WO2001040769A2 - Hochdurchsatzscreening-verfahren und -vorrichtung zur optischen erfassung von proben - Google Patents

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WO2001040769A2
WO2001040769A2 PCT/EP2000/012126 EP0012126W WO0140769A2 WO 2001040769 A2 WO2001040769 A2 WO 2001040769A2 EP 0012126 W EP0012126 W EP 0012126W WO 0140769 A2 WO0140769 A2 WO 0140769A2
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beam splitter
fibers
focusing optics
radiation
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Norbert Garbow
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Evotec Oai Ag
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence

Definitions

  • the invention relates to a high-throughput screening method and a high-throughput screening device for the optical detection of samples.
  • FCS fluorescence correlation spectroscopy
  • This task can be carried out without disturbing the sample (“contactless”) by focusing a laser beam into the sample from suitable optics.
  • Molecules labeled (“labeled") with a fluorescent dye are excited and light up when they move through the focus.
  • the diffusion properties and concentration of the labeled molecules can be determined from the measured brightness or from the brightness variations.
  • the measurement volume is determined from the product of the intensity distribution of the excitation light and the field of view of the detector.
  • the measurement volume becomes minimal when the maxima of both distributions coincide. If the values of the distributions outside the focus range are very small, it is simultaneously ensured that no fluorescent light is detected that does not come from the focus.
  • the numerical aperture of the focus optics should be as large as possible.
  • the exciting laser should radiate in TEMoo basic mode and the detector should be quasi punctiform. For this purpose, his field of vision may be limited by a small aperture ("pinhole").
  • a lens focuses the exciting laser light and also collects the fluorescent light to image it on the detector.
  • a dichroic beam splitter separates the excitation and fluorescent light between the lens and the detector.
  • the focusing optics Due to the wide distribution of the wavelength in a fluorescence application, the focusing optics generally have different focal lengths for excitation and fluorescence light. The resulting chromatic focus shift can be compensated for by adjusting the pinhole or any additional optics in front of it. A corresponding construction scheme is shown in Fig. 1.
  • a radiation generating device in the form of a laser 10 generates a first magnetic excitation radiation, which is passed on to a focusing optics 14 via a beam splitter device 12 in the form of a dichroic mirror.
  • the excitation radiation is focused on a focus 16 by the focusing optics 14. This focus 16 defines the measurement volume of the sample to be examined.
  • the second magnetic emission radiation generated in this sample on the basis of the excitation radiation, which differs from the excitation radiation, is guided to the beam splitter device 12 via the focusing optics 14.
  • the emission radiation passes through the beam splitter device 12 and is directed onto a detector 22 via a lens 18 and an aperture 20.
  • a certain disadvantage of the construction scheme given is the fact that the field-of-view diaphragm of the detector has to be adjusted correctly. This can be avoided if the focusing optics have no chromatic focus shifts has, or these are significantly smaller than the length of the focus (Rayleigh length). As shown in the example according to FIG. 2, excitation and fluorescent light can then be limited by exactly one field of view diaphragm. This no longer needs to be readjusted in relation to the focusing optics.
  • a confocal scanning microscope in which the radiation between the radiation generating device and the focusing optics and between the focusing optics and the detector device is transmitted via single or multiple fibers.
  • the beam splitter device is designed as a fiber coupler.
  • a certain disadvantage of fiber couplers is that they do not allow a particularly good separation between the transmitted and the received light. They are particularly unfavorable for highly sensitive fluorescence applications. The relatively high scattered light background in fiber couplers will usually have a disruptive effect on scattered light analyzes.
  • the known confocal scanning microscope cannot be used for the parallel examination of several sample measurement volumes using single photon detections.
  • a confocal microscope is known from EP-A-0 523 159, in which confocal fiber bundles are used for photographic purposes.
  • the type of coupling of the transmitted light is extremely unfavorable for operation with single-mode waveguides, such as are generally used for correlation spectrographic measurements, since almost no excitation light could be coupled into the sample.
  • the invention is based on the object of providing a device and a method for optically recording a large number of sample measurement volumes for high-throughput screening applications.
  • the invention proposes a method with the following steps:
  • Generating a first electromagnetic radiation with at least one radiation generating device Directing the first electromagnetic radiation simultaneously in a multiplicity of first optical fibers to at least one beam splitter device, from which the first electromagnetic radiation is simultaneously directed in a multiplicity of second optical fibers to a focusing optics,
  • the device according to the invention with which, for example, the method specified above can be carried out, is provided with at least one radiation generating device for a first electromagnetic radiation, - a focusing optics with a focusing lens for focusing the first electromagnetic radiation within a focusing range, at least one beam splitter device that is between the at least one radiation generating device and the focusing optics is arranged and which forwards the first electromagnetic radiation to the focusing optics, at least one single photon detector device which is located outside of the at least one radiation generating device via the at least one beam splitter device up to the focusing optics extending beam path is arranged and receives second electromagnetic radiation emanating from the focusing area of the focusing lens and separated from the at least one beam splitter device, wherein - between the at least one radiation generating device and the at least one beam splitter device, a plurality of first optical fibers are arranged, from which the at least one beam splitter device faces Ends of the at least one radiation generating device into which the first optical radiation fed ends facing the first optical fibers
  • the device In the device according to the invention, several optical fibers are used to transmit the excitation radiation (first electromagnetic radiation) and to transmit the detection radiation (second electromagnetic radiation).
  • first electromagnetic radiation first electromagnetic radiation
  • second electromagnetic radiation detection radiation
  • the first electromagnetic radiation (excitation radiation) is expediently again fed into the beam splitter device through a multiplicity of third optical fibers.
  • This is not absolutely necessary.
  • detector devices For example, it is conceivable to provide a detector device with different sensitive areas or a detector device comprising several individual detectors.
  • a detector device can also be used, which is assigned to all foci for the purpose of measuring the total intensity.
  • the excitation radiation is thus directed to the beam splitter device via a first fiber bundle.
  • a first fiber bundle strikes the actual beam splitter via a lens, which is preferably a dichroic mirror.
  • the ends of this first fiber bundle facing the beam splitter device are to be regarded as individual point light sources.
  • the radiation emerging from these point light sources is passed, so to speak, in parallel and simultaneously from the beam splitter device to the ends of a second fiber bundle facing it, by focusing this radiation in a number of foci equal to the number of fibers of the second fiber bundle.
  • the ends of the fibers of the first fiber bundle facing the beam splitter device are mapped onto the ends of the fibers of the second fiber bundle facing the beam splitting device.
  • the excitation radiation thus coupled into the second fiber bundle is then directed to the focusing optics in order to be focused there in a large number of foci.
  • the ends of the fibers of the second fiber bundle facing the focusing optics are to be regarded as individual point light sources.
  • the focusing optics focus everyone's light of these point light sources in individual foci. These foci define the sample measurement volumes.
  • the excitation light generates emission radiation in the measurement volumes, provided that there are appropriately prepared or appropriately prepared substances (for example molecules, analytes, cells, cell fragments or the like) in these measurement volumes.
  • the emission light which can be a few photons, is fed via the focusing optics into the fibers of the second fiber bundle assigned to the individual sample measurement volumes.
  • the beam splitter device separates the optical paths from excitation and emission radiation.
  • the excitation radiation passing through the beam splitter device strikes the light-sensitive detection areas of a detector device, which is, for example, a photomultiplayer that generates wedding-resolved measurement signals. Due to this high time resolution in the submilli, submicro or nanosecond range, it is possible to detect individual photons in the measurement volumes. Corresponding correlation of the measurement signals can then be used to carry out fluorescence-spectographic analyzes of the sample measurement volumes.
  • the device according to the invention and the method according to the invention have the advantage that high-throughput screening applications can be carried out. These high-throughput screening applications are possible due to the parallelization, in that a large number of foci and thus sample measurement volumes can be examined simultaneously.
  • the construction of the device according to the invention is very simple, which is made possible by the use of optically imaged fiber bundles. These fiber bundles also ensure that the optical losses are low, so that emission radiation can be generated in the sample measurement volumes by means of excitation radiation of high intensity, which radiation can be attributed to the generation of a few individual photons. This extremely weak emission radiation can nevertheless be detected by the detector device because namely, also in this regard, the optical losses due to the use of fiber bundles are low.
  • the radiation generating device - such as one or more lasers - starting from a large number of first optical fibers, it is possible to effectively couple the first electromagnetic radiation into the second optical fibers.
  • the relative position of the foci within the samples can be optimally matched to the respective application. For example, it may be particularly desirable to arrange many foci within a sample located in a recess in a commercially available micro / nanotiter plate. As a result, a statistically relevant measurement result for this sample is simultaneously available with only a small expenditure of time. This is particularly advantageous for high throughput screening applications. Crosstalk of the second electromagnetic radiation from individual foci in these non-assigned fiber channels can thus be prevented or at least minimized.
  • the second electromagnetic radiation is a radiation which is wavelength-shifted with respect to the first radiation how to detect fluorescence.
  • the arrangement according to the invention also offers advantages in this case in that wavelength-selective beam splitter elements, in particular dichroic mirrors, adapted to the respective application can be used. These allow effective coupling of both the first and the second electromagnetic radiation.
  • the fiber-optic structures usually described in the prior art only use weakly wavelength-selective fiber couplers, but they have the disadvantage that they either have high losses in the excitation or detection radiation or the product of both.
  • first and second fibers allow the possibility of using polarization-maintaining fibers.
  • Polarization-maintaining X-shaped fiber couplers which are directly connected to the fibers, are difficult to manufacture, if at all.
  • high-throughput screening it is often desirable to carry out polarization measurements inexpensively and efficiently because of their high information content, which is made possible by the construction according to the invention using a detection-side polarization-selective beam splitter element.
  • bundle-shaped first and second fibers is advantageous. This reduces compared to
  • High throughput screening is beneficial.
  • the focusing lens used according to an advantageous development of the invention expediently has a numerical aperture of greater than or equal to 0.6, preferably 0.9, in particular 1.2.
  • the combination of such an objective with an achromatic lens as a colimator fulfills the above-mentioned conditions regarding the chromatic error.
  • the focusing optics have optical elements that work essentially refractive.
  • refractive optical elements are e.g. a reflective mirror lens or a diffractive bulge lens.
  • a plurality of third fibers is arranged in at least one detector device, the ends of the second fibers facing the at least one beam splitter device being optically imaged on the ends of the third fibers facing the at least one beam splitter device and the ends of the third fibers facing away from the at least one beam splitter device the at least one detector device are shown.
  • the ends of the fibers have anti-reflective end faces to produce a high degree of optical coupling and decoupling of the first and second electromagnetic radiation.
  • Possible configurations of the fibers are that the end faces of the fibers run essentially at right angles to the longitudinal axis, or that standard ground fibers are used.
  • the at least one beam splitter device expediently separates the first and second electromagnetic radiation as a function of their polarization, their direction of propagation, their wavelength and / or their intensity.
  • the division of the detection radiation into a plurality of detectors or detection areas of the at least one detector device can be achieved in particular by arranging between the beam splitter device and the detector device a further beam splitter device which forwards electromagnetic radiation impinging on the detector device to different detection areas of the detector device.
  • a radiation generating device instead of a radiation generating device, it is also expedient to provide a plurality of radiation generating devices, the electromagnetic radiation of which can be coupled into individual or into several different first optical fibers.
  • the at least one beam splitter device preferably has a plurality of beam splitter units which are assigned to one or more different first optical fibers.
  • the sample measurement volumes which can be examined simultaneously with the aid of the invention, are either separated from one another within a sample or else are defined as individual volume areas of a common sample.
  • the aid of the invention it is possible to examine individual samples of a total sample which are accommodated in micro- or nanotiter plates or arranged on a chip-shaped array, on a membrane or other flat base or in a flow system.
  • the above-mentioned “scanning” by "moving" the foci as a result of the movement of the ends of the fibers of the second fiber bundle facing the focusing optics can be used in both applications.
  • the samples are expediently examined with regard to at least one of the following properties of the molecules / molecular complexes present in them: fluorescence lifetime, oscillation state, translation or rotation speed, or molecular brightness.
  • the second electromagnetic radiation emitted by the samples is advantageously examined with regard to at least one of the following properties: polarization, spectral composition, intensity, or direction of propagation.
  • the processing of the measurement data expediently comprises the creation of histograms of the photons detected per unit of time by the detector areas of the at least one detector device and / or the creation of histograms of the time units lying between individual photons and / or the creation of histograms the time of detection of a photon relative to a reference signal and / or the creation of correlation functions.
  • the device according to the invention is particularly suitable for spectroscopy, in particular luminescence spectroscopy such as fluorescence correlation spectroscopy, molar mass-independent fluorescence techniques, Raman spectroscopy, light scattering, absorption spectroscopy, in particular with single or multi-photon excitation.
  • the device according to the invention will preferably be used in medical technology, in diagnostics or in screening processes for finding pharmacologically active substances.
  • FIGS. 1 and 2 confocal structures without optical fibers according to the prior art
  • FIGS. 3 to 5 schematically the structure of a confocal according to the invention
  • FIG. 3 shows a first exemplary embodiment of a device 30 for the detection of single photons in a large number of sample measurement volumes.
  • this apparatus 30 is in a groove formed as a laser Strahlungser Wegungsvor- direction 31, a first electromagnetic radiation (hereinafter ⁇ excitation radiation) is generated and fed to a plurality of optical fibers 32 of a first fiber bundle 34th Excitation radiation emitted from these fibers 32 strikes a beam splitter device 36, the actual beam splitter 38 of which in this case is designed as a dichroic mirror. Before the on ⁇ excitation radiation incident on the beam splitter, it passes through a collimator lens 40, the bundle of excitation radiation from the Strahlteilervor- Direction 36 facing ends 42 of the fibers 32 of the first fiber bundle 34 emerge, parallelized.
  • ⁇ excitation radiation hereinafter ⁇ excitation radiation
  • the individual beams bundled in this way into the second fiber bundle 50 emerge at the other ends 52 of the fibers 48 of the second fiber bundle 50 in order to be focused via a collimator lens 54 and focusing optics 56 into a multiplicity of foci 60 arranged in a focusing region 58 become. This results in several foci 60, the number of which is equal to the number of fibers 48 and 32 of the two fiber bundles 50 and 34.
  • the foci 60 define the measurement volumes to be examined of a sample (not shown here). Emission radiation generated on the basis of the excitation radiation in these sample measurement volumes is mapped onto the fiber ends 52 of the second fiber bundle 50 assigned to the individual sample measurement volumes and is fed into the second fiber bundle 50 in this way. After parallelization of the individual emission radiation bundles by the collimator lens 44 of the beam splitter device 36, the emission radiation is separated in this beam splitter device 36 and leaves the beam splitter device 36 on an optical path that is different from the excitation radiation.
  • the individual emission radiation bundles are refocused by a collimator lens 62 of the beam splitter device 36, to be precise on the ends 64 of optical fibers 66 of a third fiber bundle 68, which guides the radiation up to the various detector regions 70 of a detector device 72, which is designed as a photomultiplayer.
  • a collimator lens 62 of the beam splitter device 36 to be precise on the ends 64 of optical fibers 66 of a third fiber bundle 68, which guides the radiation up to the various detector regions 70 of a detector device 72, which is designed as a photomultiplayer.
  • the area marked IV in Fig. 3 is shown again enlarged.
  • the emission radiation bundles leaving the beam splitter device 36 could also strike the detector device 72 directly.
  • 74 denotes a movement device which acts on the ends 52 of the fibers 48 of the second fiber bundle 50 facing the collimator lens 54 and the focusing optics 56 in order to move them.
  • This movement can take the form of a lateral or longitudinal displacement or rotation about the longitudinal axis of the fibers 48 or by tilting.
  • the possible possible overlapping movements are indicated in FIG. 3 by arrows. In this way, the position of the foci 60 within the sample can be shifted, whereby this can be scanned. This is advantageous depending on the tests to be carried out on the sample.
  • FIG. 5 shows an alternative embodiment of a confocal device 80.
  • this device 80 several structures according to FIG. 3 or FIG. 4 are combined.
  • two or more second fiber bundles 50, two or more beam splitter devices 36, two or more radiation generating devices 31, two or more detector devices 70 and two or more first and third fiber bundles 34 and 68 are used for use.
  • the ends 52 of the fibers 48 of the plurality of second fiber bundles 50 can now be moved together via the movement device 74.
  • the excitation radiation emerging from these ends is emitted to form the foci 60 in the direction of the collimator lens 54 and the focusing optics 56.
  • the foci 60 can thus be divided into several groups, these focus groups being assigned to the fibers 48 of different second fiber bundles 50.
  • different excitation radiation which is produced by the different radiation generation devices.
  • directions 31 are generated to introduce into the sample.
  • this different excitation radiation leads to different emission radiation, which is divided between the different second fiber bundles 50.
  • the emission radiation is decoupled from and the excitation radiation is coupled into the fibers 48 of the second fiber bundle 50 in the same way as described above with reference to FIGS. 3 and 4 is described.
  • the emission radiation leaving a beam splitter device 36 is divided into a plurality of detector devices 70 by providing one or more further beam splitter devices.
  • the emission radiation can be passed on from these further beam splitter devices to the individual detector devices without or with optical fibers.
  • the function of the field of view diaphragm common according to the prior art for excitation and detection light is taken over by the ends of (monomode) glass fibers as fibers of the first fiber bundle.
  • the divergent excitation light originating from here is collimated by the collimator lens 54 to such an extent that the requirements of the focusing optics 56 (microscope objective) used for the tube length are met with sufficient accuracy. With this collimator lens 54, residual color errors of the focusing optics 56 can also be compensated for.
  • color or polarization-selective elements, such as bandpass filters can also be added in the detection beam path behind the collimator lens 62.
  • the image of the fiber ends 52 defines the focal points 60 in the sample. Since the image can be reversed in both directions (fiber / sample and sample / fiber), the image of the foci automatically lies on the ends 52 of the fibers 48. An adjustment is not necessary.
  • Moving the fiber ends 52 changes the positions of the measurement volumes in the sample.
  • this can be used, for example, for the accelerated recording of images of the sample or for the targeted, sequential scanning of identical sample areas with different experimental parameters (laser intensities, polarizations, wavelengths, detection filters, etc.).
  • the foci can be as small as possible.
  • the focus diameter is then inversely proportional to the wavelength and proportional to the numerical aperture (N a ) of the focused beam (which is determined by the beam diameter and the focal length of the focusing optics).
  • the case of a minimal measurement volume is particularly advantageous for FCS measurements.
  • the signal to noise ratio increases with the reciprocal of the occupation number as well as the "diffusion time" of a molecule required to pass through the measurement volume through the focus.
  • the focusing power of the optics can be reduced. Then, however, the light collection efficiency is also reduced, so that a smaller number of emitted photons can be detected by individual molecules.
  • a waveguide with a larger core diameter can be used instead of the single-mode glass fiber. This is then generally no longer monomodal, so that the imaging is not diffraction limited, but he can exploit the high light collecting the focusing high N a better.

Abstract

Für das Hochdurchsatzscreening wird eine erste elektromagnetische Strahlung mit mindestens einer Strahlungserzeugungsvorrichtung (31) erzeugt und diese simultan in einer Vielzahl von ersten optischen Fasern (34) zu mindestens einer Strahlteilervorrichtung (36) geleitet, von der ausgehend die erste elektromagnetische Strahlung simultan in einer Vielzahl von zweiten optischen Fasern (48) zu einer Fokussieroptik (56) geleitet wird. Die erste elektromagnetische Strahlung wird mittels der Fokussieroptik (56) simultan in eine Vielzahl von Foki (60) fokussiert, die innerhalb zu erfassender Probenmessvolumina liegen. Von den Probenmessvolumina emittierte zweite elektromagnetische Strahlung wird mittels der Vielzahl von zweiten optischen Fasern (48) von der Fokussieroptik (56) zu der mindestens einen Strahlteilervorrichtung (36) geleitet, von der ausgehend die zweite elektromagnetische Strahlung zu getrennten Detektorbereichen (70) mindestens einer Detektorvorrichtung (72) weitergeleitet wird, die außerhalb des sich von der mindestens einen Strahlungserzeugungsvorrichtung (31) über die mindestens eine Strahlteilervorrichtung (36) bis zur Fokussieroptik (56) erstreckenden Strahlenganges angeordnet sind und die die zweite elektromagnetische Strahlung erfassen. Die Messdaten, die auf der Grundlage der erfassten zweiten elektromagnetischen Strahlung generiert werden, werden verarbeitet.

Description

Hochdurchsatzscreeninq-Verfahren und -Vorrichtung zur optischen
Erfassung von Proben
Die Erfindung betrifft ein Hochdurchsatzscreening-Verfahren und eine Hoch- durchsatzscreening-Vorrichtung zur optischen Erfassung von Proben.
Bei einer Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie-(FCS-)Messung wird die Änderung der Anzahl von Molekülen in einem Messvolumen- untersucht. Diese sogenannten Anzahlvariationen sind besonders gut detektierbar, wenn die mittlere Zahl der Moleküle im Messvolumen klein ist (etwa 1). Daher ist es erforderlich, ein möglichst kleines Messvolumen (Durchmesser kleiner als 1 μm) in der Probe, etwa einer Lösung von Reagenzien, zu betrachten.
Diese Aufgabe kann ohne Störung der Probe ("berührungslos") durchgeführt werden, indem ein Laserstrahl von einer geeigneten Optik in die Probe hinein fokussiert wird. Mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte ("gelabelte") Moleküle werden angeregt und leuchten auf, wenn sie sich durch den Fokus bewegen. Aus der gemessenen Helligkeit bzw. aus den Helligkeitsvariationen können die Diffusionseigenschaften und Konzentration der gelabelten Moleküle bestimmt werden.
Das Messvolumen wird aus dem Produkt von Intensitätsverteilung des An- regungslichtes und dem Gesichtsfeld des Detektors bestimmt. Das Messvolumen wird minimal, wenn die Maxima beider Verteilungen zur Deckung kommen. Sind die Werte der Verteilungen außerhalb des Fokusbereiches sehr klein, wird gleichzeitig sichergestellt, dass kein Fluoreszenzlicht detektiert wird, das nicht aus dem Fokus stammt. Um kleinstmögliche Messvolumina zu erhal- ten und um einen möglichst großen Anteil des von dort emittierten Fiuores- zenzlichtes detektieren zu können, sollte die numerische Apertur der Fokus- sieroptik möglichst groß sein. Ferner sollten der anregenden Laser in der TEMoo-Grundmode strahlen und der Detektor quasi punktförmig sein. Dazu wird sein Gesichtsfeld gegebenenfalls durch eine kleine Blende ("Pinhole") beschränkt.
Ein relativ einfaches Schema, um dieses zu ermöglichen, wird mit einer konfokalen Optik realisiert: Ein Objektiv fokussiert das anregende Laserlicht und sammelt ebenfalls das Fluoreszenzlicht, um es auf den Detektor abzubilden. Zwischen Objektiv und Detektor trennt ein dichroitischer Strahlteiler das Anre- gungs- und Fluoreszenzlicht.
Auf Grund der breiten Verteilung der Wellenlänge in einer Fluoreszenzanwendung hat die fokussierende Optik im allgemeinen unterschiedliche Brennweiten für Anregungs- und Fluoreszenzlicht. Die daraus resultierende chromatische Fokusverschiebung kann durch eine Justage von Pinhole oder eventuell davor liegender Zusatzoptik kompensiert werden. Ein entsprechendes Aufbauschema wird in Fig. 1 dargestellt.
Gemäß Fig. 1 wird von einer Strahlungserzeugungsvomchtung in Form eines Lasers 10 eine erste magnetische Anregungsstrahlung erzeugt, die über eine Strahlteilervorrichtung 12 in Form eines dichroitischen Spiegels zu einer Fokussieroptik 14 weitergeleitet wird. Durch die Fokussieroptik 14 wird die Anregungsstrahlung auf einen Fokus 16 fokussiert. Dieser Fokus 16 definiert das Messvolumen der Probe, die zu untersuchen ist. Die in dieser Probe auf Grund der Anregungsstrahlung erzeugte zweite magnetische Emissionsstrahlung, die von der Anregungsstrahlung verschieden ist, wird über die Fokussieroptik 14 zu der Strahlteilervorrichtung 12 geleitet. Die Emissionsstrahlung passiert die Strahlteilervorrichtung 12 und wird über eine Linse 18 und eine Blende 20 auf einen Detektor 22 gerichtet.
Ein gewisser Nachteil des angegebenen Aufbauschemas ist darin zu sehen, die Gesichtsfeldblende des Detektors korrekt justieren zu müssen. Vermeidbar ist dies, wenn die fokussierende Optik keine chromatischen Fokusverschiebungen aufweist, bzw. diese deutlich kleiner als die Länge des Fokus (Rayleighlänge) sind. Wie in dem Beispiel nach Fig. 2 gezeigt ist, können dann Anregungs- und Fiuoreszenzlicht durch genau eine Gesichtsfeldblende begrenzt werden. Diese braucht in Bezug auf die Fokussieroptik nicht mehr nachjustiert werden.
Aus US-A-5 120 953 ist ein konfokales Scanning-Mikroskop bekannt, bei dem die Strahlung zwischen der Strahlungserzeugungsvomchtung und der Fokussieroptik sowie zwischen der Fokussieroptik und der Detektorvorrichtung über einzelne oder mehrere Fasern übertragen wird. Die Strahlteilervorrichtung ist als Faserkoppler ausgebildet. Ein gewisser Nachteil von Faserkopplern ist, dass sie keine besonders gute Separation zwischen dem Sende- und dem Empfangslicht erlauben. Insbesondere für hochempfindliche Fluoreszenzanwendungen sind sie denkbar ungünstig. Für Streulichtanalysen wird sich der relativ hohe Streulichthintergrund bei Faserkopplern zumeist störend auswir- ken. Darüber hinaus lässt sich das bekannte konfokale Scanning-Mikroskop nicht zur parallelen Untersuchung mehrerer Probenmessvolumina anhand von Einzelphotonendetektionen einsetzen.
Des Weiteren ist aus EP-A-0 523 159 ein konfokales Mikroskop bekannt, bei dem konfokale Faserbündel für photografische Zwecke eingesetzt werden. Die Art der Einkopplung des Sendelichts ist jedoch für den Betrieb mit Single- Mode-Wellenleitern, wie sie für Korrelationsspektrographische Messungen im allgemeinen benutzt werden, denkbar ungünstig, da nahezu kein Anregungslicht in die Probe eingekoppelt werden könnte.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, eine Vorrichtung und ein Verfahren zur optischen Erfassung einer Vielzahl von Probenmessvolumina für Hoch- durchsatzscreening-Anwendungen zu schaffen.
Zur Lösung dieser Aufgabe wird mit der Erfindung ein Verfahren mit den folgenden Schritten vorgeschlagen:
Erzeugen einer ersten elektromagnetischen Strahlung mit mindestens einer Strahlungserzeugungsvomchtung, Leiten der ersten elektromagnetischen Strahlung simultan in einer Vielzahl von ersten optischen Fasern zu mindestens einer Strahlteilervorrichtung, von der ausgehend die erste elektromagnetische Strahlung simultan in einer Vielzahl von zweiten optischen Fasern zu einer Fokus- sieroptik geleitet wird,
Fokussieren der ersten elektromagnetischen Strahlung mittels der Fokussieroptik simultan in eine Vielzahl von Foki, die innerhalb zu erfassender Probenmessvolumina liegen, Leiten einer von den Probenmessvolumina emittierten zweiten elektro- magnetischen Strahlung mittels der Vielzahl von zweiten optischen Fasern von der Fokussieroptik zu der mindestens einen Strahlteilervorrichtung, von der ausgehend die zweite elektromagnetische Strahlung zu getrennten Detektorbereichen mindestens einer Detektorvorrichtung weitergeleitet wird, die außerhalb des sich von der mindestens einen Strahlungs- erzeugungsvorrichtung über die mindestens eine Strahlteilervorrichtung bis zur Fokussieroptik erstreckenden Strahlenganges angeordnet sind und die die zweite elektromagnetische Strahlung erfassen, und Verarbeiten von Messdaten, die auf der Grundlage der erfassten zweiten elektromagnetischen Strahlung generierten werden.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung, mit der sich beispielsweise das vorstehend angegebene Verfahren durchführen lässt, ist versehen mit mindestens einer Strahlungserzeugungsvorrichtung für eine erste elektromagnetische Strahlung, - einer Fokussieroptik mit einem Fokussierobjektiv zur Fokussierung der ersten elektromagnetischen Strahlung innerhalb eines Fokussierbereichs, mindestens einer Strahlteilervornchtung, die zwischen der mindestens einen Strahlungserzeugungsvorrichtung und der Fokussieroptik angeordnet ist und die die erste elektromagnetische Strahlung zur Fokussieroptik weiterleitet, mindestens einer Einzelphotonen-Detektorvorrichtung, die außerhalb des sich von der mindestens einen Strahlungserzeugungsvorrichtung über die mindestens eine Strahlteilervorrichtung bis zur Fokussieroptik er- streckenden Strahlenganges angeordnet ist und vom Fokussierbereich des Fokussierobjektivs ausgehende sowie von der mindestens einen Strahlteilervorrichtung separierte zweite elektromagnetische Strahlung empfängt, wobei - zwischen der mindestens einen Strahlungserzeugungsvorrichtung und der mindestens einen Strahlteilervorrichtung eine Vielzahl von ersten optischen Fasern angeordnet ist, aus deren der mindestens einen Strahlteilervornchtung zugewandten Enden von der mindestens einen Strahlungserzeugungsvomchtung in die dieser zugewandte Enden der ersten opti- sehen Fasern eingespeiste erste elektromagnetische Strahlung austritt, zwischen der mindestens einen Strahlteilervorrichtung und der Fokussieroptik eine Vielzahl von zweiten optischen Fasern angeordnet ist, die der mindestens einen Strahlteilervorrichtung zugewandten Enden der ersten optischen Fasern auf die der mindestens einen Strahlteilervorrich- tung zugewandten Enden der zweiten optischen Fasern optisch abgebildet sind, aus den der Fokussieroptik zugewandten Enden der zweiten optischen Fasern austretende erste elektromagnetische Strahlung durch das Fokussierobjektiv in eine Vielzahl von Foki innerhalb des Fokussierbereichs fo- kussiert ist und die der mindestens einen Strahlteilervorrichtung zugewandten Enden der zweiten optischen Fasern zur Detektion von Einzelphotonen in der aus diesen Enden der zweiten optischen Fasern austretenden zweiten elektromagnetischen Strahlung auf getrennte Detektorbereiche der min- destens einen Detektorvorrichtung optisch abgebildet sind.
In den Unteransprüchen sind die Merkmale einzelner Ausführungsbeispiele der Erfindung angegeben.
Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung werden zur Übertragung der Anregungsstrahlung (erste elektromagnetische Strahlung) und zur Übertragung der Detektionsstrahlung (zweite elektromagnetische Strahlung) jeweils mehrere optische Fasern verwendet. Dabei ist eine erste Vielzahl von optischen Fasern zwischen der Fokussieroptik und der Strahlteilervorrichtung und eine zweite Vielzahl von optischen Fasern zwischen der Strahlteilervorrichtung und der Detektorvorrichtung angeordnet. Statt einer Strahlteilervorrichtung und einer Detektorvorrichtung können erfindungsgemäß auch mehrere Strahlteiler- und mehrere Detektorvorrichtung eingesetzt werden. Die Einspeisung der ersten elektromagnetischen Strahlung (Anregungsstrahlung) in die Strahlteilervorrichtung erfolgt zweckmäßigerweise wiederum durch eine Vielzahl von dritten optischen Fasern. Dies ist allerdings nicht zwingend erforderlich. Als Detektorvorrichtungen sind mehrere Varianten möglich. So ist es beispielsweise denk- bar, eine Detektorvorrichtung mit unterschiedlichen empfindlichen Bereichen oder eine mehrere Einzeldetektoren umfassende Detektorvorrichtung vorzusehen. Schließlich kann auch eine Detektorvorrichtung Verwendung finden, die sämtlichen Foki zwecks Messung der Gesamtintensität zugeordnet ist.
Nach der Erfindung wird also die Anregungsstrahlung über ein erstes Faserbündel zur Strahlteilervorrichtung geleitet. Dort trifft sie beispielsweise über eine Linse auf den eigentlichen Strahlteiler, bei dem es sich vorzugsweise um einen dichroitischen Spiegel handelt, auf. Die der Strahlteilervorrichtung zugewandten Enden dieses ersten Faserbündels sind wie einzelne Punktlichtquellen zu betrachten. Die aus diesen Punktlichtquellen austretende Strahlung wird sozusagen parallel und gleichzeitig von der Strahlteilervorrichtung zu den dieser zugewandten Enden eines zweiten Faserbündels weitergeleitet, indem diese Strahlung in einer der Anzahl der Fasern des zweiten Faserbündels gleichen Anzahl von Foki fokussiert wird. Mit anderen Worten werden also die der Strahlteilervorrichtung zugewandten Enden der Fasern des ersten Faserbündels auf die der Strahlteilervorrichtung zugewandten Enden der Fasern des zweiten Faserbündels abgebildet.
Anschließend wird die so in das zweite Faserbündel eingekoppelte Anregungs- Strahlung bis zur Fokussieroptik geleitet, um dort in eine Vielzahl von Foki fokussiert zu werden. Auch hier gilt wiederum, dass die der Fokussieroptik zugewandten Enden der Fasern des zweiten Faserbündels wie einzelne Punktlichtquellen zu betrachten sind. Die Fokussieroptik fokussiert das Licht jeder dieser punktförmigen Lichtquellen in einzelne Foki. Diese Foki definieren die Probenmessvolumina.
Durch das Anregungslicht werden in den Messvolumina Emissionsstrahlungen erzeugt, sofern sich in diesen Messvolumina entsprechend präparierte bzw. entsprechend beschaffene Substanzen (beispielsweise Moleküle, Analyten, Zellen, Zellbruchstücke o.dgl.) befinden. Das Emissionslicht, bei dem es sich um einzelne wenige Photonen handeln kann, wird über die Fokussieroptik in die den einzelnen Probenmessvolumina zugeordneten Fasern des zweiten Faserbündels eingespeist. Durch die Strahlteilervorrichtung kommt es zu einer Separation der optischen Pfade von Anregungs- und Emissionsstrahlung. Die die Strahlteilervorrichtung passierende Anregungsstrahlung trifft auf die lichtempfindlichen Detektionsbereiche einer Detektorvorrichtung auf, bei der es sich beispielsweise um einen Photomultiplayer handelt, der hochzeitaufgelöste Messsignale erzeugt. Auf Grund dieser hohen Zeitauflösung im Submilli- oder Submikro- bzw. Nanosekundenbereich ist es möglich, in den Messvolumina einzelne Photonen zu detektieren. Durch entsprechende Korrelation der Messsignale können dann fluoreszenzspektographische Untersuchungen der Probenmessvolumina durchgeführt werden.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung und das erfindungsgemäße Verfahren haben den Vorteil, dass Hochdurchsatzscreening-Anwendungen durchgeführt werden können. Diese Hochdurchsatzscreening-Anwendungen sind auf Grund der Parallelisierung möglich, indem nämlich eine Vielzahl von Foki und damit Probenmessvolumina gleichzeitig untersucht werden können. Der Aufbau der erfϊndungsgemäßen Vorrichtung ist denkbar einfach, was durch die Verwendung von optisch aufeinander abgebildete Faserbündel ermöglicht wird. Diese Faserbündel sorgen ferner dafür, dass die optischen Verluste gering sind, so dass mittels Anregungsstrahlung hoher Intensität in den Probenmessvolumina Emissionsstrahlung erzeugt werden kann, die auf die Erzeugung von wenigen einzelnen Photonen zurückzuführen ist. Diese äußerst schwache Emissionsstrahlung kann dennoch durch die Detektorvorrichtung detektiert werden, da nämlich auch diesbezüglich gilt, dass die optischen Verluste durch die Verwendung von Faserbündeln gering ist.
Die Erfindung und insbesondere die Anordnung der Fasern zeichnet sich gegenüber dem Stand der Technik durch folgende vorteilhafte Merkmale aus:
1. Von der Strahlungserzeugungsvomchtung - wie z.B. einem oder mehreren Lasern - ausgehend ist es durch eine Vielzahl von ersten optischen Fasern möglich, die erste elektromagnetische Strahlung effektiv in die zweiten optischen Fasern überzukoppeln.
2. Durch Wahl der Abstände zwischen den der Fokussieroptik zugewandten Enden der zweiten Fasern kann die relative Lage der Foki innerhalb der Proben optimal auf den jeweiligen Anwendungszweck abgestimmt wer- den. So kann es insbesondere wünschenswert sein, viele Foki innerhalb einer in einer Aufnahmevertiefung einer handelsüblichen Mikro- /Nanotiterplatte befindlichen Probe anzuordnen. Hierdurch wird simultan mit nur einem geringen Zeitaufwand ein statistisch relevantes Messergebnis für diese Probe erhältlich. Dies ist insbesondere für Hochdurch- satzscreening-Anwendungen vorteilhaft. Ein Übersprechen der zweiten elektromagnetischen Strahlung aus einzelnen Foki in diesen nicht zugeordneten Faserkanälen, kann somit verhindert oder zumindest minimiert werden.
3. Es ist oftmals wünschenswert, als zweite elektromagnetische Strahlung eine gegenüber der ersten Strahlung welleniängenverschobene Strahlung wie Fluoreszenz zu detektieren. Die erfindungsgemäße Anordnung bietet auch in diesem Fall Vorteile dahingehend, daß an die jeweilige Anwendung angepasste wellenlängen-selektive Strahlteilerelemente, insbesondere dichroitische Spiegel, eingesetzt werden können. Diese erlauben ein effektives Überkoppeln sowohl der ersten als auch der zweiten elektromagnetischen Strahlung. Die üblicherweise im Stand der Technik beschriebenen faseroptischen Aufbauten verwenden nur schwach wellenlängenselektive Faserkoppler, die jedoch den Nachteil haben, daß sie entweder hohe Verluste in der Anregungs- oder Detektionsstrahlung oder dem Produkt aus beidem aufweisen. In einem einkanaligen Faseraufbau ist dies noch tolerierbar, da die Verluste so gewählt werden können, daß sie laserseitig entstehen (z.B. durch 90/10-Koppler) und durch eine hohe Laserleistung kompensiert werden können. Bei einem Mehrkanalaufbau wird jedoch die Laserleistung auf viele Kanäle verteilt und ein derartiges Vorgehen ist nicht mehr praktikabel.
4. Der Einsatz von getrennten ersten und zweiten Fasern erlaubt die Möglichkeit, polarisationserhaltende Fasern einzusetzen. Polarisationserhaltende X-förmige Faserkoppler, die direkt mit den Fasern verbunden sind, sind, falls überhaupt, nur schwer herstellbar. Im Hochdurchsatzscreening ist es jedoch oftmals wünschenswert, kostengünstig und effizient Polarisationsmessungen wegen ihres hohen Informationsgehaltes durchzuführen, welches durch den erfindungsgemäßen Aufbau unter Verwendung eines detektionsseitigen polarisationsselektiven Strahlteilerelementes er- möglicht wird. 5. Insbesondere ist die Verwendung von bündeiförmig angeordneten ersten und zweiten Fasern vorteilhaft. Hierdurch reduziert sich im Vergleich zur
Verwendung jeweils einer Vielzahl einzelner Fasern der Justageaufwand erheblich, welches für die Herstellung und die spätere Verwendung im
Hochdurchsatzscreening (HTS) vorteilhaft ist.
Insbesondere beim Einsatz von Fokussierobjektiven hoher numerischer Apertur ist die Forderung, dass chromatische Fehler deutlich kleiner als die Fokus- große sind bzw. bleiben, nur schwer realisierbar. Das gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung zur Verwendung kommende Fokussierobjektiv weist zweckmäßigerweise eine numerische Apertur von größer oder gleich 0,6, vorzugsweise 0,9, insbesondere 1,2, auf. Insbesondere die Kombination eines solchen Objektivs mit einer achromatischen Linse als Kolimator erfüllt die oben angegebenen Bedingungen betreffend den chromatischen Fehler.
In vorteilhafter Weiterbildung der Erfindung ist vorgesehen, dass die Fokussieroptik optische Elemente aufweist, die im wesentlichen refraktiv arbeiten.
Alternativen zu refraktiv arbeitenden optischen Elementen sind z.B. ein reflek- tives Spiegelobjektiv oder ein difraktives Wölbungsobjektiv.
Wie bereits oben kurz erwähnt, ist es zweckmäßig, wenn zwischen der mindestens einen Strahlteilervorrichtung und der. mindestens einen Detektorvor- richtung eine Vielzahl von dritten Fasern angeordnet ist, wobei die der mindestens einen Strahlteilervorrichtung zugewandten Enden der zweiten Fasern auf die der mindestens einen Strahlteilervorrichtung zugewandten Enden der dritten Fasern optisch abgebildet sind und die der mindestens einen Strahlteilervorrichtung abgewandten Enden der dritten Fasern auf die mindestens eine Detektorvorrichtung abgebildet sind. Bei einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass die Enden der Fasern zur Erzeugung eines hohen Grades an optischer Aus- und Einkopplung der ersten und zweiten elektromagnetischen Strahlung entspiegelte Stirnflächen aufweisen.
Mögliche Ausgestaltungen der Fasern sind, dass die Stirnflächen der Fasern im wesentlichen rechtwinklig zur Längsachse verlaufen, oder dass standardmäßig angeschliffene Fasern verwendet werden.
Zweckmäßigerweise separiert die mindestens eine Strahlteilervorrichtung die erste und zweite elektromagnetische Strahlung in Abhängigkeit von ihrer Polarisation, ihrer Ausbreitungsrichtung, ihrer Wellenlänge und/oder ihrer Intensität.
Die Aufteilung der Detektionsstrahlung auf mehrere Detektoren oder Detek- tionsbereiche der mindestens einen Detektorvorrichtung lässt sich insbesondere dadurch realisieren, dass zwischen der Strahlteilervorrichtung und der Detektorvorrichtung eine weitere Strahlteilervorrichtung angeordnet ist, die auf die Detektorvorrichtung auftreffende elektromagnetische Strahlung zu unterschiedlichen Detektionsbereichen der Detektorvorrichtung weiterleitet.
Anstelle einer Strahlungserzeugungsvomchtung können zweckmäßigerweise auch mehrere Strahlungserzeugungsvorrichtungen vorgesehen werden, deren elektromagnetische Strahlung in einzelne oder in mehrere unterschiedliche erste optische Fasern einkoppelbar ist.
Die mindestens eine Strahlteilervornchtung weist vorzugsweise mehrere Strahlteilereinheiten auf, die einzelnen oder mehreren unterschiedlichen ersten optischen Fasern zugeordnet sind.
Um die Probenmessvolumina "scannen" zu können, d.h. um die Foki (Messvolumina) innerhalb einer Probe "verfahren" zu können, ist es zweckmäßig, eine Bewegungsvorrichtung vorzusehen, mittels derer die der Fokus- sieroptik zugewandten Enden der zweiten Fasern in einer quer zu den Längsachsen der Fasern verlaufenden Ebene und/oder in Längsrichtung der Fasern einzeln und/oder gemeinsam bewegbar sind und/oder mittels derer die der Fokussieroptik zugewandten Enden der zweiten Fasern kippbar sind oder dreh- bar sind, und zwar vorzugsweise um eine zu deren Längsachsen parallele Achse.
Die Probenmessvolumina, die mit Hilfe der Erfindung gleichzeitig untersucht werden können, sind entweder innerhalb einer Probe voneinander separiert oder aber als einzelne Volumenbereiche einer gemeinsamen Probe definiert. So ist es beispielsweise möglich, mit Hilfe der Erfindung in Mikro- oder Nano- titerplatten untergebrachte oder auf einem chipförmigen Array, auf einer Membran oder sonstigen flächigen Unterlage oder in einem Durchflusssystem angeordnete Einzelproben einer Gesamtprobe zu untersuchen. Andererseits ist es aber auch möglich, innerhalb einer gemeinsamen Probe einzelne Bereiche dieser Probe zu untersuchen. Das zuvor angesprochene "Scannen" durch "Bewegen" der Foki infolge der Bewegung der der Fokussieroptik zugewandten Enden der Fasern des zweiten Faserbündels ist bei beiden Anwendungen einsetzbar.
Zweckmäßigerweise werden die Proben hinsichtlich mindestens einer der folgenden Eigenschaften der in ihnen vorhandenen Moleküle/Molekülkomplexe untersucht: Fluoreszenzlebensdauer, Schwingungszustand, Translations- oder Rotationsgeschwindigkeit, oder molekulare Helligkeit. Vorteilhafterweise wird die von den Proben emittierte zweite elektromagnetische Strahlung hinsichtlich mindestens einer der folgenden Eigenschaften untersucht: Polarisation, spektrale Zusammensetzung, Intensität, oder Ausbreitungsrichtung. Zweckmäßigerweise umfasst die Verarbeitung der Messdaten die Erstellung von Histogrammen der pro Zeiteinheit von den Detektorbereichen der mindestens einen Detektorvorrichtung erfassten Photonen und/oder die Erstellung von Histogrammen der zwischen einzelnen Photonen liegenden Zeiteinheiten und/oder die Erstellung von Histogrammen der Zeitpunkt der Erfassung eines Photonen relativ zu einem Referenzsignal und/oder die Erstellung von Korrelationsfunktionen.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung eignet sich insbesondere für die Spektro- skopie, insbesondere Lumineszenzspektroskopie wie Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie, molmassenunabhängige Fluoreszenztechniken, Ramanspektro- skopie, Lichtstreuung, Absorptionsspektroskopie, insbesondere mit Ein- oder Mehrphotonenanregung. Vorzugsweise wird die erfindungsgemäße Vorrichtung in der Medizintechnik, in der Diagnostik oder in Screeningverfahren zum Auf- finden pharmakologischer Wirkstoffe Verwendung finden.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Zeichnung näher erläutert. Im einzelnen zeigen :
Fign. 1 und 2 konfokale Aufbauten ohne optische Fasern nach dem Stand der Technik und
Fign. 3 bis 5 schematisch den Aufbau eines erfindungsgemäßen konfokalen
Mikroskops zur zeitlich hochaufgelösten Detektion von Einzelphotonen.
Fig. 3 zeigt ein erstes Ausführungsbeispiel einer Vorrichtung 30 zur Detektion von Einzelphotonen in einer Vielzahl von Probenmessvolumina. Bei dieser Vorrichtung 30 wird in einer als Laser ausgebildeten Strahlungserzeugungsvor- richtung 31 eine erste elektromagnetische Strahlung (nachfolgend Anregungs¬ strahlung) erzeugt und in eine Vielzahl von optischen Fasern 32 eines ersten Faserbündels 34 eingespeist. Aus -diesen Fasern 32 ausgesendete Anregungs- Strahlung trifft auf eine Strahlteilervorrichtung 36, deren eigentlicher Strahlteiler 38 in diesem Fall als dichroitischer Spiegel ausgebildet ist. Bevor die An¬ regungsstrahlung auf den Strahlteiler auftrifft, passiert sie eine Kollimatorlinse 40, die die Bündel von Anregungsstrahlung, die aus den der Strahlteilervor- richtung 36 zugewandten Enden 42 der Fasern 32 des ersten Faserbündels 34 austreten, parallelisiert.
Diese parallelisierten Strahlenbündel gelangen hinter dem Strahlteiler 38 zu einer weiteren Kollimatorlinse 44, die die einzelnen Strahlenbündel auf die der Strahlteilervorrichtung 36 zugewandten Enden 46 von optischen Fasern 48 eines zweiten Faserbündels 50 fokussiert. Damit sind also die von den Enden 42 der Fasern 32 des ersten Faserbündels 34 gebildeten Punktlichtquellen auf die Enden 46 der Fasern 48 des zweiten Faserbündels 50 optisch abgebildet.
Die auf diese Weise gleichzeitig in das zweite Faserbündel 50 eingespeisten einzelnen Strahlenbündel treten an den anderen Enden 52 der Fasern 48 des zweiten Faserbündels 50 aus, um über eine Kollimatorlinse 54 und eine Fokussieroptik 56 in eine Vielzahl von in einem Fokussierbereich 58 angeordneten Foki 60 fokussiert zu werden. Es entstehen also mehrere Foki 60, deren Anzahl gleich der Anzahl der Fasern 48 und 32 der beiden Faserbündel 50 und 34 ist.
Die Foki 60 definieren die zu untersuchenden Messvolumina einer (hier nicht dargestellten) Probe. In diesen Probenmessvolumina auf Grund der Anre- gungsstrahlung erzeugte Emissionsstrahlung wird auf die den einzelnen Probenmessvolumina zugeordneten Faserenden 52 des zweiten Faserbündels 50 abgebildet und auf diese Weise in das zweite Faserbündel 50 eingespeist. Nach Parallelisierung der einzelnen Emissionsstrahlungsbündel durch die Kollimatorlinse 44 der Strahlteilervorrichtung 36 wird die Emissionsstrahlung in dieser Strahlteilervorrichtung 36 separiert und verlässt die Strahlteilervornchtung 36 auf einem von der Anregungsstrahlung verschiedenen optischen Pfad. Durch eine Kollimatorlinse 62 der Strahlteilervorrichtung 36 werden die einzelnen Emissionsstrahlungsbündel wieder fokussiert, und zwar auf die Enden 64 von optischen Fasern 66 eines dritten Faserbündels 68, das die Strahlung bis zu den verschiedenen Detektorbereichen 70 einer Detektorvorrichtung 72 leitet, die als Photomultiplayer ausgebildet ist. In Fig. 4 ist der in Fig. 3 mit IV gekennzeichnete Bereich nochmals vergrößert dargestellt.
Anstelle des zuvor beschriebenen dritten Faserbündels 68 könnten die die Strahlteilervorrichtung 36 verlassenden Emissionsstrahlungsbündel auch direkt auf die Detektorvorrichtung 72 auftreffen.
In Fig. 3 ist mit 74 eine Bewegungsvorrichtung gekennzeichnet, die auf die der Kollimatorlinse 54 und der Fokussieroptik 56 zugewandten Enden 52 der Fa- sern 48 des zweiten Fasernbündels 50 einwirkt, um diese zu bewegen. Diese Bewegung kann in Form einer seitlichen Verschiebung oder Verschiebung in Längsrichtung oder Verdrehung um die Längsachse der Fasern 48 oder durch Kippen erfolgen. Die jeweils möglichen sich eventuell überlagernden Bewegungen sind in Fig. 3 durch Pfeile gekennzeichnet. Hierdurch lässt sich die Lage der Foki 60 innerhalb der Probe verschieben, wodurch diese abgetastet werden kann. Dies ist je nach den durchzuführenden Untersuchungen der Probe von Vorteil.
Fig. 5 zeigt eine alternative Ausgestaltung einer konfokalen Vorrichtung 80. Bei dieser Vorrichtung 80 sind mehrere Aufbauten gemäß Fig. 3 bzw. Fig. 4 kombiniert. Bei Verwendung einer gemeinsamen Fokussieroptik 56 und einer gemeinsamen Kollimatorlinse 54 kommen zwei oder mehrere zweite Faserbündel 50, zwei oder mehrere Strahlteilervorrichtungen 36, zwei oder mehrere Strahlungserzeugungsvorrichtungen 31, zwei oder mehrere Detektorvorrich- tungen 70 und zwei oder mehrere erste und dritte Faserbündel 34 bzw. 68 zum Einsatz. Die Enden 52 der Fasern 48 der mehreren zweiten Faserbündel 50 lassen sich nunmehr gemeinsam über die Bewegungsvorrichtung 74 verschieben. Die aus diesen Enden austretende Anregungsstrahlung wird zur Bildung der Foki 60 in Richtung auf die Kollimatorlinse 54 und die Fokussieroptik 56 ausgesendet. Die Foki 60 lassen sich somit in mehrere Gruppen unterteilen, wobei diese Fokigruppen den Fasern 48 unterschiedlicher zweiter Faserbündel 50 zugeordnet sind. Auf diese Weise ist es möglich, unterschiedliche Anregungsstrahlung, die durch die unterschiedlichen Strahlungserzeugungsvor- richtungen 31 erzeugt werden, in die Probe einzubringen. Diese unterschiedliche Anregungsstrahlung führt je nach Beschaffenheit der Probe zu unterschiedlicher Emissionsstrahlung, die auf die unterschiedlichen zweiten Faserbündel 50 aufgeteilt wird. Die Auskopplung der Emissionsstrahlung aus den und die Einkopplung der Anregungsstrahlung in die Fasern 48 der zweiten Faserbündel 50 erfolgt auf die gleiche Weise, wie es weiter oben anhand der Fign. 3 und 4 beschrieben ist.
Eine Variante der Ausführungsbeispiele gemäß den Fign. 3 und 5 ist darin zu sehen, dass die eine Strahlteilervorrichtung 36 verlassende Emissionsstrahlung durch Vorsehen einer oder mehrerer weiterer Strahlteilervorrichtungen auf mehrere Detektorvorrichtungen 70 aufgeteilt wird. Die Weiterleitung der Emissionsstrahlung von diesen weiteren Strahlteilervorrichtungen zu den einzelnen Detektorvorrichtungen kann ohne oder mit optischen Fasern erfolgen.
In den beiden erfindungsgemäßen Ausführungsbeispielen wird die Funktion der nach dem Stand der Technik für Anregungs- und Detektionslicht gemeinsamen Gesichtsfeldblende von den Enden von (Monomode-) Glasfasern als Fasern des ersten Faserbündels übernommen. Von hier ausgehendes divergentes Anre- gungslicht wird von der Kollimatorlinse 54 so weit kollimiert, dass die Anforderungen der eingesetzten Fokussieroptik 56 (Mikroskopobjektiv) an die Tubuslänge hinreichend genau erfüllt werden. Mit dieser Kollimatorlinse 54 können auch restliche Farbfehler der Fokussieroptik 56 ausgeglichen werden. Entsprechend den Anforderungen an die spektrale Empfindlichkeit können im Detektionsstrahlengang hinter der Kollimatorlinse 62 noch färb- oder polarisationsselektive Elemente, etwa Bandpass-Filter, hinzugefügt werden. Das Bild der Faserenden 52 definiert die Brennpunkte 60 in der Probe. Da die Abbildung in beide Richtungen (Faser/Probe und Probe/Faser) umkehrbar ist, liegt das Bild der Foki automatisch auf den Enden 52 der Fasern 48. Eine Justage ist nicht erforderlich.
Durch Verschieben der Faserenden 52 ("Scannen") ändern sich die Positionen der Messvolumina in der Probe. Sind die Relativpositionen der Messvolumina zueinander bekannt, kann dies z.B. zur beschleunigten Aufnahme von Bildern der Probe oder zum gezielten, sequentiellen Abscannen identischer Probenbereich mit unterschiedlichen experimentellen Parametern (Laserintensitäten, - Polarisationen, -Wellenlängen, Detektionsfilter, etc.) eingesetzt werden.
Werden für die Fasern 48 Monomode-Fasern gewählt und ist die Abbildung nur durch Beugung begrenzt, können die Foki kleinstmögliche Größe annehmen. Der Fokusdurchmesser ist dann umgekehrt proportional zur Wellenlänge und proportional zur numerischen Apertur (Na) des fokussierten Strahles (die vom Strahldurchmesser und der Brennweite der Fokussieroptik bestimmt wird).
Ein Vorteil für polychromatische Anwendungen ist in diesem Aufbau die (Näherungsweise) Unabhängigkeit der Fokusgröße von der Wellenlänge. In guter Näherung ist der Divergenzwinkel des aus der Faser austretenden Lich- tes proportional zur Wellenlänge. Die Na (auf der Brennpunktseite) steigt daher mit der Wellenlänge an, so dass der Fokusdurchmesser fast wellenlängenunabhängig ist.
Der Fall eines minimalen Messvolumens ist besonders für FCS-Messungen von Vorteil. Das Signal zur Rausch-Verhältnis steigt mit den Kehrwerten von Besetzungszahl wie auch der zum Passieren des Messvolumens benötigten "Diffusionszeit" eines Moleküls durch den Fokus.
Für Anwendungen, die größere Messvolumina erfordern, kann die Fokussier- stärke der Optik reduziert werden. Dann wird jedoch auch die Lichtsammeieffizienz verringert, so dass von einzelnen Molekülen eine geringere Anzahl von emittierten Photonen detektiert werden kann.
Alternativ dazu kann Anstelle der Monomode-Glasfaser ein Wellenleiter mit größerem Kerndurchmesser eingesetzt werden. Dieser ist dann im Allgemeinen nicht mehr monomodal, so dass die Abbildung nicht beugungsbegrenzt ist, dafür kann er die hohe Lichtsammeieffizienz der Fokussieroptik hoher Na besser ausnutzen.

Claims

ANSPRÜCHE
1. Hochdurchsatzscreening-Verfahren zur optischen Erfassung von Proben mit den Schritten:
Erzeugen einer ersten elektromagnetischen Strahlung mit mindestens einer Strahlungserzeugungsvomchtung (31),
Leiten der ersten elektromagnetischen Strahlung simultan in einer Vielzahl von ersten optischen Fasern (34) zu mindestens einer Strahlteilervorrichtung (36), von der ausgehend die erste elektromagnetische Strahlung simultan in einer Vielzahl von zweiten optischen Fasern (48) zu einer Fokussieroptik (56) geleitet wird, Fokussieren der ersten elektromagnetischen Strahlung mittels der Fokussieroptik (56) simultan in eine Vielzahl von Foki (60), die innerhalb zu erfassender Probenmessvolumina liegen, Leiten einer von den Probenmessvolumina emittierten zweiten elektromagnetischen Strahlung mittels der Vielzahl von zweiten optischen Fasern (48) von der Fokussieroptik (56) zu der mindestens einen Strahlteilervorrichtung (36), von der ausgehend die zweite elektromagnetische Strahlung zu getrennten Detektorbereichen (70) mindestens einer Detektorvorrichtung (72) weitergeleitet wird, die außerhalb des sich von der mindestens einen Strahlungserzeugungsvomchtung (31) über die mindestens eine Strahlteilervorrichtung (36) bis zur Fokussieroptik (56) erstreckenden Strahlenganges angeordnet sind und die die zweite elektromagnetische Strahlung erfassen, und Verarbeiten von Messdaten, die auf der Grundlage der erfassten zweiten elektromagnetischen Strahlung generierten werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Erfassung der zweiten elektromagnetischen Strahlung zeitaufgelöst erfolgt, insbesondere mit einer zeitlichen Auflösung von kleiner als 1 ms, besonders bevorzugt kleiner als 1 μs, insbesondere besonders bevorzugt mit einer zeitlichen Auflösung, die die Detektion einzelner Photonen erlaubt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenmessvolumina arrayförmig angeordnet sind und dass für jedes Probenmessvolumina ein Fokus (60) erzeugt wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenmessvolumina in einer Mikro- oder Nanotiter- platte, einem chipförmigen Array, auf einer Membran oder sonstigen flächigen Unterlage, oder in einem Durchflusssystem angeordnet sind.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenmessvolumina hinsichtlich mindestens einer der folgenden Eigenschaften der in ihnen vorhandenen Moleküle/Molekülkomplexe untersucht werden : Fluoreszenzlebensdauer, Schwingungszustand, Translations- oder Rotationsgeschwindigkeit, Helligkeit einzelner Moleküle/Molekülkomplexe, oder Gesamthelligkeit der Probe.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die von den Probenmessvolumina emittierte zweite elektromagnetische Strahlung hinsichtlich mindestens einer der folgenden Eigenschaften untersucht wird: Polarisation, spektrale Zusammensetzung, Intensität, Ausbreitungsrichtung oder zeitliche Abfolge der auf die Detektorbereiche (70) der Detektorvorrichtung (72) auftreffenden Photonen.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Verarbeitung der Messdaten die Erstellung von Histogrammen der pro Zeiteinheit von den Detektorbereichen (70) der mindestens einen Detektorvorrichtung (72) erfassten Photonen, und/oder die Erstellung von Histogrammen der zwischen einzelnen Photonen liegenden Zeiteinheiten, und/oder die Erstellung von Histogrammen der Zeitpunkte der Erfassung einzelner Photonen relativ zu einem Referenzsignal, und/oder die Erstellung von Korrelationsfunktionen umfasst.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenmessvolumina mit bildgebenden oder spektroskopischen Analysetechniken, insbesondere Lumineszenzspektroskopie wie FCS, molmassenunabhängigen Fluoreszenztechniken, Ramanspek- troskopie, Lichtstreuung, oder Absorptionsspektroskopie, untersucht wird.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Fokussieroptik (56) farblängskorrigiert ist und/oder die Fokussieroptik (56) eine numerische Apertur von größer als oder gleich 0,6 vorzugsweise 0,9 und insbesondere 1,2 aufweist.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite elektromagnetische Strahlung mittels einer Vielzahl von dritten optischen Fasern (66) von der mindestens einen Strahlteilervorrichtung (36) zu den Detektorbereichen (70) der mindestens einen Detektorvorrichtung (72) geleitet wird.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Vielzahl von ersten, zweiten und/oder dritten Fasern (32,48,66) jeweils bündeiförmig angeordnet sind.
12. Hochdurchsatzscreening-Vorrichtung zur optischen Erfassung von Probenvolumina mit mindestens einer Strahlungserzeugungsvomchtung (31) für eine erste elektromagnetische Strahlung, einer Fokussieroptik (56) zur Fokussierung der ersten elektromagnetischen Strahlung simultan in eine Vielzahl von innerhalb der zu erfassenden Probenmessvolumina liegenden Foki (60), mindestens einer Strahlteilervorrichtung (36), die zwischen der mindestens einen Strahlungserzeugungsvorrichtung (31) und der Fokus- sieroptik (56) angeordnet ist und die die erste elektromagnetische Strahlung zur Fokussieroptik (56) weiterleitet, mindestens einer Detektorvorrichtung (72), die außerhalb des sich
von der mindestens einen Strahlungserzeugungsvorrichtung (31) über die mindestens eine Strahlteilervorrichtung (36) bis zur Fokussieroptik (56) erstreckenden Strahlenganges angeordnet ist und die durch die mindestens eine Strahlteilervorrichtung (31) separierte von der Vielzahl der Foki (60) ausgehende zweite elektromagnetische Strahlung empfängt, wobei zwischen der mindestens einen Strahlungserzeugungsvomchtung (31) und der mindestens einen Strahlteilervorrichtung (36) eine Vielzahl von ersten optischen Fasern (32) angeordnet ist, aus deren der mindestens einen Strahlteilervorrichtung (36) zugewandten Enden (42) von der mindestens einen Strahlungserzeugungsvorrichtung (31) in die dieser zugewandte Enden der ersten optischen Fasern (32) eingespeiste erste elektromagnetische Strahlung austritt, zwischen der mindestens einen Strahlteilervorrichtung (36) und der Fokussieroptik (56) eine Vielzahl von zweiten optischen Fasern (48) angeordnet ist, die der mindestens einen Strahlteilervorrichtung (36) zugewandten Enden (42) der ersten optischen Fasern (32) auf die der mindestens einen Strahlteilervorrichtung (36) zugewandten Enden (46) der zweiten optischen Fasern (48) optisch abgebildet sind, aus den der Fokussieroptik (56) zugewandten Enden (52) der zweiten optischen Fasern (48) austretende erste elektromagnetische Strah- lung durch die Fokussieroptik (56) in eine Vielzahl von Foki (60) innerhalb der zu erfassenden Probenmessvolumina fokussiert ist und die der mindestens einen Strahlteilervorrichtung (36) zugewandten Enden (46) der zweiten optischen Fasern (48) zur Detektion der zweiten elektromagnetischen Strahlung mindestens einer Detektorvorrichtung (70) optisch zugeordnet sind.
13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektorvorrichtung (70) die zweite elektromagnetische Strahlung zeitaufgelöst erfasst, insbesondere mit einer zeitlichen Auflösung von kleiner als 1 ms, besonders bevorzugt kleiner als 1 μs, insbesondere besonders bevorzugt mit einer zeitlichen Auflösung, die die Detektion einzelner Photonen erlaubt.
14. Vorrichtung nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Fokussieroptik (56) farblängskorrigiert ist und /oder eine numerische Apertur von größer als oder gleich 0,6, vorzugsweise 0,9 und insbesondere 1,2 aufweist.
15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Fokussieroptik (56) optische Elemente aufweist, die im wesentlichen refraktiv arbeiten.
16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen der mindestens einen Strahlteilervorrichtung (36) und der mindestens einen Detektorvorrichtung (70) eine Vielzahl von dritten Fasern (66) angeordnet ist, wobei die der mindestens einen Strahlteilervorrichtung (36) zugewandten Enden (46) der zweiten Fasern (48) auf die der mindestens einen Strahlteilervorrichtung (36) zugewandten Enden (64) der dritten Fasern (66) optisch abgebildet sind und die der mindestens einen Strahlteilervorrichtung (36) abgewandten Enden der dritten Fasern (66) auf die mindestens eine Detektorvorrichtung (70) abgebildet sind.
17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Enden (42,46,52,64) der Fasern (32,48,66) zur Erzeugung eines hohen Grades an optischer Aus- und Einkopplung der ersten und zweiten elektromagnetischen Strahlung entspiegelte Stirnflächen aufwei¬
sen.
18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Strahlteilervorrichtung (36) die erste und zweite elektromagnetische Strahlung in Abhängigkeit von ihrer Polarisation, ihrer Ausbreitungsrichtung, ihrer Wellenlänge und/oder ihrer Intensität separiert.
19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen der mindestens einen Detektorvorrichtung (70) und der mindestens einen Strahlteilervorrichtung (36) eine weitere Strahlteilervorrichtung angeordnet ist, die von der Strahlteilervorrichtung (36) kommende zweite elektromagnetische Strahlung zu unterschiedlichen Bereichen der Detektorvorrichtung (70) weiterleitet.
20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Strahlerzeugungsvorrichtungen (31) vorgesehen sind, deren elektromagnetische Strahlung in einzelne oder in mehrere unterschiedliche erste optische Fasern (32) einkoppelbar sind.
21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlteilervorrichtung (36) mehrere Strahlteilereinheiten aufweist, die einzelnen oder mehreren der ersten und/oder zweiten und/oder dritten optischen Fasern (32,48,66) zugeordnet sind.
22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass eine Bewegungsvorrichtung (74) vorgesehen ist, mittels derer die der Fokussieroptik (56) zugewandten Enden (52) der zweiten Fasern (48) in einer quer zu den Längsachsen der Fasern (48) verlaufenden Ebene und/oder in Längsrichtung der Fasern (48) einzeln und/oder gemeinsam bewegbar sind und/oder mittels derer die der Fokussieroptik (56) zugewandten Enden (52) der zweiten Fasern (48) kippbar oder drehbar sind, und zwar vorzugsweise um eine zu deren Längsachsen parallele Achse.
23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Vielzahl von ersten, zweiten und/oder dritten Fasern (32,48,66) jeweils bündeiförmig angeordnet sind.
24. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 23 für die Spektroskopie, insbesondere Lumineszenzspektroskopie wie Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS), molmassenunabhängige Fluoreszenztechniken, Ramanspektroskopie, Lichtstreuung, Absorptionsspektroskopie, oder für die Mikroskopie, jeweils insbesondere mit Ein- oder Mehrphotonenanregung.
25. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 23 in Screeningverfahren zum Auffinden biologisch-chemischer, insbesondere pharmakologischer, Wirkstoffe oder der Hochdurchsatz-Diagnostik
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