WO2002014811A1 - Lichterfassungseinheit und verfahren zum erfassen von lumineszenzlicht sowie konfokales mikroskop für die lumineszenzmikroskopie - Google Patents

Lichterfassungseinheit und verfahren zum erfassen von lumineszenzlicht sowie konfokales mikroskop für die lumineszenzmikroskopie Download PDF

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detection unit
detector
confocal microscope
light detection
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Alexander Drabenstedt
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Mg Microscope Gmbh
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    • G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence

Definitions

  • the invention relates to a light detection unit for luminescence microscopy with a confocal microscope, a method for detecting luminescence light and a confocal microscope with such a light detection unit according to the preambles of the appended claims 1, 10 and 21.
  • Luminescence microscopy takes advantage of the luminescence effect of objects which have one or of corresponding substances with which the objects to be microscoped are prepared.
  • it is a fluorescence effect in which a light beam, usually a laser beam, is directed as an excitation light onto the object to be measured, where it stimulates fluorescence.
  • the light of the object or of parts thereof emitted by the fluorescence effect generally has a wavelength that is different from the excitation light, so that it can be distinguished from backscattered excitation light.
  • fluorescence microscopy several fluorescent stains are usually introduced into an object in such a way that the concentrations of the individual dyes reflect the spatial distribution and concentration of otherwise invisible substances.
  • a confocal microscope makes it possible to recognize the spatial distribution of these multiple markings by focusing the excitation light into the object and imaging the fluorescent light stimulated and emitted in the focus of the excitation light via the objective onto a photodetector. This enables a three-dimensional measurement of the object.
  • Dyes with different emission spectra are used in order to be able to distinguish between the colors of multiple markings of an object with several fluorescent colors. This means that filters or dichroic mirrors must be arranged in the beam path of the microscope or in front of the detector in order to mask out the spectral ranges that are not of interest. If the fluorescent dye in question is present in the focus of the excitation light, then this is detected on the detector due to the light intensity transmitted through the filter.
  • Luminescence microscopy in particular fluorescence microscopy
  • fluorescence microscopy is used, for example, in biotechnology, in particular measuring cells and labeling different cell components with different fluorescent dyes.
  • the light intensity is disadvantageously reduced both in the case of spectrally selective masking by means of dichroic mirrors and in the case of selective transmission by means of filters.
  • the measurable spectral ranges are naturally fixed here, so that usually a plurality of filters and / or beam splitters must be present for the detection of the different fluorescent dyes.
  • US Pat. No. 5,886,784 discloses a confocal microscope and a light detection unit of the type in which these disadvantages are eliminated in that the luminescent light is spectrally broken down on a prism and only that from the spectrum obtained by means of a mirrored, movable slit diaphragm spectral band of interest is hidden and passed to the detector.
  • the light reflected by the slit diaphragm is directed to a second detector, which is optionally provided with a further mirrored slit diaphragm.
  • the division of the luminescent light is thus achieved by spectrally fanning it out and masking out a spectral range. It is obvious that the provision of movable slit diaphragms to mask out individual spectral ranges from the spectrally broken down luminescent light requires complex precision mechanics and very precise adjustment.
  • the object of the invention is to propose a light detection unit, a method for detecting luminescent light and a confocal microscope of the type mentioned at the outset, with which the measurement of a measurement object can be carried out quickly and precisely by means of the spatially resolved detection of luminescence effects. but at the same time mechanically inexpensive.
  • This object is achieved by a light detection unit for luminescence microscopy with the features of appended claim 1, by a confocal microscope for luminescence microscopy with the features of appended claim 10 and by a method for detecting luminescent light with the features of appended claim 21.
  • the light detection unit for luminescence microscopy according to the invention with a confocal microscope thus comprises a dispersive element for spectrally splitting the luminescent light emitted by a measurement object into a spectrum and a detector for detecting at least a part of the spectrally split luminescent light, the detector being made up of a plurality of independently working ones , arranged along the spectrum, each detecting a selected area of the spectrum, the respective output signals of which can be read out in parallel and evaluated in correlation.
  • the confocal microscope according to the invention for luminescence microscopy comprises a light source for excitation light, imaging optics for focusing the excitation light into a measurement object and for focusing the luminescence light emitted from the measurement object into a light detection unit, this light detection unit being designed as just described.
  • the method according to the invention for detecting luminescent light also differs from the previously known methods in that selected areas of the spectrally split luminescent light are detected by a plurality of independently operating detector elements arranged along the spectral distribution, the output signals of the individual detector elements elements can be read out in parallel and evaluated in a time-correlated manner.
  • a detailed spectrum is therefore primarily detected with a resolution which is given by the number of individual detector elements.
  • the parallel reading of the output signals of all detector elements enables the luminescent light to be classified into different spectral ranges within a very short time, which is essential for the scanning speeds customary in confocal microscopy.
  • the simultaneous detection of the different spectral bands which is made possible by the parallel reading of the output signals, also prevents measurement inaccuracies which result from the change in the wavelength of the emitted light from fluorescent dyes when they are in changing environments, for example with regard to the pH value.
  • An aperture in the beam path after the dispersive element of the light detection unit is completely eliminated; consequently, there is also no need for precision facial expressions to move the diaphragm in the spectrally split luminescent light.
  • the detector composed according to the invention from a plurality of detector elements is preferably a multi-element detector, in particular a line detector, with a plurality of detection windows arranged side by side and signal outputs to be read in parallel.
  • a detector can be, for example, a multi-anode photomultiplier, but photodiode arrays, avalanche photodiode arrays and the like can also be used depending on the application.
  • the dispersive element used in the light detection unit can be a reflection diffraction grating, a transmission diffraction grating or also a dispersion prism.
  • the transmission diffraction grating has the highest efficiency with reproducible boundary conditions.
  • the luminescent light is sometimes only very weak, so that it can be advantageous if an image intensifier is assigned to the detector of the light detection unit.
  • lens or prism elements can be connected upstream of the individual detector elements.
  • a multielement detector can be covered, for example, with a microlens array, which optimizes the impact of the spectrally split luminescent light on the centers of the detector elements and prevents dead areas between the individual windows of the multielement detector.
  • the confocal microscope according to the invention can also be advantageously configured by the developments of the light detection unit according to the invention just described.
  • a particularly preferred further embodiment of the confocal microscope according to the invention is characterized in that the dispersive element of the Light detection unit can also be used "backwards" and consequently the excitation light can also be coupled into the imaging optics via the dispersive element of the light detection unit.
  • Such coupling of the excitation light via the dispersive element is of course independent of whether only a conventional detector or a detector composed according to the invention from several detector elements is used.
  • the excitation in particular of fluorescent dyes, generally takes place with a wavelength that is smaller than the emission wavelengths, typically 10 to 50 nm
  • the light source emitting the excitation light can be arranged next to the associated photodetector or coupled in there, since the excitation light wavelength range extends through the spectral decomposition is also next to the wavelength range to be detected.
  • This preferred embodiment of the invention saves the beam splitters that were previously required in confocal microscopes, which brings enormous advantages, above all, if several fluorescent dyes with relatively far apart emission spectra are used: the absorption spectra of the dyes are generally not wider than the emission spectra, so that for separately labeled specimens, several separate wavelength ranges must be covered by the excitation light, which can usually only be achieved by using several excitation light sources.
  • the excitation beam splitters had to be available in the confocal microscope in this case, which is completely obsolete when the excitation light wavelengths are coupled in via the dispersive element.
  • Figure 1 is a schematic representation of a light detection unit according to the invention
  • FIG. 2 shows a schematic illustration of a confocal microscope according to the invention
  • Figure 3 is a schematic representation of a differently designed light detection unit according to the invention.
  • FIG. 1 shows an exemplary embodiment of a light detection unit according to the invention for a confocal microscope in a schematic representation of the essential elements: a beam of luminescent light 2 from the object is broken down into a spectrum 4 in a dispersive element 3 designed as a prism, and onto a field next to one another in rows arranged detector elements 5 of a detector 6 designed as a multi-anode photomultiplier.
  • the anodes of the individual detector elements 5 are connected to an analog electronic unit (not visible here) via a connection 7 that can be read in parallel.
  • This electronics unit is controlled by a computer 8.
  • This computer 8 makes it possible to combine individual or subfields of the detector elements 5 into groups to be evaluated together, that is to say into detector channels.
  • FIG. 2 also shows a schematic representation of a light detection unit 1 constructed as in FIG. 1 as part of a confocal microscope.
  • the excitation light 10 emitted from the light source 9, which is designed as a laser, is focused via a widening lens 11, a first pinhole 12 and a beam splitter 13 via an imaging lens 14 onto a focus in an object plane 15, where it is a photo in an object (not shown here) - stimulates luminescence.
  • FIG. 3 again shows a schematic illustration of a light detection unit 1, which differs from the light detection unit 1 shown in FIG. 1 in that the light source 9 for excitation light 10, ie the laser, of the confocal microscope is arranged next to the detector 6.
  • the dispersive element 3 is thus passed "forward" by the excitation light 10 and “backward” by the luminescent light 2.
  • the excitation light 10 and the luminescent light 2 run through identical light paths; they only have different wavelengths (due to the frequency shift of the luminescence effect, in particular fluorescence effect), so that the excitation light 10 takes on a different color and thus a different location in the spectrum 4 than the luminescence light 2. It is obvious that this design of the light detection unit 1 a confocal microscope, the beam splitter 13 of the microscope can be omitted without replacement.

Abstract

Es wird eine Lichterfassungseinheit (1) für ein konfokales Mikroskop, ein Verfahren zum Erfassen von Lumineszenzlicht (2) in einem konfokalen Mikroskop sowie ein konfokales Mikroskop selbst vorgeschlagen, wobei das von einem Messobjekt ausgesandte Lumineszenzlicht (2) konfokal auf ein dispersives Element (3) geleitet wird, durch welches das Lumineszenzlicht (2) in ein Spektrum (4) zerlegt wird. Erfindungsgemäss werden jeweils ausgewählte Bereiche dieses Spektrums (4) durch mehrere unabhängig voneinander arbeitende, entlang der Spektralverteilung angeordnete Detektorelemente (5) erfasst, wobei die Ausgangssignale der einzelnen Detektorelemente (5) parallel ausgelesen und insbesondere zeitlich korreliert ausgewertet werden. Ein fallweises Zusammenfassen von beliebigen Detektorelemente (5) in jeweils einen Detektionskanal ist softwaregesteuert möglich.

Description

Lichterfassungseinheit und Verfahren zum Erfassen von Lumineszenzlicht sowie konfokales Mikroskop für die Lumineszenzmikroskopie
B e s c h r e i b u n g
Die Erfindung betrifft eine Lichterfassungseinheit für die Lumineszenzmikroskopie mit einem konfokalen Mikroskop, ein Verfahren zum Erfassen von Lumineszenzlicht und ein konfokales Mikroskop mit einer solchen Lichterfassungseinheit nach den Oberbegriffen der beigefügten Patentansprüche 1 , 10 und 21.
Die Lumineszenzmikroskopie macht sich den Lumineszenzeffekt von Objekten, die einen solchen aufweisen, oder von entsprechenden Stoffen, mit denen die zu - ■ mikroskopierenden Objekte präpariert werden, zunutze. In der Regel handelt es sich um einen Fluoreszenzeffekt, bei welchem ein Lichtstrahl, in der Regel ein Laserstrahl, als Anregungslicht auf das zu vermessende Objekt gelenkt wird, wo er eine Fluoreszenz stimuliert. Das durch den Fluoreszenzeffekt emittierte Licht des Objekts oder von Teilen desselben hat in der Regel eine vom Anregungslicht verschiedene Wellenlänge, so dass es von rückgestreutem Anregungslicht unterscheidbar ist. In der Fluoreszenzmikroskopie werden meist mehrere Fluoreszenz- färben so in ein Objekt eingebracht, dass die Konzentrationen der einzelnen Farbstoffe die räumliche Verteilung und Konzentration ansonsten nicht sichtbarer Stoffe widerspiegelt. Ein konfokales Mikroskop ermöglicht hierbei, die räumliche Verteilung dieser Mehrfachmarkierungen zu erkennen, indem das Anregungslicht in das Objekt fokussiert wird und das im Fokus des Anregungslichts stimulierte und emit- tierte Fluoreszenzlicht über das Objetiv auf einen Fotodetektor abgebildet wird. So wird ein dreidimensionales Vermessen des Objekts möglich.
Um bei Mehrfachmarkierungen eines Objekts mit mehreren Fluoreszenzfarben die Färbungen unterscheiden zu können, werden Farbstoffe mit verschiedenen Emis- sionsspektren eingesetzt. Dies bedingt, dass Filter oder dichroitische Spiegel im Strahlengang des Mikroskops bzw. vor dem Detektor angeordnet sein müssen, um die jeweils nicht interessierenden Spektralbereiche auszublenden. Ist also der betreffende fluoreszierende Farbstoff im Fokus des Anregungslichts vorhanden, wird dies am Detektor aufgrund der durch das Filter transmittierten Lichtintensität erkannt.
Anwendung findet die Lumineszenzmikroskopie, insbesondere die Fluoreszenz- mikroskopie, beispielsweise in der Biotechnologie, wobei insbesondere Zellen vermessen und verschiedene Zellenbestandteile mit verschiedenen fluoreszierenden Farbstoffen markiert werden. Sowohl beim spektral selektiven Ausblenden durch dichroitische Spiegel als auch bei der selektiven Transmission durch Filter wird die Lichtintensität nachteilig vermindert. Außerdem sind hier die messbaren Spektralbereiche naturgemäß fest vorgegeben, so dass meist eine Mehrzahl von Filtern und/oder Strahlteilern zur Detektion der unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffe vorhanden sein müssen.
Aus der US 5 886 784 ist ein konfokales Mikroskop und eine Lichterfassungsein- heit eines solchen bekannt geworden, bei dem diese Nachteile dadurch beseitigt werden, dass das Lumineszenzlicht an einem Prisma spektral zerlegt wird und aus dem erhaltenen Spektrum mittels einer verspiegelten, verfahrbaren Spaltblende nur das interessierende Spektralband ausgeblendet und zum Detektor durchgelassen wird. Das von der Spaltblende reflektierte Licht wird auf einen zweiten Detek- tor geleitet, der gegebenenfalls mit einer weiteren verspiegelten Spaltblende versehen ist. Die Aufteilung des Lumineszenzlichtes wird also durch spektrales Auffächern desselben und Ausblenden eines Spektralbereichs erzielt. Es liegt auf der Hand, dass das Vorsehen von bewegbaren Spaltblenden zum Ausblenden einzelner Spektralbereiche aus dem spektral zerlegten Lumineszenzlicht eine aufwendige Präzisionsmechanik und eine sehr genaue Justierung erfordern.
Ausgehend von diesem Stand der Technik liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Lichterfassungseinheit, ein Verfahren zum Erfassen von Lumineszenzlicht und ein konfokales Mikroskop der eingangs genannten Art vorzuschla- gen, mit dem die Vermessung eines Messobjekts durch die ortsaufgelöste Detektion von Lumineszenzeffekten schnell und genau, jedoch gleichzeitig mechanisch unaufwendig ermöglicht wird. Gelöst ist diese Aufgabe durch eine Lichterfassungseinheit für die Lumineszenzmikroskopie mit den Merkmalen des beigefügten Patentanspruchs 1 , durch ein konfokales Mikroskop für die Lumineszenzmikroskopie mit den Merkmalen des beigefügten Patentanspruchs 10 sowie durch ein Verfahren zum Erfassen von Lumineszenzlicht mit den Merkmalen des beigefügten Patentanspruchs 21.
Bevorzugte Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Lichterfassungseinheit ergeben sich aus den Ansprüchen 2 bis 9; bevorzugte Weiterbildungen des erfindungsgemäßen konfokalen Mikroskops sind in den Ansprüchen 11 bis 20 nieder- gelegt. Eine bevorzugte Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens findet sich in Anspruch 22.
Die erfindungsgemäße Lichterfassungseinheit für die Lumineszenzmikroskopie mit einem konfokalen Mikroskop umfasst also ein dispersives Element zum spektralen Zerlegen des von einem Messobjekt ausgesandten Lumineszenzlichts in ein Spektrum sowie einen Detektor zum Detektieren wenigstens eines Teils des spektral zerlegten Lumineszenzlichts, wobei der Detektor aus einer Mehrzahl von unabhängig voneinander arbeitenden, entlang des Spektrums angeordneten, jeweils einen ausgewählten Bereich des Spektrums erfassenden Detektorelementen be- steht, deren jeweilige Ausgangssignale parallel auslesbar und korreliert auswertbar sind.
Das erfindungsgemäße konfokale Mikroskop für die Lumineszenzmikroskopie umfasst eine Lichtquelle für Anregungslicht, eine Abbildungsoptik zum Fokussieren des Anregungslichts in ein Messobjekt und zum Fokussieren des aus dem Messobjekt ausgesandten Lumineszenzlichts in eine Lichterfassungseinheit, wobei diese Lichterfassungseinheit wie eben beschrieben ausgebildet ist.
Auch das erfindungsgemäße Verfahren zum Erfassen von Lumineszenzlicht unter- scheidet sich von den bisher bekannten Verfahren dadurch, dass jeweils ausgewählte Bereiche des spektral zerlegten Lumineszenzlichts durch mehrere unabhängig voneinander arbeitende, entlang der Spektralverteilung angeordnete Detektorelemente detektiert werden, wobei die Ausgangssignale der einzelnen Detektorele- mente parallel ausgelesen und insbesondere zeitlich korreliert ausgewertet werden.
Erfindungsgemäß wird also primär ein detailliertes Spektrum mit einer Auflösung detektiert, die duch die Anzahl der einzelnen Detektorelemente gegeben ist.
Das parallele Auslesen der Ausgangssignale aller Detektorelemente ermöglicht eine Einordnung des Lumineszenzlichts in unterschiedliche Spektralbereiche innerhalb kürzester Zeit, was für die in der konfokalen Mikroskopie üblichen Scan-Ge- schwindigkeiten unabdingbar ist. Die durch das parallele Auslesen der Ausgangssignale mögliche gleichzeitige Erfassung der verschiedenen Spektralbänder verhindert auch Messungenauigkeiten, die sich durch die Wellenlängenänderung des emittierten Lichts von Fluoreszenzfarbstoffen ergibt, wenn diese sich in veränderlichen Umgebungen befinden, bespielsweise hinsichtlich des pH-Werts. Eine Blen- de im Strahlengang nach dem dispersiven Element der Lichterfassungseinheit entfällt ganz; folgerichtig kann auch auf eine Präzisionsmimik zur Bewegung der Blende im spektral zerlegten Lumineszenzlicht verzichtet werden.
Gleichzeitig ergeben sich gegenüber dem Stand der Technik, wie er insbesondere in der US 5 886 784 beschrieben ist, weitere erhebliche Vorteile, da, wie nach einer besonders bevorzugten Verfahrensvariante, die Detektorelemente fallweise beliebig zu jeweils einem Detektionskanal zusammengefasst und deren Ausgangssignale jeweils als einheitliches Signal ausgewertet werden können. Nachdem die Auswertung der Ausgangssignale zweckmäßig mit einer elektronischen Datenver- arbeitungsanlage erfolgt, ergibt sich so ein Detektor, dessen Auflösung softwaregesteuert konfigurierbar ist, und zwar ohne jede Bewegung oder Umschaltung der einzelnen Detektorelemente. Die erfindungsgemäße Lichterfassungseinheit und das mit dieser ausgerüstete konfokale Mikroskop können also in kürzester Zeit hinsichtlich ihrer spektralen Auflösung und der Anzahl der Kanäle umkonfiguriert werden.
Nicht zuletzt eröffnet sich dadurch auch die Möglichkeit, nicht nur zusammenhängende Teile des Spektrums, sondern beliebige, an unterschiedlichen Stellen des Spektrums sitzende Detektor-Elemente zu einer einheitlich auszuwertenden Grup- pe und somit zu einem Detektionskanal zusammenzufassen, der beispielsweise genau auf das Emissionsspektrum eines bestimmten Lumimeszenzeffektes abgestimmt ist.
Der erfindungsgemäß aus einer Mehrzahl von Detektorelementen zusammengesetzte Detektor ist vorzugsweise ein Multielement-Detektor, insbesondere ein Zeilendetektor, mit einer Mehrzahl von nebeneinander angeordneten Detektions- fenstern und parallel auszulesenden Signalausgängen. Solch ein Detektor kann beispielsweise ein Multianoden-Photomultiplier sein, aber auch Photodiodenzeilen, Avalanche-Photodioden-Arrays und dergleichen können je nach Anwendung in Frage kommen.
Das in der Lichterfassungseinheit verwendete dispersive Element kann ein Reflek- tions-Beugungsgitter, ein Transmissions-Beugungsgitter oder auch ein Disper- sionsprisma sein. Das Transmissions-Beugungsgitter hat dabei die höchste Effizienz bei reproduzierbaren Randbedingungen.
Das Lumineszenzlicht ist mitunter nur sehr schwach, so dass es vorteilhaft sein kann, wenn dem Detektor der Lichterfassungseinheit ein Bildverstärker zugeordnet wird.
Um die Totbereiche zwischen den einzelnen Detektorelementen zu eliminieren, können den einzelnen Detektorelementen Linsen- oder Prismenelemente vorgeschaltet sein. Ein Multielement-Detektor kann beispielsweise mit einem Mikro- linsen-Array abgedeckt werden, das das Auftreffen des spektral zerlegten Lumineszenzlichts auf die Zentren der Detektorelemente optimiert und Totbereiche zwischen den einzelnen Fenstern des Multielement-Detektors verhindert.
Das konfokale Mikroskop nach der Erfindung kann durch die eben beschriebenen Weiterbildungen der erfindungsgemäßen Lichterfassungseinheit ebenso vorteilhaft ausgestaltet werden.
Eine besonders bevorzugte weitere Ausgestaltung des erfindungsgemäßen konfokalen Mikroskops zeichnet sich dadurch aus, dass das dispersive Element der Lichterfassungseinheit auch "rückwärts" benutzt werden kann und infolgedessen auch das Anregungslicht über das dispersive Element der Lichterfassungseinheit in die Abbildungsoptik einkoppelbar ist. Eine solche Einkopplung des Anregungslichts über das dispersive Element ist selbstverständlich unabhängig davon, ob nur ein herkömmlicher Detektor oder ein erfindungsgemäß aus mehreren Detektorelementen zusammengesetzter Detektor verwendet wird. Da die Anregung insbesondere von fluoreszierenden Farbstoffen generell mit einer Wellenlänge erfolgt, die kleiner als die Emissionswellenlängen ist, und zwar typischerweise 10 bis 50 nm, kann die das Anregungslicht aussendende Lichtquelle neben dem zugehörigen Photodetektor angeordnet oder dort eingekoppelt werden, da der Anregungslicht- Wellenläηgenbereich durch die spektrale Zerlegung ebenfalls neben dem zu detek- tierenden Wellenlängenbereich liegt. Je nach Anwendungsfall kann es auch vorteilhaft sein, die Lichtquelle zwischen den Detektorelementen anzuordnen oder dort einzuspiegeln.
Durch diese bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung spart man sich den bei konfokalen Mikroskopen bislang obligatorischen Strahlteiler, was vor allem dann enorme Vorteile bringt, wenn mehrere Fluoreszenzfarbstoffe mit relativ weit auseinanderliegenden Emissionsspektren verwendet werden: Die Absorptionsspektren der Farbstoffe sind in der Regel nicht breiter als die Emissionsspektren, so dass für mehrfach markierte Präparate mehrere getrennte Wellenlängebereiche vom Anregungslicht überdeckt werden müssen, was meist nur durch mehrere Anregungslichtquellen erzielbar ist. Bislang mussten in diesem Fall sogar mehrere Anregungsstrahlteiler im konfokalen Mikroskop vorhanden sein, was durch das Ein- koppeln der Anregungslichtwellenlängen über das dispersive Element vollständig obsolet wird.
Drei Ausführungsbeispiele der Erfindung werden im Folgenden anhand der beigefügten Zeichnungen näher beschrieben und erläutert. Es zeigen: '
Figur 1 eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Lichterfassungseinheit;
Figur 2 eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen konfokalen Mikroskops; Figur 3 eine schematische Darstellung einer anders ausgebildeten erfindungsgemäßen Lichterfassungseinheit.
Figur 1 zeigt ein Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Lichterfassungs- einheit für ein konfokales Mikroskop in einer schematischen Darstellung der wesentlichen Elemente: Ein Strahl aus Lumineszenzlicht 2 vom Objekt wird in einem als Prisma ausgebildeten dispersiven Element 3 in ein Spektrum 4 zerlegt und auf ein Feld von zeilenartig nebeneinander angeordneten Detektorelementen 5 eines als Multianoden-Photomultipliers ausgebildeten Detektors 6 abgebildet. Die Anoden der einzelnen Detektorelemente 5 werden über einen parallel auslesbaren Anschluss 7 mit einer (hier nicht sichtbaren) analogen Elektronikeinheit verbunden. Diese Elektronikeinheit wird von einem Computer 8 angesteuert. Mittels dieses Computers 8 ist es möglich, einzelne oder Teilfelder der Detektorelemente 5 zu gemeinsam auszuwertenden Gruppen, also zu Detektorkanälen zusammen- zufassen. Werden diese zusammengefassten Gruppen von Detektorelementen 5 den zu erwartenden Emissionsspektren des Lumineszenzlichts 2 angepasst, ergibt sich neben der großen Flexibilität in der Detektorkonfiguration und Auflösung auch eine optimale Lichtausbeute des Lumineszenzlichts 2. Der Ausgang der analogen Elektronikeinheit liefert dann mehrere zusammengefasste Detektorsignale, die im Computer 8 weiterverarbeitet werden.
Figur 2 zeigt ebenfalls in schematischer Darstellung eine wie in Figur 1 aufgebaute Lichterfassungseinheit 1 als Bestandteil eines konfokalen Mikroskops. Das aus der als Laser ausgebildeten Lichtquelle 9 ausgesandte Anregungslicht 10 wird über eine Aufweitungsoptik 11 , eine erste Lochblende 12 und einen Strahlteiler 13 über eine Abbildungsoptik 14 auf einen Fokus in einer Objektebene 15 fokussiert, wo er in einem (hier nicht dargestellten) Objekt eine Photo-Lumineszenz anregt. Das hierbei ausgesandte Lumineszenzlicht 2 wird über eine Abbildungsoptik 14 nach Spiegelung am Strahlteiler 13 auf die Lichterfassungseinheit 1 abgebildet, wo es eine konfokale Lochblende 16 und eine Strahlformungsoptik 17 passiert, um danach im dispersiven Element 3 in ein von den Detektorelementen 5 des Detektors 6 zu erfassendes Spektrum 4 zerlegt wird. Das Auslesen und Auswerten der Ausgangssignale der einzelnen Detektorelemente 5 erfolgt wie anhand Figur 1 beschrieben. Figur 3 zeigt wiederum eine schematische Darstellung einer Lichterfassungseinheit 1 , wobei sich diese von der in Figur 1 dargestellten Lichterfassungseinheit 1 dadurch unterscheidet, dass neben dem Detektor 6 die Lichtquelle 9 für Anregungslicht 10, also der Laser, des konfokalen Mikroskops angeordnet ist. Das dispersive Element 3 wird also "vorwärts" durch das Anregungslicht 10 und "rückwärts" durch das Lumineszenzlicht 2 durchlaufen. Zwischen dem dispersiven Element 3 und der Objektebene 15 des (hier nicht dargestellten) konfokalen Mikroskops durchlaufen das Anregungslicht 10 und das Lumineszenzlicht 2 identische Lichtwege; sie besitzen lediglich unterschiedliche Wellenlängen (durch die Frequenzverschiebung des Lumineszenzeffekts, insbesondere Fluoreszenzeffekts), so dass das Anregungslicht 10 eine andere Farbe und somit einen anderen Ort im Spektrum 4 einnimmt, als das Lumineszenzlicht 2. Es ist offensichtlich, dass durch diese Ausbildung der Lichterfassungseinheit 1 eines konfokalen Mikroskops der Strahlteiler 13 des Mikroskops ersatzlos entfallen kann.
Bezugszeichenliste
Lichterfassungseinheit Lumineszenzlicht dispersives Element Spektrum Detektorelemente Detektor Anschluss Computer Lichtquelle Anregungslicht Aufweitungsoptik Lochblende Strahlteiler Objektiv Objektebene konfokale Lochblende Strahlformungsoptik

Claims

Pate nta ns p rü che
1. Lichterfassungseinheit für die Lumineszenzmikroskopie mit einem konfokalen Mikroskop, umfassend ein dispersives Element (3) zum spektralen Zerlegen des von einem Messobjekt ausgesandten Lumineszenzlichts (2) in ein Spektrum (4) sowie einen Detektor (6) zum Detektieren wenigstens eines Teiles des spektral zerlegten Lumineszenzlichts (2), dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (6) aus einer Mehrzahl von unabhängig voneinander arbeitenden, entlang des Spektrums (4) angeordneten, jeweils einen ausgewählten Bereich des Spektrums (4) erfassenden Detektorelementen (5) besteht, deren jeweilige Ausgangssignale parallel auslesbar und korreliert auswertbar sind.
2. Lichterfassungseinheit nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (6) ein Multielement-Detektor, insbesondere Zeilendetektor, mit einer Mehrzahl von nebeneinander angeordneten Detektionsfenstern und ei- nem parallel auslesbaren Anschluss (7) für die Ausgangssignale ist.
3. Lichterfassungseinheit nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (6) ein Multianoden-Photomultiplier ist.
4. Lichterfassungseinheit nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen Detektorelemente (5) je nach Anwendungsfall gruppenweise zusammengefasst auswertbar sind.
5. Lichterfassungseinheit nach einem der Ansprüche 1 bis4, dadurch gekennzeichnet, dass das dispersive Element (3) ein Reflektions-Beugungsgitter ist.
6. Lichterfassungseinheit nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das dispersive Element (3) ein Transmissions-Beugungsgitter ist.
7. Lichterfassungseinheit nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das dispersive Element (3) ein Dispersionsprisma ist.
8. Lichterfassungseinheit nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass dem Detektor (6) ein Bildverstärker zugeordnet ist.
9. Lichterfassungseinheit nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass den einzelnen Detektorelementen (5) Linsen- oder Prismenelemente vorgeschaltet sind.
10. Konfokales Mikroskop für die Lumineszenzmikroskopie, mit einer Lichtquelle (9) für Anregungslicht (10), einer Abbildungsoptik (14) zum Fokussieren des Anregungslichtes (10) in ein Messobjekt und zum Fokussieren des aus dem Messobjekt ausgesandten Lumineszenzlichtes (2) in eine Lichterfassungseinheit (1), welche ein dispersives Element (3) zum spektralen Zerlegen des Lumineszenzlichts (2) in ein Spektrum (4) sowie einen Detektor (6) zum Detektieren wenigstens eines Teils des spektral zerlegten Lumineszenzlichts (2) enthält, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (6) aus einer Mehrzahl von unabhängig voneinander arbeitenden, entlang des Spektrums (4) angeordneten, jeweils einen ausgewählten Bereich des Spektrums (4) erfassenden Detektorelementen (5) besteht, deren jeweilige Ausgangssignale parallel auslesbar und korreliert auswertbar sind.
11. Konfokales Mikroskop nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht (10) über das dispersive Element (3) der Lichterfas- sungseinheit (1 ) in die Abbildungsoptik (14) einkoppelbar ist.
12. Konfokales Mikroskop nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle (9) für das Anregungslicht (10) neben oder zwischen den De- tektorelementen (5) der Lichterfassungseinheit (1 ) angeordnet ist.
13. Konfokales Mikroskop nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (6) der Lichterfassungseinheit (1) ein Multielement-Detektor, insbesondere Zeilendetektor, mit einer Mehrzahl von nebeneinander angeordneten Detektionsfenstern und einem parallel auslesbaren Anschluss (7) für die Ausgangssignale ist.
14. Konfokales Mikroskop nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (6) der Lichterfassungseinheit (1 ) ein Multianoden-Photomulti- plier ist.
15. Konfokales Mikroskop nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen Detektorelemente (5) der Lichterfassungseinheit (1 ) je nach Anwendungsfall gruppenweise zusammengefasst auswertbar sind.
16. Konfokales Mikroskop nach einem der Ansprüche 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das dispersive Element (3) der Lichterfassungseinheit (1) ein Reflektions- Beugungsgitter ist.
17. Konfokales Mikroskop nach einem der Ansprüche 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das dispersive Element (3) der Lichterfassungseinheit (1) ein Transmissions- Beugungsgitter ist.
18. Konfokales Mikroskop nach einem der Ansprüche 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das dispersive Element (3) der Lichterfassungseinheit (1) ein Dispersions- prisma ist.
19. Konfokales Mikroskop nach einem der Ansprüche 10 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass dem Detektor (6) der Lichterfassungseinheit (1) ein Bildverstärker zugeordnet ist.
20. Konfokales Mikroskop nach einem der Ansprüche 10 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass den einzelnen Detektorelementen (5) der Lichterfassungseinheit (1 ) Linsen- oder Prismenelemente vorgeschaltet sind.
21. Verfahren zum Erfassen von Lumineszenzlicht eines in einem konfokalen Mikroskop zu vermessenden Messobjekts, wobei das Anregungslicht einer Lichtquelle in das Messobjekt fokussiert und das aus dem Messobjekt ausgesandte Lumineszenzlicht konfokal auf ein dispersives Element geleitet wird, durch welches das Lumineszenzlicht in ein Spektrum zerlegt wird, dadurch gekennzeichnet, dass jeweils ausgewählte Bereiche des Spektrums durch mehrere unabhängig voneinander arbeitende, entlang der Spektralverteilung angeordnete Detektorele- mente detektiert werden, wobei die Ausgangssignale der einzelnen Detektorelemente parallel ausgelesen und korreliert ausgewertet werden.
22. Verfahren nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, dass fallweise beliebige Detektorelemente zu jeweils einem Detektionskanal zu- sammengefasst und deren Ausgangssignale jeweils als einheitliches Signal ausgewertet werden.
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