CN110192094A - 自动化组织切片捕获、索引和储存系统及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于运输和处理切片的生物样本的系统和方法。优选的实施例提供了使用多种成像和处理方式以表征切片的组织样本。系统的自动化操作提供了多模态成像和多级处理，以为每个样本提供三维(3D)数据集。

Description

自动化组织切片捕获、索引和储存系统及方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年11月18日提交的、申请号为62/424,270的美国临时专利申请的优先权，其全部内容通过引用整体并入本文。

背景技术

组织切片用于广泛的组织学和病理学分析，因为它们有助于组织的染色、标记和成像，其通常不能在厚样本上直接进行。切片过程包括将组织嵌入例如蜡、树脂、冰或凝胶的支撑材料中，然后使用切片机或振动刀片切片机将其薄切片成数微米至数百微米的厚度。切片机和振动刀片切片机之间的差别在于振动刀片切片机使用浸没在流体中的振动刀片，流体允许振动刀片可控制地切割例如组织和凝胶的软材料。切片机通常需要渗入组织的更硬的嵌入介质，并且可能需要进行重要的后处理以去除渗入的蜡/树脂。这种后处理会影响样本并干扰二次分析。切片之后，组织切片的收集、处理、储存、和安装需要由经验丰富的技术人员手动完成，甚至在商业自动化系统中完成。就劳动力和生产量而言，这是繁琐且昂贵的，并且该过程中的许多步骤都存在人为错误。需要一种用于组织切片自动化切片和储存的鲁棒系统，以降低成本并提高组织学分析的生产量和一致性。这些功能还有助于与现有的和新颖的自动化实验室系统集成。一种提供组织切片自动化捕获和成像的技术是串行双光子断层扫描(STPT)。

STPT能够以亚微米分辨率快速离体成像厚组织样本，甚至贯穿例如小鼠脑的整个器官中。先进的分子组织学分析可以用丰富的分子信息注释组织切片。然而，目前没有技术可以产生厚组织和整个器官的分子注释的三维图。STPT缺乏必要的多重生化特异性，并且通常仅限于光学显微镜方法，而大多数分子分析缺乏必要的生产量和三维空间范围。因此，在理解厚组织和整个器官的结构和组成方面仍存在关键差距。如果没有这样的理解，很难(乃至不可能)为许多疾病和病症开发有效的治疗方法。

在组织病理学方面很少有成功的尝试来使组织切片和储存过程自动化。虽然商业上存在“自动化”切片机，但它们往往意味着半自动化或辅助切片过程，并且不具有自动化收集和处理组织切片的能力。这些设备仍然需要经验丰富的技术人员手动或半手动操作和收集切片。

执行自动化切片的以前的系统与软样本不兼容，并且通常与切片之间的成像不兼容。这些系统的设计考虑了不同的特定目标应用。例如，一个系统以切片机切片石蜡嵌入样本，并输出用于载玻片扫描(slide-scanning)应用的预制载玻片(slide)。另一个系统产生用于连续电子显微镜的树脂嵌入样本(通常是C线虫)的超薄切片机。其样本输出馈入定制的电子显微镜样本架。

已经开发了使用六轴线机械臂以拾取和放置配置捕获琼脂糖组织切片的方法。例如，Troy等人的序列号为PCT/GB2014/051899的国际专利申请(国际专利公开号WO2014/202998)，其全部内容通过引用并入本文，描述了一种系统，其中臂将端部执行器降低到浴液中，使用吸力将切片粘附在其端部执行器上的吸盘上，然后将切片从溶液中提起并将其存放在容器中，同时分配缓冲溶液。然后将容器装入旋转传送带中用于储存。除了成本和复杂性，该系统可能会存在可靠性问题，特别是较薄的切片，因为它不能很好地处理组织切片之间的构造差异，并且对存放的切片具有较差的构造控制。当研究人员朝向较薄的切片移动时，有必要将切片轻轻地捕获到支撑基板上处理，因为直接处理会损坏较薄的切片。

发明内容

本发明涉及自动化组织病理学领域，尤其是用于生物组织样本的研究或这些组织中的疾病和病症的病理学的自动化方法。这可以包括在感兴趣的组织样本上加工、处理、以及执行各种方法。

在本发明的优选实施例中，描述了多种方式，用于自动化捕获、索引和储存由振动刀片切片机技术产生的组织学上的组织切片以改善振动刀片切片，以及这些技术的多种应用。用于捕获组织切片的机构施加力以将组织切片或切片移动到转移材料上，例如板、或载玻片。当在水浴中从样本块切下组织切片时，优选的方法提供吸引力以拉动组织切片与支撑基板或托盘相接触。基板和吸引力用于引导组织切片的构造和运动，以使得它可以被运输出水浴并进入储存部。一旦离开水浴，湿润的组织切片和支撑基板之间的表面张力可用于在运输过程中保持切片牢固地粘附到表面而不损失构造。表面处理也可用于提升切片粘附力。

使用流体惯性力将切片从支撑基板上分离，以克服粘合剂表面张力，从而可控地转移到储存部或其他处理系统和方式中。切片储存在孔或管中，在基板上，或在一些其他容器中，有或没有缓冲溶液取决于应用。切片也可以按顺序存储在胶片夹上，或被包裹在薄膜中以用于进一步的自动化处理。在控制软件中完成索引；可以将部坐标加载到软件中，以指定切片的存储方式和位置，并且元数据文件跟踪每个切片的物理位置。系统配置设计成与许多成像方式完全兼容，包括串行双光子断层扫描(STPT)，三维组织成像方法，为了能够相对于来自STPT的三维成像数据跟踪物理组织切片。在本发明的其他实施例中，可以使用其他成像块面和整个样本形态。可以通过相应的多个探测器元件探测多个波长。数据处理器可用于处理由探测器产生的光谱数据。

将受益于自动化切片和切片收集的除STPT之外的其他成像技术，包括相干反拉曼斯托克斯成像(CARS)、受激拉曼散射(SRS)、光学相干断层扫描(OCT)、斜光板、光片西塔显微镜、倒置光片显微镜、扫描共焦对齐平面激发(SCAPE)、选择性平面照明显微镜(SPIM)、共聚焦拉曼、共聚焦、旋转盘共聚焦、块面结构照明、块面成像、和光频域成像(OFDI)。在优选实施例中，这些成像方式与组织的物理切片相结合。

例如磁共振成像(MRI)、正电子发射断层扫描(PET)、光学投影层析成像(OPT)和超声波的其他方法可用于其他实施例，因为这些方法可用于产生样本的三维体积，例如组织(包括植物组织)、器官或整个动物。在本发明的一些实施方案中，可以通过各种方法(CLARITY、CUBIC、ScaleS、Sacel、3Disco、UDisco)清理样本或通过整个安装程序标记，例如iDisco，或通过各种方法标记整个动物和器官，例如活体标签。然后可以对成像的样本进行切片，并且可以通过各种方法，光学和生物化学，分析回收的切片，然后，可以匹配从这些对切片的分析中获得的信息，并且将这些信息注册回原始的三维体积。

因此，本系统通过使自动化组织捕获设备能够集成到二维和三维成像设备中而消除获得三维分子图的关键障碍。尤其，串行块面成像技术可以替代光学成像和机械切片以构建宏观样本的三维数据集。对组织的最上部分成像至例如几十微米的深度，然后用振动刀片切片机或其他切片设备去除。然后重复该过程直到成像整个组织。目前，产生的组织切片随机分布在缓冲浴中，需要手动收集、排序、并单独安装用于二次分析。这种方法对于大量精密切片而言是不切实际的。进一步，薄的组织切片倾向于自身翻卷和折叠，使得它们难以处理。本申请中描述的系统自动化捕获组织切片，同时保持其方向并存储其用于下游分析。然后可以将从这些分析中获得的深度分子信息映射回高分辨率三维数据集，以构建组织和整个器官的三维分子图。这些二次分析可以专门针对感兴趣的特定区域，在一组样本上执行，例如，每N个切片，或在整个样本执行，用于更多的探索性分析。这些二次分析不需要是已知先验的，并且可以响应于未来分析的结果而执行。

附图说明

图1A-1E描绘了小鼠脑的串行双光子断层扫描。图1A描绘了示例设备设置。图1B描绘了以2mm比例尺进行三维重建后小鼠脑的冠状(顶部)、水平(中间)和矢状(底部)视图。图1C描绘了冠状切片的三维视图。图1D和1E描绘了图1C中标记的区域的放大区域，示出了树突棘(1D)和轴突纤维(1E)。图1D和1E中的比例尺为25μm，图1D的插图中比例尺为5μm。

图1F描绘了用于本发明优选实施例的数据处理和控制系统。

图2A和2B示例了输送机概念。图2A示出了示意性侧视图。在切片过程中，组织切片经由吸力吸引至输送机的绞盘进气歧管(CIM)。将切片拉成与输送带共形接触，然后将其从溶液中运输出来，在该溶液中表面张力使其粘附至带上。图2B描绘了初步输送机框架设计的三维CAD模型。图2B的插图示出了具有NPT螺纹液力耦合器的CIM的放大视图。将孔的尺寸和间隔设计成沿其长度获得近似均匀的流动。

图2C示例了根据本公开的各种实施例的绞盘进气歧管(CIM)的端视图。

图2D示例了根据本公开的各种实施例的具有替代孔布局的绞盘进气歧管(CIM)。

图2E、2F和2G分别示出了根据本文描述的各种实施例的振动刀架和可定位进气歧管的侧视图、端视图和透视图。

图3A和3B描绘了替代的输送机绞盘进气歧管(CIM)横截面，分别具有楔形几何形状和细长几何形状。CIM横截面由深灰色形状描绘。红色(内部)轮廓表示将施加吸力的表面区域，绿色(外部)曲线代表输送带、薄膜、或柔性基板的路径。箭头表示运动方向。

图4A和4B描绘了卷轴到卷轴的概念。在图4A中，多孔或穿孔的薄膜以卷轴到卷轴的方式绕过绞盘进气歧管(CIM)。对歧管头施加吸力以穿过薄膜抽吸流体，以在切片过程中，对组织切片施加吸引力或流体阻力。红色框表示图4B中示例的区域。图4B描绘了储存的概念，其中使用自动化模切机从薄膜冲压出组织切片。将薄膜基板上的冲压的组织切片存放到具有缓冲溶液的孔阵列中。

图4C描绘了根据本文描述的各种实施例通过调节流体密度而从带上粘附和脱粘组织切片。

图4D示例了根据本文描述的实施例的第一和第二切片捕获系统。

图5示例了组织切片的包封和成像。将组织切片捕获或转移至薄膜(描绘为穿孔)，然后用二次膜包封。描绘弹簧辊机构以帮助粘附第二薄膜并且起到惰轮的作用，两个薄膜围绕该惰轮接触。以一定的光学特性，人们可以通过薄膜成像。

图6A-6D描绘了用于将切片从输送带输送到另一物体的组织切片分离机构。图6A描绘了该机构的示意性侧视图。当其处于反方向时，将压缩惰性气体的喷射从输送带的后侧施加至组织切片。流体惯性力和重力足以克服粘合剂表面张力并允许切片转移至相邻的基板。图6B描绘了具有在虚线框中勾勒外形的分离区域的CAD模型侧视图。图6C示例了在示出具有NPT联轴器的气体出口的图6B的虚线框中勾勒外形的分离区域的展开的正视图。将出口设计成引导流体从NPT联轴器向下流过带并进入组织切片。图6D描绘了转移至处理过的玻璃显微镜载玻片的100μm小鼠脑冠状组织切片。

图7A描绘了组织切片静电附着至功能化基板。基板以绿色显示并以阳离子表面处理功能化，以使其具有正电荷，其吸引组织的天然负电荷。

图7B描绘了根据本申请的各种实施例的用于转移组织切片的流体流动系统。

图8A-8C描绘了在通过气体射流分离组织切片时的各种组织切片储存配置。图8A描绘了分离到基板上的组织切片，例如显微镜载玻片，以绿色显示。图8B描绘了用缓冲溶液分离到孔中的组织切片。图8C描绘了分离到另一输送机、薄膜或带条上的组织切片。

图9A和9B描绘了自动化储存系统。图9A描绘了孔板储存。将组织切片存放到载玻片阵列上(未示出)或XY平台上的孔板内(图示)。当板/阵列装满时，龙门式机器人将其转移到机动转盘上的储存架上，然后将新的板/阵列从机架转移到XY平台。当机架满了时，转盘将下一个机架旋转到位。图9B描绘了单个载玻片储存系统。可以将切片转移到转盘上的单个载玻片上。龙门式机器人将载玻片上的组织切片从单个拾取位置转移到储存架，然后从供应架上替换转盘上的新载玻片。

图10A和10B描绘了组织切片储存的自动化概念。图10A描绘了储存概念的示意性侧视图。带翼的输送带从分配器上捕获载玻片，将它们装载到带上。可以将组织切片从切片捕获输送机转移到各个载玻片上。具有吸力提升(如图)或机械夹具的机器人端部执行器可将载玻片放入储存架中。图10B描绘了图10A中的系统的示意性俯视图。

图11示例了使用与STPT和二次分析相结合的切片捕获系统，以执行组织学数据的三维映射的方法的流程图。

图12描绘了自动化三维组织学映射。在这个映射中，对组织样本执行STPT。从STPT捕获组织切片并将其传递至二次分析，该二次分析可能包括染色、成像、测序、或其他分子分析。STPT数据与二次分析数据、以及例如器官图谱和动物谱系的其他参考信息相结合，并将数据传递至图像注册软件。该软件将多路复用数据流映射到高分辨率STPT模板，产生分子注释的3D数据集。

图13A-13D描绘了改进的切片技术。图13A描绘了嵌入在可以被切片的次级、更硬的材料中的样本块。该次级材料在切片过程中为块提供额外的支撑。图13B描绘了在切片过程中使用支撑材料。对于薄切片，可以将支撑材料添加到块的顶部并被切片，从而有效地切割较厚的切片。然后可以去除该支撑材料。图13C描绘了以角度θ切割从而向切口添加额外的横向速度分量的振动刀片切片机。由红色箭头表示样本运动。图13D描绘了除了正常的振动刀片切片机切片之外的样本块的运动。以红色显示样本轨迹，表示块的旋转或正弦运动。这种运动还为切口增加了额外的横向速度。

图14A和14B示例了自动化三维组织学映射。在组织样本上执行STPT。从STPT捕获组织切片并将其传递至二次分析，该二次分析可能包括染色、成像、测序、或其他分子分析。STPT数据与二次分析数据、以及例如器官图谱和动物谱系的其他参考信息相结合，并将数据传递至图像注册软件。该软件将多路复用数据流映射到高分辨率STPT模板，产生分子注释的3D数据集。

图15描绘了组织样本的切片自动化成像，以产生组织样本的三维模型的方法。

图16A示例了根据本文描述的各种实施例使用信托标记(fiduciary marker)以识别和分析组织切片。

图16B示例了根据本文描述的各种实施例的光电传感器布置。

图17示例了根据本文描述的各种实施例的切片捕获系统的渲染视图。

图18A和18B示例了根据本文描述的各种实施例的载玻片储存转盘的局部分解图。

具体实施方式

本发明的优选实施例可包括四个中心元件：(1)振动刀片切片机，其可以从嵌入例如琼脂块的组织块的组织切下薄的(10-1,000微米)切片。(2)进气歧管，可通过附加泵将缓冲溶液通过该进气歧管抽出，并再循环到缓冲浴中。该歧管位于振动刀片切片机附近，其也称之为振动切片机，并且缓冲液的吸入产生吸引组织切片的流体力。(3)围绕进气歧管驱动例如在其上运输样本的多孔输送带、胶带或柔性材料的转移材料。歧管的作用类似于滑轮，以重新定向运输材料或带运动。带在歧管表面上滑动并将组织切片从缓冲液中运输出来(图2A)，在缓冲液中组织切片通过表面张力牢固地粘附在带上。(4)收集站，组织切片存放在该收集站中(例如，图4B)。这种设计有几个有益的方面。在切片时，将组织切片轻柔且可控地拉到样本运输设备或输送机上，提供切片位置和方向的一致性。将组织切片拉到与带条或带表面良好接触，防止由于卷曲或折叠引起的构造变化，并通过提供均匀的支撑来帮助保持组织切片的完整性。当将它运输出缓冲区时，表面张力使切片保持在具有平坦结构的带上。最后，该系统机械构造简单，在定位部件方面具有广泛的灵活性，并且由简单旋转运动驱动，其与例如多轴线机器人的替代选项相比，可以节省成本并降低复杂性。该系统设计成用于与STPT和其他成像方法完全兼容，但可以独立地用于一般的组织病理学应用，或者以与整个器官或生物体成像形式相似的配置使用。关于组织样本的切片、成像和处理的其他细节可以在序列号为8,771,978的美国专利中找到，其全部内容通过引用并入本文。

图1A-1E描绘了小鼠脑的串行双光子断层扫描的示例。图1A描绘了示例设备设置。图1B描绘了以2mm比例尺进行三维重建后小鼠脑的冠状(顶部)、水平(中间)和矢状(底部)视图。图1C描绘了冠状切片的三维视图。图1D和1E描绘了图1C中标记的区域的放大区域，示出了树突棘(1D)和轴突纤维(1E)。图1D和1F中的比例尺为25μm，图1D的插图中比例尺为5μm。

图1F描绘了根据本发明的成像和处理系统40。处理器42与系统部件相连接，该系统部件包括光源48、第一PMT通道50、第二PMT通道52、第三PMT通道54、(x，y)扫描仪56、相对于组织样本65(例如全器官小鼠脑)转移物镜60的垂直扫描仪58、样本机动化平台62、具有切割工具66的切片机64、将每个组织切片移动至储存系统70的组织切片运输系统68、进一步处理切片的处理系统72以及可以与第一成像系统45相结合使用以产生处理组织的图像的第二成像系统74。可以将切片前后的组织图像存储在存储器46中，并以如本文所述的各种格式显示在显示器44上。关于成像系统和使用这些系统的方法的其他细节描述于序列号为7,372,985和7,724,937的美国专利中以及2006年5月25日提交的序列号为11/442,702的美国专利申请中，并且作为序列号为2007/0057211的美国专利公开而公开，这些专利和申请的全部内容通过引用并入本文。2014年12月24日提交的序列号为PCT/US2014/072368的国际申请，并且作为序列号为WO2015/100421的国际专利公开而公开，2016年3月11日提交的序列号为PCT/US2016/022106的国际专利申请，并且作为序列号为WO2016/145366的国际专利公开而公开，以及2011年11月15日提交的序列号为PCT/US2011/060831的国际专利申请，并且以序列号为WO2012/068142的国际专利公开而公开中描述了切片样本成像和检测时间分辨数据与本发明的优选实施例相结合使用的系统和方法的进一步细节，这些专利和申请的全部内容通过引用并入本文。如本文将进一步描述地，可以用操作系统部件并处理图像数据的软件对处理器42编程。运输系统68可移动组织样本以进行如本文所述的进一步处理和成像。然后，处理器42可以分析来自切片之前和之后的图像数据，以关联和量化数据，从而详细地表征组织。由于切片可以改变组织的表面形态，这可能在进一步处理和成像之后在组织结构中关联细节的过程中产生困难。优选实施例提供了用于分析来自组合切片之前和之后的图像数据以表征组织的方法。

图2A示出了根据本文描述的各种实施例的切片捕获系统100。为了产生有吸引力的流体力，将组合的流体进气歧管用作绞盘，转移材料围绕该绞盘滑动。在一些实施例中，转移材料是多孔输送带114。为简洁起见，我们将其称为绞盘进气歧管110、或CIM。通过CIM110外表面中的孔112并且因此通过多孔输送带114抽出流体，然后再循环到浴液116中以保持液位。该流体流动将阻力施加到组织切片120上，以经由抽吸将其拉向带114。容积泵适用于此应用，因为它们是自吸式的，横跨一定范围压力提供一致的流量，并且可以吸引。输送机概念的三维CAD模型如图2B所示，在图2B中，为了清楚起见，已经去除了带114。在放大的插图中描绘了一个CIM设计。单螺纹管接头(例如，NPT)用于与歧管头122形成流体连接。为了确保沿着CIM 110的长度具有大致均匀的吸力，可以调节每个轴向位置的孔112的尺寸和数量，以防止可能损坏组织或改变其在带114上的定位的不均匀力。

使用例如如上所述的多孔输送带114或如下所述的各种薄膜的转移材料有利地允许组织样本120被快速吸引并固定在物理基板上。通过将组织样本120固定在物理基板上，组织样本120不太可能卷曲或以例如在流体或吸力下的长期运输过程中可能发生的其他方式损坏。此外，如本文所述的连续转移材料提供了有条不紊地固定一系列组织样本120的能力(例如，沿着薄膜、带条或带以线性方式)。这克服了切片的典型问题，其中漂浮在流体中的松散组织样本可彼此粘附或快速无序移动。

图2C示例了根据本公开的各种实施例的绞盘进气歧管110。在该实施例中，孔112被描绘为圆形，并且该形状可以有益于可加工性。然而，CIM 110中的孔112可以具有任意尺寸和形状，以更好地控制相对于样本块的局部流动特性。在一些实施例中并且如图2D所示，CIM 110的孔112可以是槽形的。计算流体动力学(CFD)软件可用于参数化地优化最佳流动特性的入口尺寸、形状和分布。

在如图2E和2F所示的一些实施例中，进气歧管可定位。在一些实施例中，可以修改振动刀架470，以使得进气歧管110可以定位在刀架471之间的间隙中。在一些实施例中，进气歧管110可相对于刀片66的边缘任意定位。在一些实施例中，进气歧管110的定位可以调节，或甚至是动态的。例如，进气歧管110可以移动以适应不同的样本类型或者可以在捕获过程中经历运动以改善组织切片120的捕获机制。

在一些实施例中，振动刀架470中的支撑臂471之间的间隙可以减小臂的重量并且还允许流体通过。由于这个间隙，在浴液116和CIM 110之间存在更直接的流体通路，以在捕获过程中以更温和的流速在组织切片上施加更加一致的流体力。在该臂的设计中，刀片66的俯仰角或“迎角”是固定的，以允许臂中的更大刚度并且还确保刀片66相对于输送机114的一致定位。为调整该角度，刀架部件可以换成一个不同的设定角度。这与另一种设计形成对比，在这另一种设计中，整个臂都可以旋转以调节该俯仰角。这种设计导致安装位置和围绕刀片的局部流体动力学的变化性，这可能导致组织切片捕获的不一致。

CIM最简单的几何形状是圆柱体，但非轴对称设计可用于更好地控制组织切片上的力分布，以及带运动。图3A和3B中描绘了两个示例。

在一些实施例中，输送带114能够以陡峭的初始角度绕过CIM 110，以在水平重新定向运动之前清洗浴缸壁和弯曲滑轮126。输送机可以由鼓式驱动皮带轮128提供动力。驱动皮带轮128可以是冠状的，从而合适地保持带轨迹，或者可以安装在张紧支架127上，以允许带114的张力调节。

使用绞盘114，而不是旋转滑轮，避免了对水下轴承和旋转流体联轴器的需求，这增加了系统的尺寸、成本、复杂性和故障模式。由于进气孔112相对于振动刀片切片机64处于固定位置，因此绞盘114可以提供所施加吸力的一致性。由于输送机的轻量化负载，这种设计是可能的。克服绞盘上摩擦力所需的额外带张力是系数2，其对于该系统而言是微不足道的。类似特氟隆或尼龙的低摩擦聚合物材料可用于CIM 110，在一些实施例中，弯曲滑轮126可由类似的绞盘代替。如果CIM 110的磨损或耐用性是特定应用的关注点，可以使用金属或陶瓷。部件的简单性意味着它们可以更容易、更便宜地更换以进行维护，或者在交叉污染是生物样本的一个问题的情况下进行更换。带材料可以是生物相容性的、耐腐蚀、和微亲水聚合物，例如尼龙或聚对苯二甲酸乙二酯(PET/聚酯纤维)网，这是耐用和廉价的。

为防止振动干扰切片过程，输送机及其电动部件(电机、泵等)可独立于振动切片机64和成像设备安装或与阻尼材料隔离。

代替输送带114，用于组织切片捕获的相同系统配置可以用于卷轴到卷轴配置中的多孔薄膜130形式的不同转移材料，用于供应卷轴132和储存或卷带盘133，如图4A所示。在带114的交叉污染是一个问题或希望直接在薄膜130上捕获和存储线性阵列的切片的情况下，这是期望的。这也允许薄膜130容易地切换以用于不同的样本。二次包封膜135可用于完全包封组织切片120以保存它们，用于储存或二次成像、检测或分析，如图5所示。可以选择该薄膜135以具有特定属性，例如折射率、孔隙度、或取决于二次分析的化学功能化。例如，可以选择折射率，以使得切片的薄膜条/卷可以直接送入显微镜系统进行进一步成像，扮演与盖玻片相同的角色。在图4A-4B的概念中使用的胶片夹130可以是一次性的，以使得包括冲床402和模具404的自动化模切机401可以冲出包含组织切片的薄膜部分(图4B)。因此，使用模切薄膜作为托盘，切片120由薄膜130良好地支撑并且可以更容易地处理。代替输送机构，使用相同的流体机制可以将该切片直接捕获到多孔基板上。机械臂上的端部执行器可以具有流体入口，该流体入口具有可拆卸的网状基板，流体将穿过该基板流动。经由类似的流体阻力或吸力将组织切片120捕获到该基板上，并从水浴中取出，在水浴中表面张力足以将组织切片120保持在适当位置。然后将粘附有组织切片的基板存入储存部或二次处理系统中，并将新基板连接至端部执行器上。

在从样本块切下时，薄的组织切片倾向于卷曲成圆柱形构造，对于像显微镜这样需要切片是扁平的应用来说，这很难以自动化方式解开。在切片能够卷曲之前，通过在切片过程中将切片拉伸成稳定的平坦结构，可以避免这种现象。这可以通过在切片过程中运行泵和输送带114以将切片120粘附到例如多孔输送带114的转移材料而实现。输送带114的运动和孔间距的周期性可以用于平滑来自容积式泵的流体中的脉动，防止吸力集中在组织切片上的特定点。

可以仔细选择输送带孔隙度，以使得孔隙足够大，不会显著破坏进入CIM 110的流体，但足够小，以为脆弱的组织切片提供足够的支撑。塑料过滤网往往适用于此应用，孔径约为0.1-1毫米，具有耐腐蚀、耐用、生物相容性且便宜的附加好处。聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)和尼龙可以很好地工作。超声波焊接可用于连接带端部。

可以使用替代物理力来代替利用吸力/阻力吸引组织切片的有吸引力的流体力。这些包括电力，例如电泳或双向电泳、热泳、磁力、化学吸引力/附着力、和直接物理接触，例如使用柔和的机械夹持器，或其任何组合。例如，流体力吸引组织切片120，然后化学表面功能化促进对带114或薄膜130的短程附着力。该功能化需要化学键或静电吸引。可以修改缓冲溶液的离子成分和pH以调节组织切片120和基板之间相互作用的范围和强度，例如，基于德拜长度和电动电势的调节，使用低离子强度和低pH以促进带负电的组织和带正电的基板之间的更长范围和更强的静电相互作用。如图4C所示，也可以修改浴液116的密度，例如，调整切片的浮力并使它们漂浮在流体界面处。这是所希望的，因为该切片可以在界面处保持良好的延展，在该界面处可以容易地用平坦结构掠过。对于一些切片捕获配置，可以修改嵌入介质，例如，通过嵌入电介质或磁珠以控制切片上的力的大小和分布。这种珠子也可以用作图像配准标记。可以基于期望的分析进一步调节嵌入介质。例如，低熔点琼脂糖(LMA)可用作嵌入介质，因为它在不损害固定组织的温度下容易熔化。该机制可用于在不希望嵌入介质的应用中将捕获的组织切片与嵌入介质相隔离。例如，如果将多个组织切片放在载玻片上，可以移除嵌入介质，以最大化每个载玻片的切片数量，从而降低累积消耗在每个载玻片基础上的试剂或成像服务的成本。其他嵌入方法，包括渗入组织的方法，例如成分不仅仅是琼脂，还有水凝胶，可以用于改善切片。此外，这些嵌入方法可以帮助将组织交联到周围的琼脂/水凝胶块，以防止组织在被切片或转移时从琼脂块中弹出。

为了改善组织与其嵌入介质的键合，并确保切片捕获系统的完整组织切片的生产，可以将固定的组织样本嵌入已经用高碘酸钠氧化的琼脂糖(通常是4.5-6％)中，以促进与组织表面上的蛋白质形成键。随后可将样本块浸泡在丙烯酰胺和双丙烯酰胺单体的溶液中过夜，以渗透块和组织。然后在第二天将丙烯酰胺共聚物在40℃下进行2小时热聚合成聚丙烯酰胺，得到4-10％聚丙烯酰胺。能够以与聚丙烯酰胺相似的百分比添加HEMA共聚物，以减少水性缓冲液中的样本块由于吸水性而引起的膨胀。这些聚合物通过组织交联，产生更均匀的块并改善切片质量。

图4D示例了放置在与先前描述的实施例相反一侧的切片捕获系统150。切片捕获系统150可包括绞盘进气歧管180。绞盘进气歧管180可以从任何期望的方向吸引组织切片120。在一些实施例中，切片捕获系统150可以允许组织切片120以不同侧面朝上的方式安装。在各种实施例中，根据系统配置和集成，不同的配置可以允许在安装和间隙方面提供更好的通道。

图4E示例了与第二切片捕获系统150协同工作的第一切片捕获系统100。第二切片捕获系统150可包括第二歧管180。当使用具有不同形状或进气参数的两个或多个进气歧管110、180时，歧管可以协同使用，以更好地控制组织切片120的捕获机构和运输。例如，第二切片捕获系统150可用于选择性地将某些组织切片120转移到不同的储存区域或分析管道。在一些实施例中，两切片捕获系统100、150可以协同工作以受控方式翻转组织切片120。

绞盘设计简单有效，但对于某些带/CIM材料或装载条件，如果有必要，可以用滑轮410代替绞盘110，其中集成了类似的进气歧管。这种滑轮系统需要一个旋转液力耦合器和水下轴承或衬套，以使其随着水下带一起旋转，并且可能需要由更高摩擦的材料或集成正时带槽制成以确保带不会滑动(在这种情况下，可以将正时带条集成到多孔带/薄膜中)。

到目前为止所描述的系统配置在水性缓冲溶液中使用振动刀片切片机64，切割嵌入例如琼脂、琼脂糖、或聚丙烯酰胺、或水凝胶的水凝胶中的软组织。切片捕获系统的低温恒温器实施例可以使用相同的捕获机制，只不过它可以用振动刀片切片机64或切片机切割冷冻组织。可以选择液体缓冲液，以使得它可以在切片过程中保持组织样本冻结，例如使用液氮/异戊烷混合物，或其他一些过冷浴液。为了利用流体力轻柔地捕获组织切片，这种液体缓冲液是必要的。组织可以在标准的冷冻切片介质中快速冷冻，例如最佳切削温度化合物(OCT)。可以调节系统材料和使系统材料隔热，以在该较低的温度和存在显著温度梯度的情况下运行。可以调节光学系统以使用多光子显微镜对冷冻样本成像。冷冻切片的好处是可以将它们切得较薄，这对某些分析而言是理想的，并且还可以使用(不固定)新鲜组织，其有助于保持组织的生化成分。

从样本块中分离出切片后，将它们输送出浴液。为了防止不对称的力作用在样本上并使其方向在输送带上转换，可以精心设计CIM，以沿其长度施加大致均匀的流动。对称设计进一步确保了如果样本居中，作用在组织切片上的力是对称的。

一旦被捕获，重要的是能够将组织切片转移到所需的基板上用于储存、二次加工、或一般处理。这种基板的通常示例是显微镜载玻片，其便宜、小巧、并且很容易与许多标准实验室系统集成。在组织切片的位置已知之后，将组织切片移动到输送机的转移区域中。在这个区域中，将带通过皮带轮水平定向，输送机框架具有切口，以允许进入带。将该区域设计成在输送机框架的下侧上，并且表面张力足以将组织切片上下翻转。这允许将切片转移至载玻片的顶部表面，提供最大的通道空间用于从载玻片处理系统，并且还意味着重力将有助于组织切片的分离，由于它的力作用于切片本身，同时因为它作用于切片上的任何残留液体，以促进切片和其下方载玻片之间形成毛细管桥。

一旦进入转移位置，载玻片处理系统向上移动载玻片直到它轻轻接触组织切片，并且切片与载玻片表面完全共形。显微镜载玻片高度亲水，因此表面张力和重力将倾向于导致切片相比于塑料网优先粘附到载玻片上，塑料网通常根据材料是轻度亲水的或甚至是疏水的。在该点，将柔和的气体(通常是空气)喷射施加于多孔输送机的后侧，以帮助从带上分离切片。当气流冲击切片时，将载玻片缓慢降下，直到将切片完全从带脱离，并平放在载玻片上。

为了转移来自于用于储存或处理的切片捕获系统100的组织切片，表面张力用于将组织切片120操纵到位，并且可以经由气体喷射施加柔和的流体惯性力以将组织切片120无损坏的转移至邻近的孔、管、容器、基板、载玻片或薄膜。在图6A中示意性地描绘了这种情况。允许输送机上的组织切片120围绕驱动皮带轮128通过，直到它通过表面张力保持反方向。利用这种机制，组织切片120在受控气流系统的喷嘴或出口602下方通过。当组织切片120在气体出口602下方居中时，将空气或惰性气体的脉冲，例如，氮气或氩气，施加到多孔输送带114或薄膜130的后侧。气体流动通过带114或薄膜130中的孔并将与重力矢量相对准的分布流体惯性力施加到组织切片120的后侧。向下的力大约等于组织切片102的重量加上来自撞击气体射流的动量转移，其可以通过控制供气压力或气体速度来微调。使用的气体可以是任意惰性气体，虽然在大多数环境中空气是最简单和最安全的。它可以被压缩，或由鼓风机供应，并且可以通过压力或基于流量控制。可以改变气体喷射的动力学以帮助更干净地分离，例如，向上或向下倾斜流动，脉冲流体或移动喷嘴以遵循特定模式。位置传感器可用于反馈组织切片120在带114上的位置，并且可以帮助引导切片相对于气体出口区域的位置。将组织切片120描绘为被转移到孔612或平面基板，例如图6A中的载玻片614。图6B-C是气体出口602的CAD模型。目的是引导气流均匀地向下穿过带114。图6D是小鼠冠状脑切片的照片，其经由电磁阀控制利用压缩空气的脉冲从输送机转移到平面基板614。平面基板614是显微镜载玻片，其可以被处理以促进组织粘附，如图7A中示意性描绘的。

在某些情况下可能不需要喷气，并且表面张力/重力可以足以单独地将组织切片干净利落地分离到基板上。还可以调整表面张力以调节切片的粘合性能，例如，通过添加表面活性剂或调节毛细管桥的离子组成。

还可以通过消除组织切片和带之间的液体界面而破坏组织切片的粘附。这可以通过将带和切片浸没在液体中以消除界面而完成，此时，切片将根据如上关于图4C所述的切片和液体的密度(浮力)而下沉或漂浮。通常嵌入琼脂糖的样本比水更稠密，并且将下沉。这种分离机制非常柔和，对于较薄或更精细的样本可能是理想的。如果液体比切片更稠密，则切片将漂浮并在表面上展开，其对于操纵精细切片也是有用的。

代替气体喷射转移组织切片，使用者还可以使用液体喷射或流体流动系统705，如图7B所示。这对于达到双重目的是理想的，例如，在将组织切片120转移到孔612、管、或其他容器或基板710中的同时分配染色剂或缓冲剂。可以在机器人端部执行器上使用机械夹具或吸力提升机，以从带114或薄膜130拾取切片120并将其存放到储存部中。还可以使切片120与表面或基板710达成直接接触，该表面或基板710比捕获的切片120上的带114或膜130更亲水。这可以通过基板的移动或带的移动在各种实施例中实现。相比于没有毛细管桥的情况下，在组织切片和该基板710之间形成的毛细管桥可以更强地粘附切片，特别是切片在重力的帮助下在带114或薄膜130上倒转的情况下。这足以将切片130分离到该第二基板710上，轻柔的气体脉冲可以进一步帮助分离。

在一些实施例中，基板710可以涂有液体薄膜并向上移动，直到将切片浸没在液体薄膜中。该基板710可以用亲水或疏水表面功能化形成图案，以使得液体薄膜具有一致且受控的尺寸和形状，或者它可能受到浅孔的限制。可以将额外的液体施加到输送带的背面，以帮助将切片包封在液体中以消除毛细管桥。这种额外的液体也可以用于向切片施加流体惯性力以帮助分离。该流体组合物也可根据应用进行调节，例如包括表面活性剂、组织学染色、或各种缓冲，并且不必是水溶液。将组织切片捕获在流体薄膜中的潜在益处之一是流体界面可以帮助约束组织切片的构造，防止其卷曲或折叠。

所述转移系统的替代方案可以是使用如前所述并在图5和图6中描绘的卷轴到卷轴的布置。在这种配置中，切片120或者直接存储在卷轴133上，或者用模切刀401冲压出来，不需要任何技术将它们从最初捕获它们的多孔基板/薄膜/带上转移。

根据感兴趣的应用，组织切片120可以储存在各种各样不同的容器或基板中。两种最广泛期望的储存方法可以是直接储存在玻璃显微镜载玻片614上或在孔板612中。气体喷射转移技术具有高鲁棒性，因为它能够可靠地将组织切片120转移到平面基板614而不会损失构造，但通常也足以将切片存放入开口容器612中。作为替代，流体流动系统可用于将组织切片120从输送机分离到载玻片614或收集腔室612上。如图8A所描绘的，可以将切片120转移到显微镜载玻片614，其无处不在、紧凑存储、容易功能化、并与如盖拖鞋(cover-slippers)、染色机和载玻片扫描显微镜的自动化系统兼容，除了使用STPT获得的3D成像数据之外，还可以使整个切片、载玻片安装、染色、以及成像过程自动化。如图8B所描绘的，孔板612对于较厚的组织切片(>50微米)是理想的，因为许多二次分析使用需要切片在溶液中自由漂浮的染色技术。如图8C所描绘的，组织切片120也可以以线性阵列存储在二次薄膜条带132上，该线性阵列可以被输入其他系统。如果需要的话，每个基板、孔、管、或容器可以存储多个切片。

除了载玻片和孔阵列，可以将组织切片存放到组织储存管或定制孔阵列中。在切片将被冷冻以备将来分析的情况下，组织储存管是理想的。如果研究人员希望对单个组织切片进行二次分析，他/她不需要解冻整批组织样本，只需解冻感兴趣的特定管。在需要定制储存特征部的情况下，例如集成的流体通道、更高的储存密度、自定义几何形状，或与特定系统的兼容性，需要定制孔、基板，或者孔/基板阵列。

储存过程可以进一步自动化，在图9和图10中示意性地描绘了几个示例。图9A示出了用于将组织切片存放到孔板902中的布局。孔板902位于机动的XY平台910上，XY平台910将孔定位在切片捕获输送带114的转移区域下方。将组织切片存放到目标孔中。当板902装满后，XY平台910将其移动到拾取位置920，在该拾取位置920处，龙门式机器人925使用机械夹具927拾取孔板902并将其存储在旋转传送带930中。然后夹具927从圆盘传送带930抓住空的孔板902并将其更换到XY平台910上。图9A中的系统还可以用于组织储存管的支架或显微镜载玻片的阵列，可以使用XY平台910和龙门式机器人925以相同的方式操纵，并且存储在旋转传送带930中的架子上。在图9B中描绘设计用于处理各个显微镜载玻片的这种系统。将空白载玻片904放置在圆盘传送带930上并存放组织切片120。然后，通过具有机械夹具927的龙门式机器人925拾取组织切片位于其上的载玻片并将其放置在载玻片储存架940中。然后从供应架940取出新的空白载玻片904并在装载和卸载位置921处将其更换到圆盘传送带930上。假如相应地调节储存架，则该系统也可用于单个管、基板、或具有相同配置的储存容器。图10A和10B描绘了使用带状输送带的载玻片储存的替代实施例。图10A是示意性侧视图，图10B是系统的示意性俯视图。载玻片分配器1002使用被动机制将载玻片904放置在输送机1004上，并且该输送机1004在切片捕获系统输送机100的输送机114下方通过。将组织切片120转移到该二级输送机1004上的载玻片904上，其是逐渐移动的。具有机械夹具927或吸力提升机929(示出)的龙门式机器人拾取具有组织切片120的载玻片904并将其放入储存架1006中。

将该切片捕获技术设计成直接以STPT工作，以捕获在3D组织成像过程中产生的组织切片。这些切片可用于二次分析，从而在由STPT产生的亚细胞三维数据集上绘制多路复用生物分子信息，例如蛋白质分布。念在图11的流程图和图12中的信息图中描绘该三维分子映射概。可以在这些组织切片上进行各种二次分析阵列，包括：

·组织学染色

免疫组织化学染色

DAB(3,3'-二氨基联苯胺)协议

免疫荧光(IF)协议

用于成像质量细胞计数法(IMC)或多路复用离子束成像(MIBI)的同位素标记的抗体染色

DAPI(4'，6-二脒基-2-苯基吲哚)

苏木精和曙红(H&E)

尼氏

原位杂交(ISH)

荧光原位杂交(FISH)

·质谱分析

传统的

质谱成像(IMS/MSI)

IMC、MIBI

·基因组学

DNA的下一代测序(NGS)

·蛋白质组学

·转录组学

RNA的NGS

荧光原位测序(FISSEQ)

·代谢分析

·目标参与

·共同定位研究

·化学和分子分析

·电子显微镜

·光谱测定法

·光谱学

·显微解剖

·扩展显微镜

·ISH

·MerFish

·smFish

这些分析可以是结合切片捕获和储存系统的输出的半自动化或全自动化。例如，可以将孔板送入自动化液体处理系统中，以进行自由漂浮染色/标记和漂洗。显微镜载玻片可在用于全自动化二次标记和成像的自动化染色系统、盖拖鞋(cover slippers)、和载玻片扫描系统中使用。

这种分子映射技术的多个感兴趣的应用之一是在经由STPT识别的特定组织区域上进行扩展显微镜检查的能力。用户可以对整个器官成像，识别感兴趣的切片，然后将组织渗透并嵌入扩展显微镜介质中，并扩展组织以便以高分辨率对感兴趣的区域成像，例如察看神经元的树突棘。

作为独立的系统，切片捕获和储存对于任何组织学或病理学实验室来说都是很有价值的，这些实验室工作使用的组织样本需要用于切片的振动刀片切片机。组织切片的手动切片和处理是实验室中人为错误和可变性的主要原因，这项技术可以帮助标准化切片制备，提高一致性和生产量，并为组织病理学方法的进一步自动化提供技术桥梁。

重要的是，切片技术与我们的切片捕获系统结合使用，以确保生产高质量、完整的切片，并且能够一致地生产较薄的切片，这对于许多二次分析而言是理想的。例如，较薄的切片可以更快地染色，或用于与厚的切片不相容的成像方式。有几种技术可以改善由切片系统所生产的切片的质量。

第一种技术包括如图13A所描述的组织样本的双重嵌入。对于振动刀片切片机，通常将组织嵌入具有类似粘弹性的材料中，从而产生更均匀的切片材料。这可以最大限度地减少由于刚度或阻尼不匹配导致的问题，这些问题可能导致组织和嵌入介质之间的振动幅度、频率或相位的差异。这些不匹配会导致组织和嵌入介质之间界面处的应力集中，并导致组织分离或撕裂。然而，较硬的嵌入介质是理想的，因为其倾向于得到更好的切片。所提出的该技术包括首先将组织样本嵌入一个介质1302中，然后将该块嵌入第二个、更硬的介质1304中，该介质1304也可以被切片，例如更高浓度的琼脂糖。这种较硬的介质为样本块提供外部支撑，其有助于约束样本块的偏转并改善切片质量。在断裂力学中，裂纹很容易从较硬的材料传播到较软的材料，因此，样本块和外部介质之间的界面不应妨碍切割质量。在块的后缘，附加材料也将支撑切口的最后部分，以确保它从块干净利落地分离。目前，较薄的切片有时不会从后缘完全分离，并且晃来晃去地留在它们可能阻碍物镜并导致成像问题的地方。这是与钻穿工件进入到一块废料相同的概念，废料片在切口尾端提供支撑，其防止碎屑和磨损，并改善切割质量。

制造如图13B所描绘的较薄切片的另一种方法可以是在切片之前将支撑层添加到样本块的顶部。例如，如果想要10微米厚的切片，可以将40微米的支撑材料添加到块的顶部，并且可以采用50微米的切片。切片后可以去除支撑材料，仅留下10微米的组织切片。

另一种改善切片质量的简单方法是增加样本横向于刀片的相对速度。通常振动刀片切片机以恒定的法向速度将样本移入刀片，而刀片沿横向正弦振动，这会施加剪切力。法向和横向切割速度分量之间的好的平衡对最佳切片是必须的，Reyssat E,Tallinen T,LeMerrer M,Mahadevan L.Slicing Softly with Shear.Physical Review Letters.2012；109(24):244301，该出版物的内容通过引用并入本文。因为我们的横向速度分量是正弦曲线，沿速度与时间曲线有很多点，这些点处的横向速度瞬时接近零，其对于切割质量是不想要的。一种改善横向速度分量的方法是使刀片相对于样本的运动方向成角度(图13C)，这导致样本块的运动同时在刀片的法向和切向具有速度分量。此外，使用者可以相对于刀片以这种方式移动样本(图13D)，以便引入额外的横向速度。例如，可以将样本以一定角度驱动入刀片中，可以旋转样本，或者也可以将样本以三角波或正弦波模式前后移动，或这些运动的任何组合。这些运动可与刀片振动同步，以实现更稳固的切割。一种同步方法包括将样本安装到弯曲部分并使样本同相振动到振动刀片切片机。另一种配置是整合旋转台，并将样本旋转入刀片同时其也在振动。另一种配置是使用压缩机作为切片设备。

图14A和14B示例了自动化三维组织学映射。在组织样本上进行STPT。通过STPT捕获组织切片并传递到可以包括染色、成像、测序、或其他分子分析的二次分析。STPT数据与二次分析数据、以及例如器官图谱和动物谱系的其他参考信息相结合，并将数据传递至图像配准软件。软件将多路复用数据流映射至高分辨率STPT模板，产生分子注释的三维数据集。

图15描绘了自动化成像组织样本的切片，以产生组织样本的三维模型的方法1500。在一些实施例中，该方法可以包括在切片开始之前成像组织样本的块面的可选步骤1502。该方法可包括使用振动刀片切片机或切片机从块面切割切片的步骤1504。在各种实施例中，使用振动刀片切片机或切片机切割切片可以如上参照图2A所述进行。该方法可以包括将切片粘附到围绕皮带轮或绞盘进气歧管的输送带或运输系统的步骤1506。传送带或运输系统、皮带轮、以及绞盘进气歧管可以基本上类似于如上参照图2B、3A、3B和7所述的那些。

该方法可包括使用输送带或运输系统运输切片的步骤1508。切片的运输可以如上参照图2B、6、9和10所述使用输送带进行。该方法可包括将切片从输送带或运输系统转移到另一加工站和/或储存容器的步骤1510。例如，可以如关于图6A-6D所述的使用一股气体转移切片。在一些实施例中，可以将切片放置在例如基板、带、薄膜、或者带条的储存容器上或在如上参考图8A-8C所述的孔中。在一些实施例中，可以将切片转移到另一个加工站，例如载玻片转盘或参照图4A-B、5、9A-B和10A-B所述的其他成像系统。

该方法可包括通过包封在膜中来保护切片的可选步骤1512。在一些实施例中，如上参照图4和5所述，可以单独封装这些切片。该方法可以包括将二次分析应用于切片并成像切片的可选步骤1514。在一些实施例中，可以使用串行双光子断层扫描或其他多光子成像技术进行成像。可以如上参照图5、11和12所述实现染色和成像。

该方法可以包括迭代地重复先前步骤以创建一系列多个连续切片图像的步骤1516。可以如上所述实现切片的连续切片和运输，例如，先前参考图2-5。该方法可以包括分析该系列图像以创建组织样本的三维模型的步骤1518。三维模型可以包括形态学组织信息以及如上参照图12所述的由染色或二次分析确定的信息。

在一些实施例中，组织切片120可以包括外部信托标记1602、内部信托标记1604、或者如图16A中所示的两者的组合。在一些实施例中，信托标记1602、1604可以使得能够使用计算机视觉。计算机视觉可用于提取有关大小、位置、方向、和组织切片120的构造的信息，其可以帮助定位用于转移的切片和基板，以及作为切片质量指标反馈入系统。它还可以用于在将组织切片120转移到基板之后对其成像，以识别其位置、方向、或构造，以送入例如二次成像和图像配准的二次处理/分析。在一些实施例中，为了计算机视觉目的，可以调整嵌入介质以改善对比度，例如使用琼脂糖、丙烯酰胺、或其他水凝胶或与荧光团或几种不同荧光团结合的聚合物。这可以作为外部信托标记1602存在于整个块中或仅存在于特定区域中。这些区域可以制成不同的形状，从而帮助识别位置、方向、或组织切片120的构造。LED或其他光源1606可用于激发荧光团，具有发射滤光器1616的照相机1610可用于在带114上或在转移到基板之后对组织切片120成像。从这些图像、阈值和物体识别可用于确定输送带114或基板上的组织切片120的大小、位置、形状和方向。

识别组织切片120内的信托标记1602、1604的位置可以帮助确定组织切片120是否与输送带114相对齐，以及其是否为平放或其他理想的结构。在一些实施例中，输送带114可以经过照明或激励源1606而运输组织切片120。然后可以使用附接至处理单元1612的照相机1610对照射的组织切片120进行成像。在一些实施例中，可以将发射滤光器1616放置在照相机1610和组织切片120之间，以过滤来自组织切片120的光。在一些实施例中，处理单元1612可以包括物体识别模块1610，以在相机1610获取的图像内隔离和识别信托标记1602、1604。然后，处理单元1612可以将分析模块1612应用于图像，以在图像中识别信托标记1602、1604的位置。例如，可以为每个信托标记计算质心，并在x-y平面中分配坐标。每个识别出的信托标记1602、1604可以为1604分配其自己的坐标，直到为C^th标记分配坐标(x_c，y_c)。处理单元1612还可以包括输出或系统反馈模块1614。输出或系统反馈模块1614可以识别或计算每个成像的基准标记1602、1604的特征，包括面积、形状、方向、质心和局部变形。可以分析信托标记1614的特征，以确定是否需要调整振动刀片切片机64或切片捕获系统100以恢复正常操作。例如，如果组织切片120的阈值包括变形的、缺失的、或不正确的大小或形状的信托标记1602、1604，则可能需要对切片机或切片捕获系统100进行调整。

组织切片很薄、透明、潮湿，其在网格背景下很难感知到。对于数字检测信号，有几种类型的标准自动化传感器，当被适当调谐时可以工作，包括：

·漫射式光电传感器

·电容式接近传感器

·光泽传感器

定制光电传感器1660也可以工作并且可以调谐到如图16B所示的特定应用。特别是，激光二极管1650反射至输出到继电器或比较器电路1670中的光电晶体管1660上的浅角度反射可用于检测组织切片120，其将比网格背景具有更多的镜面反射。

为减少误报传感器信号的发生率，检测传感器1660可以被“门控”，以使得仅在组织切片120非常接近时才监测传感器状态。输送机114的初始运动可以用作粗略定位，并且传感器边缘检测程序可以用作精确定位以确定组织切片120的确切位置。在各种实施例中，还可以使用具有多个冗余传感器以减少误报的发生率。

可以采取多个步骤来改善组织切片相对于背景的对比度，包括使用不同的网状材料、不同的颜色、以及如前所述对嵌入材料进行调整。

计算机视觉也可用于识别输送带上的组织切片的位置和方向。在一些实施例中，照相机可以在特定的照明条件下使用各种滤光器，例如标准带通发射或偏振滤光器，对带成像，所述照明条件可能包括漫射光、暗视野、紫外线、红外线、偏振、或低角度光源(或其任意组合)，。一旦以良好的对比度清晰照亮切片，则可以使用阈值和物体识别算法来识别切片。计算机视觉可以用作传感器本身，以检测组织切片120的存在和位置，或者除数字传感器外，它还可以用于向系统提供附加信息。例如，可以将方向数据反馈到系统中，以使得可以在转移过程中进行纠正。组织切片的方向、尺寸、或形状的较大偏差也可以用作切片质量的指征并且可以触发系统中的错误。

图17示例了根据本文描述的各种实施例的切片捕获系统的渲染视图。

在各种实施例中，如图18A和18B所描绘的，可以使用载玻片储存转盘1800储存载玻片。可以使用4轴线SCARA机械臂完成载玻片处理和储存，其能够在X、Y、Z笛卡尔空间中沿具有围绕Z轴旋转的附加轴线移动端部执行器。机器人可以具有力控电动夹具，其允许在抓取载玻片时使用特定的力量，这在使用不同尺寸或形状的载玻片的情况下是有用的。例如，机器人可以通过减少抓力而操作盖玻片。

夹具工具是为处理显微镜载玻片而定制设计的，其由两个具有凹槽的细长指状物组成，显微镜载玻片的侧面安装入凹槽中。这些凹槽的尺寸符合典型载玻片(1.1mm)的公差，并且具有圆角边缘以引导载玻片边缘在轻微错位的情况下不发生碎裂或损坏地进入。凹槽沿指状物长度终止于特定距离，以为载玻片的端部提供一个硬挡块。

载玻片可以存放在小型多陶瓷机架中，其与商业染色和盖玻片系统相兼容，并且可以高压灭菌和重复使用。机架可以在载玻片平放的情况下垂直定向。这些机架可以是固定的、或安装在旋转传送带、执行器、或者平台，以将它们移入机器人机壳中或者移入更理想的机器人位置以存放载玻片，或者供用户靠近机架。它们也可以使用海绵或主动加湿器被封闭加湿。图18A和18B描绘了示例性封闭的旋转载玻片储存转盘1800。

为了从架中抓取载玻片，机器人夹具可以打开并移动到距离载玻片上目标抓取位置几毫米的位置。然后夹具可以闭合，直到它的间距略宽于滑块，以使得载玻片位于凹槽内，但没有施加夹紧力。在一些实施例中，这个间距可以约为1mm。如果载玻片错位，则这个初始运动的目的在于大致对准载玻片。接下来，夹具可以移动至载玻片上的目标抓取位置。工具足够靠近，以使得如果载玻片从机架突出机架太远，它将抓住凹槽端部的硬挡块并轻轻推入到位。一旦到位，夹具可以完全启动，以施加力夹住载玻片，在任何错位的情况下，其将进一步迫使载玻片进入凹槽。这种夹具运动和工具设计可以允许机器人补偿载玻片在其架位置内的任何错位。一旦抓住，载玻片移入将要转移的组织切片的位置。

一旦将切片转移至载玻片，则机器人将载玻片插回机架，完全打开以释放载玻片，然后缩回。夹具可以具有足够的范围操作25毫米或50毫米的载玻片。夹具工具可以足够细长，以不会干涉机架中相邻的载玻片，允许减少储存系统尺寸和占地面积的良好储存密度。

可以使用定义的局部坐标系向机器人教导载玻片机架位置，以使得每个机架仅需要教导一个点。电容式接近传感器、电感式传感器、或者光电传感器可以集成到端部执行器中并与机器人同步，以为教导程序提供半自动化定位反馈，或用于检测机架中是否存在载玻片。电动夹具还可以提供反馈以指示其是否到达其目标位置和目标夹具触发力，其可以用作指示是否抓住载玻片。

自动化切片捕获和储存系统包括若干元件，这些元件组合用于可控制地切片并将组织切片安装到例如显微镜载玻片的平面基板上。这些元件包括图1-18中一般示出的以下特征部。

1.一种能够将嵌入组织连续切片成可控厚度，几十微米级的振动切片机。

2.一种连接到循环泵的进气歧管，当由振动切片机产生组织切片时，该进气歧管将有吸引力的流体力施加到组织切片。

3.经由这些流体力粘附组织切片的多孔基板，包括水浴中的流体阻力，以及水浴外形成三相界面时的表面张力。

4.一种将组织切片运输出浴液的输送系统。输送带可以用作(3)中描述的多孔基板。

5.检测组织切片存在并记录其位置的传感器或照相机。

6.发生切片转移的输送带区域，包括：

a.输送带框架的切口，以允许直接进入输送带。

b.喷嘴安装成施加温和的惰性气体流过多孔基板并到达组织切片上以帮助分离。

7.基板(显微镜载玻片)操作和储存系统，包括

a.SCARA 4轴线机械臂

b.利用力控制的电动夹具

c.定制臂端工具

d.用于储存和操作基板的可拆卸机架

e.允许基板加湿数小时至数天的外壳。

8.对系统进行编程、控制，并同步的计算机或PLC，包括电子元器件和硬件，例如：

a.运动控制器

b.传感器

c.具有模拟和数字I/O的现场总线

d.电缆、接线端子、阀门、开关、继电器、安全硬件

图17所示的系统显示了如在以下示例中示例操作的转移系统，该示例为切片加工操作提供自动化控制：

1.用户将所有相关的操作参数输入到用于系统控制的软件GUI中，例如：

a.循环泵流量(0-1000ml/min，通常为350ml/min)

b.输送机速度(0-50mm/s，通常为9.5mm/s)

c.切片厚度(10-1000um，通常为50-100um)

d.切片频率(0-90Hz，通常为50-80Hz)

e.切片速度(0-20mm/s，通常为0.5mm/s)

f.样本长度(0-45mm，通常为22mm)

g.输送机定位参数(取决于系统设置)

h.切片数量(取决于储存容量，通常为240)

i.气体压力或流量参数(通常为60psi的压缩空气)

2.切片系统在软件中启动。

3.机器人从储存架抓取基板(显微镜载玻片)并将其移动到输送带的转移区域中的位置。

4.平台向上移动样品的期望厚度，振动切片机以其目标频率激活，并且平台以其指定的切片速度将样本移动到刀片中，以从样本块切片薄片组织。

5.在切片过程中，激活输送机和循环泵。输送机是多孔的、轻度亲水、和生物相容的。

6.将组织切片捕获到输送带上，在切片运动结束时，停用泵和振动切片机，并且输送机执行步进运动以将切片带入传感器区域。

7.然后输送机运动控制器利用传感器使用边缘寻找程序以搜索和检测组织切片的边缘。

8.一旦检测到组织切片，则输送机执行步进运动以将切片精确地放置在带的转移区域中。

9.机械臂使基板移动至与组织切片直接接触，其中表面张力和重力使其优先粘附到亲水基板上。然后启动气体喷嘴以将受控的气体爆裂排出到组织切片的背面上，以帮助将其干净利落地分离到基板上。

10.基板从带下降并且停用气体喷嘴。

11.然后将具有粘附组织切片的基板返回其储存架。

12.抓取序列中的下一块载玻片，并加载至下一切片位置。将平台重置至其原点位置，并重复该序列，直到达到目标切片数。

虽然已经参考其优选实施例具体示出和描述了本发明，但本领域技术人员应该理解的是，在不脱离由所附权利要求包含的本发明范围的情况下，可以作出其各种等同物或形式和细节的改变。

Claims (65)

1.一种用于处理生物样本的方法，包括：

对生物样本的一个或多个部分进行切片以形成一个或多个切片；

使用组织捕获设备将力施加至来自所述生物样本的所述一个或多个切片，以将所述一个或多个切片转移到运输材料上；并且

将切片从切片站运输至处理站或储存站。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述运输步骤包括将流体浴中的样本粘附至运输材料，并将所述材料移动至所述处理站。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，使用振动刀片切片机对所述样本进行切片。

4.根据权利要求1所述的方法，进一步包括数据处理器，对所述数据处理器进行编程，以控制切片设备和运输设备。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述组织捕获设备包括进气歧管。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述进气歧管包括位于流体浴中的绞盘。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述运输材料包括移动带。

8.根据权利要求5所述的方法，其中，所述进气歧管安装至具有一个或多个滑轮的框架，所述滑轮包括驱动滑轮。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述组织捕获设备包括多孔基板。

10.根据权利要求1所述的方法，进一步包括传感器，所述传感器感测所述运输材料上的切片。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，进气歧管联接至流体泵。

12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述转移材料包括将流体力施加到组织切片的多孔带或多孔基板。

13.根据权利要求10所述的方法，其中，所述传感器包括成像设备或照相机。

14.根据权利要求1所述的方法，进一步包括喷嘴，所述喷嘴引导气流以将组织切片与多孔基板分离。

15.根据权利要求1所述的方法，进一步包括机械臂，以运输例如载玻片的切片基板。

16.根据权利要求15所述的方法，进一步包括载玻片储存设备。

17.根据权利要求1所述的方法，进一步包括用计算机或控制器自动控制系统。

18.根据权利要求1所述的方法，进一步包括使用图形用户界面(GUI)和显示器来显示系统操作参数。

19.根据权利要求10所述的方法，其中，所述传感器利用边缘寻找程序进行操作，以检测切片的边缘。

20.根据权利要求1所述的方法，其中，系统控制器设置包括泵排量、带速度、切片厚度、切片频率、切片速度、和气流量的系统参数。

21.根据权利要求1所述的方法，其中，机械臂相对于带定位基板，以将切片安装到所述基板。

22.根据权利要求21所述的方法，其中，将惰性气体引导至所述切片上，以将所述切片粘附至所述基板。

23.根据权利要求1所述的方法，其中，照相机对每个切片进行成像，所成的图像被处理以确定移动带上的位置和方向。

24.根据权利要求23所述的方法，其中，光源照亮样本以便成像。

25.一种自动化的样品处理系统的方法，所述系统包括：

切片工具，所述切片工具用于从组织样本的块面切割用于处理的切片；

运输系统，所述运输系统运输样本的每个切片；

处理站，所述处理站从所述运输系统接收组织切片；

储存容器，所述储存容器存储样本；

成像设备，所述成像设备对每个切片进行成像；以及

数据处理器，所述数据处理器形成所述组织样本的三维表现形式。

26.根据权利要求25所述的系统，其中，所述运输系统是传送带。

27.根据权利要求26所述的系统，其中，所述传送带相对于绞盘进气歧管运动。

28.根据权利要求27所述的系统，其中，所述绞盘进气歧管具有圆柱形、楔形或细长形之一的横截面。

29.根据权利要求25所述的系统，进一步包括在进一步成像之前应用于所述切片的二次分析。

30.根据权利要求25所述的系统，其中，所述成像设备包括串行双光子断层扫描系统。

31.根据权利要求25所述的系统，其中，所述成像设备包括光学相干断层扫描系统。

32.根据权利要求25所述的系统，进一步包括薄膜，以保护包封在所述薄膜中的切片。

33.根据权利要求25所述的系统，其中，气源在切片处引导气体脉冲。

34.根据权利要求25所述的系统，进一步将流体源与来自运输系统的切片进行比较，包括在切片处引导流体。

35.根据权利要求25所述的系统，进一步包括施加到样本表面的包封流体。

36.根据权利要求25所述的系统，其中，将所述切片粘附至所述运输系统包括使所述运输系统的一部分功能化，以增强化学键合或静电吸引。

37.根据权利要求25所述的系统，其中，所述组织样本嵌入在琼脂、琼脂糖或聚丙烯酰胺或水凝胶中的至少一种中。

38.根据权利要求25所述的系统，其中，所述储存容器是孔、基板、带、带条或薄膜中的一种。

39.根据权利要求25所述的系统，进一步包括处理图像数据的数据处理器。

40.根据权利要求25所述的系统，进一步包括双光子显微镜成像系统。

41.根据权利要求25所述的系统，进一步包括振动刀片切片机。

42.根据权利要求25所述的系统，其中，所述组织捕获设备进一步包括多孔圆筒。

43.根据权利要求25所述的系统，进一步包括索引系统。

44.根据权利要求43所述的系统，其中，所述索引系统识别存储器设备中的每个切片图像和储存位置。

45.根据权利要求25所述的系统，其中，所述切片设备包括相对于支撑臂之间的间隙定位的刀片。

46.根据权利要求25所述的系统，其中，所述系统包括组织捕获设备。

47.根据权利要求46所述的系统，其中，所述组织捕获设备包括进气歧管、带和多孔元件。

48.根据权利要求47所述的系统，进一步包括光源，以照亮带上的样本以便成像。

49.根据权利要求25所述的系统，进一步包括薄膜包封系统。

50.一种对组织样本的切片自动成像以产生所述组织样本的三维模型的方法，包括：

使用振动刀片切片机从组织样本的块面进行切片；

将所切的切片粘附至运输系统；

使用所述运输系统运输所述切片；

将所述切片从所述运输系统转移至另一个处理站或储存容器；

对所述切片进行成像；

重复切片、粘附、运输、转移、和成像的步骤，以产生多个连续切片的一系列图像；并且

分析所述一系列图像以创建所述组织样本的三维模型。

51.根据权利要求50所述的方法，其中，所述运输系统是传送带。

52.根据权利要求50所述的方法，其中，所述成像步骤包括在带或薄膜上记录切片的图像。

53.根据权利要求51所述的方法，其中，所述传送带包括绞盘进气歧管。

54.根据权利要求53所述的方法，其中，所述绞盘进气歧管具有圆柱形、楔形或细长形之一的横截面。

55.根据权利要求50所述的方法，进一步包括在成像之前对所述切片应用二次分析。

56.根据权利要求50所述的方法，其中，对切片进行成像包括串行双光子断层扫描或多光子成像技术。

57.根据权利要求50所述的方法，进一步包括通过将所述切片包封在薄膜中而保护所述切片。

58.根据权利要求50所述的方法，其中，从所述运输系统转移所述切片包括在所述切片处引导气体脉冲。

59.根据权利要求50所述的方法，其中，将所述切片粘附至所述运输系统包括使所述运输系统的一部分功能化，以增强化学键合或静电吸引。

60.根据权利要求50所述的方法，其中，所述组织样本嵌入在琼脂、琼脂糖或聚丙烯酰胺中的至少一种中。

61.根据权利要求50所述的方法，其中，所述储存容器是孔、基板、带、带条或薄膜中的一种。

62.根据权利要求50所述的方法，进一步包括利用数据处理器处理光谱数据。

63.根据权利要求50所述的方法，进一步包括感测每个切片的边缘。

64.根据权利要求50所述的方法，进一步包括使用如权利要求25-49中任一项的系统来处理样本。

65.根据权利要求50所述的方法，进一步包括以多个成像模式对每个切片进行成像，可选地包括计算机断层扫描。