore be avoided as far as possible. According to the invention, it was then further recognized that the light from a light source can also be modulated in an electro- or magneto-optical manner, the modulation means being able to be mechanically fixed in the device.
  • the modulation means of the device according to the invention can either modulate the intensity and / or the frequency of the light source. Which type of modulation is carried out depends essentially on the type of measurement to be carried out with the device according to the invention, but also on how many light sources the device according to the invention comprises.
  • a modulation of the wavelength of the light impinging on the preparation can namely also be achieved by switching between light sources which emit light of different frequencies or wavelengths.
  • the modulation means are connected upstream of the light source and implemented as a control of the light source.
  • the modulation means can be implemented, for example, in the form of an on or off switch, a dimmer and / or a switch between several light sources. It is particularly advantageous if the control of the light source not only includes these pure switching functions, but also determines the chronological sequence and coordination of the switching processes, which can be implemented in a simple manner in the form of computer-controlled modulation means.
  • the modulation means can also be arranged in the beam path of the light emitted by the light source.
  • the modulation means are arranged in the beam path almost directly behind the light source and then perform essentially the same function as the modulation means upstream of the light source.
  • the modulation means are arranged in the beam direction behind a beam splitter which at least spatially separates the light emitted by the light source, i.e. disassembled in two directions.
  • the wavelengths of the two partial beams produced in this way can then be defined, for example, by filters arranged in the respective beam paths or also wavelength-selective mirrors.
  • the modulation means are advantageously implemented as optical switches, for example in the form of fast liquid crystals or other optically active components.
  • the modulation means are computer-controlled so that the switching operations can be coordinated in time.
  • Arc lamps in particular mercury (high-pressure) lamps, are suitable as sources of light, in particular for fluorometry, since they produce a relatively small and bright arc.
  • flash lamps are also suitable as light sources, such as xenon flash lamps.
  • lasers which emit light of different wavelengths can advantageously also be used as the light source.
  • at least two light sources are provided, a filter for selecting a specific wavelength range being arranged in the beam paths of the light sources.
  • the beam paths of the light sources are combined via deflection means, which can be implemented, for example, in the form of one or more beam splitters, and directed onto the specimen to be examined.
  • each light source is preceded by a controllable on and off switch, the on and off switches being controlled in a coordinated manner.
  • the on and off switches therefore modulate and coordinate the intensity of each individual light source and thus fade in and out light of a defined wavelength.
  • a light source is provided in the device, in the beam path of which a beam splitter is arranged, which splits the light from this light source into partial beams.
  • Means for selecting a specific wavelength range are arranged in the beam path of each of these partial beams.
  • the partial beams are combined again via deflecting means and directed onto the specimen to be examined.
  • the modulation means are realized in the form of controllable electro-optical shutters which are arranged in the beam path of each partial beam.
  • the shutter is controlled in a time-coordinated manner so that a partial beam is alternately masked out.
  • the measurement results of the device described above can be improved further by pre-filtering the light emitted by the light source, for which purpose a pre-filter is arranged in the beam path.
  • a polarizer for linear polarization of the light can also be arranged here.
  • the beam egg usually splits the light from the light source into two spatially separated partial beams. It is particularly advantageous if the beam splitter is dichroic, ie the light from the light source is also spectrally split. In this case, the beam splitter serves as a means for selecting a specific wavelength range for each of the two partial beams. However, filters or mirrors with wavelength-selective properties can also be used as means for selecting a specific wavelength range in each partial beam.
  • shutters of the above-described advantageous embodiment of a device according to the invention for multi-color illumination of preparations are advantageously controlled in video cycle, i.e. can be switched on or off, in connection with a video camera and a suitable image processing system, successive images with different wavelengths can then be recorded and processed.
  • Fig. 1 in a schematic block diagram a microscope
  • Fig. 2 shows a second embodiment of a device according to the invention.
  • IT 1 shows a device for multi-color illumination of preparations in the context of preferably fluorometric measurements, in which the preparation is illuminated successively with light of different, defined wavelengths.
  • This device is part of a microscope and evaluation arrangement which, in addition to the microscope 1, comprises a detector 2 connected to it, a controller 3 and a computer 4.
  • the specimen to be examined is fixed under the microscope 1 and successively illuminated with light of different, defined wavelength.
  • the device according to the invention comprises two light sources 5 and 6 and modulation means 13.
  • the modulation means are mechanically fixed and have an electro-optical effect.
  • Filters 7 and 8 are arranged in the beam paths of the light emitted by the two light sources 5 and 6, with each of which a specific wavelength range can be selected.
  • the beam paths of the light sources 5 and 6 are combined with one another by means of deflection means in the form of a beam splitter 9 and directed onto the specimen located under the microscope 1.
  • the beam egg 9 can also have color-selective properties, ie it can contribute to the selection of a specific wavelength range.
  • the device described here can be expanded by further units, consisting of a light source 10, a filter 11 and a beam splitter 12, which is indicated in the figure by a dashed frame.
  • the modulation means 13 serve to modulate the intensities of the light sources 5, 6 and possibly 10.
  • the modulation means 13 are connected upstream of the light source and implemented as a control of the light source.
  • the lighting intensities of the light sources 5, 6 and possibly 10 are electronically controlled, so that the intensities of the two wavelengths can be adjusted to an optimum value for the preparation to be examined, in order to achieve a good one To achieve signal to noise ratio and on the other hand to keep the light exposure of the preparation as low as possible.
  • the rectangular functions shown in the symbol for the modulation means 13 symbolize that the modulation means also cause the light sources 5 and 6 to be switched on and off in a time-coordinated manner, namely alternately.
  • the entire system, ie both the modulation means 13 and the measurement electronics, are computer-controlled in the exemplary embodiment shown here.
  • arc lamps e.g.
  • Mercury (high pressure) lamps or xenon (high pressure) lamps are used, which enable a particularly fast switching. No 100 percent modulation is achieved, but this is not necessary to achieve good measurement results.
  • the device shown in FIG. 2 for multi-color illumination of preparations in the context of — preferably fluorometric — measurements, in which the preparation is successively illuminated with light of different, defined wavelengths, comprises only one light source 15.
  • the light from light source 15 is passed through a filter 16 prefiltered and linearly polarized using a polarizer 17.
  • a dichroic beam splitter 18 spatially and spectrally divides the pre-filtered and linearly polarized light into two partial beams.
  • a filter 19 and 20 for selecting a specific wavelength range and a mirror 21 and 22 are arranged in each partial beam.
  • the mirrors 21 and 22 serve primarily to deflect the two partial beams; but they can also have wavelength-selective properties.
  • the mirrors 21 and 22 feed the two partial beams to a beam splitter 23, which combines the two partial beams and directs them onto the specimen to be examined.
  • An electro-optical shutter 24 and 25 is arranged between the mirror 21 and the beam splitter 23 and between the mirror 22 and the beam splitter 23, the shutters being able to be switched on and off electronically arbitrarily, ie at selected times.
  • the shutters 24 and 25 represent modulation means which are mechanically fixed within the device and act electro- or also magneto-optically.
  • the shutters 24 and 25 represent optical switches which can be implemented, for example, in the form of fast liquid crystals. They are advantageously controlled electronically or by computer.
  • An arc lamp or a flash lamp can also be used as the light source in the exemplary embodiment shown here, or advantageously also a laser which, like an argon laser, for example, emits light with two different wavelengths.
  • two images taken in succession with different wavelengths can be displayed, for example, as a ratio. This makes it possible, for example in the case of FURA staining, to directly depict the concentration of the Ca ++ ions.
  • the device according to the invention for multi-color illumination of preparations is preferably used in fluorometry, but can advantageously also be used in conjunction with other measuring methods and apparatus.
  • Reference numerals are preferably used in fluorometry, but can advantageously also be used in conjunction with other measuring methods and apparatus.

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Abstract

Eine Vorrichtung zur Mehrfarbbeleuchtung von Präparaten im Rahmen von - vorzugsweise fluorometrischen - Messungen, bei denen das Präparat nacheinander mit Licht unterschiedlicher, definierter Wellenlänge beleuchtet wird, soll derart ausgestaltet werden, daß die Modulation des von einer Lichtquelle (5, 6, 10, 15) der Vorrichtung ausgesandten Lichtes ohne mechanische Hilfsmittel erfolgt. Als Modulationsmittel (13, 24, 25) sollen also keine mechanisch bewegbaren Teile verwendet werden, die zum einen Vibrationen in der Messaparatur hervorrufen und zum anderen relativ große Totzeiten bedingen, in denen keine Messung stattfinden kann. Erfindungsgemäß wird vorgeschlagen, elektro- oder magneto-optische Modulationsmittel (13, 24, 25) zu verwenden.

Description

'Vorrichtung zur Mehrfarbbeleuchtung von Präparaten"
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Mehrfarbbeleuchtung von Präparaten im Rahmen von - vorzugsweise fluorometrischen - Messungen, bei denen das Präparat nacheinander mit Licht unterschiedlicher, definierter Wellenlänge beleuchtet wird, mit mindestens einer Lichtquelle und Modulationsmitteln.
Fast alle biochemischen Vorgänge in Zellen oder Geweben verändern lokal oder global lonenkonzentrationen oder werden von solchen Veränderungen ausgelöst. Dabei kann es sich um H+, Ca++, Na+, K+, CI" und andere Ionen handeln. Beispielhaft sei hier besonders auf die Rolle von Kalciumionen Ca++ hingewiesen, die in geringen Mengen durch die Zellmembran wandern und dabei Signalfunktionen erfüllen. Zwar regulieren die Zellen die intrazellulären Kaiciumkonzentrationen derart, daß die Kalciumkonzentration im Zellinnern im wesentlichen konstant bleibt, jedoch kann der lonenstrom durch die Zellmembran, ein- wie auswärts, deutlich schwanken. Dieser regelrechte Kreisstrom ist in eine komplexe Ereigniskette integriert - Abläufe, mit denen Zellen länger anhaltend auf äußere Signale reagieren. l.d.R. reagieren Zellen bereits auf kleinste Veränderungen im Kalciumspiegel äußerst empfindlich. Die Bestimmung der Kalciumionenkonzentration in Zellen bzw. der Veränderung der Kalciumionenkonzentration ermöglicht daher wesentliche Einblicke in biolo- gische Vorgänge. Die Messung selbst muß dazu allerdings auf einen genau definierten räumlichen Bereich begrenzt werden, nämlich auf einzelne Zellen oder sogar nur auf Zellkompartinente. Zur Messung wird das Gewebe i.d.R. mit einem fluoreszierenden Farbstoff eingefärbt.
Viele Fluoreszenzfarbstoffe zeigen neben PH-Abhängigkeiten auch spezifische Abhängigkeiten von anderen Ionen. In bestimmten Konzentrationsbereichen sind die Absorptions- oder Emissionseigenschaften abhängig vom umgebenden Medium. Dabei kann sich die Fluoreszenzausbeute konzentrationsabhängig ändern oder die spektrale Empfindlichkeit in der Absorption oder Emission än¬ dern.
ERSATZ In Abhängigkeit von den verwendeten Farbstoffen können drei sich grundsätzlich unterscheidende Meßverfahren angewendet werden:
1. Mit bestimmten Farbstoffen, wie z.B. FLUO3, können Konzentrationen einfach durch Fluoreszenzausbeute gemessen werden. Die Kalibrierung auf absolute lonenkonzentration ist dabei jedoch meist kompliziert und unsicher.
2. Bei anderen Farbstoffen, wie z.B. FURA oder QUIN, kann dagegen die konzentrationsabhängige Absorption bei verschiedenen Wellenlängen zur Bestimmung der lonenkonzentration genutzt werden. Diese Farbstoffe weisen einen isosbestischen Punkt auf, welcher einer Wellenlänge entspricht, bei der die Absorption des Farbstoffs nahezu unabhängig von der lonenkonzentration ist. Diese Wellenlänge wird für Referenzmessungen verwendet. Die eigentliche Messung wird bei einer anderen Wellenlänge durchgeführt. Damit sind durch "Verhältnismessung" absolut kalibrierbare Messungen möglich.
3. Wieder andere Farbstoffe emittieren konzentrationsabhängig bei verschiedenen Wellenlängen, so daß durch Verhältnismessungen bei zwei verschiedenen Wellenlängen die absolute lonenkonzentration ermittelt werden kann.
Sowohl für die Verhältnismessungen entsprechend dem zweiten als auch entsprechend dem dritten Meßverfahren muß das Präparat in schneller, im Submillisekundenbereich liegender Abfolge mit Licht unterschiedlicher Wellenlänge beleuchtet werden.
Aus der Literaturstelle "A microscope fluorimeter using multiple-wavelength excitation for ultrasensitive single-cell emission spectrometry", R. Nobiling, C. Bührie, Journal of Microscopy, Vol. 156, Pt 2, November 1989, pp. 149-161 , ist bereits eine Vorrichtung der eingangs genannten Art bekannt, die eine Quecksilber(hochdruck)lampe als Lichtquelle umfaßt. Im Strahlengang der
ER ATZBLATT Quecksilber(hochdruck)lampe ist ein schnell rotierendes Filterrad als Modulationsmittel angeordnet. Die Modulation des das Präparat beleuchtenden
Lichtes in Form eines schnellen Umschaltens zwischen zwei
Anregungswellenlängen wird hier also rein mechanisch durch das rotierende Filterrad gelöst.
Die bekannte Vorrichtung ist jedoch in der Praxis problematisch, da das mit hoher Frequenz rotierende Filterrad Vibrationen in der gesamten Meßvorrichtung hervorruft. Zum einen kann dies zu einer Dejustierung des Präparats bzgl. der Meßvorrichtung führen. Zum anderen wird durch solche Vibrationen die maximal zulässige Meßfrequenz begrenzt. Außerdem tritt jeweils beim Filterwechsel eine Totzeit auf, während der keine Messung stattfinden kann.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung zur Mehrfarbbeleuchtung von Präparaten im Rahmen von - vorzugsweise fluorometrischen - Messungen derart auszugestalten und weiterzubilden, daß die Modulation des von der Lichtquelle ausgesandten Lichtes ohne mechanische Hilfsmittel erfolgt. Als Modulationsmittel sollen also keine mechanisch bewegbaren Teile verwendet werden.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Mehrfarbbeleuchtung von Präparaten im Rahmen von - vorzugsweise fluorometrischen - Messungen löst die voranstehende Aufgabe durch die Merkmale des Patentanspruchs 1. Danach ist eine Vorrichtung der in Rede stehenden Art derart ausgebildet, daß die Modulationsmittel mechanisch fixiert sind und elektro- oder magneto-optisch wirken.
ATZBLATT Es ist zunächst erkannt worden, daß die Bewegung von Teilen einer Meßvorrichtung während der Messung prinzipiell einen zusätzlichen, das Meßergebnis beeinträchtigenden Einflußfaktor darstellt und daher möglichst zu vermeiden ist. Erfindungsgemäß ist dann weiter erkannt worden, daß sich das Licht einer Lichtquelle auch auf elektro- oder magneto-optische Weise modulieren läßt, wobei die Modulationsmittel mechanisch in der Vorrichtung fixiert werden können.
Vorteilhafte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der erf indungsgemäßen Vorrichtung sind in den nachgeordneten Patentansprüchen angegeben.
Prinzipiell können die Modulationsmittel der erfindungsgemäßen Vorrichtung entweder die Intensität und/oder die Frequenz der Lichtquelle modulieren. Welche Art der Modulation vorgenommen wird, hängt im wesentlichen von der Art der mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung durchzuführenden Messung ab, aber auch davon, wieviele Lichtquellen die erfindungsgemäße Vorrichtung um¬ faßt. Eine Modulation der Wellenlänge des das Präparat beaufschlagenden Lichtes läßt sich nämlich auch durch Umschalten zwischen Lichtquellen erreichen, die Licht unterschiedlicher Frequenz bzw. Wellenlänge, aussenden.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Voπichtung sind die Modulationsmittel der Lichtquelle vorgeschaltet und als Steuerung der Lichtquelle realisiert. Dabei können die Modulationsmittel bspw. in Form eines Ein- oder Ausschalters, eines Dimmers und/oder eines Umschalters zwischen mehreren Lichtquellen realisiert sein. Besonders vorteilhaft ist es, wenn die Steuerung der Lichtquelle nicht nur diese reinen Schaltfunktionen umfaßt, sondern auch die zeitliche Abfolge und Koordination der Schaltvorgänge bestimmt, was sich in einfacher Weise in Form von computergesteuerten Modulationsmitteln realisieren läßt.
ERSATZBLATT Alternativ zu den der Lichtquelle vorgeschalteten Modulationsmitteln können die Modulationsmittel auch im Strahlengang des von der Lichtquelle ausgesandten Lichtes angeordnet sein. In diesem Falle gibt es zwei sich prinzipiell unterscheidende Anordnungsmöglichkeiten für die Modulationsmittel. Im ersten Fall sind die Modulationsmittel im Strahlengang quasi direkt hinter der Lichtquelle angeordnet und erfüllen dann im wesentlichen dieselbe Funktion wie der Lichtquelle vorgeschaltete Modulationsmittel.
Im anderen Falle sind die Modulationsmittel in Strahlrichtung hinter einem Strahlteiler angeordnet, der das von der Lichtquelle ausgesandte Licht zumindest räumlich trennt, d.h. nach zwei Richtungen zerlegt. Die Wellenlängen der beiden dabei entstehenden Teilstrahlen können dann bspw. durch in den jeweiligen Strahlengängen angeordnete Filter oder auch wellenlängenselektive Spiegel definiert werden. Mit Hilfe der in den Strahlengängen der Teilstrahlen angeordneten Modulationsmittel können die einzelnen Teilstrahlen wahlweise ausgeblendet werden. Die Modulationsmittel sind dazu in vorteilhafter Weise als optischer Schalter realisiert, bspw. in Form von schnellen Flüssigkristallen oder anderen optisch aktiven Komponenten. Auch bei dieser Variante, also im Falle, daß die Modulationsmittel im Strahlengang des von der Lichtquelle ausgesandten Lichtes angeordnet sind, ist es vorteilhaft, wenn die Moduiationsmittel computergesteuert sind, so daß die Schaltvorgänge zeitlich koordinierbar sind.
Insbesondere für die Fluorometrie kommen als Lichtqulle Bogenlampen, insbesondere Quecksilber(hochdruck)lampen, in Frage, da diese einen verhältnismäßig kleinen und hellen Lichtbogen erzeugen. Aus diesem Grunde eignen sich auch Blitzlampen als Lichtquelle, wie z.B. Xenonblitzlampen. In vorteilhafter Weise können jedoch auch Laser als Lichtquelle verwendet werden, welche Licht unterschiedlicher Wellenlänge aussenden. In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind mindestens zwei Lichtquellen vorgesehen, wobei in den Strahlengängen der Lichtquellen jeweils ein Filter zum Selektieren eines bestimmten Wellenlängenbereichs angeordnet ist. Die Strahlengänge der Lichtquellen werden über Ablenkmittel, die bspw. in Form eines oder mehrerer Strahlteiler realisiert sein können, vereinigt und auf das zu untersuchende Präparat gerichtet. Bei dieser Realisierung des Erfindungsgegenstands ist jeder Lichtquelle jeweils ein steuerbarer Ein- und Ausschalter vorgeschaltet, wobei die Steuerung der Ein- und Ausschalter koordiniert erfolgt. Die Ein- und Ausschalter modulieren also gesteuert und koordiniert die Intensität jeder einzelnen Lichtquelle und blenden auf diese Weise Licht einer definierten Wellenlänge ein und aus.
In einer anderen vorteilhaften Ausgestaltung der erfindungsgemäßen
Vorrichtung ist lediglich eine Lichtquelle vorgesehen, in deren Strahlengang ein Strahlteiler angeordnet ist, der das Licht dieser Lichtquelle in Teilstrahlen zerlegt. Im Strahlengang jedes dieser Teilstrahlen sind Mittel zum Selektieren ei¬ nes bestimmten Wellenlängenbereichs angeordnet. Über Ablenkmittel werden die Teilstrahlen wieder vereinigt und auf das zu untersuchende Präparat gerichtet. Hier sind die Modulationsmittel in Form von steuerbaren elektro- optischen Shuttern realisiert, die im Strahlengang jedes Teilstrahls angeordnet sind. Auch hier erfolgt die Ansteuerung der Shutter zeitlich koordiniert, so daß jeweils abwechselnd ein Teilstrahl ausgeblendet wird.
Die Meßergebnisse der vorab beschriebenen Vorrichtung können noch dadurch verbessert werden, daß eine Vorfilterung des von der Lichtquelle ausgesandten Lichtes erfolgt, wozu im Strahlengang ein Vorfilter angeordnet ist. Zusätzlich kann hier auch noch ein Polarisator zur linearen Polarisierung des Lichtes an¬ geordnet sein.
ERSATZBLATT Üblicherweise zerlegt der Strahlteiier das Licht der Lichtquelle in zwei räumlich getrennte Teilstrahlen. Besonders vorteilhaft ist es nun, wenn der Strahlteiler dichroitisch ist, d.h. das Licht der Lichtquelle zusätzlich spektral zerlegt. In diesem Falle dient der Strahlteiler als Mittel zum Selektieren eines bestimmten Wellenlängenbereichs für jeden der beiden Teilstrahlen. Als Mittel zum Selektieren eines bestimmten Wellenlängenbereichs in jedem Teilstrahl kommen aber auch Filter oder Spiegel mit wellenlängenselektiven Eigenschaften in Frage.
Schließlich sei noch darauf hingewiesen, daß die Shutter der voranstehend beschriebenen vorteilhaften Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Voπichtung zur Mehrfarbbeleuchtung von Präparaten in vorteilhafter Weise im Videotakt angesteuert, d.h. an- bzw. ausgeschaltet werden, in Verbindung mit einer Videokamera und einem geeigneten Bildverarbeitungssystem können dann jeweils aufeinanderfolgende Bilder mit unterschiedlicher Wellenlänge aufgenommen und verarbeitet werden.
Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die dem Patentanspruch 1 nachgeordneten Ansprüche, andererseits auf die nachfolgende Erläuterung zweier Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung der bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigt
Fig. 1 in einem schematischen Blockschaltbild eine Mikroskop- und
Auswerteanordnung mit einer erfindungsgemäßen Vorrichtung und
Fig. 2 ein zweites Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Voπichtung.
E S Fig. 1 zeigt eine Voπichtung zur Mehrfarbbeleuchtung von Präparaten im Rahmen von vorzugsweise fluorometrischen Messungen, bei denen das Präparat nacheinander mit Licht unterschiedlicher, definierter Wellenlänge beleuchtet wird. Diese Vorrichtung ist Bestandteil einer Mikroskop- und Auswerteanordnung, die neben dem Mikroskop 1 einen an dieses angeschlossenen Detektor 2, einen Controller 3 und einen Computer 4 umfaßt. Das zu untersuchende Präparat wird unter dem Mikroskop 1 fixiert und nacheinander mit Licht unterschiedlicher, definierter Wellenlänge beleuchtet.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfaßt zwei Lichtquellen 5 und 6 sowie Modulationsmittel 13.
Erfindungsgemäß sind die Modulationsmittel mechanisch fixiert und wirken eiektro-optisch. In den Strahlengängen des von den beiden Lichtquellen 5 und 6 ausgesandten Lichtes sind jeweils Filter 7 und 8 angeordnet, mit denen je ein bestimmter Wellenlängenbereich selektierbar ist. Über Ablenkmittel in Form eines Strahlteilers 9 werden die Strahlengänge der Lichtquellen 5 und 6 miteinander vereinigt und auf das unter dem Mikroskop 1 befindliche Präparat gerichtet. An dieser Stelle sei angemerkt, daß der Strahlteiier 9 ebenfalls farbselektive Eigenschaften besitzen kann, also zur Selektion eines bestimmten Wellenlängenbereichs beitragen kann. Außerdem kann die hier beschriebene Voπichtung durch weitere Einheiten, bestehend aus einer Lichtquelle 10, einem Filter 11 und einem Strahlteiler 12, erweitert werden, was in der Figur durch einen gestrichelten Rahmen angedeutet ist.
Im folgenden soll die Funktionsweise der Modulationsmittel 13 näher erläutert werden. Die Modulationsmittel 13 dienen in dem hier dargestellten Ausführungsbeispiel zum Modulieren der Intensitäten der Lichtquellen 5, 6 und ggf. 10. Die Modulationsmittel 13 sind der Lichtquelle vorgeschaltet und als Steuerung der Lichtquelle realisiert. Mit Hilfe der Modulationsmittel 13 werden die Beleuchtungsintensitäten der Lichtquellen 5, 6 und ggf. 10 elektronisch gesteuert, so daß die Intensitäten der beiden Wellenlängen auf einen für das zu untersuchende Präparat optimalen Wert einstellbar sind, um einerseits ein gutes Signal zu Rauschverhältnis zu erreichen und andererseits die Lichtbelastung des Präparats möglichst gering zu halten. Die im Symbol für die Modulationsmittel 13 dargestellten Rechteckfunktionen symbolisieren, daß die Modulationsmittel außerdem ein zeitlich koordiniertes, nämlich abwechselndes Ein- und Ausschalten der Lichtquellen 5 und 6 bewirken. Das gesamte System, d.h. sowohl die Modulationsmittel 13 als auch die Meßelektronik, sind in dem hier dargestellten Ausführungsbeispiel computergesteuert.
Als Lichtquellen 5, 6 und ggf. 10 werden Bogenlampen, z.B.
Quecksilber(hochdruck)lampen oder Xenon(hochdruck)lampen verwendet, die ein besonders schnelles Umschalten ermöglichen. Dabei wird zwar keine hundertprozentige Modulation erreicht, was aber zur Erzielung guter Meßergebnisse auch nicht erforderlich ist.
Die in Fig. 2 dargestellte Voπichtung zur Mehrfarbbeleuchtung von Präparaten im Rahmen von - vorzugsweise fluorometrischen - Messungen, bei denen das Präparat nacheinander mit Licht unterschiedlicher, definierter Wellenlänge beleuchtet wird, umfaßt lediglich eine Lichtquelle 15. Das Licht der Lichtquelle 15 wird durch einen Filter 16 vorgefiltert und mit Hilfe eines Polarisators 17 linear polarisiert. Ein dichroitischer Strahlteiler 18 zeriegt das derart vorgefilterte und linear polarisierte Licht räumlich und spektral in zwei Teilstrahlen. In jedem Teilstrahl sind jeweils ein Filter 19 und 20 zum Selektieren eines bestimmten Wellenlängenbereichs und ein Spiegel 21 und 22 angeordnet. Die Spiegel 21 und 22 dienen in erster Linie zum Umlenken der beiden Teilstrahlen; sie können aber auch wellenlängenselektive Eigenschaften aufweisen. Die Spiegel 21 und 22 führen die beiden Teilstrahlen einem Strahlteiler 23 zu, der die beiden Teilstrahlen vereinigt und auf das zu untersuchende Präparat richtet. Auch bei dem Strahlteiler 23 handelt es sich wie bei dem Strahlteiler 18 um einen dichroitischen Strahlteiler. Zwischen dem Spiegel 21 und dem Strahlteiler 23 sowie zwischen dem Spiegel 22 und dem Strahlteiler 23 ist jeweils ein elektro- optischer Shutter 24 und 25 angeordnet, wobei die Shutter willkürlich, d.h. zu gewählten Zeitpunkten, elektronisch an- bzw. ausgeschaltet werden können. Die Shutter 24 und 25 stellen in dem in Fig. 2 dargestellten Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Voπichtung Modulationsmittel dar, die innerhalb der Voπichtung mechanisch fixiert sind und elektro- oder auch magneto-optisch wirken. Sie modulieren die Intensität der Teilstrahlen der Lichtquelle 15 und sind im Strahlengang des von der Lichtquelle 15 ausgesandten Lichtes in Strahlrichtung hinter dem Strahlteiler 18 angeordnet. Die Shutter 24 und 25 stellen optische Schalter dar, die bspw. in Form von schnellen Flüssigkristallen realisiert sein können. In vorteilhafter Weise sind sie elektronisch oder über Computer gesteuert.
Als Lichtquelle in dem hier dargestellten Ausführungsbeispiel kommt entweder ebenfalls eine Bogenlampe oder eine Blitzlampe in Frage oder aber in vorteilhafter Weise auch ein Laser, der wie bspw. ein Argonlaser Licht mit zwei unterschiedlichen Wellenlängen aussendet.
Geschieht das Öffnen und Schließen der beiden Shutter 24 und 25 im Videotakt, so können in Verbindung mit einer Videokamera und einem geeigneten Bildverarbeitungssystem jeweils zwei aufeinanderfolgend mit unterschiedlicher Wellenlänge aufgenommene Bilder bspw. als Verhältnis dargestellt werden. Damit ist es möglich, bspw. bei einer FURA-Färbung die Konzentration der Ca++-lonen direkt bildlich darzustellen.
Hinsichtlich in der Zeichnung nicht dargestellter Merkmale der erfindungsgemäßen Voπichtung wird auf den allgemeinen Teil der Beschreibung verwiesen.
Abschließend sei darauf hingewiesen, daß die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Mehrfarbbeleuchtung von Präparaten zwar vorzugsweise in der Fluorometrie Anwendung findet, vorteilhaft aber auch in Verbindung mit anderen Meßverfahren und Apparaturen eingesetzt werden kann. Bezugszeichen
1 Mikroskop
2 Detektor
3 Controller
4 Computer
5 Lichtquelle
6 Lichtquelle
7 Filter
10 8 Filter
9 Strahlteiler
10 Lichtquelle
11 Filter
12 Strahlteiler
15 13 Modulationsmittel
14 -
15 Lichtquelle
16 Vorfilter
17 Polarisator
20 18 Strahlteiler
19 Filter
20 Filter
21 Spiegel
22 Spiegel
25 23 Strahlteiler
24 Shutter
25 Shutter

Claims

Patentansprüche
1. Voπichtung zur Mehrf arbbeleuchtun von Präparaten im Rahmen von - vorzugsweise fluorometrischen - Messungen, bei denen das Präparat nacheinander mit Licht unterschiedlicher, definierter Wellenlänge beleuchtet wird, mit mindestens einer Lichtquelle (5, 6, 10; 15) und Modulationsmitteln (13; 24,25),
dadurch gekennzeichnet, daß die Modulationsmittel (13; 24,25) mechanisch fixiert sind und elektro- oder magneto-optisch wirken.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Modulationsmittel (13; 24,25) die Intensität der Lichtquelle (5, 6, 10; 15) modulieren.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Modulationsmittel die Frequenz der Lichtquelle modulieren.
4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Modulationsmittel (13) der Lichtquelle (5, 6, 10) vorgeschaltet sind.
5. Voπichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Modulationsmittel (13) als Steuerung der Lichtquelle (5, 6, 10) realisiert sind.
6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Modulationsmittel (13) in Form eines Ein- und Ausschalters, eines Dimmers und/oder eines Umschalters zwischen mehreren Lichtquellen (5, 6, 10) realisiert sind. 16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtquelle (5, 6, 10; 15) als Xenon-Blitzlampe ausgeführt ist.
17. Voπichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtquelle (5, 6, 10; 15) als Laser ausgeführt ist.
18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei Lichtquellen (5, 6, 10) vorgesehen sind, daß in den Strahlengängen der Lichtquellen (5, 6, 10) jeweils ein Filter (7, 8) zum Selektieren eines bestimmten Wellenlängenbereichs angeordnet ist, daß
Ablenkmittel ( 12) zum Vereinigen der Strahlengänge der Lichtquellen (5, 6, 10) und zum Ausrichten auf das Präparat vorgesehen sind und daß als Mo¬ dulationsmittel (13) jeder Lichtquelle (5, 6, 10) jeweils ein steuerbarer Ein- und Ausschalter vorgeschaltet ist, wobei die Steuerung der Ein- und Ausschalter koordiniert ist.
19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lichtquelle (15) vorgesehen ist, daß in dem Strahlengang der Lichtquelle (15) ein Strahlteiler (18) angeordnet ist, der das Licht der Lichtquelle (15) in Teilstrahlen zerlegt, daß Mittel zum Selektieren eines bestimmten Wel- lenlängenbereichs für jeden Teilstrahl vorgesehen sind, daß Ablenkmittel (23) zum Vereinigen der Teilstrahlen und zum Ausrichten auf das Präparat vorgesehen sind und daß als Modulationsmittel (24, 25) im Strahlengang jedes Teilstrahls jeweils ein steuerbarer elektro-optischer Shutter (24, 25) angeordnet ist, wobei die Steuerung der Shutter (24, 25) koordiniert ist.
20. Voπichtung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß im
Strahlengang des von der Lichtquelle (15) ausgesandten Lichtes zwischen der Lichtquelle (15) und dem Strahlteiler (18) ein Vorfilter (16) angeordnet ist. 7. Vomchtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Modulationsmittel (24, 25) im Strahlengang des von der Lichtquelle (15) ausgesandten Lichtes angeordnet sind.
8. Voπichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß
im Strahlengang des von der Lichtquelle ausgesandten Lichtes ein Strahlteiler angeordnet ist und die Modulationsmitte! zwischen der Lichtquelle und dem Strahlteiler angeordnet sind.
9. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß im
Strahlengang des von der Lichtquelle (15) ausgesandten Lichtes ein Strahlteiler (18) angeordnet ist und die Modulationsmittel (24, 25) in Strahlrichtung hinter dem Strahlteiler (18) angeordnet sind.
10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Modulationsmittel (24, 25) als optischer Schalter realisiert sind.
11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Modulationsmittel (24, 25) in Form von schnellen Fiüssigkristallen realisiert sind.
12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Modulationsmittel (13; 24, 25) computergesteuert sind.
13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtquelle (5, 6, 10; 15) als Bogenlampe ausgeführt ist.
14. Voπichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtquelle (5, 6, 10; 15) als Quecksilber(hochdruck)lampe ausgeführt ist.
15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtquelle (5, 6, 10; 15) als Blitzlampe ausgeführt ist. 21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß im Strahlengang des von der Lichtquelle (15) ausgesandten Lichtes zwischen der Lichtquelle (15) und dem Strahlteiler (18) ein Polarisator (17) zur linearen Polarisierung des Lichtes angeordnet ist.
22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Strahlteiler (18) das Licht der Lichtquelle (15) in zwei räumlich getrennte Teilstrahlen zerlegt.
23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß der Strahlteiler (18) dichroitisch ist, d.h. das Licht der Lichtquelle (15)' zusätzlich spektral zerlegt und also als Mittel zum Selektieren eines bestimmten Wellenlängenbereichs für jeden Teilstrahl dient.
24. Voπichtung nach einem der Ansprüche 19 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß als Mittel zum Selektieren eines bestimmten Wellenlängenbereichs in jedem Teilstrahl mindestens ein Filter (19, 20) angeordnet ist.
25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 19 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß als Mittel zum Selektieren eines bestimmten Wellenlängenbereichs in jedem Teilstrahl mindestens ein Spiegel (21, 22) mit wellenlängenselektierenden Eigenschaften angeordnet ist.
26. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 19 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Shutter (24, 25) im Videotakt angesteuert, d.h. an- bzw. ausgeschaltet werden, so daß in Verbindung mit einer Videokamera und einem geeigneten Bildverarbeitungssystem jeweils aufeinanderfolgend Bilder mit unterschiedlicher Wellenlänge aufgenommen und verarbeitet werden können.
27. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Ablenkmittel (12; 23) als Strahlteiler realisiert sind.
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