DE20022966U1

DE20022966U1 - Hochdurchsatzscreening-Vorrichtung zur optischen Erfassung von Proben

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Publication number: DE20022966U1
Application number: DE20022966U
Authority: DE
Original assignee: Evotec OAI AG
Current assignee: Evotec OAI AG
Priority date: 1999-12-02
Filing date: 2000-12-02
Publication date: 2002-08-22
Anticipated expiration: 2010-12-03
Also published as: WO2001040769A3; WO2001040769A2; AU2839601A

Description

Hi-bu 021309de

Hochdurchsatzscreeninq-Vorrichtunq zur optischen Erfassung

von Proben

Die Erfindung betrifft Hochdurchsatzscreening-Vorrichtung zur optischen Erfassung von Proben.

Bei einer Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie-(FCS-)Messung wird die Änderung der Anzahl von Molekülen in einem Messvolumen untersucht. Diese sogenannten Anzahlvariationen sind besonders gut detektierbar, wenn die mittlere Zahl der Moleküle im Messvolumen klein ist (etwa 1). Daher ist es erforderlich, ein möglichst kleines Messvolumen (Durchmesser kleiner als 1 pm) in der Probe, etwa einer Lösung von Reagenzien, zu betrachten.

Diese Aufgabe kann ohne Störung der Probe ("berührungslos") durchgeführt werden, indem ein Laserstrahl von einer geeigneten Optik in die Probe hinein fokussiert wird. Mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte ("gelabelte") Moleküle werden angeregt und leuchten auf, wenn sie sich durch den Fokus bewegen. Aus der gemessenen Helligkeit bzw. aus den Helligkeitsvariationen können die Diffusionseigenschaften und Konzentration der gelabelten Moleküle bestimmt werden.

Das Messvolumen wird aus dem Produkt von Intensitätsverteilung des An-0 regungslichtes und dem Gesichtsfeld des Detektors bestimmt. Das Messvolumen wird minimal, wenn die Maxima beider Verteilungen zur Deckung kommen. Sind die Werte der Verteilungen außerhalb des Fokusbereiches sehr klein, wird gleichzeitig sichergestellt, dass kein Fluoreszenzlicht detektiert wird, das nicht aus dem Fokus stammt. Um kleinstmögliche Messvolumina zu erhalten und um einen möglichst großen Anteil des von dort emittierten Fluoreszenzlichtes detektieren zu können, sollte die numerische Apertur der Fokus-

sieroptik möglichst groß sein. Ferner sollten der anregenden Laser in der TEMoo-Grundmode strahlen und der Detektor quasi punktförmig sein. Dazu wird sein Gesichtsfeld gegebenenfalls durch eine kleine Blende ("Pinhole") beschränkt.

Ein relativ einfaches Schema, um dieses zu ermöglichen, wird mit einer konfokalen Optik realisiert: Ein Objektiv fokussiert das anregende Laserlicht und sammelt ebenfalls das Fluoreszenzlicht, um es auf den Detektor abzubilden. Zwischen Objektiv und Detektor trennt ein dichroitischer Strahlteiler das Anregungs- und Fluoreszenzlicht.

Auf Grund der breiten Verteilung der Wellenlänge in einer Fluoreszenzanwendung hat die fokussierende Optik im allgemeinen unterschiedliche Brennweiten für Anregungs- und Fluoreszenzlicht. Die daraus resultierende chromatische Fokusverschiebung kann durch eine Justage von Pinhole oder eventuell davor liegender Zusatzoptik kompensiert werden. Ein entsprechendes Aufbauschema wird in Fig. 1 dargestellt.

Gemäß Fig. 1 wird von einer Strahlungserzeugungsvorrichtung in Form eines 0 Lasers 10 eine erste magnetische Anregungsstrahlung erzeugt, die über eine Strahlteilervorrichtung 12 in Form eines dichroitischen Spiegels zu einer Fokussieroptik 14 weitergeleitet wird. Durch die Fokussieroptik 14 wird die Anregungsstrahlung auf einen Fokus 16 fokussiert. Dieser Fokus 16 definiert das Messvolumen der Probe, die zu untersuchen ist. Die in dieser Probe auf 5 Grund der Anregungsstrahlung erzeugte zweite magnetische Emissionsstrahlung, die von der Anregungsstrahlung verschieden ist, wird über die Fokussieroptik 14 zu der Strahlteilervorrichtung 12 geleitet. Die Emissionsstrahlung passiert die Strahlteilervorrichtung 12 und wird über eine Linse 18 und eine Blende 20 auf einen Detektor 22 gerichtet.
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Ein gewisser Nachteil des angegebenen Aufbauschemas ist darin zu sehen, die Gesichtsfeldblende des Detektors korrekt justieren zu müssen. Vermeidbar ist

dies, wenn die fokussierende Optik keine chromatischen Fokusverschiebungen aufweist, bzw. diese deutlich kleiner als die Länge des Fokus (Rayleighlänge) sind. Wie in dem Beispiel nach Fig. 2 gezeigt ist, können dann Anregungs- und Fluoreszenzlicht durch genau eine Gesichtsfeldblende begrenzt werden. Diese braucht in Bezug auf die Fokussieroptik nicht mehr nachjustiert werden.

Aus US-A-5 120 953 ist ein konfokales Scanning-Mikroskop bekannt, bei dem die Strahlung zwischen der Strahlungserzeugungsvorrichtung und der Fokussieroptik sowie zwischen der Fokussieroptik und der Detektorvorrichtung über einzelne oder mehrere Fasern übertragen wird. Die Strahlteilervorrichtung ist als Faserkoppler ausgebildet. Ein gewisser Nachteil von Faserkopplern ist, dass sie keine besonders gute Separation zwischen dem Sende- und dem Empfangslicht erlauben. Insbesondere für hochempfindliche Fluoreszenzanwendungen sind sie denkbar ungünstig. Für Streulichtanalysen wird sich der relativ hohe Streulichthintergrund bei Faserkopplern zumeist störend auswirken. Darüber hinaus lässt sich das bekannte konfokale Scanning-Mikroskop nicht zur parallelen Untersuchung mehrerer Probenmessvolumina anhand von Einzelphotonendetektionen einsetzen.

0 Des Weiteren ist aus EP-A-O 523 159 ein konfokales Mikroskop bekannt, bei dem konfokale Faserbündel für photografische Zwecke eingesetzt werden. Die Art der Einkopplung des Sendelichts ist jedoch für den Betrieb mit Single-Mode-Wellenleitern, wie sie für Korrelationsspektrographische Messungen im allgemeinen benutzt werden, denkbar ungünstig, da nahezu kein Anregungs-5 licht in die Probe eingekoppelt werden könnte.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, eine Vorrichtung zur optischen Erfassung einer Vielzahl von Probenmessvolumina für Hochdurchsatzscreening-Anwendungen zu schaffen.
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Zur Lösung dieser Aufgabe wird mit der Erfindung eine Vorrichtung vorgeschlagen, die versehen ist mit

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mindestens einer Strahlungserzeugungsvorrichtung für eine erste elektromagnetische Strahlung,

einer Fokussieroptik mit einem Fokussierobjektiv zur Fokussierung der ersten elektromagnetischen Strahlung innerhalb eines Fokussierbereichs, - mindestens einer Strahlteilervorrichtung, die zwischen der mindestens einen Strahlungserzeugungsvorrichtung und der Fokussieroptik angeordnet ist und die die erste elektromagnetische Strahlung zur Fokussieroptik weiterleitet,
mindestens einer Einzelphotonen-Detektorvorrichtung, die außerhalb des sich von der mindestens einen Strahlungserzeugungsvorrichtung über die mindestens eine Strahlteilervorrichtung bis zur Fokussieroptik erstreckenden Strahlenganges angeordnet ist und vom Fokussierbereich des Fokussierobjektivs ausgehende sowie von der mindestens einen Strahlteilervorrichtung separierte zweite elektromagnetische Strahlung empfängt, wobei

zwischen der mindestens einen Strahlungserzeugungsvorrichtung und der mindestens einen Strahlteilervorrichtung eine Vielzahl von ersten optischen Fasern angeordnet ist, aus deren der mindestens einen Strahlteilervorrichtung zugewandten Enden von der mindestens einen Strahlungs-

0 erzeugungsvorrichtung in die dieser zugewandte Enden der ersten optischen Fasern eingespeiste erste elektromagnetische Strahlung austritt,
zwischen der mindestens einen Strahlteilervorrichtung und der Fokussieroptik eine Vielzahl von zweiten optischen Fasern angeordnet ist,
die der mindestens einen Strahlteilervorrichtung zugewandten Enden der ersten optischen Fasern auf die der mindestens einen Strahlteilervorrichtung zugewandten Enden der zweiten optischen Fasern optisch abgebildet sind,

aus den der Fokussieroptik zugewandten Enden der zweiten optischen Fasern austretende erste elektromagnetische Strahlung durch das Fokus-

0 sierobjektiv in eine Vielzahl von Foki innerhalb des Fokussierbereichs fokussiert ist und

die der mindestens einen Strahlteilervorrichtung zugewandten Enden der zweiten optischen Fasern zur Detektion von Einzelphotonen in der aus diesen Enden der zweiten optischen Fasern austretenden zweiten elektromagnetischen Strahlung auf getrennte Detektorbereiche der mindestens einen Detektorvorrichtung optisch abgebildet sind.

In den Unteransprüchen sind die Merkmale einzelner Ausführungsbeispiele der Erfindung angegeben.

Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung werden zur Übertragung der Anregungsstrahlung (erste elektromagnetische Strahlung) und zur Übertragung der Detektionsstrahlung (zweite elektromagnetische Strahlung) jeweils mehrere optische Fasern verwendet. Dabei ist eine erste Vielzahl von optischen Fasern zwischen der Fokussieroptik und der Strahlteilervorrichtung und eine zweite Vielzahl von optischen Fasern zwischen der Strahlteilervorrichtung und der Detektorvorrichtung angeordnet. Statt einer Strahlteilervorrichtung und einer Detektorvorrichtung können erfindungsgemäß auch mehrere Strahlteiler- und mehrere Detektorvorrichtung eingesetzt werden. Die Einspeisung der ersten elektromagnetischen Strahlung (Anregungsstrahlung) in die Strahlteilervor-0 richtung erfolgt zweckmäßigerweise wiederum durch eine Vielzahl von dritten optischen Fasern. Dies ist allerdings nicht zwingend erforderlich. Als Detektorvorrichtungen sind mehrere Varianten möglich. So ist es beispielsweise denkbar, eine Detektorvorrichtung mit unterschiedlichen empfindlichen Bereichen oder eine mehrere Einzeldetektoren umfassende Detektorvorrichtung vorzusehen. Schließlich kann auch eine Detektorvorrichtung Verwendung finden, die sämtlichen Foki zwecks Messung der Gesamtintensität zugeordnet ist.

Nach der Erfindung wird also die Anregungsstrahlung über ein erstes Faserbündel zur Strahlteilervorrichtung geleitet. Dort trifft sie beispielsweise über 0 eine Linse auf den eigentlichen Strahlteiler, bei dem es sich vorzugsweise um einen dichroitischen Spiegel handelt, auf. Die der Strahlteilervorrichtung zugewandten Enden dieses ersten Faserbündels sind wie einzelne Punktlichtquellen

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zu betrachten. Die aus diesen Punktlichtquellen austretende Strahlung wird sozusagen parallel und gleichzeitig von der Strahlteilervorrichtung zu den dieser zugewandten Enden eines zweiten Faserbündels weitergeleitet, indem diese Strahlung in einer der Anzahl der Fasern des zweiten Faserbündels gleichen Anzahl von Foki fokussiert wird. Mit anderen Worten werden also die der Strahlteilervorrichtung zugewandten Enden der Fasern des ersten Faserbündels auf die der Strahlteilervorrichtung zugewandten Enden der Fasern des zweiten Faserbündels abgebildet.

Anschließend wird die so in das zweite Faserbündel eingekoppelte Anregungsstrahlung bis zur Fokussieroptik geleitet, um dort in eine Vielzahl von Foki fokussiert zu werden. Auch hier gilt wiederum, dass die der Fokussieroptik zugewandten Enden der Fasern des zweiten Faserbündels wie einzelne Punktlichtquellen zu betrachten sind. Die Fokussieroptik fokussiert das Licht jeder dieser punktförmigen Lichtquellen in einzelne Foki. Diese Foki definieren die Probenmessvolumina.

Durch das Anregungslicht werden in den Messvolumina Emissionsstrahlungen erzeugt, sofern sich in diesen Messvolumina entsprechend präparierte bzw. 0 entsprechend beschaffene Substanzen (beispielsweise Moleküle, Analyten, Zellen, Zellbruchstücke o.dgl.) befinden. Das Emissionslicht, bei dem es sich um einzelne wenige Photonen handeln kann, wird über die Fokussieroptik in die den einzelnen Probenmessvolumina zugeordneten Fasern des zweiten Faserbündels eingespeist. Durch die Strahlteilervorrichtung kommt es zu einer 5 Separation der optischen Pfade von Anregungs- und Emissionsstrahlung. Die die Strahlteilervorrichtung passierende Anregungsstrahlung trifft auf die lichtempfindlichen Detektionsbereiche einer Detektorvorrichtung auf, bei der es sich beispielsweise um einen Photomultiplayer handelt, der hochzeitaufgelöste Messsignale erzeugt. Auf Grund dieser hohen Zeitauflösung im Submilli- oder 0 Submikro- bzw. Nanosekundenbereich ist es möglich, in den Messvolumina einzelne Photonen zu detektieren. Durch entsprechende Korrelation der Mess-

signale können dann fluoreszenzspektographische Untersuchungen der Probenmessvolumina durchgeführt werden.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung hat den Vorteil, dass Hochdurchsatzscreening-Anwendungen durchgeführt werden können. Diese Hochdurchsatzscreening-Anwendungen sind auf Grund der Parallelisierung möglich, indem nämlich eine Vielzahl von Foki und damit Probenmessvolumina gleichzeitig untersucht werden können. Der Aufbau der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist denkbar einfach, was durch die Verwendung von optisch aufeinander abgebildete Faserbündel ermöglicht wird. Diese Faserbündel sorgen ferner dafür, dass die optischen Verluste gering sind, so dass mittels Anregungsstrahlung hoher Intensität in den Probenmessvolumina Emissionsstrahlung erzeugt werden kann, die auf die Erzeugung von wenigen einzelnen Photonen zurückzuführen ist. Diese äußerst schwache Emissionsstrahlung kann dennoch durch die Detektorvorrichtung detektiert werden, da nämlich auch diesbezüglich gilt, dass die optischen Verluste durch die Verwendung von Faserbündeln gering ist.

Die Erfindung und insbesondere die Anordnung der Fasern zeichnet sich gegenüber dem Stand der Technik durch folgende vorteilhafte Merkmale aus:

1. Von der Strahlungserzeugungsvorrichtung - wie z.B. einem oder mehreren Lasern - ausgehend ist es durch eine Vielzahl von ersten optischen Fasern möglich, die erste elektromagnetische Strahlung effektiv in die

5 zweiten optischen Fasern überzukoppeln.

2. Durch Wahl der Abstände zwischen den der Fokussieroptik zugewandten Enden der zweiten Fasern kann die relative Lage der Foki innerhalb der Proben optimal auf den jeweiligen Anwendungszweck abgestimmt wer-

0 den. So kann es insbesondere wünschenswert sein, viele Foki innerhalb

einer in einer Aufnahmevertiefung einer handelsüblichen Mikro-/ Nanotiterplatte befindlichen Probe anzuordnen. Hierdurch wird simultan

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mit nur einem geringen Zeitaufwand ein statistisch relevantes Messergebnis für diese Probe erhältlich. Dies ist insbesondere für Hochdurchsatzscreening-Anwendungen vorteilhaft. Ein Übersprechen der zweiten elektromagnetischen Strahlung aus einzelnen Foki in diesen nicht zugeordneten Faserkanälen kann somit verhindert oder zumindest minimiert werden.

3. Es ist oftmals wünschenswert, als zweite elektromagnetische Strahlung eine gegenüber der ersten Strahlung wellenlängenverschobene Strahlung wie Fluoreszenz zu detektieren. Die erfindungsgemäße Anordnung bietet auch in diesem Fall Vorteile dahingehend, daß an die jeweilige Anwendung angepasste wellenlängen-selektive Strahlteilerelemente, insbesondere dichroitische Spiegel, eingesetzt werden können. Diese erlauben ein effektives Überkoppeln sowohl der ersten als auch der zweiten elektromagnetischen Strahlung. Die üblicherweise im Stand der Technik beschriebenen faseroptischen Aufbauten verwenden nur schwach wellenlängenselektive Faserkoppler, die jedoch den Nachteil haben, daß sie entweder hohe Verluste in der Anregungs- oder Detektionsstrahlung oder dem Produkt aus beidem aufweisen. In einem einkanaligen Faseraufbau

0 ist dies noch tolerierbar, da die Verluste so gewählt werden können, daß

sie laserseitig entstehen (z.B. durch 90/10-Koppler) und durch eine hohe Laserleistung kompensiert werden können. Bei einem Mehrkanalaufbau wird jedoch die Laserleistung auf viele Kanäle verteilt und ein derartiges Vorgehen ist nicht mehr praktikabel.
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4. Der Einsatz von getrennten ersten und zweiten Fasern erlaubt die Möglichkeit, polarisationserhaltende Fasern einzusetzen. Polarisationserhaltende X-förmige Faserkoppler, die direkt mit den Fasern verbunden sind, sind, falls überhaupt, nur schwer herstellbar. Im Hochdurchsatzscreening

0 ist es jedoch oftmals wünschenswert, kostengünstig und effizient Polarisationsmessungen wegen ihres hohen Informationsgehaltes durchzuführen, welches durch den erfindungsgemäßen Aufbau unter Verwendung

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eines detektionsseitigen polarisationsselektiven Strahlteilerelementes ermöglicht wird.

5. Insbesondere ist die Verwendung von bündeiförmig angeordneten ersten und zweiten Fasern vorteilhaft. Hierdurch reduziert sich im Vergleich zur Verwendung jeweils einer Vielzahl einzelner Fasern der Justageaufwand erheblich, welches für die Herstellung und die spätere Verwendung im Hochdurchsatzscreening (HTS) vorteilhaft ist.

Insbesondere beim Einsatz von Fokussierobjektiven hoher numerischer Apertur ist die Forderung, dass chromatische Fehler deutlich kleiner als die Fokusgröße sind bzw. bleiben, nur schwer realisierbar. Das gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung zur Verwendung kommende Fokussierobjektiv weist zweckmäßigerweise eine numerische Apertur von größer oder gleich 0,6, vorzugsweise 0,9, insbesondere 1,2, auf. Insbesondere die Kombination eines solchen Objektivs mit einer achromatischen Linse als Kolimator erfüllt die oben angegebenen Bedingungen betreffend den chromatischen Fehler.

In vorteilhafter Weiterbildung der Erfindung ist vorgesehen, dass die Fokus-0 sieroptik optische Elemente aufweist, die im wesentlichen refraktiv arbeiten.

Alternativen zu refraktiv arbeitenden optischen Elementen sind z.B. ein reflektives Spiegelobjektiv oder ein difraktives Wölbungsobjektiv.

Wie bereits oben kurz erwähnt, ist es zweckmäßig, wenn zwischen der mindestens einen Strahlteilervorrichtung und der mindestens einen Detektorvorrichtung eine Vielzahl von dritten Fasern angeordnet ist, wobei die der mindestens einen Strahlteilervorrichtung zugewandten Enden der zweiten Fasern auf die der mindestens einen Strahlteilervorrichtung zugewandten Enden der drit-0 ten Fasern optisch abgebildet sind und die der mindestens einen Strahlteilervorrichtung abgewandten Enden der dritten Fasern auf die mindestens eine Detektorvorrichtung abgebildet sind.

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Bei einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass die Enden der Fasern zur Erzeugung eines hohen Grades an optischer Aus- und Einkopplung der ersten und zweiten elektromagnetischen Strahlung entspiegelte Stirnflächen aufweisen.

Mögliche Ausgestaltungen der Fasern sind, dass die Stirnflächen der Fasern im wesentlichen rechtwinklig zur Längsachse verlaufen, oder dass standardmäßig angeschliffene Fasern verwendet werden.

Zweckmäßigerweise separiert die mindestens eine Strahlteilervorrichtung die erste und zweite elektromagnetische Strahlung in Abhängigkeit von ihrer Polarisation, ihrer Ausbreitungsrichtung, ihrer Wellenlänge und/oder ihrer Intensität.

Die Aufteilung der Detektionsstrahlung auf mehrere Detektoren oder Detektionsbereiche der mindestens einen Detektorvorrichtung lässt sich insbesondere dadurch realisieren, dass zwischen der Strahlteilervorrichtung und der Detektorvorrichtung eine weitere Strahlteilervorrichtung angeordnet ist, die auf die Detektorvorrichtung auftreffende elektromagnetische Strahlung zu 0 unterschiedlichen Detektionsbereichen der Detektorvorrichtung weiterleitet.

Anstelle einer Strahlungserzeugungsvorrichtung können zweckmäßigerweise auch mehrere Strahlungserzeugungsvorrichtungen vorgesehen werden, deren elektromagnetische Strahlung in einzelne oder in mehrere unterschiedliche erste optische Fasern einkoppelbar ist.

Die mindestens eine Strahlteilervorrichtung weist vorzugsweise mehrere Strahlteilereinheiten auf, die einzelnen oder mehreren unterschiedlichen ersten optischen Fasern zugeordnet sind.
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Um die Probenmessvolumina "scannen" zu können, d.h. um die Foki (Messvolumina) innerhalb einer Probe "verfahren" zu können, ist es zweckmä-

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ßig, eine Bewegungsvorrichtung vorzusehen, mittels derer die der Fokussieroptik zugewandten Enden der zweiten Fasern in einer quer zu den Längsachsen der Fasern verlaufenden Ebene und/oder in Längsrichtung der Fasern einzeln und/oder gemeinsam bewegbar sind und/oder mittels derer die der Fokussieroptik zugewandten Enden der zweiten Fasern kippbar sind oder drehbar sind, und zwar vorzugsweise um eine zu deren Längsachsen parallele Achse.

Die Probenmessvolumina, die mit Hilfe der Erfindung gleichzeitig untersucht werden können, sind entweder innerhalb einer Probe voneinander separiert oder aber als einzelne Volumenbereiche einer gemeinsamen Probe definiert. So ist es beispielsweise möglich, mit Hilfe der Erfindung in Mikro- oder Nanotiterplatten untergebrachte oder auf einem chipförmigen Array, auf einer Membran oder sonstigen flächigen Unterlage oder in einem Durchflusssystem angeordnete Einzelproben einer Gesamtprobe zu untersuchen. Andererseits ist es aber auch möglich, innerhalb einer gemeinsamen Probe einzelne Bereiche dieser Probe zu untersuchen. Das zuvor angesprochene "Scannen" durch "Bewegen" der Foki infolge der Bewegung der der Fokussieroptik zugewandten Enden der Fasern des zweiten Faserbündels ist bei beiden Anwendungen ein-0 setzbar.

Zweckmäßigerweise werden die Proben hinsichtlich mindestens einer der folgenden Eigenschaften der in ihnen vorhandenen Moleküle/Molekülkomplexe untersucht: Fluoreszenzlebensdauer, Schwingungszustand, Translations- oder Rotationsgeschwindigkeit, oder molekulare Helligkeit. Vorteilhafterweise wird die von den Proben emittierte zweite elektromagnetische Strahlung hinsichtlich mindestens einer der folgenden Eigenschaften untersucht: Polarisation, spektrale Zusammensetzung, Intensität, oder Ausbreitungsrichtung. Zweckmäßigerweise umfasst die Verarbeitung der Messdaten die Erstellung von Histo-0 grammen der pro Zeiteinheit von den Detektorbereichen der mindestens einen Detektorvorrichtung erfassten Photonen und/oder die Erstellung von Histogrammen der zwischen einzelnen Photonen liegenden Zeiteinheiten und/oder

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die Erstellung von Histogrammen der Zeitpunkt der Erfassung eines Photonen relativ zu einem Referenzsignal und/oder die Erstellung von Korrelationsfunktionen.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung eignet sich insbesondere für die Spektroskopie, insbesondere Lumineszenzspektroskopie wie Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie, molmassenunabhängige Fluoreszenztechniken, Ramanspektroskopie, Lichtstreuung, Absorptionsspektroskopie, insbesondere mit Ein- oder Mehrphotonenanregung. Vorzugsweise wird die erfindungsgemäße Vorrichtung in der Medizintechnik, in der Diagnostik oder in Screeningverfahren zum Auffinden pharmakologischer Wirkstoffe Verwendung finden.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Zeichnung näher erläutert. Im einzelnen zeigen:
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Fign. 1 und 2

konfokale Aufbauten ohne optische Fasern nach dem Stand der Technik und

Fign. 3 bis 5

schematisch den Aufbau eines erfindungsgemäßen konfokalen Mikroskops zur zeitlich hochaufgelösten Detektion von Einzelphotonen.

Fig. 3 zeigt ein erstes Ausführungsbeispiel einer Vorrichtung 30 zur Detektion von Einzelphotonen in einer Vielzahl von Probenmessvolumina. Bei dieser Vorrichtung 30 wird in einer als Laser ausgebildeten Strahlungserzeugungsvorrichtung 31 eine erste elektromagnetische Strahlung (nachfolgend Anregungsstrahlung) erzeugt und in eine Vielzahl von optischen Fasern 32 eines ersten Faserbündels 34 eingespeist. Aus diesen Fasern 32 ausgesendete Anregungs-0 strahlung trifft auf eine Strahlteilervorrichtung 36, deren eigentlicher Strahlteiler 38 in diesem Fall als dichroitischer Spiegel ausgebildet ist. Bevor die Anregungsstrahlung auf den Strahlteiler auftrifft, passiert sie eine Kollimatorlinse

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40, die die Bündel von Anregungsstrahlung, die aus den der Strahlteilervorrichtung 36 zugewandten Enden 42 der Fasern 32 des ersten Faserbündels 34 austreten, parallelisiert.

Diese parallelisierten Strahlenbündel gelangen hinter dem Strahlteiler 38 zu einer weiteren Kollimatorlinse 44, die die einzelnen Strahlenbündel auf die der Strahlteilervorrichtung 36 zugewandten Enden 46 von optischen Fasern 48 eines zweiten Faserbündels 50 fokussiert. Damit sind also die von den Enden 42 der Fasern 32 des ersten Faserbündels 34 gebildeten Punktlichtquellen auf die Enden 46 der Fasern 48 des zweiten Faserbündels 50 optisch abgebildet.

Die auf diese Weise gleichzeitig in das zweite Faserbündel 50 eingespeisten einzelnen Strahlenbündel treten an den anderen Enden 52 der Fasern 48 des zweiten Faserbündels 50 aus, um über eine Kollimatorlinse 54 und eine Fokussieroptik 56 in eine Vielzahl von in einem Fokussierbereich 58 angeordneten Foki 60 fokussiert zu werden. Es entstehen also mehrere Foki 60, deren Anzahl gleich der Anzahl der Fasern 48 und 32 der beiden Faserbündel 50 und 34 ist.

Die Foki 60 definieren die zu untersuchenden Messvolumina einer (hier nicht 0 dargestellten) Probe. In diesen Probenmessvolumina auf Grund der Anregungsstrahlung erzeugte Emissionsstrahlung wird auf die den einzelnen Probenmessvolumina zugeordneten Faserenden 52 des zweiten Faserbündels 50 abgebildet und auf diese Weise in das zweite Faserbündel 50 eingespeist. Nach Parallelisierung der einzelnen Emissionsstrahlungsbündel durch die KoIIimatorlinse 44 der Strahlteilervorrichtung 36 wird die Emissionsstrahlung in dieser Strahlteilervorrichtung 36 separiert und verlässt die Strahlteilervorrichtung 36 auf einem von der Anregungsstrahlung verschiedenen optischen Pfad. Durch eine Kollimatorlinse 62 der Strahlteilervorrichtung 36 werden die einzelnen Emissionsstrahlungsbündel wieder fokussiert, und zwar auf die Enden 64 0 von optischen Fasern 66 eines dritten Faserbündels 68, das die Strahlung bis zu den verschiedenen Detektorbereichen 70 einer Detektorvorrichtung 72 leitet, die als Photomultiplayer ausgebildet ist.

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In Fig. 4 ist der in Fig. 3 mit IV gekennzeichnete Bereich nochmals vergrößert dargestellt.

Anstelle des zuvor beschriebenen dritten Faserbündels 68 könnten die die Strahlteilervorrichtung 36 verlassenden Emissionsstrahlungsbündel auch direkt auf die Detektorvorrichtung 72 auftreffen.

In Fig. 3 ist mit 74 eine Bewegungsvorrichtung gekennzeichnet, die auf die der Kollimatorlinse 54 und der Fokussieroptik 56 zugewandten Enden 52 der Fasern 48 des zweiten Fasernbündels 50 einwirkt, um diese zu bewegen. Diese Bewegung kann in Form einer seitlichen Verschiebung oder Verschiebung in Längsrichtung oder Verdrehung um die Längsachse der Fasern 48 oder durch Kippen erfolgen. Die jeweils möglichen sich eventuell überlagernden Bewegungen sind in Fig. 3 durch Pfeile gekennzeichnet. Hierdurch lässt sich die Lage der Foki 60 innerhalb der Probe verschieben, wodurch diese abgetastet werden kann. Dies ist je nach den durchzuführenden Untersuchungen der Probe von Vorteil.

Fig. 5 zeigt eine alternative Ausgestaltung einer konfokalen Vorrichtung 80. Bei 0 dieser Vorrichtung 80 sind mehrere Aufbauten gemäß Fig. 3 bzw. Fig. 4 kombiniert. Bei Verwendung einer gemeinsamen Fokussieroptik 56 und einer gemeinsamen Kollimatorlinse 54 kommen zwei oder mehrere zweite Faserbündel 50, zwei oder mehrere Strahlteilervorrichtungen 36, zwei oder mehrere Strahlungserzeugungsvorrichtungen 31, zwei oder mehrere Detektorvorrich-5 tungen 70 und zwei oder mehrere erste und dritte Faserbündel 34 bzw. 68 zum Einsatz. Die Enden 52 der Fasern 48 der mehreren zweiten Faserbündel 50 lassen sich nunmehr gemeinsam über die Bewegungsvorrichtung 74 verschieben. Die aus diesen Enden austretende Anregungsstrahlung wird zur Bildung der Foki 60 in Richtung auf die Kollimatorlinse 54 und die Fokussieroptik 0 56 ausgesendet. Die Foki 60 lassen sich somit in mehrere Gruppen unterteilen, wobei diese Fokigruppen den Fasern 48 unterschiedlicher zweiter Faserbündel 50 zugeordnet sind. Auf diese Weise ist es möglich, unterschiedliche Anre-

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gungsstrahlung, die durch die unterschiedlichen Strahlungserzeugungsvorrichtungen 31 erzeugt werden, in die Probe einzubringen. Diese unterschiedliche Anregungsstrahlung führt je nach Beschaffenheit der Probe zu unterschiedlicher Emissionsstrahlung, die auf die unterschiedlichen zweiten Faserbündel 50 aufgeteilt wird. Die Auskopplung der Emissionsstrahlung aus den und die Einkopplung der Anregungsstrahlung in die Fasern 48 der zweiten Faserbündel 50 erfolgt auf die gleiche Weise, wie es weiter oben anhand der Fign. 3 und 4 beschrieben ist.

Eine Variante der Ausführungsbeispiele gemäß den Fign. 3 und 5 ist darin zu sehen, dass die eine Strahlteilervorrichtung 36 verlassende Emissionsstrahlung durch Vorsehen einer oder mehrerer weiterer Strahlteilervorrichtungen auf mehrere Detektorvorrichtungen 70 aufgeteilt wird. Die Weiterleitung der Emissionsstrahlung von diesen weiteren Strahlteilervorrichtungen zu den einzelnen Detektorvorrichtungen kann ohne oder mit optischen Fasern erfolgen.

In den beiden erfindungsgemäßen Ausführungsbeispielen wird die Funktion der nach dem Stand der Technik für Anregungs- und Detektionslicht gemeinsamen Gesichtsfeldblende von den Enden von (Monomode-) Glasfasern als Fasern des 0 ersten Faserbündels übernommen. Von hier ausgehendes divergentes Anregungslicht wird von der Kollimatorlinse 54 so weit kollimiert, dass die Anforderungen der eingesetzten Fokussieroptik 56 (Mikroskopobjektiv) an die Tubuslänge hinreichend genau erfüllt werden. Mit dieser Kollimatorlinse 54 können auch restliche Farbfehler der Fokussieroptik 56 ausgeglichen werden. Entsprechend den Anforderungen an die spektrale Empfindlichkeit können im Detektionsstrahlengang hinter der Kollimatorlinse 62 noch färb- oder polarisationsselektive Elemente, etwa Bandpass-Filter, hinzugefügt werden. Das Bild der Faserenden 52 definiert die Brennpunkte 60 in der Probe. Da die Abbildung in beide Richtungen (Faser/Probe und Probe/Faser) umkehrbar ist, liegt das 0 Bild der Foki automatisch auf den Enden 52 der Fasern 48. Eine Justage ist nicht erforderlich.

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Durch Verschieben der Faserenden 52 ("Scannen") ändern sich die Positionen der Messvolumina in der Probe. Sind die Relativpositionen der Messvolumina zueinander bekannt, kann dies z.B. zur beschleunigten Aufnahme von Bildern der Probe oder zum gezielten, sequentiellen Abscannen identischer Probenbereich mit unterschiedlichen experimentellen Parametern (Laserintensitäten, Polarisationen, -Wellenlängen, Detektionsfilter, etc.) eingesetzt werden.

Werden für die Fasern 48 Monomode-Fasern gewählt und ist die Abbildung nur durch Beugung begrenzt, können die Foki kleinstmögliche Größe annehmen. Der Fokusdurchmesser ist dann umgekehrt proportional zur Wellenlänge und proportional zur numerischen Apertur (N_a) des fokussierten Strahles (die vom Strahldurchmesser und der Brennweite der Fokussieroptik bestimmt wird).

Ein Vorteil für polychromatische Anwendungen ist in diesem Aufbau die (Näherungsweise) Unabhängigkeit der Fokusgröße von der Wellenlänge. In guter Näherung ist der Divergenzwinkel des aus der Faser austretenden Lichtes proportional zur Wellenlänge. Die N_a (auf der Brennpunktseite) steigt daher mit der Wellenlänge an, so dass der Fokusdurchmesser fast wellenlängenunabhängig ist.

Der Fall eines minimalen Messvolumens ist besonders für FCS-Messungen von Vorteil. Das Signal zur Rausch-Verhältnis steigt mit den Kehrwerten von Besetzungszahl wie auch der zum Passieren des Messvolumens benötigten "Diffusionszeit" eines Moleküls durch den Fokus.

Für Anwendungen, die größere Messvolumina erfordern, kann die Fokussierstärke der Optik reduziert werden. Dann wird jedoch auch die Lichtsam meleffizienz verringert, so dass von einzelnen Molekülen eine geringere Anzahl von emittierten Photonen detektiert werden kann.

Alternativ dazu kann Anstelle der Monomode-Glasfaser ein Wellenleiter mit größerem Kerndurchmesser eingesetzt werden. Dieser ist dann im Allgemeinen

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nicht mehr monomodal, so dass die Abbildung nicht beugungsbegrenzt ist, dafür kann er die hohe Lichtsammeieffizienz der Fokussieroptik hoher N_a besser ausnutzen.

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Claims

1. Hochdurchsatzscreening-Vorrichtung zur optischen Erfassung von Probenvolumina mit

- mindestens einer Strahlungserzeugungsvorrichtung (31) für eine erste elektromagnetische Strahlung,

- einer Fokussieroptik (56) zur Fokussierung der ersten elektromagnetischen Strahlung simultan in eine Vielzahl von innerhalb der zu erfassenden Probenmessvolumina liegenden Foki (60),

- mindestens einer Strahlteilervorrichtung (36), die zwischen der mindestens einen Strahlungserzeugungsvorrichtung (31) und der Fokussieroptik (56) angeordnet ist und die die erste elektromagnetische Strahlung zur Fokussieroptik (56) weiterleitet,

- mindestens einer Detektorvorrichtung (72), die außerhalb des sich von der mindestens einen Strahlungserzeugungsvorrichtung (31) über die mindestens eine Strahlteilervorrichtung (36) bis zur Fokussieroptik (56) erstreckenden Strahlenganges angeordnet ist und die durch die mindestens eine Strahlteilervorrichtung (31) separierte von der Vielzahl der Foki (60) ausgehende zweite elektromagnetische Strahlung empfängt, wobei

- zwischen der mindestens einen Strahlungserzeugungsvorrichtung (31) und der mindestens einen Strahlteilervorrichtung (36) eine Vielzahl von ersten optischen Fasern (32) angeordnet ist, aus deren der mindestens einen Strahlteilervorrichtung (36) zugewandten Enden (42) von der mindestens einen Strahlungserzeugungsvorrichtung (31) in die dieser zugewandte Enden der ersten optischen Fasern (32) eingespeiste erste elektromagnetische Strahlung austritt,

- zwischen der mindestens einen Strahlteilervorrichtung (36) und der Fokussieroptik (56) eine Vielzahl von zweiten optischen Fasern (48) angeordnet ist,

- die der mindestens einen Strahlteilervorrichtung (36) zugewandten Enden (42) der ersten optischen Fasern (32) auf die der mindestens einen Strahlteilervorrichtung (36) zugewandten Enden (46) der zweiten optischen Fasern (48) optisch abgebildet sind,

- aus den der Fokussieroptik (56) zugewandten Enden (52) der zweiten optischen Fasern (48) austretende erste elektromagnetische Strahlung durch die Fokussieroptik (56) in eine Vielzahl von Foki (60) innerhalb der zu erfassenden Probenmessvolumina fokussiert ist und

- die der mindestens einen Strahlteilervorrichtung (36) zugewandten Enden (46) der zweiten optischen Fasern (48) zur Detektion der zweiten elektromagnetischen Strahlung mindestens einer Detektorvorrichtung (70) optisch zugeordnet sind,

- dadurch gekennzeichnet,

- dass die Fokussieroptik (56) farbslängskorrigiert ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektorvorrichtung (70) die zweite elektromagnetische Strahlung zeitaufgelöst erfasst, insbesondere mit einer zeitlichen Auflösung von kleiner als 1 ms, besonders bevorzugt kleiner als 1 µs, insbesondere besonders bevorzugt mit einer zeitlichen Auflösung, die die Detektion einzelner Photonen erlaubt.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Fokussieroptik (56) eine numerische Apertur von größer als oder gleich 0,6, vorzugsweise 0,9 und insbesondere 1, 2 aufweist.

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Fokussieroptik (56) optische Elemente aufweist, die im wesentlichen refraktiv arbeiten.

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen der mindestens einen Strahlteilervorrichtung (36) und der mindestens einen Detektorvorrichtung (70) eine Vielzahl von dritten Fasern (66) angeordnet ist, wobei die der mindestens einen Strahlteilervorrichtung (36) zugewandten Enden (46) der zweiten Fasern (48) auf die der mindestens einen Strahlteilervorrichtung (36) zugewandten Enden (64) der dritten Fasern (66) optisch abgebildet sind und die der mindestens einen Strahlteilervorrichtung (36) abgewandten Enden der dritten Fasern (66) auf die mindestens eine Detektorvorrichtung (70) abgebildet sind.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Enden (42, 46, 52, 64) der Fasern (32, 48, 66) zur Erzeugung eines hohen Grades an optischer Aus- und Einkopplung der ersten und zweiten elektromagnetischen Strahlung entspiegelte Stirnflächen aufweisen.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Strahlteilervorrichtung (36) die erste und zweite elektromagnetische Strahlung in Abhängigkeit von ihrer Polarisation, ihrer Ausbreitungsrichtung, ihrer Wellenlänge und/oder ihrer Intensität separiert.

8. Vorrichtung nach einem Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen der mindestens einen Detektorvorrichtung (70) und der mindestens einen Strahlteilervorrichtung (36) eine weitere Strahlteilervorrichtung angeordnet ist, die von der Strahlteilervorrichtung (36) kommende . zweite elektromagnetische Strahlung zu unterschiedlichen Bereichen der Detektorvorrichtung (70) weiterleitet.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Strahlerzeugungsvorrichtungen (31) vorgesehen sind, deren elektromagnetische Strahlung in einzelne oder in mehrere unterschiedliche erste optische Fasern (32) einkoppelbar sind.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlteilervorrichtung (36) mehrere Strahlteilereinheiten aufweist, die einzelnen oder mehreren der ersten und/oder zweiten und/oder dritten optischen Fasern (32, 48, 66) zugeordnet sind.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass eine Bewegungsvorrichtung (74) vorgesehen ist, mittels derer die der Fokussieroptik (56) zugewandten Enden (52) der zweiten Fasern (48) in einer quer zu den Längsachsen der Fasern (48) verlaufenden Ebene und/oder in Längsrichtung der Fasern (48) einzeln und/oder gemeinsam bewegbar sind und/oder mittels derer die der Fokussieroptik (56) zugewandten Enden (52) der zweiten Fasern (48) kippbar oder drehbar sind, und zwar vorzugsweise um eine zu deren Längsachsen parallele Achse.

12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Vielzahl von ersten, zweiten und/oder dritten Fasern (32, 48, 66) jeweils bündelförmig angeordnet sind.