DE10056384C2 - Vorrichtung zur Messung der Lebensdauer eines angeregten Zustandes in einer Probe und Verwendung der Vorrichtung - Google Patents
Vorrichtung zur Messung der Lebensdauer eines angeregten Zustandes in einer Probe und Verwendung der VorrichtungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Messung der Lebensdauer eines
angeregten Zustandes in einer Probe gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1, wie aus Analytical Chemistry News &
Features, 1997, Seiten 351A-357A, bekannt, und deren
Verwendung.
In der Scanmikroskopie wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um
das von der Probe emittierte Reflexions- oder Fluoreszenzlicht zu beobachten.
Der Fokus des Beleuchtungslichtstrahles wird mit Hilfe einer steuerbaren
Strahlablenkeinrichtung, im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in
einer Objektebene bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht
aufeinander stehen, so daß ein Spiegel in x-, der andere in y-Richtung
ablenkt. Die Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von
Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt
kommenden Lichtes wird in Abhängigkeit von der Position des Abtaststrahles
gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente mit Sensoren zur
Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet.
Speziell in der konfokalen Scanmikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus
eines Lichtstrahles in drei Dimensionen abgetastet.
Ein konfokales Rastermikroskop umfasst im allgemeinen eine Lichtquelle, eine
Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende - die sog.
Anregungsblende - fokussiert wird, einen Strahlteiler, eine
Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Mikroskopoptik, eine
Detektionsblende und die Detektoren zum Nachweis des Detektions- bzw.
Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen Strahlteiler
eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz- oder Reflexionslicht
gelangt über die Strahlablenkeinrichtung zurück zum Strahlteiler, passiert
diesen, um anschließend auf die Detektionsblende fokussiert zu werden,
hinter der sich die Detektoren befinden. Detektionslicht, das nicht direkt aus
der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die
Detektionsblende nicht, so daß man eine Punktinformation erhält, die durch
sequentielles Abtasten des Objekts zu einem dreidimensionalen Bild führt.
Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme
erzielt.
Die Leistung des vom Objekt kommenden Lichtes wird in festen
Zeitabständen während des Abtastvorganges gemessen und so Rasterpunkt
für Rasterpunkt abgetastet. Der Messwert muss eindeutig der dazugehörigen
Scanposition zugeordnet sein, um aus den Messdaten ein Bild erzeugen zu
können. Zweckmäßiger Weise werden hierfür die Zustandsdaten der
Verstellelemente der Strahlablenkeinrichtung laufend mitgemessen oder, was
allerdings weniger genau ist, direkt die Steuersolldaten der
Strahlablenkeinrichtung verwendet.
Es ist auch möglich in einer Durchlichtanordnung beispielsweise das
Fluoreszenzlicht oder die Transmission des Anregungslichtes kondensorseitig
zu detektieren. Der Detektionslichtstrahl gelangt dann nicht über die
Scanspiegel zum Detektor (Non descan Anordnung). Für die Detektion des
Fluoreszenzlichtes wäre in der Durchlichtanordnung eine kondensorseitige
Detektionsblende nötig, um, wie in der beschriebenen Descan-Anordnung,
eine dreidimensionale Auflösung zu erzielen. Im Falle der
Zweiphotonenanregung kann jedoch auf eine kondensorseitige
Detektionsblende verzichtet werden, da die Anregungswahrscheinlichkeit vom
Quadrat der Photonendichte abhängt (Proportional Intensität2), die
naturgemäß im Fokus viel höher ist als in den Nachbarregionen. Das zu
detektierende Fluoreszenzlicht stammt daher mit großer Wahrscheinlichkeit
zum aller größten Teil aus der Fokusregion, was eine weitere Differenzierung
von Fluoreszenzphotonen aus dem Fokusbereich von Fluoreszenzphotonen
aus den Nachbarbereichen mit einer Blendenanordnung überflüssig macht.
Das Auflösungsvermögen eines konfokalen
Rastermikroskops ist unter anderem durch die Intensitätsverteilung und die
räumliche Ausdehnung des Fokus des Beleuchtungslichtstrahles gegeben.
Eine Anordnung zur Steigerung des Auflösungsvermögens für
Fluoreszenzanwendungen ist aus WO 95/21396 A2 bekannt. Hierbei
werden die lateralen Randbereiche des Beleuchtungsfokusvolumens mit
Laserlicht einer anderen Wellenlänge, das von einem zweiten Laser emittiert
wird, beleuchtet, um dort die vom Licht des ersten Lasers angeregten
Probenbereiche stimuliert in den Grundzustand zurück zu bringen. Detektiert
wird dann nur das spontan emittierte Licht aus den nicht vom zweiten Laser
beleuchteten Bereichen, so daß insgesamt eine Auflösungsverbesserung
erreicht wird. Für dieses Verfahren hat sich die Bezeichnung STED
(Stimulated Emission Depletion) eingebürgert.
In der eingangs genannten Analytical Chemistry News & Features, Juni 1997, Seiten 351A bis 357A ist
ein Spektrometer für die Messung von stimulierter Emission beschrieben. Hier
werden der Anregungslichtpuls und der Emissionslichtpuls mit zwei
getrennten, unabhängigen Lasern oder laseraktiven Mitteln erreicht. Die
Problematik der Synchronisation der Laser ist hierbei nicht gelöst.
In der Mikroskopie werden beispielsweise Proben, die mit
Fluoreszenzfarbstoffen präpariert sind, untersucht. Bei der Anregung der
Fluoreszenzfarbstoffe sind sowohl Einphotonenanregung, als auch
Mehrphotonenanregung üblich. Oft werden mehrere verschiedene Farbstoffe
eingesetzt, die Fluoreszenzlicht unterschiedlicher Wellenlänge abgeben. Die
Farbstoffe werden so verwendet, daß sie sich spezifisch an
Probenbestandteile anlagern.
Bei Fluoreszenz-Resonanz-Energy-Transfer (FRET) werden
Fluoreszenzmoleküle optisch, beispielsweise mit Licht von 488 nm
Wellenlänge, angeregt. Das Emissionslicht dieser sog. Donormoleküle, das im
Beispielfall eine Wellenlänge von ca. 543 nm aufweisen würde, führt über den
sog. Förstertransfer zur Anregung eng benachbarter anderer Moleküle, der
Akzeptormoleküle. Der angeregte Zustand der Akzeptormoleküle zerfällt
zunächst in einen Zwischenzustand und dann in den Grundzustand unter
Emission von Licht von ca. 570 nm Wellenlänge für den Beispielfall. Neben
der Anregung der Akzeptormoleküle durch Förstertransfer kann es auch -
unerwünschter Weise - zur teilweisen Direktanregung kommen.
Eine von der Konzentration unabhängige Information über die Probe kann die
Lebensdauer des angeregten Zustandes der Fluoreszenzfarbstoffe geben. Die
Lebensdauer der Fluoreszenzfarbstoffe ist unter anderem von der
Beschaffenheit und der Zusammensetzung der Umgebung abhängig. So kann
beispielsweise in der Zellbiologie durch Messung der Lebensdauer der
Fluoreszenzfarbstoffe indirekt auf die Kalziumkonzentration in einem
Probenbereich geschlossen werden.
Zur Messung der Lebensdauer der angeregten Zustände von
Fluoreszenzfarbstoffen haben sich mehrere Methoden etabliert. Diese
Methoden sind in den Kapiteln 4 und 5 des Lehrbuchs von Joseph R.
Lakowicz, "Principles of Fluorescence Spectroscopy", Kluwer
Academic/Plenum Publishers, second edition, 1999, ausführlich beschrieben.
Beispielsweise ist es üblich, die Leistung des Anregungslichtes zeitlich zu
modulieren, um aus der Phasenverzögerung des Emissionslichtes auf die
Lebensdauer des angeregten Zustandes zu schließen. Es ist auch üblich, die
Fluoreszenzfarbstoffe mit kurzen Lichtpulsen anzuregen, um elektronisch den
zeitlichen Versatz der Emissionslichtpulse zu messen.
Es gibt Fluoreszenzfarbstoffe, die eine Lebensdauer des angeregten
Zustandes von wenigen Nanosekunden oder sogar im Pikosekundenbereich
aufweisen. Mit den bekannten Methoden ist eine solch kurze Lebensdauer
nicht messbar; denn auch mit aufwendiger Elektronik ist es nicht möglich,
gleichzeitig eine große Zeitauflösung und ein gutes Signal-zu-Rausch-
Verhältnis zu erreichen. Darüber hinaus ist es bei der erwähnten
Modulationsmethode äußerst schwierig, das Anregungslicht hochfrequent zu
modulieren. Selbst mit akusto-optischen Modulatoren können die
erforderlichen Frequenzen von mehreren hundert Megahertz oder gar einigen
Gigahertz nicht erreicht werden.
Aufgabe der Erfindung ist es, eine einfache Vorrichtung zum Einstellen unterschiedlicher Wellenlängen unter Beibehaltung
des zeitlichen Abstandes von Lichtpulsen anzugeben.
Eine solche Vorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, dass als Lichtquelle eine
Lichtquelle zur Abgabe einer einzigen Wellenlänge vorgesehen ist, und dass
die Mittel zum Bereitstellen der unterschiedlichen Wellenlängen in mindestens
einem Teillichtstrahl ein Element zur Wellenlängenänderung ist.
Vorteilhaft ist die Verwendung der Vorrichtung in einem Scanmikroskop
mit einer Einrichtung zur Erzeugung einer Relativbewegung zwischen einem
Beleuchtungslichtstrahl und einer Probe, einer
Mikroskopoptik und mindestens einem geeigneten Detektor.
Die Erfindung hat den weiteren Vorteil, dass durch den gezielten Einsatz der
stimulierten Emission Techniken und Methoden überflüssig werden, die die
Messung einer kurzen Lebensdauer des angeregten Zustandes erschweren
oder gar vereiteln.
Die erwähnten Probleme werden auf die exakte Einstellung des zeitlichen
Abstandes von Anregungs- und Emissionslichtpuls reduziert. Hierbei ist es
von ganz besonderem Vorteil, wenn eine einzige elektromagnetische
Energiequelle vorgesehen ist, deren Licht durch Aufteilen zur Erzeugung des
Anregungslichtpulses und des Emissionslichtpulses dient. In diesem Fall ist
die Einstellung des zeitlichen Abstandes durch das Einstellen von
Laufzeitunterschieden zwischen den aufgeteilten Lichtwegen gelöst.
Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann auch auf einfache Weise
festgestellt werden, ob der Förstertransfer in einer für FRET präparierten
Probe effizient vor sich geht, nämlich durch Messung der Lebensdauer des
angeregten Zustandes des Donors. Wenn sich die Lebensdauer gegenüber
der reinen Donorlebensdauer ändert, dann ist ein weiterer Zerfallskanal hinzu
gekommen, was deutliche Rückschlüsse auf die Effizienz der FRET-Anregung
zulässt.
In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und
wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben. Dabei zeigen:
Fig. 1 eine erfindungsgemäße Vorrichtung,
Fig. 2 ein Scanmikroskop,
Fig. 3 ein Scanmikroskop in Non-Descan-
Anordnung und Mehrphotonenanregung und
Fig. 4 einen Ablaufplan des mit der
Vorrichtung durchführbaren Verfahrens.
Fig. 1 zeigt die Vorrichtung. Als Lichtquelle 1 ist ein
Pulslaser vorgesehen, der als Titan:Saphir-Laser ausgeführt ist. Das Licht 3
des Pulslasers wird mit dem Strahlteiler 5 in einen ersten und zweiten
Teillichtstrahl 9 und 7 aufgespalten. Der Teillichtstrahl 7 gelangt über den
Spiegel 11 zum Element 13 zur Wellenlängenänderung, einem optisch parametrischen Oszillator. Der vom optisch
parametrischen Oszillator ausgehende Lichtstrahl 15 wird über den Spiegel 17
zum dichroitischen Strahlvereiniger 19 geführt, um dort mit Teillichtstrahl 9
vereinigt zu werden. Nach der Strahlteilung am Strahlteiler 5 wird der
Teillichtstrahl 9 mit Hilfe von Spiegel 21 auf ein Zwischenelement 23, das z. B.
als rechtwinkliges Prisma ausgebildet ist, gelenkt, das so angeordnet ist, dass
der Teillichtstrahl 9 an den beiden Kathetenflächen totalreflektiert wird und die
Hypotenusenfläche senkrecht durchtritt. Über den Spiegel 25 gelangt der
Teillichtstrahl 9 zum dichroitischen Strahlvereiniger 19. Der zeitliche Abstand der
Lichtpulse im vereinigtem Lichtstrahl 27 kann durch Verschieben des Prismas
23 entlang der mit Doppelpfeil 29 angedeuteten Richtungen verändert werden.
Das Zwischenelement 23 definiert im optischen Weg des zweiten
Teillichtstrahles 7 eine optische Wegverlängerung, die als Schikane 24
bezeichnet ist.
Fig. 2 zeigt ein Scanmikroskop, das als konfokales
Scanmikroskop ausgeführt ist. Zur Beleuchtung dient die in Fig. 1 gezeigte
Vorrichtung; insoweit sind für gleiche Elemente dieselben Bezugszeichen
angegeben.
Der vereinigte Lichtstrahl 27 wird von einem Strahlteiler 31 zum Scanmodul 33
reflektiert, das einen kardanisch aufgehängten Scanspiegel 35 beinhaltet, der
den vereinigten Lichtstrahl 27 über die Scanoptik 37, die Optik 39 und durch
die Mikroskopoptik 41 hindurch über bzw. durch die Probe 43 führt. Der
vereinigte Lichtstrahl 27 wird bei nicht transparenten Proben 43 über die
Probenoberfläche geführt. Bei biologischen Proben 43 (Präparaten) oder
transparenten Proben kann der vereinigte Lichtstrahl 27 auch durch die Probe
43 geführt werden. Dies bedeutet, dass verschiedene Fokusebenen des
Objekts nacheinander durch den Lichtstrahl abgetastet werden. Der
vereinigte Lichtstrahl 27 ist als durchgezogene Linie dargestellt. Von der
Probe ausgehendes Licht 45 gelangt durch die Mikroskopoptik 41 und über
das Scanmodul 33 zum Strahlteiler 31, passiert diesen und trifft auf den Detektor
47, der als Photomultiplier ausgeführt ist. Das von der Probe 43 ausgehende
Licht 45 ist als gestrichelte Linie dargestellt. Im Detektor 47 werden
elektrische, zur Leistung des vom Objekt ausgehenden Lichtes
proportionale Detektionssignale erzeugt und an eine nicht gezeigte
Verarbeitungseinheit weitergegeben. Vor dem Detektor ist ein Bandpassfilter
48 angeordnet, das Licht der Wellenlänge des Lichtstrahles 15 ausblendet.
Das bei einem konfokalen Scanmikroskop üblicherweise vorgesehene
Beleuchtungspinhole 51 und das Detektionspinhole 49 sind der Vollständigkeit
halber schematisch eingezeichnet. Weggelassen sind wegen der besseren
Anschaulichkeit hingegen einige optische Elemente zur Führung und Formung
der Lichtstrahlen. Diese sind einem auf diesem Gebiet tätigen Fachmann
hinlänglich bekannt.
Fig. 3 zeigt ein Scanmikroskop in Non-Descan-
Anordnung und Mehrphotonenanregung. Zur Beleuchtung dient die in Fig. 1
gezeigte Vorrichtung; insoweit sind für gleiche Elemente dieselben
Bezugszeichen angegeben.
Die Detektion findet bei dieser Ausführung kondensorseitig statt. Das von der
Probe 43 ausgehende Licht 55 wird von der Kondensoroptik 53 fokussiert und
über den Spiegel 61 zum Detektor 57 geleitet, der als Photomultiplier
ausgeführt ist. Vor dem Detektor ist ein Bandpassfilter 59 angeordnet, das
Licht der Wellenlänge des Lichtstrahles 15 ausblendet. Die
Probenbeleuchtung findet analog zu der in Fig. 2 beschriebenen Beleuchtung
statt.
Fig. 4 zeigt einen Ablaufplan des mit der beschriebenen Vorrichtung
realisierten Verfahrens. In einem ersten Schritt erfolgt das Erzeugen 63 eines
Anregungslichtpulses und eines Emissionslichtpulses. Hierzu bietet sich die
Verwendung von modenverkoppelten Pulslasern an, deren Licht in zwei
Teilstrahlen aufgespalten wird.
In einem weiteren Schritt erfolgt das Beleuchten 65 der
Probe mit dem Anregungslichtpuls. Der Anregungslichtpuls kann sowohl Ein-
oder Mehrphotonenanregung bewirken. In den folgenden Schritt folgt das
Beleuchten 67 der Probe mit dem Emissionslichtpuls in einem vorgegebenem
zeitlichen Abstand zum Beleuchten mit dem Anregungslichtpuls. Wenn der
Emissionslichtpuls innerhalb der Lebensdauer des angeregten Zustandes auf
die Probe trifft, so wird stimulierte Emission bewirkt. Falls der
Emissionslichtpuls später auf die Probe trifft, so bewirkt er keine stimulierte
Emission. In folgenden Schritt erfolgt die Detektion 69 der Leistung des von
der Probe ausgehenden Lumineszenzlichtes, wobei das stimuliert emittierte
Licht nicht detektiert wird. Wenn stimulierte Emission erfolgt ist, ist die
Leistung des Lumineszenzlichtes niedriger, als bei nicht erfolgter stimulierter
Emission. Zur Ausblendung des stimuliert emittierten Lichtes kann ein
Farbfilter, der als Bandfilter ausgeführt ist, verwendet werden. Durch
Wiederholen 71 der ersten vier Schritte mit unterschiedlichen zeitlichen
Abständen lässt sich die Abhängigkeit der Leistung des von der. Probe
ausgehenden Lumineszenzlichtes von dem zeitlichen Abstand von
Anregungslichtpuls und Emissionslichtpuls bestimmen. Im letzten Schritt
erfolgt das Ermitteln 73 der Lebensdauer des angeregten Zustandes der
Probe aus der Abhängigkeit der Leistung des von der Probe ausgehenden
Lumineszenzlichtes von dem zeitlichen Abstand. Der kürzeste zeitliche
Abstand, bei der gerade keine stimulierte Emission stattfindet, entspricht der
Lebensdauer des angeregten Zustandes.
1
Lichtquelle
3
Licht
5
Strahlteiler
7
zweiter Teillichtstrahl
9
erster Teillichtstrahl
11
Spiegel
13
Element zur Wellenlängenänderung
15
Lichtstrahl
17
Spiegel
19
dichroitischer Strahlvereiniger
21
Spiegel
23
Zwischenelement
24
Schikane
25
Spiegel
27
Lichtstrahl
29
Doppelpfeil
31
Strahlteiler
33
Scanmodul
35
Scanspiegel
37
Scanoptik
39
Optik
41
Mikroskopoptik
43
Probe
45
ausgehendes Licht
47
Detektor
48
Bandpassfilter
49
Detektionspinhole
51
Beleuchtungspinhole
53
Kondensoroptik
55
Licht
57
Detektor
59
Bandpassfilter
61
Spiegel
63
Erzeugen
65
Beleuchten
67
Beleuchten
69
Detektion
71
Wiederholen
73
Ermitteln
Claims (9)
1. Vorrichtung zur Messung der Lebensdauer eines angeregten Zustandes in
einer Probe (43) mit einer Lichtquelle (1) zur Abgabe von Lichtpulsen,
Mitteln zum Bereitstellen mindestens eines ersten und eines zweiten
Teillichtstrahls (7, 9) einer unterschiedlichen Wellenlänge, und einem
Zwischenelement (23) in mindestens einem Teillichtstrahl (7, 9) zur
Beeinflussung der Laufzeit, dadurch gekennzeichnet, dass als Lichtquelle
(1) eine Lichtquelle zur Abgabe einer einzigen Wellenlänge vorgesehen
ist, und dass die Mittel zum Bereitstellen der unterschiedlichen
Wellenlängen in mindestens einem Teillichtstrahl (7, 9) ein Element (13)
zur Wellenlängenänderung ist.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der erste
Teillichtstrahl (9) einen Anregungslichtstrahl definiert, der über einen
dichroitischen Strahlvereiniger (19) auf die Probe (43) gerichtet ist und dort
einen definierten Teilbereich anregt.
3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite
Teillichtstrahl (7), einen Emissionslichtstrahl definiert und über den dichroitischen Strahlvereiniger (19) derart auf die
Probe (43) gerichtet ist, dass der Teilbereich der Probe (43) zumindest
teilweise überdeckt ist.
4. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das
Zwischenelement (23) die Länge des optischen Lichtweges verändert.
5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das
Zwischenelement (23) bewegbar ausgestaltet ist und dadurch eine
Schikane (24) mit einer einstellbaren Durchlauflänge definiert.
6. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Element
(13) zur Wellenlängenänderung ein optisch parametrischer Oszillator oder
ein Element zur Frequenzvervielfachung ist.
7. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die
Lichtquelle (1) ein Pulslaser ist.
8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Pulslaser
zur Mehrphotonenanregung ausgebildet ist.
9. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1-8 in einem
Scanmikroskop mit einer Einrichtung zur Erzeugung einer
Relativbewegung zwischen einem Lichtstrahl (27) aus einem
ersten und zweiten Teillichtstrahl (7, 9) und der Probe (43), einer
Mikroskopoptik (41) und einem Detektor (47).
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