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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung,
durch die Laser-induzierte Fluoreszenz parallel in einer Vielzahl
von konfokalen Volumenelementen in einem Probenvolumen detektiert
wird, und wobei aus dem Fluss der detektierten Fluoreszenzphotonen
zeitaufgelöst
eine Mehrparameter-Information über
die Probe, insbesondere über
die biochemische Zusammensetzung, die physikalischen, chemischen oder
spektroskopischen Eigenschaften, oder die Struktur von biochemischen
oder biologischen Proben extrahiert wird. Das erfindungsgemäße Verfahren
ist insbesondere zur Messung von hochauflösenden biochemischen Kinetiken
und für
Hochdurchsatz-Screening-Anwendungen geeignet.
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Technischer
Hintergrund der Erfindung
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Allgemein
in den Lebenswissenschaften und insbesondere in der Biotechnologie
besteht ein ausgeprägter
Bedarf an bioanalytischen Methoden, die die genaue, schnelle und
effiziente Analyse von chemischen, biochemischen und biologischen
Parametern in verschiedenen Probenformaten, z.B. in wässrigen
Lösungen, komplexen
biochemischen Mixturen, an der Oberfläche oder im Inneren von Zellen,
oder in Proben, die aus Pflanzen- oder
Tiergewebe entnommen wurden, ermöglichen.
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Die
allgemeine Aufgabe derartiger bioanalytischer Methoden ist die Charakterisierung
einer biologischen oder biochemischen Probe in Bezug auf ihre chemische
Zusammensetzung mit einer sehr hohen räumlichen und zeitlichen Auflösung. Idealerweise
erlauben diese Methoden Echtzeit-Analysen der chemischen Zusammensetzung
von kleinen, adressierbaren Volumenele menten und deren Änderung
im Zeitverlauf. Die Dimension derartiger Volumenelemente sollte
im Bereich der Mikrostruktur von biologischen Prozessen, das heißt der Größe einer
Zelle oder darunter, liegen. Die Zeitauflösung sollte in der Größenordnung
der biologischen Prozesse, das heißt im Bereich von Mikrosekunden
und weniger, liegen. Die Empfindlichkeit sollte bis hinab auf das
Einzelmolekülniveau
gegeben sein, da biologische Vorgänge häufig auf einem einzelnen Molekül beruhen
oder durch ein einzelnes Molekül
ausgelöst
werden. Darüber
hinaus sind Gesamtheiten von biologischen Molekülen – wie beispielsweise Proteine – offensichtlich
ziemlich heterogen, wie es aus Einzelmolekülanalysen ersichtlich ist,
und diese intrinsische Heterogenität scheint für die Regulation von biologischen Vorgängen recht
bedeutsam zu sein.
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Die
Verwendung von Fluoreszenz ist aus einer Reihe von Gründen für derartige
bioanalytische Verfahren außerordentlich
gut geeignet. Erstens wird Fluoreszenz induziert. Folglich können interessierende
Moleküle
selektiv angeregt werden, so dass ermöglicht wird, dass zwischen
verschiedenen Molekülen
unterschieden und ein Hintergrund unterdrückt wird. Zweitens ist die
Fluoreszenz eine Eigenschaft des einzelnen Moleküls, das heißt ein einzelnes Molekül kann angeregt
werden und emittiert entsprechend einzelne Photonen, die detektiert
werden können.
Daher kann Fluoreszenz mit einer Empfindlichkeit auf Einzelmolekülniveau
gemessen werden. Drittens sind Fluoreszenzparameter Kennwerte für die Natur
des Moleküls,
das die Fluoreszenz aufweist. Die Wellenlänge von Photonen, die absorbiert
werden, die Lebensdauer des angeregten Zustandes, die Wellenlänge der
emittierten Photonen und der Polarisationswinkel der emittierten
Photonen sind sämtlich
Charakteristika der chemischen Struktur des fluoreszierenden Moleküls. Diese
und weitere Parameter können
sämtlich
verwertet werden, um verschiedene Biomoleküle zu erfassen und zwischen
diesen zu unterscheiden. Viertens ist die Fluoreszenz schnell. Die
Lebensdauer des fluoreszierenden Zustands ist typischerweise in
der Größenordnung
von Pico- bis Nanosekunden. Daher können Kinetiken der Größenordnung von
Mikro- bis Millisekunden aufgelöst
werden. Fünftens
ist Fluoreszenz zerstörungsfrei
und nicht-invasiv, und Fluoreszenz erfordert keinerlei Fixierung
der Probe. Daher kann Fluoreszenz leicht in lebenden Zellen oder
in Gewebe unter sanften Bedingungen analysiert werden.
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Es
ist eine Vielzahl von bioanalytischen Methoden bekannt, die auf
der Messung der Fluoreszenz basieren.
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Die
Verwendung der Fluoreszenz ist in der Durchfluss-Zytometrie Stand der Technik: EP-A-0424934 ist
auf eine Vorrichtung zur Zählung
von Fluoreszenzpartikeln gerichtet, die in einem Fluid suspendiert
sind. Um einen breiteren Messbereich zu erreichen, wird der Laserstrahl
durch Strahlteiler zerlegt, jedoch nach dem Beobachtungspunkt auf
dem Detektor refokussiert, so dass nur ein Fokus, entsprechend überlappende
Foki, detektiert werden kann.
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JP
(A) 2002005843 offenbart eine Verteilungsmessvorrichtung zum Untersuchen
von DNA-Probenarrays durch die Detektion von Fluoreszenz, die durch
eine Vielzahl von Bestrahlungspunkten auf der Probe emittiert wird.
Die Probe in der Form einer ebenen Anordnung mit fixierten, fluoreszenz-markierten
Substanzen wird auf einer Plattform platziert und über eine
Fokussieroptik bestrahlt. Das Verfahren ist nur auf fixierte ebene Proben
anwendbar. Daher muss der Abstand zwischen der Fokussieroptik und
der ebenen Probe so justiert werden, dass in der Ebene der Probe
gemessen wird, ohne dass eine Überlappung
von Anregungs- und Detektionsvolumina der Foki auftritt. Es ist
daher ein für
Volumenproben (Flüssigkeiten)
ungeeigne tes Verfahren, wie sie für biologische oder biochemische
Assays typisch sind.
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US-B1-6229635
bezieht sich auf eine ähnliche
Vorrichtung, wie sie aus JP (A) 2002005834 bekannt ist. Es offenbart
eine Scanvorrichtung zum Abbilden großer ebener Proben unter Verwendung
von Lichtleitern, um ein Übersprechen
des Emissionslichts zu vermeiden. Die Lichtleiter sind derart angeordnet,
dass der Abstand zwischen dem Lichtleiter und dem Fokus kleiner
ist als der Abstand zwischen benachbarten Foki. Der Gebrauch von
Lichtleitern ist daher für
die Detektion von Bildern geeignet, er versagt jedoch bei der Verhinderung
eines Übersprechens
in Volumenproben, wie Fluiden.
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WO-A-0011024
offenbart das konfokale Abtasten über einer Vielzahl von Punkten
von Anregungslicht. Die Anregung wird durch eine Ein-Photon- oder
Zwei-Photonen-Aufwärtskonvertierungs-Anregung
erreicht, die ein von der Multi-Photonen-Anregung unterschiedliches Anregungsverfahren
darstellt. Aufwärtskonvertierung
ist nicht auf die Fokalfläche
beschränkt
und erfordert die zeitaufwändige
Ausrichtung von Lochblenden für
jeden Fokus. Anstelle von Lochblenden werden CCD-Bins verwendet,
um das Detektionsvolumen abzugrenzen. Ein Hauptnachteil von CCD-Bins
ist die erheblich geringere Zeitauflösung (Millisekunden), die für Fluoreszenz-Fluktuationsmessungen
(Nano- bis Mikrosekunden) ungeeignet ist.
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Um
eine hohe räumliche
Auflösung
aufzuweisen, wurde die Fluorimetrie ziemlich früh mit Konfokal-Anordnungen
kombiniert. Die Anwendung der Fluorimetrie in einer Konfokal-Anordnung
in der Biotechnologie wurde ausführlich
durch Eigen und Rigler demonstriert (PNAS 1994, 91(13):5740). Eigen
und Rigler beschrieben insbesondere die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie,
die Korrelationen zwischen den fluktuierenden Fluores zenzemissionssignalen
aufzeichnet und die daher die Analyse der molekularen Diffusions-
und Transportphänomene
ermöglicht.
Die Autoren verwendeten diese Technik für die Messung von molekularen
Größen und
von biomolekularen Wechselwirkungen, wie beispielsweise die Bindung
eines Liganden an seinen Rezeptor. Des Weiteren koppelten sie diese
Untersuchungen mit Einrichtungen zum Einfangen einzelner Moleküle in elektrischen
Feldern, um die Empfindlichkeit zu erhöhen und das Detektionslimit
weiter zu verringern. Bei diesen Messungen wurden Moleküle mit spezifischen
Fluorophoren markiert, und sie konnten bei Konzentrationen von 10–15 M
und geringer beobachtet werden.
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Probleme
von dieser und anderen Anordnungen sind unter anderem die begrenzte
räumliche
Auflösung,
die vergleichsweise langen Aufzeichnungszeiten, um eine sehr hohe
Datenqualität
zu erreichen, die Anforderung der Überlagerung von zwei oder mehr
Laserstrahlen, um mehr als ein Fluorophor anzuregen, und die Schwierigkeiten
beim Ausrichten der Lochblende, um das offene Volumenelement in
der axialen Richtung zu beschränken.
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Multi-Photonen-Anregung
wurde verwendet, um die Größe des Volumenelements
weiter zu verringern und um das Volumenelement klar zu beschränken, ohne
eine Lochblende zu benötigen.
Die Prinzipien der Zwei-Photonen-Anregung in Kombination mit Hochauflösungsmikroskopie
wurden von Denk et al. (Science, 248 (1990) 73-76) beschrieben.
Multi-Photonen-Anregung hat mehrere substanzielle Vorteile insbesondere
für die
Verwendung mit biologischen Proben und Verfahren, die auf molekularen
Fluktuationen in einem mikroskopischen Fokus beruhen. Die Zwei-Photonen-Anregung
ist wegen ihrer nicht-linearen Natur strikt auf die Fokalfläche eines
Mikroskopobjektivs beschränkt.
Daraus ergibt sich ein sehr hoher Kontrast, eine sehr hohe räumliche
Auflösung
und die Tatsache, dass die Ver wendung eines räumlichen Filterelements („pinhole") zur Eingrenzung
des Detektionsvolumens nicht notwendig ist, was die Ausrichtungsprozedur
erleichtert. Des Weiteren werden Probleme, wie zum Beispiel eine
Photozerstörung
oder ein Photobleichen der Biomoleküle oder der Markermoleküle verringert.
Photozerstörung
und ähnliche
Effekte führen
häufig
zu falschen oder fehlinterpretierten Ergebnissen.
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Eine
spezielle Anordnung zum Gebrauch der Zwei-Photonen-Anregung ist in WO
02/08732 beschrieben. Probenanalyte, die durch verschiedene fluoreszierende
Farbstoffe markiert sind und spektral verschiedene Fluoreszenzemissionen
haben, werden durch eine Laserwellenlänge mittels Zwei-Photonen-Anregung
beleuchtet. Die Fluoreszenzemissionen werden durch zwei getrennte
Detektionsvorrichtungen detektiert. Die Verwendung der Zwei-Photonen-Anregung
stellt sowohl die Identität
der Anregungsvolumina für
beide Farbstoffe als auch die Vermeidung der Verwendung einer Lochblende
zur Eingrenzung des Messvolumens in beiden Detektionswegen sicher.
Diese Anordnung ist jedoch auf die Kreuzkorrelations- und/oder konfokale
Fluoreszenzkoinzidenzanalysen beschränkt und liefert keine räumlichen
Informationen.
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US 6 262 423 B1 offenbart
eine Einrichtung zum Untersuchen von Eigenschaften einer Probe durch die
Messung von Fluoreszenzparametern in mehreren Foki, umfassend eine
Quelle zur Erzeugung eines kollimierten primären Laserstrahls mit einer
Photonendichte und einer Wellenlänge,
die zur Multi-Photonen-Anregung
der Probe geeignet sind, eine Mikrolinsen-Anordnung zum Aufspalten
des primären
Laserstrahls in eine Vielzahl von sekundären Laserstrahlen, eine Fokussierungsoptik
zum Fokussieren der sekundären
Laserstrahlen in eine Vielzahl von Volumenelementen in der Probe,
und eine Detektionsvorrichtung zur Detektion von Licht, das von
den Volumenelementen emit tiert worden ist, und zur Auswertung des
detektierten Lichts, um die zu analysierende Eigenschaft zu erhalten.
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Analysen
mit einer hohen Präzision,
einem hohen Probendurchsatz und zusätzlicher räumlicher Information über jede
Probe können
erreicht werden, wenn diese konfokal-fluorimetrischen Anordnungen
mit Einzelfokus parallelisiert werden. Vorzugsweise kann dies unter
Verwendung von Anordnungen mit Mehrfach-Foki erreicht werden.
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Es
sind verbesserte Anordnungen für
fluorimetrische Analysen beschrieben worden, die Fluoreszenz in
einer Vielzahl von Volumenelementen detektieren. Das Patent
US 5 815 262 beschreibt
eine Vorrichtung und ein Verfahren zur parallelen Ausführung von
Laser-induzierter Zwei-Photonen-Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie
in einer Vielzahl von Probenvolumina. Bei dieser Anordnung wird
ein Laserstrahl über
Mikroskopobjektive aufeinanderfolgend durch eine Reihe von Probenvolumina
fokussiert, das heißt,
das Licht, das durch ein Probenvolumen hindurchtritt, wird in die
nächste
Probe refokussiert. Die Fluoreszenz wird durch eine parallele Anordnung
von optischen Einrichtungen umfassend Linsen, Filter und Photovervielfacher
für jede Probe
detektiert. Dieser Aufbau ist komplex, da er für jeden Fokus Hochqualitätsoptiken
erfordert. Des Weiteren verringert sich wegen optischen Verlusten
in den Proben und den Optiken entlang der Reihenanordnung die Anregungsintensität von Probe
zu Probe. Dies führt
zu Beschränkungen,
wenn resultierende Fluoreszenzsignale von verschiedenen Proben verglichen
werden. Des Weiteren erzeugt der Aufbau Foki in verschiedenen Proben.
Daher liefert der Aufbau keine räumliche
Information aus der Probe.
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In
WO 01/40769 ist ein Aufbau zur Messung der Fluoreszenz in einer
konfokalen Anordnung in einer Vielzahl von Fokalpunkten beschrieben,
die in jeder Probe erzeugt werden. Der technische Aufbau verwendet eine
Vielzahl von optischen Fasern, eine Strahlteilereinrichtung und
Fokussierungsoptiken. Der Laserstrahl oder irgendein anderes Licht,
das zur Anregung verwendet wird, wird durch eine Vielzahl von optischen
Fasern geleitet. Die Ausgänge
der Fasern sind über
einen dichroitischen Spiegel zu einer Fokussieroptik gerichtet,
die wiederum das Anregungslicht in eine Vielzahl von sekundären Fasern
fokussiert. Die Ausgänge
des sekundären
Satzes von Fasern wird durch eine weitere Fokussierungsoptik in
die Probe fokussiert, wobei eine Vielzahl von Foki erzeugt wird.
Die resultierende Fluoreszenz von Molekülen in den Foki wird dann durch
dieselbe Optik in die sekundären
Fasern gesammelt. Dann wird nach Vorbeitritt am dichroitischen Spiegel
die Fluoreszenz in eine dritte Vielzahl von Fasern fokussiert, die
schließlich
das Fluoreszenzlicht auf mindestens eine Detektorvorrichtung richten.
Um in der Probe beugungsbegrenzte Fokalpunkte hoher Qualität und begrenzte
Detektionsvolumina zu erreichen, die für Messungen basierend auf molekularen
Fluktuationen wesentlich sind, müssen
alle Fasern im optischen Anregungsweg Monomode-Fasern sein. Abgesehen
von der Tatsache, dass die Justierprozedur sehr zeitaufwändig ist,
unterliegt das Einkoppeln von Licht in Monomode-Fasern erheblichen Intensitätsverlusten.
Dies gilt für
das Anregungslicht sowie für
die detektierte Fluoreszenz, was zu einer signifikanten Verringerung
der Anzahl der detektierten Emissionsphotonen pro angeregtem Molekül führt. Außerdem macht
dies den Aufbau inkompatibel mit einer Multi-Photonen-Anregung,
da de Fasern eine signifikante Pulsverbreiterung von fs-Laserpulsen
verursachen, die für
die Zwei-Photonen-Anregung notwendig sind. Die Verwendung einer
Ein-Photon-Anregung in einem Mehrfokal-Aufbau führt jedoch wegen der Anregung
hinter der Fokalfläche
zu einem erheblichen Übersprechen
zwischen den Foki, was weiter die Qualität des Signals verringert.
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Zusammengefasst
weisen alle bisher beschriebenen, herkömmlichen Aufbauten Beschränkungen hinsichtlich
ihrer räumlichen
und zeitlichen Auflösung,
ihrer Signalqualität,
ihrer Aufzeichnungsgeschwindigkeit und daher ihres Probendurchsatzes,
ihrer Robustheit zu komplexen und sich verändernden Probenmatrizen und
ihrer technischen Stabilität
und Anforderungen für
Rejustierungen und Ausrichtungen auf.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Daher
besteht die technische Aufgabe, die der vorliegenden Erfindung zugrunde
liegt, darin, ein verbessertes Verfahren zur Untersuchung von Fluoreszenzparametern
einer Probe bereitzustellen. Eine spezielle Aufgabe der Erfindung
ist es, ein Verfahren zur Untersuchung insbesondere biologischer
oder biochemischer Proben mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung, mit
einem hohen Probendurchsatz, mit einer hohen Robustheit zu komplexen
und sich ändernden
Probenmatrizen und mit einer hohen optischen Stabilität und geringerem
Aufwand beim Ausrichten des optischen Aufbaus bereitzustellen. Der
Aufbau sollte für
eine Vielzahl von fluoreszierenden Molekülen und ein Maximum von ausgelesenen
Fluoreszenzparametern breit anwendbar sein. Eine weitere Aufgabe
der Erfindung ist es, eine verbesserte Vorrichtung zur Untersuchung
von Fluoreszenzparametern einer Probe bereitzustellen.
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Diese
Aufgaben werden entsprechend mit Verfahren und Vorrichtungen mit
den Merkmalen der Ansprüche
1 oder 7 gelöst.
Vorteilhafte Ausführungsformen
und Anwendungen der Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen gekennzeichnet.
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Ein
Verfahren zur Untersuchung von Eigenschaften einer Probe durch Messung
von Fluoreszenzparametern (oder allgemein: Pa rametern der Wechselwirkung
zwischen Licht und der Probe) in mehreren Foki, umfasst die Schritte
einer Teilung eines kollimierten primären (oder ersten) Laserstrahls
mit einer Teilungsvorrichtung in mindestens zwei kollimierte sekundäre Laserstrahlen
und eines Ablenkens der sekundären
(oder zweiten) Laserstrahlen derart, dass sie unter verschiedenen
Ausbreitungswinkeln in Bezug auf eine optische Achse einer Fokussierungsoptik
fortschreiten, einer Fokussierung der sekundären Laserstrahlen mit der Fokussierungsoptik
in mindestens zwei Volumenelemente in der Probe, einer Detektion
von Licht, das von den Volumenelementen emittiert wird, mit einer
Detektionsvorrichtung, und einer Auswertung des detektierten Lichtes,
um die zu untersuchenden Eigenschaften zu erhalten. Eine Vorrichtung
zur Untersuchung von Eigenschaften einer Probe durch Messung von
Fluoreszenzparametern in mehreren Foki umfasst eine Quelle zur Generierung
des kollimierten primären
Laserstrahls, eine Teilungsvorrichtung zur Teilung des primären Laserstrahls in
mindestens zwei sekundäre
Laserstrahlen, wobei die Teilungsvorrichtung ebene refraktive oder
reflektive Oberflächen
enthält,
die zur Formung der sekundären
Laserstrahlen als kollimierte Laserstrahlen angeordnet sind, von
denen jeder einen anderen Ausbreitungswinkel in Bezug auf eine optische
Achse der Fokussierungsoptik aufweist, eine Fokussierungsoptik zur
Fokussierung der sekundären
Laserstrahlen in mindestens zwei Volumenelemente in der Probe, und
eine Detektionsvorrichtung zur Detektion von Licht, das von den
Volumenelementen emittiert worden ist, und zur Auswertung des detektierten
Lichts, um die zu untersuchenden Eigenschaften zu erhalten. Durch
die Kombination dieser Maßnahmen
können
die Foki in der Probe insbesondere mit hoher Genauigkeit und verbesserter
Homogenität
erzeugt werden. Die Teilung des Anregungslichts in die kollimierten
Strahlen hat den besonderen Vorteil, dass optische Störungen in
dem optischen Aufbau vermieden werden.
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Die
vorliegende Erfindung ist insbesondere auf ein Verfahren und eine
Vorrichtung gerichtet, die die Charakterisierung von Proben mit
hoher Geschwindigkeit durch die simultane Messung von Laser-induzierter Multi-Photonen-Anregungs-Fluoreszenz
mit hoher räumlicher
und zeitlicher Auflösung
in einer Vielzahl von Volumenelementen in jeder Probe ermöglichen.
Der Hauptvorteil dieses Multifoki-Aufbaus besteht darin, dass die Bestimmung
von molekularen Fluoreszenzparametern parallel statt aufeinanderfolgend
durchgeführt
werden kann. Daher können
die Messzeiten signifikant verkürzt
werden. Zusätzlich
können
verschiedene molekulare Parameter in einer Probe simultan untersucht
und in Echtzeit verglichen werden. Das Verfahren ist insbesondere
zur Durchführung
von Fluoreszenzfluktuationsuntersuchungen geeignet. Fluoreszenzfluktuationsuntersuchungen
sind Untersuchungen, die Probeneigenschaften durch eine Auswertung
von Fluktuationen im Fluoreszenzsignal bestimmen. Eine derartige
Auswertung wird vorzugsweise durch eine Impulsanalyse durchgeführt. Das
Verfahren ermöglicht
daher die Bestimmung von molekularen Parametern, wie die Fluoreszenzlebensdauer,
die Fluoreszenzanisotropie, den Fluoreszenzenergietransfer, die
Fluorophorbeweglichkeiten und deren Kombinationen in einer Vielzahl
von Foki. Der Aufbau zeichnet sich durch beugungsbegrenzte optische Qualität aus und
ist frei vom Übersprechen
zwischen den Foki in derselben Probe. Des Weiteren ist der Aufbau mit
einem breiten Bereich fluoreszierender Moleküle, vorzugsweise durch Abstimmen
der Anregungswellenlängen,
um alle interessierenden fluoreszierenden Moleküle gleichzeitig anzuregen,
ohne die Notwendigkeit irgendeiner Ausrichtungsprozedur oder eines Änderns optischer
Komponenten kompatibel. Des Weiteren stellt der Aufbau eine homogene
Intensitätsverteilung
unter den fokalen Volumenelementen für Wellenlängen über einen breiten Wellenlängenbereich
bereit.
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Für Multi-Photonen-Anregungs-Anwendungen
umfasst das erfindungsgemäße Verfahren
insbesondere die folgenden Schritte:
- (a) Erzeugung
des ersten Laserstrahls mit einer Intensität und Wellenlänge, die
zur Multi-Photonen-Anregung geeignet ist;
- (b) Erzeugen einer Vielzahl von zwei oder mehr zweiten Laserstrahlen
mit homogenen Intensitäten
aus dem ersten Laserstrahl;
- (c) Koppeln der Vielzahl von zwei oder mehr zweiten Laserstrahlen
unter verschiedenen Winkeln in die Rückapertur eines Mikroskopobjektivs,
das die Fokussieroptik bildet, wobei eine Vielzahl von zwei oder mehr
beleuchteten Volumenelementen in dem Probenvolumen erzeugt werden;
- (d) Projizieren der Vielzahl von zwei oder mehr Volumenelementen
mittels desselben Mikroskopobjektivs und eines Strahlteilers auf
eine Vielzahl von zwei oder mehr Detektionseinheiten;
- (e) Transformieren des detektierten Photonenflusses in jeder
Detektionseinheit in einen über
die Zeit verlaufenden Signalstrom; und
- (f) Konvertieren und/oder Kombinieren der Signale, die von der
Vielzahl von Volumenelementen zu verschiedenen Zeitpunkten und von
verschiedenen Detektionseinheiten gesammelt wurden, in Information über die
Probe in dem Probenvolumen.
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Die
Vorrichtung für
Multi-Photonen-Anregungs-Anwendungen umfasst insbesondere die folgenden Komponenten:
- – eine
Quelle zur Erzeugung eines ersten Laserstrahls, der zur Multi-Photonen-Anregung
geeignet ist;
- – eine
Anordnung von optischen Komponenten zur Teilung des ersten Laserstrahls
in zwei oder mehr zweite Laserstrahlen, vorzugsweise mit homogenen
Intensitäten;
- – eine
Anordnung von optischen Komponenten zum Koppeln der zweiten Laserstrahlen
unter verschiedenen Winkeln in die Rückapertur eines Mikroskopobjektivs;
- – ein
Mikroskopobjektiv;
- – einen
Strahlteiler zum Trennen von Fluoreszenzphotonen von der Anregungsstrahlung;
- – eine
Fokussierungsoptik, um jedes Volumenelement, optional über optische
Fasern, auf eine Detektionseinheit zu projizieren;
- – zwei
oder mehr Detektionseinheiten, wobei die Zahl gleich oder ein Vielfaches
der Zahl von zweiten Laserstrahlen ist; und
- – eine
Signalverarbeitungseinheit, um detektierte Photonen in einen Signalstrom
zu transformieren und um Kombinationen und Korrelationen der Signale
aus verschiedenen Volumenelementen zu verschiedenen Zeitpunkten
zu berechnen.
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Die
Vielzahl von Volumenelementen sind durch eine Vielzahl von Fokalpunkten
innerhalb desselben Probenvolumens definiert. Der Multi-Fokal-Aufbau
ist durch eine erfindungsgemäße Anordnung
von optischen Einrichtungen gebildet.
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Erfindungsgemäß wird der
Multi-Fokal-Aufbau durch eine Kombination einer Anordnung von Prismen und
einer Anordnung von Spiegeln erzeugt.
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Kurze Beschreibung
der Figuren
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Weitere
Einzelheiten, Vorteile und bevorzugte Merkmale der Erfindung werden
im Folgenden unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben.
Die Zeichnungen sind vorgesehen, um die vorliegende Erfindung ergänzend zu
der detaillierten Beschreibung weiter zu erklären, sie sind jedoch nicht
vorgese hen, um den Umfang der Erfindung zu beschränken, wie
er in den Ansprüchen
definiert ist.
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1:
zeigt schematisch die Erfindung mit dem Verfahren und der Vorrichtung,
die eine Messung von Fluoreszenzparametern in einer Vielzahl von
Volumenelementen innerhalb desselben Probenvolumens ermöglichen,
die durch die Vielzahl von Fokalpunkten definiert sind.
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2:
zeigt schematisch einen optischen Aufbau (der die Erfindung nicht
verkörpert),
wobei die Erzeugung eines Multi-Fokus-Arrays
durch eine Spiegelanordnung realisiert wird.
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3:
zeigt die Verwendung von strahlformenden Elementen mit einem ND-Gradientenfilter
oder einem diffraktiven Strahlformer.
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4:
zeigt schematisch einen optischen Aufbau (der nicht die Erfindung
verkörpert),
wobei die Erzeugung eines Multi-Fokus-Arrays
durch einen Satz von Wollaston-Prismen realisiert wird.
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5:
zeigt schematisch eine Ausführungsform
der Erfindung, wobei die Erzeugung eines Multi-Fokus-Arrays durch
eine Kombination von Wollaston-Prismen und einer Spiegelanordnung
realisiert wird.
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6:
zeigt die Muster von Fokalpunkten, die durch die erfindungsgemäße Anordnung
von vier Wollaston-Prismen erzeugt werden.
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7:
zeigt einen speziellen Aufbau mit einem zusätzlichen Strahlteiler, der
verwendet wird, um das Fluoreszenzlicht gleichmäßig auf zwei Koinzidenzkanäle aufzuteilen.
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8:
zeigt die Messung des Koinzidenzwertes und seiner Standardabweichungen
von Tetramethylrhodamin-(TMR)-Lösungen
unter Verwendung eines Strahlteilers, der die Fluoreszenzintensität gleichmäßig in zwei
Kanäle
aufteilt, wobei ein Vergleich eines Aufbaus mit zwölf Foki
mit derselben Messung in einem Aufbau mit einem Fokus zu verschiedenen
Messzeiten gezeigt ist.
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9:
zeigt einen Vergleich des z-Faktors einer Ein-Fokus-, Ein-Photon-Messung der Diffusionszeit von
TMR im Vergleich mit TMR-markiertem Kalbsserum-Albumin (BSA) mit
derselben Messung in einem Multi-Fokal-Zwei-Photonen-Aufbau.
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10:
zeigt Fluoreszenzlebensdaueruntersuchungen von TMR, die mit dem
erfindungsgemäßen Multi-Photonen-Aufbau
gemessen wurden.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Im
Rahmen dieser Erfindung werden die folgenden Begriffe und Definitionen
verwendet.
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„Zählwerte
pro Partikel" ist
die mittlere Anzahl von Photonen pro Sekunde, die durch ein persistent
wiederangeregtes, einzelnes fluoreszierendes Molekül emittiert
und durch eine Detektionseinheit detektiert werden, wobei alle optischen
Verluste in einem optischen Aufbau in Betracht gezogen werden.
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Der
Begriff „Volumenelement" bezieht sich auf
das extrahierte Volumen innerhalb des Probenvolumens mit seinen
Dimensionen, die durch den erfindungsgemäßen Gebrauch von Konfokaloptiken
definiert werden. Das „Volumenelement" ist die Einheit
innerhalb des Probenvolumens, in der die Probe durch den zweiten Laserstrahl
beleuchtet wird, der erfindungsgemäß erzeugt wird. Fluktuationsuntersuchungen
werten Signalfluktuationen in einem derartigen Volumenelement aus.
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Ein „konfokaler" Aufbau wird durch
eine Anordnung von optischen Komponenten definiert, wobei der optische
Anregungs- und Detektionsweg
durch eine einzelne Linse oder ein Mikroskopobjektiv gerichtet sind, wodurch
verursacht wird, dass der Fokus dieser Linse oder des Mikroskopobjektivs
für den
optischen Anregungs- und den optischen Detektionsweg identisch ist.
Dies stellt sicher, dass selbst mit einem Volumenelement, das im
Durchmesser kleiner als 1 μm
ist, das Anregungsvolumen und das Detektionsvolumen innerhalb einer
Probe identisch sind, ohne dass eine Ausrichtung notwendig ist,
um diese zwei Volumina räumlich
zu überlagern.
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Die „Beleuchtungsintensität" ist die Intensität der elektromagnetischen
Strahlung, die schließlich
das Volumenelement beleuchtet, wobei alle Verluste in einem optischen
Aufbau in Betracht gezogen werden.
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Die
vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren und eine Vorrichtung
gerichtet, die die Charakterisierung von Proben mit hoher Geschwindigkeit
durch die gleichzeitige Messung von Laserinduzierter Multi-Photonen-Anregungs-Fluoreszenz
mit hoher räumlicher
und zeitlicher Auflösung
in einer Vielzahl von Volumenelementen in jeder Probe ermöglichen.
Die detektierten Fluoreszenzphotonen werden in einen Signalstrom transformiert,
der Informationen über
den Ort des Volumenelements, von dem jedes detektierte Photon stammt,
die Energie und den Polarisationswinkel von jedem detektierten Photon,
die Lebensdauer des angeregten Zustandes von jedem detektierten
Photon und weitere Parameter trägt.
Der Signalstrom wird in Echtzeit ausgewertet, um Informationen über die
Struktur und/oder Zusammensetzung der Probe, die untersucht wird, und
die zeitliche Entwicklung dieser Parameter freizugeben.
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Ein
Verfahren, das zur Multi-Photonen-Anregung von den Proben eingerichtet
ist, ist schematisch in 1 illustriert. Entsprechend
wird ein erster Laserstrahl 101 erzeugt, der eine Photonendichte
und eine Wellenlänge
aufweist, die für
eine Multi-Photonen-Anregung geeignet sind. Mittels einer Strahlteilereinheit 102 wird-dieser
erste Laserstrahl in eine Vielzahl von zwei oder mehr parallelen
zweiten Laserstrahlen 103 mit einer homogenen Intensitätsverteilung
unter den zweiten Laserstrahlen aufgeteilt. Die Richtung der Vielzahl
von zweiten Laserstrahlen wird dann durch eine Ablenkungseinheit 104 modifiziert,
um Laserstrahlen mit verschiedenen Winkeln 106 zu erzeugen. Über einen
Strahlteiler 105 werden diese Laserstrahlen dann in die
Rückapertur
eines Mikroskopobjektivs 107 eingekoppelt, wodurch eine
Vielzahl von zwei oder mehr beleuchteten Volumenelementen 108 in
dem Probenvolumen erzeugt werden. Die Photonendichte in jedem der
Volumenelemente ist so hoch eingestellt, wie es für eine Multi-Photonen-Anregung
erforderlich ist, und Fluorophore, die in dem Volumenelement angeordnet
sind oder durch dieses hindurchtreten, werden in ihren fluoreszierenden
Zustand angeregt. Die Volumenelemente werden dann über eine
Fokussierungsoptik 109 auf einen Detektorsatz 110 projiziert,
der in Kombination mit einer Signalverarbeitungseinheit 111 die
zeitaufgelöste
Detektion von Photonen, ihre Zuordnung zu einem der verwendeten
Volumenelemente und ihre Charakterisierung in Bezug auf die Photonenenergie,
die Dauer des angeregten Zustandes, den Polarisationswinkel und
weitere Kennwerte ermöglicht.
Mit der Signalverarbeitungseinheit 111 wird diese Information
weiter verarbeitet, um Informationen über die Struktur und Zusammensetzung
der Probe, die analysiert wird, und die zeitliche Entwicklung dieser
Parameter freizugeben. Daher ist das Verfah ren insbesondere für die Messung
von chemischen oder biochemischen Reaktionen, wie von einer Ligand-Rezeptor-Bindung,
von Enzymkinetiken oder ähnlichen
Kinetiken geeignet. Darüber
hinaus ist das Verfahren insbesondere zur Messung von molekularen
Transportprozessen geeignet.
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Die
Verwendung der Multi-Photonen-Anregung in der konfokalen Fluorimetrie
eröffnet
gegenüber
der Einzel-Photonen-Anregung verschiedene Vorteile. Erstens ist
die Multi-Phontonen-Anregung
wegen ihrer nicht-linearen Natur strikt auf die Fokalebene beschränkt. Eine
Konsequenz besteht in der Eliminierung des problematischen, sogenannten Übersprechens
zwischen verschiedenen Foki in einer Probe. Da die Anregung außerhalb
des Fokalvolumens vernachlässigbar
ist, bestehen keine Interferenzen durch Fluoreszenz aus dem außerhalb
des Fokus bestehenden Hintergrund der diversen angrenzenden Anregungs-
und Detektionsvolumina. Daher wird der wichtige Parameter „Zählwerte
pro Partikel" in
dem multifokalen Aufbau nicht beeinträchtigt, wie es typisch ist,
wenn Ein-Photon-Anregung verwendet wird. Multi-Photonen-Anregung
vermeidet auch den Gebrauch und die zeitaufwändige Ausrichtung einzelner
Lochblenden für
jeden Fokus, wie es für
Ein-Photon-Aufbauten notwendig ist, um das Detektionsvolumen weiter
einzuschränken.
In Kombination mit der großen
Detektionsfläche
der verwendeten Detektoren ermöglicht
die Multi-Photonen-Anregung eine sehr hohe Ausrichtungsstabilität.
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Ein
weiterer wichtiger Vorteil der Multi-Photonen-Anregung bezieht sich
auf die Möglichkeit,
gleichzeitig mehrere fluoreszierende Moleküle anzuregen, die sich signifikant
in ihren Ein-Photonen-Absorptionsspektren unterscheiden. Die Multi-Photonen-Anregung
ist in der Lage, alle üblichen
Fluoreszenzfarbstoffe und fluoreszierende Proteine anzuregen, da
deren Zwei-Photonen-Querschnitts-Spektren im Bereich der üblichen, verstimmbaren
Laser eine signifikante Amplitude aufweisen. Selbst wenn die Emissionsspektren
von angeregten fluoreszierenden Molekülen ziemlich verschieden sind,
kann typischerweise eine gemeinsame Zwei-Photonen-Anregungswellenlänge gefunden
werden, da ihre Zwei-Photonen-Querschnitts-Spektren signifikant überlappen.
Als eine weitere Konsequenz besteht keine Notwendigkeit, die Anregungsvolumina
von verschiedenen Lasern durch zeitaufwändige Justiervorgänge zu überlappen.
Ein weiterer Vorteil der Multi-Photonen-Anregung ist, dass allgemein
auf die Anforderung des Wechselns von Filtern oder dichroitischen
Spiegeln und ein darauffolgendes, zeitaufwändiges Re-Justieren des Systems
verzichtet werden kann, wenn verschiedene fluoreszierende Moleküle verwendet
werden. Ein Filter und ein dichroitischer Spiegelsatz können allgemein
verwendet werden, um zu verhindern, dass Photonen der infraroten
Anregungsquelle auf die Detektoren treffen, bei denen vorausgesetzt
wird, dass sie nur Photonen im sichtbaren Bereich detektieren, wo
die Wellenlänge
der Fluoreszenzphotonen liegt, die durch die fluoreszierenden Moleküle emittiert
worden sind.
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Ein
weiterer Vorteil der Multi-Photonen-Anregung besteht darin, dass
die resultierenden Fokalpunkte eine hohe Qualität in Bezug auf die Form ihrer
Anregungsprofile aufweisen, die einer Kugel ähnlich ist. Daraus ergibt sich,
dass selbst beim Auslesen von Parametern, die stark von der Form
des Fokalvolumenelements abhängen,
wie zum Beispiel der molekularen Helligkeit, die Optiken für die Erzeugung
des Anregungs- und Detektionsvolumens nicht mit einem zeitaufwändigen Vorgang
geändert
werden müssen,
wie es typischerweise im Fall der Einzel-Photonen-Anregung erforderlich
ist.
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Um
eine angemessene Multi-Photonen-Anregung zu erreichen, ist eine
hohe Spitzenleistung des elektromagnetischen Feldes er forderlich.
Gemäß einem
speziellen Merkmal der Erfindung wird dies durch die Verwendung
von gepulsten Laserquellen als Quellen für den ersten Laserstrahl 101, 701 erreicht.
Vorzugsweise werden Hochrepetitions-Femtosekunden-Pulslaser mit
Repetitionsraten im Bereich von 100 MHz und Pulsdauern im Bereich
von 100–300
fs verwendet. Diese Laserquellen stellen sehr hohe Spitzenleistungen
bereit, während
sie dennoch unempfindlich gegenüber
einer Pulsverbreiterung sind, die durch Dispersionseffekte in den
Objekten eines konfokalen Aufbaus gegeben sein können. Die hohe Repetitionsrate
im Bereich von 100 MHz ermöglicht
eine maximale Rate aufeinanderfolgender Anregungen der fluoreszierenden
Moleküle,
da die entsprechende Periode von 10 ns ausreichend oberhalb der
Relaxationszeit der meisten dieser Moleküle ist, die im Bereich von
0,5 bis 5 ns liegt. Wenn jedoch die Untersuchung auf molekularen
Zuständen
basiert, die typischerweise sogar kürzere Lebensdauern als 0.5
ns aufweisen, zum Beispiel auf Zuständen mit typischen Lebensdauern
auf der ps- oder fs-Zeitskala, werden Repetitionsraten der Anregungspulse
bevorzugt, die sogar erheblich höher
als 100 MHz sind. Daher verwendet die Erfindung vorzugsweise eine
in der Wellenlänge abstimmbare
Lichtquelle, die linear polarisierte ultrakurze Laserpulse im nahen
Infrarot bereitstellt, wie zum Beispiel Titan-Saphir-fs-Lichtquellen. Die
Verwendung von Licht im infraroten Bereich ist für die Anregung der meisten üblichen
fluoreszierenden Moleküle
mittels Zwei-Photonen-Anregung vorteilhaft. Ein weiterer Vorteil der
Verwendung von fs-Pulsen besteht in der Möglichkeit, gleichzeitig Dynamiken
auf der ps-(Fluoreszenzlebensdauer)
und der fs-Zeitskala (zum Beispiel Schwingungsumverteilung von fluoreszierenden
Molekülen) gleichzeitig
zu messen. Die Anregung kann auch durch zirkular und/oder linear
polarisiertes Laserlicht durchgeführt werden.
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Im
erfindungsgemäßen Aufbau
wird eine gepulste Laserquelle auch verwendet, um die Messung der Dauer
des angeregten Zustands für
jedes detektierte Photon zu messen. Mittels einer Signalverarbeitungseinheit
werden die zeitaufgelösten
Signale von der Detektionseinheit mit einem Triggersignal von der
gepulsten Laserquelle kombiniert, um Information über den
Abstand zwischen dem Zwei-Photonen-Anregungsereignis und der Emission
des entsprechenden Fluoreszenzphotons zu extrahieren.
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Gemäß einem
speziellen Merkmal der Erfindung wird der kollimierte Laserstrahl,
der durch eine geeignete Laserquelle 201, 401, 501 erzeugt
wird, vorzugsweise auf die Größe der Rückapertur
eines Hochqualitäts-Mikroskopobjektivs 107, 207, 407, 507, 707 oder
einem Mehrfachen von dieser aufgeweitet und dann durch einen Satz
optischer Komponenten 102, 702 in eine Vielzahl
von sekundären
einzelnen Strahlen 103, 703 getrennt oder geteilt,
die gegebenenfalls durch die erfindungsgemäße Anordnung von optischen
Einrichtungen in die Vielzahl von Fokalpunkten in dem Probenvolumen
geführt
werden.
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Gemäß einem
speziellen Merkmal der Erfindung haben die sekundären Laserstrahlen 103, 703 identische
Intensitäten,
selbst wenn die Wellenlänge über einen
breiten Bereich abgestimmt wird. Die Intensitäten der Strahlen werden als
identisch betrachtet, wenn die messbaren Differenzen kleiner als
5 bis 10% des Mittelwerts der Intensitäten der Vielzahl von Strahlen
sind. Ein Wellenlängenbereich
wird als breit betrachtet, wenn er mindestens 100 bis 200 nm abdeckt.
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Die
Strahlen werden als nächstes
durch einen Satz von optischen Komponenten 104, 704 derart
abgelenkt, dass alle sekundären
Strahlen in der Rückapertur
eines Mikroskopobjektivs 107, 207, 407, 507, 707 überlagert
werden, wobei jeder in das Objektiv unter einem geringfügig verschiedenen
Winkel 106, 706 eintritt. Die Vielzahl von nicht-parallelen,
jedoch kollimierten Laserstrahlen wird dann durch einen Strahlteiler 105, 205, 405, 505, 705 reflektiert,
der in der Lage ist, zwischen dem Anregungslicht längerer Wellenlänge und
den Emissionsphotonen kürzerer
Wellenlänge
zu unterscheiden. Somit ist der Strahlteiler 105, 205, 405, 505, 705 typischerweise
ein dichroitischer Spiegel, kann jedoch auch ein Polarisationswürfel, ein
Intensitäts-Strahlteiler oder
eine ähnliche
optische Komponente sein.
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Die
Vielzahl von beugungsbegrenzten Anregungspunkten in einer Probe
wird unter Verwendung eines Hochqualitäts-Mikroskopobjektivs 107, 207, 407, 507, 707 erzeugt.
Erfindungsgemäß werden
die Positionen der einzelnen Foki in der Probe 108, 708 durch
den Einfallswinkel der einzelnen Strahlen bestimmt, die in die Rückapertur
des Mikroskopobjektivs eintreten. Die Größe der Foki ist typischerweise
im Bereich > 1 μm, kann jedoch
signifikant kleiner oder größer sein.
Die Positionen der und der Abstand zwischen den Foki kann wie gewünscht durch
die erfindungsgemäße Anordnung
von optischen Einrichtungen justiert werden. Typischerweise sind
Fokus-zu-Fokus-Abstände
vorzugsweise in der Größenordnung
von 5 bis 50 μm,
besonders bevorzugt zwischen 10 und 20 μm, können jedoch von einem Bruchteil
des Durchmessers von jedem Fokus bis zur Grenze der Fokussieroptik
reichen. Wenn typische Hochqualitäts-Mikroskopobjektive verwendet werden,
liegt diese Grenze zwischen 300 und 1000 μm. Die Anzahl der Foki ist auch
nicht begrenzt und hängt
einzig von der optischen Komponente 102, 702 ab.
In Abhängigkeit
von der Ausführungsform
ist die Anzahl der Foki entweder proportional zur Anzahl der optischen
Komponenten 102, 702 oder ist sogar so hoch wie
2n oder geringer, wobei n die Anzahl der
optischen Komponenten 102, 702 ist.
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Vorzugsweise
ist die Anzahl der Foki zwischen 2 und 10000, besonders bevorzugt
zwischen 2 und 1000 und am meisten bevorzugt zwischen 2 und 100.
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Die
Fluoreszenzphotonen, die von Molekülen emittiert werden, die angeregt
werden, wenn sie in oder an irgendeinem der Volumenelemente angeordnet
sind oder vorbeitreten, werden durch dasselbe Mikroskopobjektiv 107, 207, 407, 507, 707 gesammelt.
Wegen der Natur des oben beschriebenen Strahlteilers 105, 205, 405, 505, 705 passieren
die Fluoreszenzphotonen den Stahlteiler 105, 205, 405, 505, 705,
und sie werden auf eine Detektionseinheit 110, 210, 410, 510, 710 refokussiert 109, 209, 409, 509, 709.
Diese Detektionseinheit umfasst mehrere Detektionsflächen. Diese
Detektionsflächen
können
empfindliche Flächen
von einzelnen Detektoren, z.B. Fotodioden, insbesondere APDn, oder
Teilbereiche der empfindlichen Fläche von Detektionsanordnungen,
wie CCD-Chips, oder ähnliche
Detektionsvorrichtungen sein. Vorzugsweise muss die Detektionseinheit 110, 210, 410, 510, 710 genügend Empfindlichkeit
bereitstellen, um einzelne Photonen zu detektieren, die auf die
empfindlichen Flächen
der Detektionseinheit auftreffen. Immer wenn Photonen in einer sensitiven Fläche der
Detektionseinheit detektiert werden, werden ein Signal entsprechend
der Adresse des Volumenelements, von dem das Photon stammt, der
Wellenlänge
und/oder dem Polarisationswinkel des Photons und weitere Parameter
durch eine Signalverarbeitungseinheit 111, 711 extrahiert.
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In
einem ersten optischen Aufbau A (2) wird
die Erzeugung der kollimierten Strahlen mit verschiedenen Einfallswinkeln
durch eine Anordnung von ebenen Spiegeln 204 erzielt. In
diesem Fall wird der Laserstrahl, der durch die Quelle 201 erzeugt
worden ist, mit einem Strahldehner 202 auf die Größe der gesamten Anordnung
der ebenen Spiegel 204 aufgeweitet und dann mittels eines
Strahlformungselement 203 moduliert. Der Neigungswinkel
der Spiegel kann wiederum einzeln justiert werden, um den individuellen
kollimierten Strahl durch einen individuellen Spiegel zu der Rückapertur
des Mikroskopobjektivs 207 zu richten. Gemäß der Erfindung
kann die genaue Position des entsprechenden Fokus in der Probe durch
den Neigungswinkel des Spiegels bestimmt werden. Daher kann auch
die exakte Fokalposition im Detektionsweg, die unten beschrieben
wird, durch den Neigungswinkel des Spiegels bestimmt werden. Erfindungsgemäß wird dadurch
eine individuelle Ausrichtung der Detektoren oder Detektorfasern 210 im
Detektionsweg vermieden. Dies erleichtert die anfängliche
Ausrichtung des Systems auf eine sehr vorteilhafte Weise. Die optische
Qualität
der auf diese Weise erzeugten Foki ist sehr hoch, da das Stahlprofil
der individuellen Strahlen einer sogenannten „Flat-Top"-Form sehr nahe kommt und die Wellenfront
der Strahlen sehr eben ist.
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Bei
einem weiteren optischen Aufbau A1 (3) wird
das Gauss'sche Intensitätsprofil
von typischen Laserquellen unter Verwendung eines Gradientenneutraldichtefilters
geändert,
um homogene Anregungsintensitäten
in jedem Fokus zu erreichen. Der Gradientenneutraldichtefilter hat
ein zentralsymmetrisches, inverses Gauss'sches Profil der optischen Dichte. Die
maximale optische Dichte ist daher in der Mitte des Filters, wo
die maximale Intensität
des Laserstrahls auftritt. Die optische Dichte an diesem Punkt kann
jedoch nur so dicht sein, dass noch ein signifikanter Anteil des
Lichts hindurchtreten kann. In derselben Weise, wie sich die Intensität des Strahls
von seiner Mitte her verringert, verringert sich die optische Dichte
des Filters. Das resultierende Intensitätsprofil nach dem Filter ist
in einem mittleren Bereich des ursprünglichen Gauss-Profils eben. Dieser
Bereich wird dann verwendet, um die Spiegelanordnung homogen zu
beleuchten.
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Bei
einem weiteren optischen Aufbau A2 (3) wird
ein diffraktiver Strahlformer als das strahlformende Element verwendet,
um homogene Anregungsintensitäten
in jedem Fokus zu erreichen. Ein diffraktiver Strahlformer ist ein
spezieller Fall eines diffraktiven Elements (Turunen und Wyrowski,
Herausgeber, in „Diffraktive
Optics for Industrial and Commercial Applications", Akademie Verlag,
Berlin, 1997). Anders als bei Linsen und Spiegeln basiert die Funktion
von diffraktiven Elementen auf Streuung und Interferenz. Ein diffraktives Element
ist gewöhnlich
ein dünnes
ebenes Substrat. Auf einer Seite der Komponente findet sich eine
feine Rillenstruktur. Diffraktive Optiken formen Licht unter Ausnutzung
von dessen Wellennatur. Der Vorteil der Verwendung eines diffraktiven
Stahlformers gegenüber
der Verwendung des Gradientenneutraldichtefilters besteht darin,
dass kein Verlust der Laserintensität auftritt. Diffraktive Strahlformer,
die dem Fachmann bekannt sind, verwenden Interferenzeffekte, um
aus einem Strahl mit bekannten Eigenschaften jegliches gewünschtes
diffraktives Muster zu erzeugen. Das bevorzugte diffraktive Muster,
das für
diese Ausführungsform
der Erfindung verwendet wird, erzeugt ein sogenanntes „Fiat Top"-Muster aus dem ankommenden
Strahl, wobei dieses bestimmte Merkmal ein homogenes, rechteckiges
Intensitätsprofil
ist. Daher kann jeder Spiegel homogen beleuchtet werden.
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Bei
einem weiteren optischen Aufbau B wird die Multi-Fokus-Anordnung mit Prismen
erzeugt (4). Der Laserstrahl, der durch
die Quelle 401 bereitgestellt wird, wird auf die Größe der Rückapertur
des Hochqualitäts-Mikroskopobjektivs 407 aufgeweitet
und dann zu einem Satz von Prismen 403 geleitet. Durch
die Verwendung von Polarisationsprismen wird der Laser strahl in
eine Vielzahl von Strahlen mit absolut identischen Hochqualitäts-Strahlprofilen
und Energien, jedoch mit verschiedenen Ausbreitungswinkeln geteilt.
Die Teilung des einen Laserstrahls in mehrere einzelne Strahlen
mit verschiedenen Winkeln wird durch einen Satz von Wollaston-Prismen
erreicht. Ein intrinsisches Merkmal der verwendeten Prismen wird
verwendet, das in der Auftrennung eines Laserstrahls linear polarisierten
Lichts in zwei Strahlen mit orthogonalen Polarisationswinkeln besteht,
die abgesehen von der Polarisation identisch sind, wenn die Polarisation
des einfallenden Strahls um 45° in
Bezug auf die zwei senkrechten Polarisationen der zwei austretenden
Strahlen des Prismas geneigt ist. n Prismen können in einer Anordnung mit
alternierenden relativen Winkeln der Hauptachsen von 45° für die Erzeugung
von 2n identischen Strahlen mit alternierender
Polarisation angeordnet sein. Dies ermöglicht die Erzeugung einer
exponentiell steigenden Anzahl identischer Strahlen mit einer nur
linear steigenden Anzahl der verwendeten Prismen n. In einer bevorzugten
Ausführungsform
haben diese austretenden Strahlen nur schwach verschiedene Ausbreitungswinkel
von typischerweise weniger als 1°.
Daher dient der Satz von Wollaston-Prismen in Kombination als der
Strahlteiler 102 und die Ablenkeinheit 104.
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Bei
einem weiteren optischen Aufbau (B1) sind die Wollaston-Prismen angeordnet,
um eine Rhombus-förmige
Fokalanordnung zu erreichen. Ein Beispiel einer derartigen Anordnung
mit vier Wollaston-Prismen ist in 6 gezeigt.
Das erste Wollaston-Prisma ist in einer Weise hin zu dem aufgedehnten,
linear polarisierten Laserstrahl (Neigungswinkel 45°) orientiert,
dass der Strahl in zwei neue Strahlen mit orthogonalen linearen
Polarisationen aufgeteilt wird, die um +/– 45° von der ursprünglichen
Polarisation abweichen. Dies wird für die zwei neuen Strahlen mit
einem zweiten Wollaston-Prisma wie derholt, das seinerseits wieder
die zwei Strahlen in vier neue Strahlen aufteilt. Das nächste Wollaston-Prisma
wiederum teilt die vier Strahlen in acht Strahlen, wobei in diesem
Fall der Teilerwinkel der Ausbreitungsvektoren der Strahlen den
halben Betrag der Teilerwinkel der ersten und der zweiten Wollaston-Prismen
hat, um eine Rekombination der Strahlungsvektoren zu vermeiden.
Es gibt eine Vielzahl von Möglichkeiten
der gegenseitigen Orientierungen und Teilerwinkel der Prismenanordnung,
um gut geteilte Strahlen derselben Qualität und Energie und auch verschiedener
Energien zu erhalten.
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Die
austretenden Strahlen der Anordnung werden dann hin zu einer Fokussierungsoptik,
z.B. zu der Rückapertur
des Mikroskopobjektivs gerichtet, wobei entsprechend ihrer verschiedenen
Einfallswinkel an verschiedenen Positionen in der Probe identische
Hochqualitäts-Fokalpunkte
erzeugt werden. Wenn Wollaston-Prismen verwendet werden, sind die
Abweichungen der Zentren der einfallenden Strahlen von der Mitte der
Rückapertur
des Objektivs extrem gering, wobei die Qualität und die Gleichförmigkeit
der Foki nicht beeinträchtigt
wird, da die Winkel typischerweise kleiner als 1° sind.
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In
einem weiteren optischen Aufbau gemäß der Erfindung. (C) wird die
Mehrfach-Fokus-Anordnung durch die Kombination des technischen Aufbaus
von Prismen und ebenen Spiegeln erzeugt. Diese Ausführungsform
ist schematisch in 5 gezeigt. Hier treffen die
austretenden Strahlen der Anordnung von Prismen 503 auf
Spiegel einer Spiegelanordnung 504 und werden dann durch
Neigen der einzelnen Spiegel in der Spiegelanordnung ausgerichtet.
Vorzugsweise werden Wollaston-Prismen als die strahlteilenden Prismen 503 verwendet.
Dieser Aufbau kombiniert die Vorteile beider einzelner Aufbauten
ohne jeden Nachteil. Insbesondere können die geringen Abweichungen
der Zentren der einfallenden Strahlen der Prismen von der Mitte der
Rückapertur
des Objektivs 507 in der bevorzugten Ausführungsform
B durch Neigen der Spiegel derart kompensiert werden, dass alle
Strahlen exakt an der Rückapertur
des Objektivs kombiniert werden. Durch das Neigen der einzelnen
Spiegel können
auch identische Foki in der Probe in jeder gewünschten Weise positioniert
werden. Daher dient bei dieser Ausführungsform der Satz von Prismen 503 als
die Strahlteilereinheit 102 und die Spiegelanordnung 504 dient
als die Ablenkeinheit 104. Wegen der Eigenschaften der
Wollaston-Prismen
ist in einem derartigen Aufbau kein strahlformendes Element erforderlich.
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Erfindungsgemäß ist die
Detektionseinheit 110 in einer Weise angeordnet, welche
die zeitaufgelöste Detektion
einzelner Photonen erlaubt, die von jedem der Vielzahl von Volumenelementen
stammen. Fluoreszenzlicht, das von den fluoreszierenden Molekülen an den
Foki in der Probe emittiert wird, wird durch das Mikroskopobjektiv
gesammelt und erzeugt an der Rückapertur
austretende Strahlen mit derselben Abweichung der Ausbreitungswinkel
wie die einfallenden Anregungsstrahlen, die durch den erfindungsgemäßen Aufbau
erzeugt worden sind. Sie treten durch den dichroitischen Spiegel 105 hindurch,
der aus herkömmlichen
Konfokaltechniken bekannt ist, und werden an einer Position fokussiert,
die von den Eigenschaften des Mikroskopobjektivs oder weiterer fokussierender
Linsen abhängig
ist, die dem Fachmann bekannt sind. An der Position der Foki ist
mindestens ein Detektor platziert, um die Intensität oder einzelne
Photonen des emittierten Fluoreszenzlichts zu detektieren. In einer
bevorzugten Ausführungsform
detektiert ein Detektor sämtliche
Fluoreszenz der einzelnen Foki. In einer speziell bevorzugten Ausführungsform
dieser Art ist der Detektor zur Einzelphotonenzählung geeignet, wobei er eine
hohe Zeitauflösung
von < 1 ns aufweist.
Bei dieser speziell bevorzugten Ausführungsform kann der eine Detektor
durch Identifizieren charakteristischer verschiedener Ankunftszeiten,
die mit den einzelnen Foki verknüpft
sind, Photonen unterscheiden, die von den verschiedenen Foki kommen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die Fluoreszenz
der einzelnen Foki mit einer Anordnung von Detektoren detektiert.
Eine bevorzugte Ausführungsform
dieser Art ist eine hochempfindliche CCD-Einrichtung (ladungsgekoppelte
Einrichtung), die gleichzeitig mehr als 1000 × 1000 Foki detektieren und
auflösen
kann. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform dieser Art ist eine
Anordnung von Photovervielfachern oder Avalanche-Photodioden (APD'n), die einzelne
Detektoren aufweisen, die an den Positionen der fokussierten Fluoreszenz
der einzelnen Foki platziert sind, die in der Probe erzeugt wurden,
und die in der Lage sind, die Ankunftszeiten einzelner Photonen
besser als mit 1 ns aufzulösen.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform
ist eine Anordnung von gespaltenen oder polierten Faserenden von
Fasern, die ihrerseits das gesammelte Fluoreszenzlicht in die einzelnen
Detektoren leiten.
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Bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren
wird die Signalverarbeitungseinheit 111 verwendet, um Informationen über die
Struktur und die Zusammensetzung von jeder Probe, die analysiert
wird, und die zeitliche Entwicklung dieser Parameter mit hoher Geschwindigkeit
und hoher Auflösung
zu extrahieren. Dies wird durch eine Kombination von verschiedenen
Signalverarbeitungsmodulen realisiert. Wie oben beschrieben wurde,
erzeugt jeder einzelne Detektor der Detektionseinheit einen zeitaufgelösten Strom
elektronischer Pulse entsprechend dem Strom der Photonen, die auf
diesen Detektor treffen. Diese Einzelphotonenzählersignale des Detektors werden
in zwei elektronische Einrichtungen aufgeteilt. Eine Einrichtung
ist ein übliches
elektronisches OR-Gatter. Der Ausgang des OR-Gatters ist die zeitaufgelöste Summe
aller elektronischen Pulse, die durch alle Detektoren für die einzelnen
Foki erzeugt worden sind. Die andere Einrichtung ist ein Binärdecoder.
Der Ausgang des Binärdecoders
ist die Adresse des Detektors, wo ein Photon zu der Zeit detektiert
wurde, zu der der elektronische Puls erzeugt wurde. Beide Ausgangssignale
werden mit einem ps-Zeitanalysator verbunden, der Abstände zwischen
elektronischen Pulsen und Laser-Triggersignalen berechnet. Da bei
dieser Art von Einrichtung mit der Detektion eines einzelnen Zählereignisses
keine Totzeit verbunden ist, ist die elektronische Bewertung geeignet,
Photonen-Zähl-Signalfolgeraten
von bis zu einigen GHz zu evaluieren, und sie kann gleichzeitig
Zählwerte
von mehr als 200 Detektoren mit einer Zeitauflösung besser als 300 ps evaluieren.
Daher wird eine individuelle Auswertung der Fluoreszenzlebensdauer
oder Photonenankunftszeiten, die in einer sehr großen Anzahl
von Foki gemessen wurden, durch dieses Verfahren mit einer ps-Zeitauflösung ermöglicht. Mit
dieser Einrichtung können
auch alle anderen konfokalen Verfahren, die auf den Fluktuationen
von Molekülen
basieren, und andere Verfahren, die auf Fluoreszenz basieren, für jeden
Fokus einzeln ausgewertet werden. Es können auch die einzelnen Ankunftszeiten
der Photonen mit anderen messbaren Parametern oder deren Kombinationen
für jedes
einzelne Photon verknüpft
werden. Die Vielzahl von Foki und die schnelle elektronische Aufnahme
ermöglichen
auch, Informationen über
die Struktur der Probe zu extrahieren.
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Experimenteller
Abschnitt
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Beispiel 1
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In
einem ersten Experiment wurde die konfokale Fluoreszenzkoinzidenzanalyse
verwendet, um die hohe Genauigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens
zu demonstrieren. Der spezielle Aufbau dieses Beispiels ist in 7 gezeigt.
Ein Strahlteiler (713) wurde verwendet, um das Fluoreszenzlicht
gleichmäßig auf beide
Koinzidenzkanäle
aufzuteilen. Tetramethylrhodamin(TMR)-Lösungen wurden bei Konzentrationen
von 20 und 100 Partikeln pro Fokus verwendet. Die Zwei-Photonen-Anregung
wurde bei einer Wellenlänge
von 830 nm durchgeführt.
Die Messungen wurden jeweils entsprechend bei 1000, 500, 300, 200,
100 und 50 ms durchgeführt.
Es ist der Vergleich der Ergebnisse gezeigt, die unter Verwendung
von einem Fokus erhalten wurden, verglichen mit der gleichzeitigen
Verwendung von zwölf
Foki (siehe 8). Standardabweichungen wurden
aus drei Messungen ermittelt und sind als Fehlerbalken gezeigt.
Die Darstellung demonstriert klar, dass der Multi-Fokal-Aufbau die
Verringerung der Messzeit um einen Faktor erlaubt, der proportional
zur Zahl der Foki ist, während
dieselbe Standardabweichung erhalten bleibt. Die Standardabweichung
der 100 ms-Messung
unter Verwendung des Multi-Fokal-Aufbaus ist sogar besser als die
Standardabweichung der 1000 ms-Messung unter Verwendung von einem
Fokus. Speziell bei sehr kurzen Zeiten, wenn statistische Fluktuationen
ins Spiel kommen, sind die Ergebnisse mit dem Multi-Fokal-Aufbau
vielfach genauer. Messungen können
gut mit Messzeiten unterhalb von 100 ms durchgeführt werden, bei denen der Einzelfokus-Aufbau einen
unannehmbar hohen statistischen Fehler zeigt.
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Es
kann klar gesehen werden, dass der Multi-Fokal-Aufbau die Verringerung
der Messzeit um einen Faktor erlaubt, der proportional zur Anzahl
der Foki ist, während
dieselbe Standardabweichung erhalten bleibt.
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Beispiel 2
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Für einen ähnlichen
Multi-Photonen-, Multi-Fokal-Aufbau umfassend acht Foki sind die
mittlere Partikelzahl und die CPP in Tabelle 1 gezeigt. Wieder wurde
Tetramethylrhodamin in Kombination mit einer Anregungswellenlänge von
830 nm verwen det. Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, zeigen die
erhaltenen Ergebnisse eine hohe Gleichmäßigkeit. Das gemessene CPP
von etwa 20 ist nahe dem Sättigungswert,
der mit den verwendeten APD-Detektoren erhalten werden kann. Dieser
Wert kann weiter vergrößert werden,
wenn Stabilisatoren verwendet werden, welche den Farbstoff vor Photobleichung
schützen.
Der CPP-Wert ist dann ungefähr
50. CPP ist sehr ähnlich
zu den Werten, die mit Ein-Photon-Anregung erhalten werden können. Tabelle
1:
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Beispiel 3
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Um
den Einfluss des geringeren CPP-Wertes aufzuklären, der mit einer Zwei-Photonen-Anregung
für eine
Fluktuationsanalyse erhalten wurde, wurde eine Messung unter Verwendung
von Ein-Photonen-Anregung
mit derselben Messung unter Verwendung von Zwei-Photon-Anregung
verglichen. Die Diffusionszeiten des freien TMR-Farbstoffs und des
TMR-markierten Proteins Bovines Serum-Albumin (BSA) wurden gemessen
und der z-Faktor wurde für
beide Anregungsoptionen berechnet. Für die Ein-Photon-Anregung war die
Anregungswellenlänge
543 nm und die Anregungsleistung ungefähr 100 μW. Für die Zwei-Photonen-Anregung war
die Anregungswellenlänge
840 nm und die Anregungsleistung ungefähr 30 mW bei Pulsbreiten von
ungefähr
200 fs und einer Wiederholrate von 90 MHz. Bei allen Messungen wurde
die gemessene Partikelzahl auf fünf
Partikel pro Fokus justiert. Der z-Faktor wurde berechnet als z
= 1 – (3σ
TMRBSA +
3σ
TMR)/(x
TMRBSA – x
TMR). Dabei bezeichnen x
TMRBSA und
x
TMR den Mitelwert von 100 Messungen der
gefitteten Diffusionszeit, die in einem FCS-Experiment von einer
Probe jeweils entsprechend mit TMR-markiertem BSA und TMR gemessen
wurde. σ
TMRBSA und σ
TMR sind
die Standardabweichungen der entsprechenden Mittelwerte. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 2 gezeigt. Der z-Faktor ist ein Maß für die Eignung
eines biochemischen Assays, zwischen zwei verschiedenen Assayendpunkten
zu unterscheiden. Ein Assay mit einem z-Faktor oberhalb 0,5 wird
gewöhnlich
als eine ausreichende Auflösung
aufweisend betrachtet. Wie aus Tabelle 2 ersichtlich ist, ist der
Assay unter Verwendung von Zwei-Photonen-Anregung in einem Fokus
von nur geringfügig
schlechterer Leistung als der Assay unter Verwendung von Einz-Photon-Anregung
in einem Fokus. Der z-Faktor einer Ein-Fokus-, Ein-Photon-Messung
ist jedoch signifikant schlechter als dieselbe Messung eines Multi-Fokal-(12)-Zwei-Photonen-Aufbaus.
Der z-Faktor der Multi-Fokal-Multi-Photonen-Messung zeigt die Realisierbarkeit
dieser Technik von biomolekularen Parametern. Diese Ergebnisse sind
weiter in
9 gezeigt. Tabelle
2
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Beispiel 4
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10 zeigt
Lebensdaueranalysen von TMR, die mit dem Multi-Fokal-Aufbau gemessen
werden. Selbst bei kürzesten
Messzeiten ist die Qualität
der Kurven sehr hoch. Die Instrumentansprechzeit, die erreicht wurde,
ist geringer als 500 ps, das nahe der Zeitauflösung der APD's ist, die bei diesen
Experimenten verwendet wurden.
