JP6984053B2 - マイクロ流体デバイスにおける細胞の凍結及び保管 - Google Patents

Description

[0001] 本開示は、一般に、マイクロ流体デバイスを用いて生体細胞を処理及び貯蔵することに関する。

[0002] マイクロ流体工学の分野が進展を続けるにつれて、マイクロ流体デバイスは、生体細胞のような微小物体を処理及び操作するための便利なプラットフォームになっている。たとえそうであっても、マイクロ流体デバイスの最大の可能性は、特に生物科学に適用される場合、いまだ実現されていない。例えば、マイクロ流体デバイスは生体細胞の分析に適用されているが、そのような細胞の貯蔵及び保管には、試験管やマイクロタイタープレート等の容器が使用され続けている。こういったタイプの容器（試験管及びマイクロタイタープレート）は、マイクロ流体デバイスと充分に適合しない。更に、それらは比較的大きいので高コストの冷凍庫空間の大きな部分を占有し、また、生体細胞の貯蔵及び保管に用いられる場合に高コストの細胞保存試薬を大量に必要とする。

[0003] 本明細書に開示された実施形態によれば、マイクロ流体デバイスにおいて生体細胞を処理及び貯蔵するための例示的な方法は、（ｉ）マイクロ流体デバイス内に、生体細胞を含む流動性媒体を導入することと、（ｉｉ）マイクロ流体デバイスの１つ以上の単離領域に流動性媒体からの１つ以上の生体細胞を隔離する（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒ）ことと、（ｉｉｉ）内部で隔離された１つ以上の生体細胞を含むマイクロ流体デバイスを凍結することと、を含む。マイクロ流体デバイスは、１つ以上の単離領域が流体接続されている流れ領域を含むことができる。マイクロ流体デバイス内にわずか１つだけの生体細胞を最初に隔離することも可能であるが、より典型的には、マイクロ流体デバイス内の複数の単離領域の各々に少なくとも１つの細胞が隔離される。更に、この方法の実施形態で用いられる典型的なマイクロ流体デバイスは、数十から数百、又はそれ以上までの任意の単離領域を有することができ、各単離領域は、（限定ではないが）約１．５×１０^５立方ミクロンから約１．５×１０^６立方ミクロンの範囲内の体積を有するので、約１０の細胞から約５０もの細胞を隔離することができる。一実施形態では、マイクロ流体デバイスを凍結する前に、マイクロ流体デバイスの第１の単離領域内の隔離された（「開始（ｓｔａｒｔｉｎｇ）」）細胞の１つ以上を培養して、適切な数の複数の「新しい」細胞（例えば少なくとも８、より好ましくは少なくとも１０、１６、２０、２４、３０、又はそれ以上の細胞）を第１の単離領域において生成することで、マイクロ流体デバイスの解凍後に第１の単離領域に少なくとも１つの生存細胞が存在することを可能とする。

[0004] 開示される方法を実施するために必須というわけではないが、好適な実施形態では、マイクロ流体デバイスを凍結する前に、マイクロ流体デバイスの内容の在庫目録を生成し、将来の検索及び参照のため記憶する。例えば在庫目録は、限定ではないが一例として、１つ以上の隔離された細胞の各々について、アイデンティティ（例えば、患者／被験者のサンプル番号等、隔離された細胞の起源）及び単離領域位置を含み得る。いくつかの実施形態において、在庫目録は、（ｉ）流動性媒体中の生体細胞がどのように取得されたか、（ｉｉ）マイクロ流体デバイス内に導入される前又は後に生体細胞に実行された処理が存在する場合はこの処理、（ｉｉｉ）単離チャンバ内で隔離された後に１つ以上の隔離された生体細胞に実行された処理が存在する場合はこの処理、及び（ｉｖ）そのような隔離前又は隔離後の処理の過程において得られたデータ、のうち１つ以上を識別する情報を更に含む。マイクロ流体デバイスは、バーコード、ステッカー、ＲＦＩＤ等の識別標識（ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｉｎｄｉｃｉａ）を含むことができ、デバイス在庫目録は、デバイスの識別標識を参照するデータベースに記憶することができる。この代わりに又はこれに加えて、デバイス在庫目録は、マイクロ流体デバイスに結合されてマイクロ流体デバイスと共に凍結されるメモリチップ（例えばＥＥＰＲＯＭ等）に記憶してもよい。

[0005] 様々な実施形態において、この方法は更に、（デバイスの凍結前に）マイクロ流体デバイス内にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ：ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）等の細胞保存試薬を導入することを含む。１つのそのような実施形態において、ＤＭＳＯは、マイクロ流体デバイスの凍結時に１つ以上の隔離された生体細胞が約１０％ＤＭＳＯを含有する溶液によって実質的に取り囲まれるように選択された濃度及び持続時間で、マイクロ流体デバイスに導入される。１つのそのような実施形態において、ＤＭＳＯは、（例えば、マイクロ流体デバイス内の流れ領域の体積と単離領域の全体積との比に応じて）体積で約１５％から約２５％の濃度でマイクロ流体デバイスに導入され、隔離された生体細胞を含む１つ以上の単離領域に拡散される。別のそのような実施形態において、ＤＭＳＯは、１つ以上の単離領域の各々において約１０％のＤＭＳＯ濃度を達成するのに充分な時間量、マイクロ流体デバイスをかん流させる（ｐｅｒｆｏｒａｔｅ）。

[0006] 様々な実施形態において、マイクロ流体デバイスを凍結することは、凍結温度付近（例えば約４℃）又は凍結温度（例えば約０℃）までのマイクロ流体デバイスの最初の制御冷却、及び、その後の氷点下の温度までのマイクロ流体デバイスの追加の冷却を含み得る。限定ではなく一例として、マイクロ流体デバイスの最初の制御冷却は、毎分約１℃〜毎分約２℃の範囲内の速度であり得るが、もっと遅い速度（例えば、毎分０．１℃）、又はもっと速い速度（例えば、毎分３℃以上）を用いてもよい。様々な実施形態において、氷点下の温度は約−２０℃以下であり、より好適には約−８０℃以下であり、いくつかの実施形態では約−１５０℃以下を含む。

[0007] この方法は更に、（ｉ）マイクロ流体デバイスの制御加熱及び（ｉｉ）マイクロ流体デバイスを室温まで自己加熱させることの一方又は双方によって、マイクロ流体デバイスを解凍することを含み得る。これは、解凍後に、隔離された細胞をテスト、評価、アッセイ、シークエンシング、及び／又は別のやり方で使用するため行われる。例えばいくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスを解凍した後、この方法は、（例えばマイクロ流体デバイスに流動性細胞成長媒体を連続的に又は間欠的にかん流させることで）マイクロ流体デバイス内で１つ以上の生存細胞を培養し、これによって追加の細胞を生成することを含む。そのような実施形態において、この方法は（解凍後に）、マイクロ流体デバイスを解凍した後に、１つ以上の隔離された細胞及び／又はそこから生成した細胞のうちどれが生存しているか識別すること、及び／又は、マイクロ流体デバイスから、少なくとも１つの隔離された細胞及び／又はそこから生成した細胞を検索することを更に含み得る。一例として、解凍後、マイクロ流体デバイスにおいて１つ以上の細胞のアッセイを実行して、細胞分泌物（例えば、抗体もしくはサイトカインを含む免疫学的分子）又は細胞表面マーカを検出することができる。

[0008] いくつかの実施形態において、この方法は、汚染及び／又は細胞の貼り付きを軽減するように調節された内面の１つ以上（例えば基板表面、カバー表面、及び／又は回路材料の表面）を有するマイクロ流体デバイスに対して実行され得る。例えば、流れ領域及び１つ以上の単離領域をブロッキング溶液で処理して、汚染を防止及び／又は細胞接着を軽減することができる。このため、ブロッキング溶液は、血清、血清アルブミン（例えばＢＳＡ）、ポリマー、洗剤、酵素、又はそれらの任意の組み合わせ等、１つ以上の内面に結合するブロッキング剤を含み得る。

[0009] いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスは、コーティング材料を含む内側基板表面（及び／又は内側カバー表面及び／又は回路材料の内面）を含み得る。いくつかの実施形態において、コーティング材料は、連結基及びアルキル部分を有する分子を含む。連結基は内側基板表面に共有結合することができ、例えばシロキシ連結基であり得る。アルキル部分は、例えば非置換アルキル部分、又はフルオロアルキル部分もしくはペルフルオロアルキル部分のような置換アルキル部分であり得る。アルキル部分は、少なくとも１０の炭素原子（例えば少なくとも１２、１４、１６、１８、２０、２２、又はそれ以上の炭素原子）を含む炭素の直鎖を含み得る。コーティング材料の分子は、内側基板表面に共有結合している高密度充填（ｄｅｎｓｅｌｙ−ｐａｃｋｅｄ）単層構造を形成することができる。

[0010] いくつかの実施形態において、コーティング材料は、連結基及びカチオン性部分及び／又はアニオン性部分を有する分子を含み、連結基は、内側基板表面（及び／又は内側カバー表面及び／又は回路材料の内面）に共有結合している。カチオン性部分は第４級アンモニウム基を含み得る。アニオン性部分は、ホスホン酸、カルボン酸、又はスルホン酸を含み得る。いくつかの関連する実施形態において、コーティング材料は、連結基及び両性イオン部分を有する分子を含むことができ、連結基は、内側基板表面（及び／又は内側カバー表面及び／又は回路材料の内面）に共有結合している。両性イオン部分は、カルボキシベタイン、スルホベタイン、スルファミン酸、及びアミノ酸から選択される。いくつかの実施形態において、カチオン性部分、アニオン性部分、及び両性イオン部分は、ブロッキング剤とイオン結合することができる。

[0011] いくつかの実施形態において、コーティング材料は、アルキレンエーテル部分、サッカライド部分、又はアミノ酸部分を含むポリマーを含む。例えば、コーティング材料はデキストランを含み得る。この代わりに又はこれに加えて、コーティング材料はポリエチレングリコールを含み得る。

[0012] 開示される本発明の実施形態のその他及び更に別の態様及び特徴は、添付図面を参照した以下の詳細な説明から明らかとなろう。

[0013] 生体細胞を培養するためのマイクロ流体デバイスを含むシステムの例示的な実施形態の斜視図である。 [0014] 図１Ａのマイクロ流体デバイスの側断面図である。 [0015] 図１Ａのマイクロ流体デバイスの水平断面図である。 [0016] 誘電泳動（ＤＥＰ：ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）構成を有するマイクロ流体デバイスの実施形態の側断面図である。 [0017] 図１Ｄのマイクロ流体デバイスの一実施形態の水平断面図である。 [0018] 図１Ａのマイクロ流体デバイスにおいて使用され得る単離チャンバの一例を示し、流れチャネルから単離チャンバまでの接続領域の長さは、流れチャネルを流れる媒体の侵入深さよりも大きい。 [0019] 図１Ａのマイクロ流体デバイスにおいて使用され得る単離チャンバの別の例を示し、流れチャネルを流れる媒体の侵入深さよりも長い流れチャネルから単離チャンバまでの接続領域を含む。 [0020] マイクロ流体デバイスの別の実施形態を示し、デバイス内で用いられる単離チャンバの別の例を含む。 [0020] マイクロ流体デバイスの別の実施形態を示し、デバイス内で用いられる単離チャンバの別の例を含む。 [0020] マイクロ流体デバイスの別の実施形態を示し、デバイス内で用いられる単離チャンバの別の例を含む。 [0021] 基板及びデバイスカバーの双方の内面に共有結合しているコーティング材料を有するマイクロ流体デバイスの実施形態を示す。 [0022] マイクロ流体デバイスにおいて生体細胞を処理し、（凍結によって）貯蔵し、解凍し、更に処理する例示的な方法の概略フロー図である。 [0023] マイクロ流体デバイスにおいて隔離した生体細胞の在庫目録を生成し記憶する例示的な方法の概略フロー図である。 [0024] 内部で隔離された１つ以上の生体細胞を含むマイクロ流体デバイスを凍結する例示的な方法の概略フロー図である。 [0025] 内部で隔離された１つ以上の生体細胞を含む凍結したマイクロ流体デバイスを解凍する例示的な方法の概略フロー図である。

[0026] この明細書は本発明の例示的な実施形態及び適用例を記載する。しかしながら本発明は、これらの例示的な実施形態及び適用例に限定されず、これらの例示的な実施形態及び適用例が動作するやり方にも本明細書で記載されるやり方にも限定されない。更に、図面は簡略化された図又は部分的な図を示すことがあり、図面における要素の寸法は、明確さのため誇張されているか又は別の方法で比例して示されていないことがある。更に、「〜の上に（ｏｎ）」、「〜に取り付けられている（ａｔｔａｃｈｅｄ ｔｏ）」、又は「〜に結合されている（ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｏ）」という言葉が本明細書で用いられる場合、１つの要素（例えば材料、層、基板等）は、別の要素「の上に」あるか、「に取り付けられている」か、又は「に結合されている」可能性があり、この場合、１つの要素が別の要素の直接上にあるか、取り付けられているか、もしくは結合されているか、又は１つの要素と別の要素との間に１つ以上の介在する要素があるか否かは関係ない。また、方向（例えば、上方（ａｂｏｖｅ）、下方（ｂｅｌｏｗ）、上部（ｔｏｐ）、下部（ｂｏｔｔｏｍ）、側方（ｓｉｄｅ）、上へ（ｕｐ）、下へ（ｄｏｗｎ）、〜の下に（ｕｎｄｅｒ）、〜の上に（ｏｖｅｒ）、〜より上（ｕｐｐｅｒ）、〜より下（ｌｏｗｅｒ）、水平方向（ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ）、垂直方向（ｖｅｒｔｉｃａｌ）、「ｘ」、「ｙ」、「ｚ」等）が与えられる場合、これらは相対的なものであり、単に例示のため、並びに例示及び検討を容易にするために与えられ、限定ではない。更に、要素の列挙（例えば要素ａ、ｂ、ｃ）に言及する場合、そのような言及は、列挙した要素自体のいずれか１つ、列挙した要素の一部のものの組み合わせ、及び／又は列挙した要素の全ての組み合わせを含むことが意図される。

[0027] 本明細書における項目の分割は、検討を容易にすることだけを目的とし、考察される要素の任意の組み合わせを限定するものではない。

[0028] 本明細書で用いる場合、「実質的に」は、意図する目的のため機能するのに充分であることを意味する。従って、「実質的に」という言葉は、絶対的な又は完璧な状態、寸法、測定値、結果等からの小さい有意でない変動であって、当業者によって予想されるが全体的な性能に認め得るほどの影響を及ぼさないものを考慮に入れている。数値又はパラメータ、又は数値として表現できる特性に関連付けて用いられる場合、「実質的に」は１０パーセント内を意味する。「１つ（複数）（ｏｎｅｓ）」という言葉は、２つ以上を意味する。

[0029] 本明細書で用いる場合、「微小物体（ｍｉｃｒｏ−ｏｂｊｅｃｔ）」という言葉は、以下のうち１つ以上を包含することができる：微小粒子、マイクロビーズ（例えばポリスチレンビーズ、Ｌｕｍｉｎｅｘ（商標）ビーズ等）、磁性ビーズ、常磁性ビーズ、マイクロロッド（ｍｉｃｒｏｒｏｄ）、マイクロワイヤ（ｍｉｃｒｏｗｉｒｅ）、量子ドット等の無生物の微小物体；細胞（例えば胚、卵母細胞、精子、組織から解離された細胞、血液細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、樹枝状細胞（ＤＣ）等を含む免疫細胞、ハイブリドーマ、培養細胞、組織から解離された細胞、トランスフェクション及び／又は形質転換されている可能性のあるＣＨＯ細胞等の細胞株からの細胞、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ：ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ）を含むがん細胞、感染細胞、レポーター細胞等）、リポソーム（合成もしくは膜調製から得られる）、脂質ナノラフト（ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｒａｆｔ）等の生物学的な微小物体；又は、無生物の微小物体と生物学的な微小物体の組み合わせ（例えば、細胞に付着させたマイクロビーズ、リポソームでコーティングしたマイクロビーズ、リポソームでコーティングした磁性ビーズ等）。脂質ナノラフトは、例えばＲｉｔｃｈｉｅ等（２００９年）の「Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ Ｂｉｌａｙｅｒ Ｎａｎｏｄｉｓｃｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、４６４：２１１−２３１に記載されている。ビーズは更に、アッセイで使用できる、蛍光標識、タンパク質、小分子シグナリング部分、抗原、又は化学種／生物学的種等、共有結合又は非共有結合の他の部分／分子も有し得る。

[0030] 本明細書で用いる場合、「細胞」という言葉は生体細胞を指し、植物細胞、動物細胞（例えば哺乳類細胞）、細菌細胞、真菌細胞等であり得る。哺乳類細胞は、例えばヒト、マウス、ラット、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、霊長類等からのものであり得る。

[0031] 本明細書で用いる場合、「細胞（複数の細胞）を維持する」という言葉は、流体成分及び気体成分の双方を含むと共に、任意選択的に、細胞を生存可能に及び／又は拡大状態に維持するのに必要な条件を与える表面も含む環境を提供することを示す。

[0032] 流体媒体の「成分」は、媒体内に存在するいずれかの化学的又は生化学的分子であり、溶媒分子、イオン、小分子、抗生物質、ヌクレオチド及びヌクレオシド、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖類、炭水化物、脂質、脂肪酸、コレステロール、代謝産物等を含む。

[0033] 流体媒体に関して本明細書で用いる場合、「拡散する」及び「拡散」は、流体媒体の成分が濃度勾配に沿って熱力学的に移動することを指す。

[0034] 「媒体の流れ」という語句は、主に拡散以外のいずれかの機構による流体媒体のバルク移動を指す。例えば、媒体の流れは、流体媒体が１つのポイントから別のポイントへ、それらのポイント間の圧力差のために移動することを含み得る。そのような流れは、液体の連続的な流れ、パルス状の流れ、周期的な流れ、ランダムな流れ、間欠的な流れ、又は往復の流れ、又はそれらの任意の組み合わせを含む可能性がある。１つの流体媒体が別の流体媒体内へ流れる場合、結果として媒体の乱流及び混合が生じ得る。

[0035] 「実質的に流れがない」という語句は、経時的に平均した流体媒体の流れの速度が、流体媒体内への又は流体媒体内での材料の成分（例えば対象のアナライト（ａｎａｌｙｔｅ））の拡散速度未満であることを指す。そのような材料の成分の拡散速度は、例えば、温度、成分の大きさ、及び成分と流体媒体との相互作用の強度に依存し得る。

[0036] マイクロ流体デバイス内の異なる領域に関して本明細書で用いる場合、「流体接続されている」という語句は、それらの異なる領域が流体媒体のような流体で実質的に充填されている場合、各領域内の流体が流体の単体（ｓｉｎｇｌｅ ｂｏｄｙ）を形成するように接続されていることを意味する。これは、異なる領域内の流体（又は流体媒体）の組成が必ずしも同一であることを意味していない。むしろ、マイクロ流体デバイスの流体接続された異なる領域内の流体は、溶質がそれぞれの濃度勾配に沿って移動する及び／又は流体がデバイス内を流れるので流動的である異なる組成を有し得る（例えば、タンパク質、炭水化物、イオン、又は他の分子のような溶質の異なる濃度）。

[0037] いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスは、「一掃される（ｓｗｅｐｔ）」領域と「一掃されない（ｕｎｓｗｅｐｔ）」領域とを備え得る。一掃される領域と一掃されない領域との間で媒体の拡散は可能であるが実質的に媒体の流れはないように流体接続が構築されるならば、一掃されない領域は一掃される領域に流体接続され得る。従ってマイクロ流体デバイスは、一掃される領域内の媒体の流れから一掃されない領域を実質的に分離しながら、一掃される領域と一掃されない領域との間で実質的に拡散による流体連通のみを可能とするように構築することができる。

[0038] 本明細書で用いる場合、「マイクロ流体チャネル」又は「流れチャネル」は、水平方向及び垂直方向の双方の寸法よりも実質的に大きい長さを有するマイクロ流体デバイスの流れ領域を指す。例えば、流れチャネルは、水平方向又は垂直方向のいずれかの寸法の長さの少なくとも５倍とすることができ、例えば長さの少なくとも１０倍、長さの少なくとも２５倍、長さの少なくとも１００倍、長さの少なくとも２００倍、長さの少なくとも３００倍、長さの少なくとも４００倍、長さの少なくとも５００倍、又はそれ以上の長さである。いくつかの実施形態では、流れチャネルの長さは、約２０，０００ミクロンから約１００，０００ミクロンの範囲内であり、それらの間のいずれの範囲も含む。いくつかの実施形態では、水平方向の寸法は約１００ミクロンから約３００ミクロンの範囲内であり（例えば約２００ミクロン）、垂直方向の寸法は約２５ミクロンから約１００ミクロンの範囲内であり、例えば約４０から約５０ミクロンである。流れチャネルはマイクロ流体デバイスにおいて多種多様な異なる空間構成を有することができるので、完璧な線形の要素に制限されないことに留意すべきである。例えば流れチャネルは、曲線、屈曲、らせん、傾斜、下り勾配、フォーク（例えば複数の異なる流路）、及びそれらの組み合わせの形状を有する１つ以上のセクションであるか、又はこれを含み得る。更に、流れチャネルは、経路に沿って異なる断面積を有し、幅が拡大及び縮小して、所望の流体流を与えることも可能である。

[0039] いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスの流れチャネルは、一掃される領域（上記で定義されている）の一例であり、マイクロ流体デバイスの単離領域（以下で更に詳しく説明する）は、一掃されない領域の一例である。

[0040] 生物学的微小物体（例えば生体細胞）が特定の生物学的物質（例えば抗体のようなタンパク質）を生成する能力を、そのようなマイクロ流体デバイスにおいてアッセイすることができる。例えば、対象のアナライトの生成についてアッセイされる生物学的微小物体（例えば細胞）を含むサンプル物質を、マイクロ流体デバイスの一掃される領域に挿入することができる。生物学的微小物体の１つ（例えばヒトの細胞のような哺乳類細胞）を、特定の特性のため選択し、一掃されない領域に配置することができる。次いで、一掃される領域から残りのサンプル物質を流出させ、一掃される領域にアッセイ物質を流入させることができる。選択した生物学的微小物体は一掃されない領域にあるので、残りのサンプル物質の流出によってもアッセイ物質の流入によっても実質的に影響を受けない。選択した生物学的微小物体に対象のアナライトを生成させ、これは一掃されない領域から一掃される領域へ拡散する。ここで、対象のアナライトはアッセイ物質と反応して検出可能な局所反応を生成する。この反応の各々を、特定の一掃されない領域に相関付けることができる。検出された反応に関連付けた一掃されない領域を分析して、一掃されない領域内の生物学的微小物体のいずれかが対象のアナライトを充分に生成するものであると判定できる。

[0041] マイクロ流体デバイスを含むシステム 図１Ａ〜図１Ｃは、本明細書に記載される方法において使用できるマイクロ流体デバイス１００を有するシステムの一例を示す。図示のように、マイクロ流体デバイス１００は、相互接続された複数の流体回路要素を備えたマイクロ流体回路１３２を包囲している。図１Ａ〜図１Ｃに示す例では、マイクロ流体回路１３２は、単離チャンバ１３６、１３８、１４０が流体接続されている流れチャネル１３４を含む。図示する実施形態では１つの流れチャネル１３４及び３つの単離チャンバ１３６、１３８、１４０が示されているが、代替的な実施形態では、２つ以上の流れチャネル１３４、及び３つよりも多いか又は少ない単離チャンバ１３６、１３８、１４０があり得ることは理解されよう。マイクロ流体回路１３２は、流体チャンバ、貯蔵容器のような追加の又は異なる流体回路要素も含むことができる。

[0042] マイクロ流体デバイス１００は、１つ以上の流体媒体を含有し得るマイクロ流体回路１３２を包囲する筐体（ｅｎｃｌｏｓｕｒｅ）１０２を備えている。デバイス１００は物理的に異なる構造であり得るが、図１Ａ〜図１Ｃに示す実施形態では、筐体１０２は、支持構造１０４（例えばベース）、マイクロ流体回路構造１１２、及びカバー１２２を含む。支持構造１０４、マイクロ流体回路構造１１２、及びカバー１２２は、相互に取り付けることができる。例えば、支持構造１０４の上にマイクロ流体回路構造１１２を配置し、マイクロ流体回路構造１１２の上にカバー１２２を配置することができる。支持構造１０４及びカバー１２２によって、マイクロ流体回路構造１１２はマイクロ流体回路１３２を画定できる。マイクロ流体回路１３２の内面は、図面において１０６で識別されている。

[0043] 図１Ａ及び図１Ｂに示すように、支持構造１０４はデバイス１００の下部にあり、カバー１２２は上部にある。あるいは、支持構造１０４及びカバー１２２は他の向きであり得る。例えば、支持構造１０４がデバイス１００の上部にあり、カバー１２２が下部にあることも可能である。構成とは無関係に、１つ以上の流体アクセス（すなわち流入及び流出）ポート１２４が設けられている。各流体アクセスポート１２４は、マイクロ流体回路１３２と連通している通路１２６を含み、これによって流体物質が筐体１０２へ流入するか又は筐体１０２から流出することができる。流体通路１２６は、弁、ゲート、貫通孔等を含み得る。図示する実施形態では２つの流体アクセスポート１２４が示されているが、デバイス１００の代替的な実施形態は、マイクロ流体回路１３２内への及びマイクロ流体回路１３２外への流体物質の流入及び流出を可能とする流体アクセスポート１２４を１つだけ又は３つ以上有し得ることは理解されよう。

[0044] マイクロ流体回路構造１１２は、マイクロ流体回路１３２の回路要素、又は筐体１０２内に位置付けられた他のタイプの回路を、画定するか又は他の方法で収容することができる。図１Ａ〜図１Ｃに示す実施形態において、マイクロ流体回路構造１１２は、フレーム１１４及びマイクロ流体回路材料１１６を含む。

[0045] 支持構造１０４は、１つの基板又は相互接続された複数の基板を含み得る。例えば支持構造１０４は、１つ以上の相互接続された半導体基板、プリント回路基板（ＰＣＢ）等、及びそれらの組み合わせ（例えばＰＣＢに搭載された半導体基板）を含み得る。フレーム１１４は、部分的に又は全体的にマイクロ流体回路材料１１６を包囲し得る。フレーム１１４は例えば、マイクロ流体回路材料１１６を実質的に取り囲む比較的剛性の構造とすることができる。例えば、フレーム１１４は金属材料を含み得る。

[0046] マイクロ流体回路材料１１６は、キャビティ等をパターニングすることで、マイクロ流体回路１３２のマイクロ流体回路要素及び相互接続を画定できる。マイクロ流体回路材料１１６は、ガス透過性であり得る可撓性材料（例えばゴム、プラスチック、エラストマ、シリコーン、ポリジメチルシロキサン（「ＰＤＭＳ：ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ」）等）を含むことができる。マイクロ流体回路材料１１６を構成し得る材料の他の例には、成形ガラス、シリコン（例えば光パターニング可能シリコン）等のエッチング可能材料、フォトレジスト（例えばＳＵ８）等が含まれる。いくつかの実施形態では、そのような材料、従ってマイクロ流体回路材料１１６は、剛性であり得る及び／又はガスに対して実質的に不透過性であり得る。使用する材料（複数の材料）とは無関係に、マイクロ流体回路材料１１６は、支持構造１０４上でフレーム１１４内に配置されている。

[0047] カバー１２２は、フレーム１１４及び／又はマイクロ流体回路材料１１６と一体的な部分とすることができる。あるいは、カバー１２２は構造的に別個の要素とすることも可能である（図１Ａ及び図１Ｂに示すように）。カバー１２２は、フレーム１１４及び／又はマイクロ流体回路材料１１６と同一であるか又は異なる材料を含み得る。同様に、支持構造１０４は、図示のようにフレーム１１４もしくはマイクロ流体回路材料１１６とは別個の構造とするか、又はフレーム１１４もしくはマイクロ流体回路材料１１６と一体的な部分とすることができる。同様に、フレーム１１４及びマイクロ流体回路材料１１６は、図１Ａ〜図１Ｃに示すような別個の構造、又は同一の構造の一体的な部分とすることができる。いくつかの実施形態では、カバー又は蓋１２２は剛性材料から作製される。剛性材料はガラス等とすればよい。いくつかの実施形態では、剛性材料は導電性である（例えばＩＴＯでコーティングしたガラス）、及び／又は、細胞の接着、生存、及び／又は成長をサポートするように変更され得る。この変更は、合成ポリマー又は天然ポリマーのコーティングを含み得る。いくつかの実施形態では、図１Ａ〜図１Ｃの各単離チャンバ１３６、１３８、１４０の上に位置決めされているカバーもしくは蓋１２２の一部、又は図２、図３、及び図４に示す後述の実施形態における均等物は、限定ではないが、ＰＤＭＳを含む変形可能材料で作製される。従って、カバー又は蓋１２２は、剛性部分及び変形可能部分の双方を有する複合構造であり得る。いくつかの実施形態では、カバー１２２及び／又は支持構造１０４は光に対して透過性である。

[0048] カバー１２２は、限定ではないが、ＰＤＭＳを含むガス透過性の少なくとも１つの材料も含み得る。

[0049] 他のシステム構成要素 図１Ａは、マイクロ流体デバイス１００と共に利用することができ、併せて生体細胞培養のためのシステムを提供する制御／監視システム１７０の簡略化ブロック図も示している。（概略的に）図示するように、制御／監視システム１７０は、制御モジュール１７２及び制御／監視機器１８０を含む。制御モジュール１７２は、直接に及び／又は制御／監視機器１８０を介してデバイス１００を制御及び監視するように構成することができる。

[0050] 制御モジュール１７２は、コントローラ１７４及びメモリ１７６を含む。コントローラ１７４は、例えばデジタルプロセッサ、コンピュータ等とすることができ、メモリ１７６は、例えば、データ及び機械実行可能命令（例えばソフトウェア、ファームウェア、マイクロコード等）を非一時的（ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｉｔｏｒｙ）データ又は信号として記憶するための非一時的デジタルメモリとすることができる。コントローラ１７４は、メモリ１７６に記憶されたそのような機械実行可能命令に従って動作するように構成できる。この代わりに又はこれに加えて、コントローラ１７４は、配線デジタル回路及び／又はアナログ回路を含み得る。従って制御モジュール１７２は、本明細書に記載する方法において有用ないずれかのプロセス、そのようなプロセスのステップ、機能、作用、又は本明細書で検討される同種のものを（自動的に、又はユーザ指示による入力に基づいて）実行するように構成できる。

[0051] 制御／監視機器１８０は、マイクロ流体デバイス１００及びマイクロ流体デバイス１００によって実行されるプロセスを制御又は監視するための多数の異なるタイプのデバイスのいずれかを含み得る。例えば、制御／監視機器１８０は、マイクロ流体デバイス１００に電力を与えるための電源（図示せず）；マイクロ流体デバイス１００に流体媒体を与えると共にマイクロ流体デバイス１００から媒体を除去するための流体媒体源（図示せず）；非限定的な例として、マイクロ流体回路１３２内の微小物体（図示せず）の選択及び移動を制御するための選択制御モジュール（後述する）のような動力モジュール；非限定的な例として、マイクロ流体回路１３２の内部の（例えば微小物体の）画像をキャプチャするための検出器（後述する）のような画像キャプチャ機構；非限定的な例として、マイクロ流体回路１３２にエネルギを誘導して反応を刺激するための、図１Ｄに示す実施形態の後述する光源３２０のような刺激機構を含み得る。

[0052] より具体的には、画像キャプチャ検出器は、流れ領域におけるイベントを検出するための１つ以上の画像キャプチャデバイス及び／又は機構を含むことができる。流れ領域には、限定ではないが、図１Ａ〜図１Ｃ、図２、及び図３に示す実施形態の流れチャネル１３４、図４Ａ〜図４Ｃに示す実施形態の流れチャネル４３４、図１Ｄ〜図１Ｅに示す実施形態の流れ領域２４０、及び／又は図示される各マイクロ流体デバイス１００、３００、及び４００の単離チャンバが含まれ、これらは、各流れ領域及び／又は単離チャンバを占有する流体媒体に含有されている微小物体を含む。例えば、検出器は、流体媒体中の微小物体（図示せず）の（例えば蛍光及び発光による）１つ以上の放射特性を検出することができる光検出器を含み得る。そのような検出器は、例えば、媒体中の１つ以上の微小物体（図示せず）が電磁放射を放出していること、及び／又はその放射のおおよその波長、輝度、強度等を検出するように構成することができる。検出器は、可視光、赤外腺、又は紫外腺の波長下で画像をキャプチャできる。適切な光検出器の例には、限定ではないが、光電子増倍管検出器及びアバランシェ光検出器が含まれる。

[0053] 検出器が含み得る適切な撮像デバイスの例には、電荷結合素子及び相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）撮像装置のようなデジタルカメラ又は光検知器が含まれる。そのようなデバイスを用いて画像をキャプチャし、解析することができる（例えば、制御モジュール１７２及び／又は人のオペレータによって）。

[0054] 流れコントローラは、図示される各マイクロ流体デバイス１００、３００、及び４００の流れ領域／流れチャネル／一掃される領域における流体媒体の流れを制御するように構成することができる。例えば、流れコントローラは流れの方向及び／又は速度を制御できる。流れコントローラのそのような流れ制御要素の非限定的な例には、ポンプ及び流体アクチュエータが含まれる。いくつかの実施形態において、流れコントローラは、例えば流れ領域／流れチャネル／一掃される領域における流れの速度及び／又は媒体のｐＨを検知するための１つ以上のセンサ等、追加の要素を含み得る。

[0055] 制御モジュール１７２は、選択制御モジュール、検出器、及び／又は流れコントローラからの信号を受信し、これらを制御するように構成することができる。

[0056] 図１Ｄに示されている実施形態を具体的に参照すると、光源３２０は、照明及び／又は蛍光励起のために有用な光をマイクロ流体回路１３２へ誘導することができる。この代わりに又はこれに加えて、光源は、エネルギをマイクロ流体回路１３２へ誘導して、ＤＥＰ構成マイクロ流体デバイスが微小物体を選択し移動させるために必要な活性化エネルギを与えることを含めて反応を刺激することができる。光源は、高圧水銀ランプ、キセノンアークランプ、ダイオード、レーザ等、マイクロ流体回路１３２に光エネルギを投影できる任意の適切な光源とすればよい。ダイオードはＬＥＤであり得る。１つの非限定的な例では、ＬＥＤは広域スペクトル「白色」光ＬＥＤとすればよい（例えば、ＰｒｉｚｍａｔｉｘによるＵＨＰ−Ｔ−ＬＥＤ−Ｗｈｉｔｅ）。光源は、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）、ＭＳＡ（マイクロアレイシステム）、又はレーザ等、構造化された光を発生するためのプロジェクタ又は他のデバイスを含み得る。

[0057] 生体細胞を含む微小物体を選択及び移動させるための動力モジュール 上述のように、制御／監視機器１８０は、マイクロ流体回路１３２において微小物体（図示せず）を選択及び移動させるための動力モジュールを含み得る。多種多様な動力機構を利用できる。例えば、誘電泳動（ＤＥＰ）機構を利用して、マイクロ流体回路において微小物体（図示せず）を選択及び移動させることができる。図１Ａ〜図１Ｃのマイクロ流体デバイス１００の支持構造１０４及び／又はカバー１２２は、マイクロ流体回路１３２における流体媒体（図示せず）内の微小物体（図示せず）に対するＤＥＰ力を選択的に誘発し、これによって個々の微小物体を選択、捕獲、及び／又は移動させるためのＤＥＰ構成を含むことができる。制御／監視機器１８０は、そのようなＤＥＰ構成のための１つ以上の制御モジュールを含み得る。あるいは、重力、磁力、流体流等を用いて、細胞を含む微小物体をマイクロ流体回路内で移動させるか、又はマイクロ流体回路から外に出すことができる。

[0058] 支持構造１０４及びカバー１２２を含むＤＥＰ構成を有するマイクロ流体デバイスの一例が、図１Ｄ及び図１Ｅに示すマイクロ流体デバイス３００である。簡略化のため、図１Ｄ及び図１Ｅはマイクロ流体デバイス３００の流れ領域２４０の一部の側断面図及び水平断面図を示すが、マイクロ流体デバイス３００は、マイクロ流体デバイス１００及び４００に関して本明細書に記載されるような１つ以上の単離チャンバ及び１つ以上の追加の流れ領域／流れチャネルも含み得ること、更に、ＤＥＰ構成はマイクロ流体デバイス３００のそのような領域のうち任意のものに組み込まれ得ることは理解されよう。更に、上記の又は下記のマイクロ流体システム構成要素の任意のものが、マイクロ流体デバイス３００に組み込まれ得ること、及び／又はマイクロ流体デバイス３００と組み合わせて使用され得ることも認められよう。例えば、画像キャプチャ検出器、流れコントローラ、及び選択制御モジュールのうち１つ以上を含む、図１Ａ〜図１Ｃのマイクロ流体デバイス１００と関連付けて上述した制御／監視機器１８０を含む制御モジュール１７２を、マイクロ流体デバイス３００と共に使用することができる。

[0059] 図１Ｄに見られるように、マイクロ流体デバイス３００は、第１の電極３０４と、この第１の電極３０４から離間した第２の電極３１０と、電極３１０の上にある電極活性化基板３０８と、を含む。第１の電極３０４及び電極活性化基板３０８はそれぞれ、流れ領域２４０の対向表面を画定し、流れ領域２４０に含まれる媒体２０２は、電極３０４と電極活性化基板３０８との間に抵抗性流路を与える。第１の電極３０４及び第２の電極３１０に接続するように、かつ、流れ領域２４０でのＤＥＰ力の発生に必要な電極間のバイアス電圧を生成するように構成された電源３１２も示されている。電源３１２は、例えば交流（ＡＣ）電源であり得る。

[0060] いくつかの実施形態において、図１Ｄ及び図１Ｅに示すマイクロ流体デバイス３００は、光電子ピンセット（ＯＥＴ：Ｏｐｔｏ−Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｔｗｅｅｚｅｒ）構成のような光学的に活性化されるＤＥＰ構成を有し得る。そのような実施形態では、選択制御モジュールによって制御することができる光源３２０からの光３２２の変化するパターンを用いて、流れ領域２４０の内面２４２上の標的位置３１４で変化するパターンの「ＤＥＰ電極」を選択的に活性化できる。以下、流れ領域２４０の内面２４２上の標的領域３１４を「ＤＥＰ電極領域」と称する。

[0061] 図１Ｅに示す例において、内面２４２上に誘導された光パターン３２２’は、図示する方形パターンの網目状の陰影を付けたＤＥＰ電極領域３１４ａを照明する。その他のＤＥＰ電極領域３１４は照明されず、以下、「暗い」ＤＥＰ電極領域３１４と称される。ＤＥＰ電極活性化基板３０８を介した（すなわち、内面２４２上の各暗い電極領域３１４から第２の電極３１０までの）電気インピーダンスは、媒体２０２を介した（すなわち、第１の電極３０４から流れ領域２４０内の媒体２０２を横切って内面２４２上の暗いＤＥＰ電極領域３１４までの）電気インピーダンスよりも大きい。しかしながら、ＤＥＰ電極領域３１４ａを照明すると、電極活性化基板３０８を介した（すなわち、内面２４２上の照明されたＤＥＰ電極領域３１４ａから第２の電極３１０までの）インピーダンスは、媒体２０２を介した（すなわち、第１の電極３０４から流れ領域２４０内の媒体２０２を横切って内面２４２上の照明されたＤＥＰ電極領域３１４ａまでの）インピーダンス未満に低減する。

[0062] 電源３１２が活性化されると、前述のことから、各照明されたＤＥＰ電極領域３１４ａと隣接する暗いＤＥＰ電極領域３１４との間で媒体２０２中に電界勾配が生じ、これが、流体媒体２０２中で付近の微小物体（図示せず）を引き付けるか又は反発する局所的なＤＥＰ力を生成する。このように、光源３２０からマイクロ流体デバイス３００へ投影される光パターン３２２を変化させることによって、流れ領域２４０内の微小物体を操作する、すなわち移動させるために、媒体２０２中の微小物体を引き付けるか又は反発するＤＥＰ電極を選択的に活性化又は非活性化できる。光源３２０は、例えばレーザ、又はプロジェクタのような他のタイプの構造化光源であり得る。ＤＥＰ力が付近の微小物体を引き付けるか又は反発するかは、限定ではないが、電源３１２の周波数、媒体２０２及び／又は微小物体（図示せず）の誘電特性のようなパラメータに応じて決まり得る。

[0063] 図１Ｅに示されている照明されたＤＥＰ電極領域３１４ａの方形パターン３２２’は、単なる例である。ＤＥＰ電極領域３１４の任意の数のパターン又は構成を、光源３２０からデバイス３００に投影される光３２２の対応するパターンによって選択的に照明することができ、照明されたＤＥＰ電極領域のパターン３２２’は、流体媒体２０２中の微小物体を操作するため光パターン３２２を変えることによって繰り返し変化させることができる。

[0064] いくつかの実施形態では、電極活性化基板３０８は光伝導性材料とすることができ、内面２４２の残り部分は特徴のないもの（ｆｅａｔｕｒｅｌｅｓｓ）とすることができる。例えば、光伝導性材料はアモルファスシリコンで作製でき、厚さが約５００ｎｍから約２μｍ（例えば、実質的に厚さ１ミクロン）の層を形成できる。そのような実施形態では、ＤＥＰ電極領域３１４は、光パターン３２２（例えば図１Ｅに示される光パターン３２２’）に従って、流れ領域２４０の内面２４２上のどこにでも任意のパターンで生成することができる。従って、照明されたＤＥＰ電極領域３１４ａの数及びパターンは固定されず、各投影された光パターン３２２に対応する。電極活性化基板３０８を含み得る光伝導性材料の一例としてドーピングされていないアモルファスシリコン材料が用いられている例が、米国特許第７，６１２，３５５号に示されている。

[0065] 他の実施形態において、電極活性化基板３０８は、半導体の分野で既知であるような半導体集積回路を形成する、複数のドーピング層、電気絶縁層、及び導電層を備えた基板を含むことができる。例えば、電極活性化基板３０８はフォトトランジスタのアレイを含み得る。そのような実施形態では、電気回路要素によって、流れ領域２４０の内面２４２におけるＤＥＰ電極領域３１４と、各光パターン３２２によって選択的に活性化できる第２の電極３１０との間で、電気的接続を形成することができる。活性化されていない場合、各電気的接続を介した（すなわち、内面２４２上の対応するＤＥＰ電極領域３１４から電気的接続を介して第２の電極３１０までの）電気インピーダンスは、媒体２０２を介した（すなわち、第１の電極３０４から媒体２０２を介して内面２４２上の対応するＤＥＰ電極領域３１４までの）インピーダンスよりも大きい可能性がある。しかしながら、光パターン３２２の光によって活性化されると、照明された電気的接続を介した（すなわち、各照明されたＤＥＰ電極領域３１４から電気的接続を介して第２の電極３１０までの）電気インピーダンスは、媒体２０２を介した（すなわち、第１の電極３０４から媒体２０２を介して対応する照明されたＤＥＰ電極領域３１４ａまでの）電気インピーダンス未満の量に低減され、これによって、上述のように、対応するＤＥＰ電極領域３１４ａにおいてＤＥＰ電極を活性化することができる。このため、媒体２０２中の微小物体（図示せず）を引き付けるか又は反発するＤＥＰ電極を、光パターン３２２によって、流れ領域２４０の内面２４２における多くの異なるＤＥＰ電極領域３１４で選択的に活性化及び非活性化できる。電極活性化基板３０８のそのような構成の非限定的な例には、米国特許第７，９５６，３３９号の図２１及び図２２に示されたフォトトランジスタベースのデバイス３００が含まれる。

[0066] 他の実施形態において、電極活性化基板３０８は、光活性化され得る複数の電極を備えた基板を含み得る。電極活性化基板３０８のそのような構成の非限定的な例には、米国出願公報第２０１４／０１２４３７０号に図示され記載された光活性化デバイス２００、４００、５００、及び６００が含まれる。更に別の実施形態において、支持構造１０４及び／又はカバー１２２のＤＥＰ構成は、マイクロ流体デバイスの内面におけるＤＥＰ電極の光活性化に頼らず、米国特許第６，９４２，７７６号に記載されたもののように、少なくとも１つの電極を含む表面に対向して位置決めされた選択的にアドレス可能かつ励起可能な電極を使用する。

[0067] ＤＥＰ構成デバイスのいくつかの実施形態では、概ね図１Ｄに示すように、第１の電極３０４は筐体（ｈｏｕｓｉｎｇ）１０２の第１の壁３０２（又はカバー）の一部とすることができ、電極活性化基板３０８及び第２の電極３１０は筐体１０２の第２の壁３０６（又はベース）の一部とすることができる。図示のように、流れ領域２４０は、第１の壁３０２と第２の壁３０６との間にあり得る。しかしながら、前述のことは単なる例である。代替的な実施形態では、第１の電極３０４が第２の壁３０６の一部であり、電極活性化基板３０８及び／又は第２の電極３１０の一方又は双方が第１の壁３０２の一部であり得る。更に、光源３２０は代替的に、筐体１０２の下に位置付けることも可能である。いくつかの実施形態では、第１の電極３０４はインジウムスズ酸化物（ＩＴＯ：ｉｎｄｉｕｍ−ｔｉｎ−ｏｘｉｄｅ）電極とすればよいが、他の材料も使用することができる。

[0068] 図１Ｄ〜図１Ｅのマイクロ流体デバイス３００の光学的に活性化されるＤＥＰ構成と共に用いる場合、選択制御モジュールは、１つ以上の連続的な光パターン３２２をデバイス３００に投影して、微小物体（図示せず）を取り囲むと共に「捕獲する（ｃａｐｔｕｒｅ）」連続パターンで流れ領域２４０の内面２４２のＤＥＰ電極領域３１４における対応する１つ以上のＤＥＰ電極を活性化することによって、流れ領域２４０の媒体２０２内の微小物体を選択できる。次いで、選択制御モジュールは、デバイス３００に対して光パターン３２２を移動させることにより、流れ領域２４０内の捕獲した微小物体を移動させることができる（又は、光源３２０及び／又は光パターン３２２に対して、デバイス３００（従ってその中で捕獲した微小物体）を移動させることができる）。マイクロ流体デバイス３００の電気的に活性化されるＤＥＰ構成を特徴とする実施形態では、選択制御モジュールは、微小物体（図示せず）を取り囲むと共に「捕獲する」パターンを形成する流れ領域２４０の内面２４２のＤＥＰ電極領域３１４におけるＤＥＰ電極のサブセットを電気的に活性化することによって、流れ領域２４０の媒体２０２中の微小物体を選択することができる。次いで、選択制御モジュールは、電気的に活性化されているＤＥＰ電極のサブセットを変更することにより、流れ領域２４０内の捕獲した微小物体を移動させることができる。

[0069] 単離チャンバの構成 図１Ａ〜図１Ｃに、デバイス１００の単離チャンバ１３６、１３８、及び１４０の非限定的な例が示されている。特に図１Ｃを参照すると、各単離チャンバ１３６、１３８、１４０は、単離領域１４４と、この単離領域１４４を流れチャネル１３４に流体接続する接続領域１４２と、を画定する単離構造１４６を備えている。接続領域１４２の各々は、流れチャネル１３４に対する近位開口１５２と、各単離領域１４４に対する遠位開口１５４と、を有する。接続領域１４２は、好ましくは、流れチャネル１３４内を最大速度（Ｖ_ｍａｘ）で流れる流体媒体（図示せず）の流れの最大侵入深さが偶発的に単離領域１４４内まで入り込まないように構成されている。これにより、各単離チャンバ１３６、１３８、１４０の単離領域１４４に配置された微小物体（図示せず）又は他の物質（図示せず）を、流れチャネル１３４内の媒体（図示せず）の流れから単離すると共に、実質的にその影響を受けないようにすることができる。従って、流れチャネル１３４は一掃される領域の一例であり、単離チャンバ１３６、１３８、１４０の単離領域は一掃されない領域の一例であり得る。上記のように、各流れチャネル１３４及び単離チャンバ１３６、１３８、１４０は、１つ以上の流体媒体（図示せず）を収容するように構成されている。図１Ａ〜図１Ｃに示す実施形態では、流体アクセスポート１２４が流れチャネル１３４に流体接続されて、流体媒体（図示せず）をマイクロ流体回路１３２内に導入するか又はマイクロ流体回路１３２から除去することを可能とする。一度マイクロ流体回路１３２が流体媒体を収容したら、その中の特定の流体媒体の流れを流れチャネル１３４で選択的に発生させることができる。例えば、入口として機能する１つの流体アクセスポート１２４から出口として機能する別の流体アクセスポート１２４へ、媒体の流れを生成することができる。

[0070] 図２は、図１Ａ〜図１Ｃのデバイス１００の単離チャンバ１３６の一例の詳細図を示す。単離チャンバ１３８、１４０も同様に構成することができる。単離チャンバ１３６内に位置付けられている微小物体２２２の例も示している。

[0071] 既知のように、マイクロ流体流れチャネル１３４内の流体媒体２０２の流れ（方向指示矢印２１２によって示されている）は、単離チャンバ１３６の近位開口１５２を通り過ぎる際、単離チャンバ１３６内へ及び／又は単離チャンバ１３６外への媒体２０２の二次的な流れ（方向指示矢印２１４によって示されている）を生じ得る。単離チャンバ１３６の単離領域１４４内の微小物体２２２を二次的な流れ２１４から単離するため、接続領域１４２の近位開口１５２から遠位開口１５４までの長さＬ_ｃｏｎは、流れチャネル１３４内の流れ２１２の速度が最大（Ｖ_ｍａｘ）である場合の二次的な流れ２１４の接続領域１４２内への最大侵入深さＤ_ｐよりも大きいことが好ましい。流れチャネル１３４内の流れ２１２が最大速度Ｖ_ｍａｘを超えない限り、流れ２１２及びこれによって生じる二次的な流れ２１４は、各流れチャネル１３４及び接続領域１４２内に制限され、単離チャンバ１３６の単離領域１４４に入らないように維持される。従って、流れチャネル１３４内の流れ２１２が微小物体２２２を単離チャンバ１３６の単離領域１４４の外へ引き出すことはない。

[0072] 更に、流れ２１２が、流れチャネル１３４内に位置し得る種々の粒子（例えば微小粒子及び／又はナノ粒子）を単離チャンバ１３６の単離領域１４４内へ移動させることはない。従って、接続領域１４２の長さＬ_ｃｏｎを最大侵入深さＤ_ｐよりも大きくすることにより、流れチャネル１３４からの又は別の単離チャンバ１３８、１４０からの種々の粒子によって単離チャンバ１３６が汚染されることを防止できる。

[0073] 流れチャネル１３４及び単離チャンバ１３６、１３８、１４０の接続領域１４２は流れチャネル１３４内の媒体２０２の流れ２１２によって影響され得るので、流れチャネル１３４及び接続領域１４２を、マイクロ流体回路１３２の一掃される（又は流れ）領域と見なすことができる。一方、単離チャンバ１３６、１３８、１４０の単離領域１４４を、一掃されない（又は非流れ）領域と見なすことができる。例えば、流れチャネル１３４内の第１の媒体２０２の成分（図示せず）は、実質的に、第１の媒体２０２の成分が流れチャネル１３４から接続領域１４２を介して単離領域１４４内の第２の媒体２０４へと拡散することによってのみ、単離領域１４４内の第２の媒体２０４と混合し得る。同様に、単離領域１４４内の第２の媒体２０４（図示せず）の成分は、実質的に、第２の媒体２０４の成分が単離領域１４４から接続領域１４２を介して流れチャネル１３４内の第１の媒体２０２へと拡散することによってのみ、流れチャネル１３４内の第１の媒体２０２と混合し得る。第１の媒体２０２は第２の媒体２０４と同一の媒体であるか又は異なる媒体であり得ることは認められよう。更に、第１の媒体２０２及び第２の媒体２０４は同一のものから出発し、次いで、例えば単離領域１４４で１つ以上の細胞によって第２の媒体を調節することで、又は流れチャネル１３４を流れている媒体を変更することで、相互に異なるものとすることができる。

[0074] 流れチャネル１３４内の流れ２１２によって生じる二次的な流れ２１４の最大侵入深さＤ_ｐは、多数のパラメータに依存し得る。そのようなパラメータの例には、（限定ではないが）流れチャネル１３４の形状（例えば、流れチャネルは媒体を接続領域１４２内へ誘導するか、媒体を接続領域１４２からそらすか、又は単に接続領域１４２を通り過ぎるように流れることができる）、近位開口１５２における流れチャネル１３４の幅Ｗ_ｃｈ（又は断面積）、近位開口１５２における接続領域１４２の幅Ｗ_ｃｏｎ（又は断面積）、流れチャネル１３４における流れ２１２の最大速度Ｖ_ｍａｘ、第１の媒体２０２及び／又は第２の媒体２０４の粘度等が含まれる。

[0075] いくつかの実施形態では、流れチャネル１３４及び／又は単離チャンバ１３６、１３８、１４０の寸法は、流れチャネル１３４内の流れ２１２に対して以下のような向きとされる。すなわち、流れチャネルの幅Ｗ_ｃｈ（又は流れチャネル１３４の断面積）は、流れ２１２に対して実質的に垂直であり得る。近位開口１５２における接続領域１４２の幅Ｗ_ｃｏｎ（又は断面積）は、流れ２１２に対して実質的に平行であり得る。接続領域の長さＬ_ｃｏｎは、流れ２１２に対して実質的に垂直であり得る。前述のことは単なる例示であり、流れチャネル１３４及び単離チャンバ１３６、１３８、１４０の寸法は、相互に対して追加の向き及び／又は別の向きとすることも可能である。

[0076] 図２に示すように、接続領域１４２の幅Ｗ_ｃｏｎは、近位開口１５２から遠位開口１５４まで均一であり得る。このため、遠位開口１５４における接続領域１４２の幅Ｗ_ｃｏｎは、近位開口１５２における接続領域１４２の幅Ｗ_ｃｏｎに対応した以下に特定される範囲のいずれかであり得る。あるいは、遠位開口１５４における接続領域１４２の幅Ｗ_ｃｏｎは、近位開口１５２における接続領域１４２の幅Ｗ_ｃｏｎよりも大きい（例えば図３の実施形態に示すように）か、又は小さい（例えば図４Ａ〜図４Ｃの実施形態に示すように）ことも可能である。

[0077] また、図２に示すように、遠位開口１５４における単離領域１４４の幅は、近位開口１５２における接続領域１４２の幅Ｗ_ｃｏｎと実質的に同じであり得る。従って、遠位開口１５４における単離領域１４４の幅は、近位開口１５２における接続領域１４２の幅Ｗ_ｃｏｎに対応して以下に特定される範囲のいずれかであり得る。あるいは、遠位開口１５４における単離領域１４４の幅は、近位開口１５２における接続領域１４２の幅Ｗ_ｃｏｎよりも大きい（例えば図３に示すように）か、又は小さい（図示せず）ことも可能である。

[0078] いくつかの実施形態では、流れチャネル１３４内の流れ２１２の最大速度Ｖ_ｍａｘは、流れチャネルが位置付けられている各マイクロ流体デバイス（例えばデバイス１００）に構造的な障害を生じることなく流れチャネル１３４を維持できる最大速度と実質的に同一である。一般に、流れチャネルを維持できる最大速度は、マイクロ流体デバイスの構造的完全性及び流れチャネルの断面積を含む様々なファクタに依存する。本明細書に開示し記載する例示的なマイクロ流体デバイスでは、断面積が約３，５００から１０，０００平方ミクロンである流れチャネルでの最大流速Ｖ_ｍａｘは、約１．５〜１５μＬ／秒である。あるいは、流れチャネル内の流れの最大速度Ｖ_ｍａｘは、流れチャネル内の流れから単離領域を分離することを保証するように設定できる。具体的には、単離チャンバの接続領域の近位開口の幅Ｗ_ｃｏｎに基づいて、接続領域内への二次的な流れの侵入深さＤ_ｐが確実にＬ_ｃｏｎ未満となるようにＶ_ｍａｘを設定することができる。例えば、近位開口の幅Ｗ_ｃｏｎが約４０〜５０ミクロンであり、Ｌ_ｃｏｎが約５０〜１００ミクロンである接続領域を有する単離チャンバでは、Ｖ_ｍａｘは、約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、もしくは２．５μＬ／秒、又はこれら付近の値に設定することができる。

[0079] いくつかの実施形態では、単離チャンバ１３６、１３８、１４０の接続領域１４２の長さＬ_ｃｏｎと単離領域１４４の対応する長さの和は、単離領域１４４に含まれる第２の媒体２０４の成分が流れチャネル１３４内を流れているか又は他の状態で流れチャネル１３４内に含まれる第１の媒体２０２へ比較的迅速に拡散するため、充分に短くすることができる。例えば、いくつかの実施形態では、（１）単離チャンバ１３６、１３８、１４０の接続領域１４２の長さＬ_ｃｏｎ、及び（２）単離領域１４４内に位置する生物学的微小物体と接続領域の遠位開口１５４との距離の和は、約４０ミクロンから５００ミクロン、５０ミクロンから４５０ミクロン、６０ミクロンから４００ミクロン、７０ミクロンから３５０ミクロン、８０ミクロンから３００ミクロン、９０ミクロンから２５０ミクロン、１００ミクロンから２００ミクロンの範囲、又は前述の終点の１つを含む任意の範囲のうち１つとすることができる。分子（例えば抗体のような対象のアナライト）の拡散速度は、（限定ではないが）温度、媒体の粘度、及び分子の拡散係数Ｄ_０を含む多数のファクタに依存する。例えば、約２０℃の水溶液中のＩｇＧ抗体のＤ_０は約４．４×１０^−７ｃｍ^２／秒であり、細胞培養培地の動粘度は約９×１０^−４ｍ^２／秒である。このため、約２０℃の細胞培養培地中の抗体は約０．５ミクロン／秒の拡散速度を有し得る。従って、いくつかの実施形態では、単離領域１４４に位置する生物学的微小物体から流れチャネル１３４への拡散にかかる時間期間は、約１０分以下であり得る（例えば約９分、８分、７分、６分、５分、又はそれ未満）。拡散にかかる時間期間は、拡散速度に影響を及ぼすパラメータを変更することによって操作できる。例えば、媒体の温度を上昇させ（例えば約３７℃のような生理的温度まで）、又は低下させ（例えば約１５℃、１０℃、又は４℃まで）、これによって、拡散速度を上昇又は低下させることができる。この代わりに又はこれに加えて、媒体中の溶質の濃度を上昇又は低下させることも可能である。

[0080] 図２に示す単離チャンバ１３６の物理的構成は単なる例であり、単離チャンバには他の多くの構成及び変形が可能である。例えば、単離領域１４４は、複数の微小物体２２２を収容するような大きさに示されているが、単離領域１４４は、約１、２、３、４、５、又は同様の比較的少数の微小物体２２２を収容するような大きさにすることも可能である。従って、単離領域１４４の体積は、少なくとも３×１０^３、６×１０^３、９×１０^３、１×１０^４、２×１０^４、４×１０^４、８×１０^４、１×１０^５、２×１０^５、４×１０^５、８×１０^５、１×１０^６、２×１０^６、４×１０^６、６×１０^６立方ミクロン、又はそれ以上とすることができる。

[0081] 別の例として、単離チャンバ１３６は、流れチャネル１３４から概ね垂直に延出し、従って流れチャネル１３４に対して概ね約９０度の角度を形成するように図２に示されている。あるいは、単離チャンバ１３６は、流れチャネル１３４から、例えば約３０度から約１５０度までの任意の角度のような他の角度で延出することも可能である。

[0082] 更に別の例として、接続領域１４２及び単離領域１４４は、実質的に矩形の構成を有するように図２に示されているが、接続領域１４２及び単離領域１４４の一方又は双方は、（限定ではないが）楕円形、三角形、円形、砂時計の形等を含む異なる構成を有することも可能である。

[0083] 更に別の例として、接続領域１４２及び単離領域１４４は、実質的に均一の幅を有するように図２に示されている。すなわち、接続領域１４２の幅Ｗ_ｃｏｎは、近位開口１５２から遠位開口１５４まで長さＬ_ｃｏｎ全体に沿って均一であるものとして図示されている。単離領域１４４の対応する幅も同様に均一であり、このため、接続領域１４２の幅Ｗ_ｃｏｎ及び単離領域１４４の対応する幅は等しいものとして示されている。しかしながら、代替的な実施形態では、前述のうち任意のものが異なることがある。例えば、接続領域１４２の幅Ｗ_ｃｏｎが、近位開口１５２から遠位開口１５４までの長さＬ_ｃｏｎに沿って、例えば台形又は砂時計の形状に変動し、単離領域１４４の幅も、長さＬ_ｃｏｎに沿って、例えば三角形又はフラスコ形に変動し、接続領域１４２の幅Ｗ_ｃｏｎが単離領域１４４の幅とは異なるということも可能である。

[0084] 図３は、単離チャンバ３３６の代替的な実施形態を示し、前述の変形のいくつかの例を明示している。代替的な単離チャンバ３３６は、マイクロ流体デバイス１００における単離チャンバ１３６に代わるものとして記載するが、単離チャンバ３３６は、本明細書に開示又は記載されるいずれかのマイクロ流体デバイス実施形態のいずれの単離チャンバの代わりにもなることは認められよう。更に、所与のマイクロ流体デバイスにおいて、１つの単離チャンバ３３６又は複数の単離チャンバ３３６を設けることができる。

[0085] 単離チャンバ３３６は、接続領域３４２と、単離領域３４４を含む単離構造３４６と、を含む。接続領域３４２は、流れチャネル１３４に対する近位開口３５２と、単離領域３４４に対する遠位開口３５４と、を有する。図３に示す実施形態において、接続領域３４２は、その幅Ｗ_ｃｏｎが接続領域の長さＬ_ｃｏｎに沿って近位開口３５２から遠位開口３５４まで増大するように広がっている。しかしながら、異なる形状を有する以外は、接続領域３４２、単離構造３４６、及び単離領域３４４は、図２に示した単離チャンバ１３６の上述の接続領域１４２、単離構造１４６、及び単離領域１４４と概ね同一に機能する。

[0086] 例えば、流れチャネル１３４及び単離チャンバ３３６は、二次的な流れ２１４の最大侵入深さＤ_ｐが接続領域３４２内には入るが単離領域３４４内までは入り込まないように構成することができる。従って、概ね図２に示した接続領域１４２に関して上述したように、接続領域３４２の長さＬ_ｃｏｎを最大侵入深さＤ_ｐよりも大きくすることができる。また、上述のように、流れチャネル１３４内の流れ２１２の速度が最大流速Ｖ_ｍａｘを超えない限り、単離領域３４４内の微小物体２２２は単離領域３４４内に留まる。従って、流れチャネル１３４及び接続領域３４２は一掃される（又は流れ）領域の例であり、単離領域３４４は一掃されない（又は非流れ）領域の例である。

[0087] 図４Ａ〜図４Ｃは、マイクロ流体回路４３２及び流れチャネル４３４を収容するマイクロ流体デバイス４００の別の例示的な実施形態を示す。これらはそれぞれ、図１Ａ〜図１Ｃのマイクロ流体デバイス１００、回路１３２、及び流れチャネル１３４の変形である。また、マイクロ流体デバイス４００は、上述の単離チャンバ１３６、１３８、１４０、及び３３６の追加の変形である複数の単離チャンバ４３６も有する。具体的には、図４Ａ〜図４Ｃに示されているデバイス４００の単離チャンバ４３６は、デバイス１００及び３００の上述の単離チャンバ１３６、１３８、１４０、３３６のいずれの代わりにもなることは認められよう。同様に、マイクロ流体デバイス４００は、マイクロ流体デバイス１００の別の変形（ｖａｒｉａｎｔ）であり、また、上述のマイクロ流体デバイス３００と同一であるか又は異なるＤＥＰ構成、及び本明細書に記載される他のマイクロ流体シスステム構成要素のうち任意のものも有し得る。

[0088] 図４Ａ〜図４Ｃのマイクロ流体デバイス４００は、支持構造（図４Ａ〜図４Ｃで見ることはできないが、図１Ａ〜図１Ｃに示すデバイス１００の支持構造１０４と同一であるか又は概ね同様であり得る）、マイクロ流体回路構造４１２、及びカバー（図４Ａ〜図４Ｃで見ることはできないが、図１Ａ〜図１Ｃに示すデバイス１００のカバー１２２と同一であるか又は概ね同様であり得る）を備えている。マイクロ流体回路構造４１２は、フレーム４１４及びマイクロ流体回路材料４１６を含み、これらは図１Ａ〜図１Ｃに示すデバイス１００のフレーム１１４及びマイクロ流体回路材料１１６と同一であるか又は概ね同様であり得る。図４Ａに示すように、マイクロ流体回路材料４１６によって画定されるマイクロ流体回路４３２は、複数の単離チャンバ４３６が流体接続されている複数の流れチャネル４３４（２つを示すが、もっと多く存在することもある）を含むことができる。

[0089] 各単離チャンバ４３６は、単離構造４４６、この単離構造４４６内の単離領域４４４、及び接続領域４４２を含み得る。接続領域４４２は、流れチャネル４３４における近位開口４７２から単離構造４３６における遠位開口４７４まで、流れチャネル４３４を単離領域４４４に流体接続する。概ね上記の図２の検討に従って、流れチャネル４３４内の第１の流体媒体４０２の流れ４８２は、流れチャネル４３４から単離チャンバ４３６の各接続領域４４２内へ流入する及び／又は各接続領域４４２から流出する第１の媒体４０２の二次的な流れ４８４を生成し得る。

[0090] 図４Ｂに示すように、各単離チャンバ４３６の接続領域４４２は概ね、流れチャネル４３４への近位開口４７２と単離構造４４６への遠位開口４７４との間に延出しているエリアを含む。接続領域４４２の長さＬ_ｃｏｎは二次的な流れ４８４の最大侵入深さＤ_ｐよりも大きくすることができ、この場合、（図４Ａに示すように）二次的な流れ４８４は、単離領域４４４の方へ方向を変えることなく接続領域４４２内に入り込む。あるいは図４Ｃに示すように、接続領域４４２は最大侵入深さＤ_ｐ未満の長さＬ_ｃｏｎを有することができ、この場合、二次的な流れ４８４は、接続領域４４２を通って単離領域４４４の方へ方向を変える。この後者の状況において、接続領域４４２の長さＬ_ｃ１とＬ_ｃ２の和は最大侵入深さＤ_ｐよりも大きいので、二次的な流れ４８４は単離領域４４４内まで入り込まない。接続領域４４２の長さＬ_ｃｏｎが侵入深さＤ_ｐよりも大きいにせよ、又は接続領域４４２の長さＬ_ｃ１及びＬ_ｃ２の和が侵入深さＤ_ｐよりも大きいにせよ、最大速度Ｖ_ｍａｘを超えない流れチャネル４３４内の第１の媒体４０２の流れ４８２は侵入深さＤ_ｐを有する二次的な流れを生成し、単離チャンバ４３６の単離領域４４４内の微小物体（図示しないが、図２に示す微小物体２２２と同一であるか又は概ね同様であり得る）が、流れチャネル４３４内の第１の媒体４０２の流れ４８２によって単離領域４４４の外へ引き出されることはない。また、流れチャネル４３４内の流れ４８２が、流れチャネル４３４から種々の物質（図示せず）を単離チャンバ４３６の単離領域４４４内へ引き入れることはない。このため、流れチャネル４３４内の第１の媒体４０２の成分が流れチャネル４３４から単離チャンバ４３６の単離領域４４４内の第２の媒体４０４へ移動できる機構は、拡散だけである。同様に、単離チャンバ４３６の単離領域４４４内の第２の媒体４０４の成分が単離領域４４４から流れチャネル４３４内の第１の媒体４０２へ移動できる機構も、拡散だけである。第１の媒体４０２は第２の媒体４０４と同一の媒体であるか、又は、第１の媒体４０２は第２の媒体４０４とは異なる媒体であり得る。あるいは、第１の媒体４０２及び第２の媒体４０４は同一のものから出発し、次いで、例えば単離領域４４４で１つ以上の細胞によって第２の媒体を調節することで、又は流れチャネル４３４を流れている媒体を変更することで、相互に異なるものとすることができる。

[0091] 図４Ｂに示すように、流れチャネル４３４における流れチャネル４３４の幅Ｗ_ｃｈ（すなわち、図４Ａの矢印４８２で示された流れチャネルを通る流体媒体流を横断する方向）は、近位開口４７２の幅Ｗ_ｃｏｎ１に対して実質的に垂直であり、従って遠位開口４７４の幅Ｗ_ｃｏｎ２に対して実質的に平行であり得る。しかしながら、近位開口４７２の幅Ｗ_ｃｏｎ１及び遠位開口４７４の幅Ｗ_ｃｏｎ２は、相互に実質的に垂直である必要はない。例えば、近位開口４７２の幅Ｗ_ｃｏｎ１を位置付けた軸（図示せず）と、遠位開口４７４の幅Ｗ_ｃｏｎ２を位置付けた軸（図示せず）との角度は、垂直以外、従って９０度以外であり得る。代替的な角度の例には、約３０度から約９０度、約４５度から約９０度、約６０度から約９０度等のいずれかの範囲内の角度が含まれる。

[0092] 単離チャンバ１３６、１３８、１４０、３３６、又は４３６の様々な実施形態において、単離チャンバの単離領域は、培養下の約１×１０^３、５×１０^２、４×１０^２、３×１０^２、２×１０^２、１×１０^２、５０、２５、１５、又は１０以下の細胞を支持するように構成された体積を有し得る。他の実施形態では、単離チャンバの単離領域は、最大で約１×１０^３、１×１０^４、又は１×１０^５の細胞を支持する体積を有する。

[0093] 単離チャンバ１３６、１３８、１４０、３３６、又は４３６の様々な実施形態において、近位開口１５２における流れチャネル１３４の幅Ｗ_ｃｈ（単離チャンバ１３６、１３８、又は１４）、近位開口３５２における流れチャネル１３４の幅Ｗ_ｃｈ（単離チャンバ３３６）、又は近位開口４７２における流れチャネル４３４の幅Ｗ_ｃｈ（単離チャンバ４３６）は、約５０〜１０００ミクロン、約５０〜５００ミクロン、約５０〜４００ミクロン、約５０〜３００ミクロン、約５０〜２５０ミクロン、約５０〜２００ミクロン、約５０〜１５０ミクロン、約５０〜１００ミクロン、約７０〜５００ミクロン、約７０〜４００ミクロン、約７０〜３００ミクロン、約７０〜２５０ミクロン、約７０〜２００ミクロン、約７０〜１５０ミクロン、約９０〜４００ミクロン、約９０〜３００ミクロン、約９０〜２５０ミクロン、約９０〜２００ミクロン、約９０〜１５０ミクロン、約１００〜３００ミクロン、約１００〜２５０ミクロン、約１００〜２００ミクロン、約１００〜１５０ミクロン、及び約１００〜１２０ミクロンの範囲のいずれかとすることができる。前述のものは単なる例示であり、流れチャネル１３４又は４３４の幅Ｗ_ｃｈは、他の範囲（例えば、上に列挙した終点のいずれかで画定される範囲）内とすることも可能である。

[0094] 単離チャンバ１３６、１３８、１４０、３３６、又は４３６の様々な実施形態において、近位開口１５２における流れチャネル１３４（単離チャンバ１３６、１３８、又は１４０）、近位開口３５２における流れチャネル１３４（単離チャンバ３３６）、又は近位開口４７２における流れチャネル４３４（単離チャンバ４３６）の高さＨ_ｃｈは、約２０〜１００ミクロン、約２０〜９０ミクロン、約２０〜８０ミクロン、約２０〜７０ミクロン、約２０〜６０ミクロン、約２０〜５０ミクロン、約３０〜１００ミクロン、約３０〜９０ミクロン、約３０〜８０ミクロン、約３０〜７０ミクロン、約３０〜６０ミクロン、約３０〜５０ミクロン、約４０〜１００ミクロン、約４０〜９０ミクロン、約４０〜８０ミクロン、約４０〜７０ミクロン、約４０〜６０ミクロン、又は約４０〜５０ミクロンの範囲のいずれかとすることができる。前述のものは単なる例示であり、流れチャネル１３４又は４３４の高さＨ_ｃｈは、他の範囲（例えば、上に列挙した終点のいずれかで画定される範囲）内とすることも可能である。

[0095] 単離チャンバ１３６、１３８、１４０、３３６、又は４３６の様々な実施形態において、近位開口１５２における流れチャネル１３４（単離チャンバ１３６、１３８、又は１４０）、近位開口３５２における流れチャネル１３４（単離チャンバ３３６）、又は近位開口４７２における流れチャネル４３４（単離チャンバ４３６）の断面積は、約５００〜５０，０００平方ミクロン、約５００〜４０，０００平方ミクロン、約５００〜３０，０００平方ミクロン、約５００〜２５，０００平方ミクロン、約５００〜２０，０００平方ミクロン、約５００〜１５，０００平方ミクロン、約５００〜１０，０００平方ミクロン、約５００〜７，５００平方ミクロン、約５００〜５，０００平方ミクロン、約１，０００〜２５，０００平方ミクロン、約１，０００〜２０，０００平方ミクロン、約１，０００〜１５，０００平方ミクロン、約１，０００〜１０，０００平方ミクロン、約１，０００〜７，５００平方ミクロン、約１，０００〜５，０００平方ミクロン、約２，０００〜２０，０００平方ミクロン、約２，０００〜１５，０００平方ミクロン、約２，０００〜１０，０００平方ミクロン、約２，０００〜７，５００平方ミクロン、約２，０００〜６，０００平方ミクロン、約３，０００〜２０，０００平方ミクロン、約３，０００〜１５，０００平方ミクロン、約３，０００〜１０，０００平方ミクロン、約３，０００〜７，５００平方ミクロン、又は約３，０００〜６，０００平方ミクロンの範囲のいずれかとすることができる。前述のものは単なる例示であり、近位開口１５２における流れチャネル１３４、近位開口３５２における流れチャネル１３４、又は近位開口４７２における流れチャネル４３４の断面積は、他の範囲（例えば、上に列挙した終点のいずれかで画定される範囲）内とすることも可能である。

[0096] 単離チャンバ１３６、１３８、１４０、３３６、又は４３６の様々な実施形態において、接続領域の長さＬ_ｃｏｎは、約１〜２００ミクロン、約５〜１５０ミクロン、約１０〜１００ミクロン、約１５〜８０ミクロン、約２０〜６０ミクロン、約２０〜５００ミクロン、約４０〜４００ミクロン、約６０〜３００ミクロン、約８０〜２００ミクロン、及び１００〜１５０ミクロンの範囲のいずれかとすることができる。前述のものは単なる例示であり、接続領域１４２（単離チャンバ１３６、１３８、又は１４０）、接続領域３４２（単離チャンバ３３６）、又は接続領域４４２（単離チャンバ４３６）の長さＬ_ｃｏｎは、前述の例とは異なる範囲（例えば、上に列挙した終点のいずれかで画定される範囲）内とすることも可能である。

[0097] 単離チャンバ１３６、１３８、１４０、３３６、又は４３６の様々な実施形態において、近位開口１５２における接続領域１４２（単離チャンバ１３６、１３８、又は１４０、近位開口３５２における接続領域３４２（単離チャンバ３３６）、又は近位開口４７２における接続領域４４２（単離チャンバ４３６）の幅Ｗ_ｃｏｎは、約２０〜５００ミクロン、約２０〜４００ミクロン、約２０〜３００ミクロン、約２０〜２００ミクロン、約２０〜１５０ミクロン、約２０〜１００ミクロン、約２０〜８０ミクロン、約２０〜６０ミクロン、約３０〜４００ミクロン、約３０〜３００ミクロン、約３０〜２００ミクロン、約３０〜１５０ミクロン、約３０〜１００ミクロン、約３０〜８０ミクロン、約３０〜６０ミクロン、約４０〜３００ミクロン、約４０〜２００ミクロン、約４０〜１５０ミクロン、約４０〜１００ミクロン、約４０〜８０ミクロン、約４０〜６０ミクロン、約５０〜２５０ミクロン、約５０〜２００ミクロン、約５０〜１５０ミクロン、約５０〜１００ミクロン、約５０〜８０ミクロン、約６０〜２００ミクロン、約６０〜１５０ミクロン、約６０〜１００ミクロン、約６０〜８０ミクロン、約７０〜１５０ミクロン、約７０〜１００ミクロン、及び約８０〜１００ミクロンの範囲のいずれかとすることができる。前述のものは単なる例示であり、近位開口１５２における接続領域１４２、近位開口３５２における接続領域３４２、又は近位開口４７２における接続領域４４２の幅Ｗ_ｃｏｎは、前述の例とは異なる（例えば、上に列挙した終点のいずれかで画定される範囲）ことも可能である。

[0098] 単離チャンバ１３６、１３８、１４０、３３６、又は４３６の様々な実施形態において、近位開口１５２における接続領域１４２（単離チャンバ１３６、１３８、又は１４０）、近位開口３５２における接続領域３４２（単離チャンバ３３６）、又は近位開口４７２における接続領域４４２（単離チャンバ４３６）の幅Ｗ_ｃｏｎは、約２〜３５ミクロン、約２〜２５ミクロン、約２〜２０ミクロン、約２〜１５ミクロン、約２〜１０ミクロン、約２〜７ミクロン、約２〜５ミクロン、約２〜３ミクロン、約３〜２５ミクロン、約３〜２０ミクロン、約３〜１５ミクロン、約３〜１０ミクロン、約３〜７ミクロン、約３〜５ミクロン、約３〜４ミクロン、約４〜２０ミクロン、約４〜１５ミクロン、約４〜１０ミクロン、約４〜７ミクロン、約４〜５ミクロン、約５〜１５ミクロン、約５〜１０ミクロン、約５〜７ミクロン、約６〜１５ミクロン、約６〜１０ミクロン、約６〜７ミクロン、約７〜１５ミクロン、約７〜１０ミクロン、約８〜１５ミクロン、及び約８〜１０ミクロンの範囲のいずれかとすることができる。前述のものは単なる例示であり、近位開口１５２における接続領域１４２、近位開口３５２における接続領域３４２、又は近位開口４７２における接続領域４４２の幅Ｗ_ｃｏｎは、前述の例とは異なる（例えば、上に列挙した終点のいずれかで画定される範囲）ことも可能である。

[0099] 単離チャンバ１３６、１３８、１４０、３３６、又は４３６の様々な実施形態において、近位開口１５２における接続領域１４２の幅Ｗ_ｃｏｎに対する接続領域１４２の長さＬ_ｃｏｎの比（単離チャンバ１３６、１３８、又は１４０）、近位開口３５２における接続領域３４２の幅Ｗ_ｃｏｎに対する接続領域３４２の長さＬ_ｃｏｎの比（単離チャンバ３３６）、又は近位開口４７２における接続領域４４２の幅Ｗ_ｃｏｎに対する接続領域接続領域４４２の幅Ｗｃｏｎに対する接続領域４４２の長さＬ_ｃｏｎの比（単離チャンバ４３６）は、約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、又はそれ以上の範囲のいずれかに等しいか又はそれ以上とすることができる。前述のものは単なる例示であり、近位開口１５２における接続領域１４２の幅Ｗ_ｃｏｎに対する接続領域１４２の長さＬ_ｃｏｎの比、近位開口３７２における接続領域３４２の幅Ｗ_ｃｏｎに対する接続領域３４２の長さＬ_ｃｏｎの比、又は近位開口４７２における接続領域４４２の幅Ｗ_ｃｏｎに対する接続領域４４２の長さＬ_ｃｏｎの比は、前述の例とは異なることも可能である。

[00100] 単離チャンバ１３６、１３８、１４０、３３６、又は４３６を有するマイクロ流体デバイスの様々な実施形態において、Ｖ_ｍａｘは、約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、もしくは２．５μＬ／秒、又はこれら付近の値に設定することができる。

[00101] 単離チャンバ１３６、１３８、１４０、３３６、又は４３６を有するマイクロ流体デバイスの様々な実施形態において、単離領域１４４（単離チャンバ１３６、１３８、又は１４０）、３４４（単離チャンバ３３６）、又は４４４（単離チャンバ４３６）の体積は、例えば、少なくとも３×１０^３、６×１０^３、９×１０^３、１×１０^４、２×１０^４、４×１０^４、８×１０^４、１×１０^５、２×１０^５、４×１０^５、８×１０^５、１×１０^６、２×１０^６、４×１０^６、６×１０^６立方ミクロン、又はそれ以上とすることができる。

[00102] いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスが有する単離チャンバ１３６、１３８、１４０、３３６、又は４３６において、約１×１０^２以下の生体細胞を維持することができ、これらの単離チャンバの体積を約２×１０^６立方ミクロン以下とすることができる。

[00103] いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスが有する単離チャンバ１３６、１３８、１４０、３３６、又は４３６において、約１×１０^２以下の生体細胞を維持することができ、これらの単離チャンバの体積を約４×１０^５立方ミクロン以下とすることができる。

[00104] 他の実施形態では、マイクロ流体デバイスが有する単離チャンバ１３６、１３８、１４０、３３６、又は４３６において、約５０以下の生体細胞を維持することができ、これらの単離チャンバの体積を約４×１０^５立方ミクロン以下とすることができる。

[00105] 様々な実施形態において、マイクロ流体デバイスは、本明細書で検討した実施形態の任意のものと同様に構成された単離チャンバを有し、マイクロ流体デバイスは、約１００から約５００の単離チャンバ、約２００から約１０００の単離チャンバ、約５００から約１５００の単離チャンバ、約１０００から約２０００の単離チャンバ、又は約１０００から約３５００の単離チャンバを有する。

[00106] 他のいくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスは、本明細書で検討した実施形態の任意のものと同様に構成された単離チャンバを有し、マイクロ流体デバイスは、約１５００から約３０００の単離チャンバ、約２０００から約３５００の単離チャンバ、約２０００から約４０００の単離チャンバ、約２５００から約４０００の単離チャンバ、又は約３０００から約４５００の単離チャンバを有する。

[00107] いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスは、本明細書で検討した実施形態の任意のものと同様に構成された単離チャンバを有し、マイクロ流体デバイスは、約３０００から約４５００の単離チャンバ、約３５００から約５０００の単離チャンバ、約４０００から約５５００の単離チャンバ、約４５００から約６０００の単離チャンバ、又は約５０００から約６５００の単離チャンバを有する。

[00108] 更に別の実施形態において、マイクロ流体デバイスは、本明細書で検討した実施形態の任意のものと同様に構成された単離チャンバを有し、マイクロ流体デバイスは、約６０００から約７５００の単離チャンバ、約７０００から約８５００の単離チャンバ、約８０００から約９５００の単離チャンバ、約９０００から約１０，５００の単離チャンバ、約、約１０，０００から約１１，５００の単離チャンバ、約１１，０００から約１２，５００の単離チャンバ、約１２，０００から約１３，５００の単離チャンバ、約１３，０００から約１４，５００の単離チャンバ、約１４，０００から約１５，５００の単離チャンバ、約１５，０００から約１６，５００の単離チャンバ、約１６，０００から約１７，５００の単離チャンバ、約１７，０００から約１８，５００の単離チャンバを有する。

[00109] 様々な実施形態において、マイクロ流体デバイスは、本明細書で検討した実施形態の任意のものと同様に構成された単離チャンバを有し、マイクロ流体デバイスは、約１８，０００から約１９，５００の単離チャンバ、約１８，５００から約２０，０００の単離チャンバ、約１９，０００から約２０，５００の単離チャンバ、約１９，５００から約２１，０００の単離チャンバ、又は約２０，０００から約２１，５００の単離チャンバを有する。

[00110] 単離チャンバの他の特性 デバイス１００（図１Ａ〜図１Ｃ）の各単離チャンバ１３６、１３８、１４０を画定し、デバイス４００（図４Ａ〜図４Ｃ）の単離チャンバ４３６の単離構造４４６を形成するマイクロ流体回路材料１１６（図１Ａ〜図１Ｃ）及び４１６（図４Ａ〜図４Ｃ）の障壁は、物理的障壁として図示し検討しているが、これらの障壁は代替的に、光パターン３２２の光によって活性化されるＤＥＰ力を含む「仮想的な」障壁として生成できることは認められよう。

[00111] いくつかの他の実施形態において、各単離チャンバ１３６、１３８、１４０、３３６、及び４３６は、（例えば、光源３２０に向けた検出器及び／又は選択制御モジュールによって）照明から遮蔽することができ、又は、短い時間期間だけ選択的に照明することも可能である。これにより、単離チャンバに収容されている細胞及び他の生物学的微小物体を、単離チャンバ１３６、１３８、１４０、３３６、及び４３６内へ移動させた後、更に別の（すなわち有害であり得る）照明から保護することができる。

[00112] 流体媒体 流れチャネル及び１つ以上の単離チャンバを有するマイクロ流体デバイスについての前述の検討に関して、流体媒体（例えば第１の媒体及び／又は第２の媒体）は、生物学的微小物体を実質的にアッセイ可能な状態に維持することができる任意の流体であり得る。アッセイ可能な状態は、生物学的微小物体及び実行されるアッセイに依存する。例えば、生物学的微小物体が、対象のタンパク質の分泌についてアッセイされる細胞である場合、この細胞は、生存し、タンパク質を発現及び分泌できるならば、実質的にアッセイ可能である。

[00113] 生体細胞の処理及び貯蔵 図５Ａは、生体細胞を（例えば凍結する場合）保持及び貯蔵するために用いられる、（従来技術の）マイクロタイターウェルプレートの複数のスタックを示す。上述のように、マイクロタイターウェルプレートは、マイクロ流体デバイスと充分に適合しない。更に、それらは比較的大きいので高コストの冷凍庫空間の大きな部分を占有し、また、生体細胞の貯蔵及び保管に用いられる場合に高コストの細胞保存試薬を大量に必要とする。比較のため、図５Ｂは、本明細書に開示される実施形態に従って構築された例示的なマイクロ流体デバイスの図である。

[00114] より具体的には、本明細書に詳細に図示し記載する）マイクロ流体デバイスのインフラストラクチャは、生体細胞のための極めて効率的な貯蔵容器となる。その理由としては、特に、同一のマイクロ流体デバイスを、例えばシークエンシング、培養、拡大／クローニング／サブクローニング、アッセイ等（以下、これらをまとめて「テスト」と称する）、細胞の下流での実験及び分析に使用できることである。具体的には、単離チャンバ（例えば上述の図１Ａ〜図１Ｃに示したデバイス１００の単離チャンバ１３６、１３８、及び１４０の各単離領域に生体細胞を隔離することを含めて、サンプルをマイクロ流体デバイスで最初に処理した後、隔離した細胞の在庫目録（又はライブラリ）を生成し、マイクロ流体デバイスに関連付けた記憶媒体に記憶することができ、その後、隔離した細胞の試験を行う必要が生じるまで、デバイスを氷点下の貯蔵冷凍庫で冷却し貯蔵することができる（数日、数週間、数か月、又は数年にわたる場合もある）。

[00115] このため、図６を参照すると、マイクロ流体デバイスにおいて生体細胞を処理し貯蔵するための例示的な方法は、ステップ５００において、マイクロ流体デバイスに流動性媒体を導入することを含む。流動性媒体は生体細胞を含む。ステップ５１０において、マイクロ流体デバイスの１つ以上の単離領域に、流動性媒体からの１つ以上の生体細胞を隔離する。ステップ５５０において、内部で隔離された１つ以上の生体細胞を含めてマイクロ流体デバイスを貯蔵のために凍結する。

[00116] 凍結前の細胞拡大（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ） マイクロ流体デバイス内にわずか１つだけの生体細胞を最初に隔離することも可能であるが、より典型的には、マイクロ流体デバイス内の複数の単離領域の各々に少なくとも１つの細胞が隔離される。この方法の実施形態で用いられる典型的なマイクロ流体デバイスは、数十から数百、又はそれ以上までの任意の単離領域を有することができ、各単離領域は、（限定ではないが）約１．５×１０^５立方ミクロンから約１．５×１０^６立方ミクロンの範囲内の体積を有するので、約１０の細胞から約５０の細胞、又はそれ以上という多数の細胞を隔離することができる。一実施形態では、マイクロ流体デバイスを凍結する前に、マイクロ流体デバイスの第１の単離領域内の隔離された（「開始」）細胞の１つ以上を培養して、適切な数の複数の「新しい」細胞を第１の単離領域において生成することで、マイクロ流体デバイスの解凍後に第１の単離領域に少なくとも１つの生存細胞が存在するようにする。

[00117] このため、充分な培養を行って、デバイスの凍結前に対象の各単離チャンバに少なくとも８の生体細胞を蓄積すること、更に好ましくは、デバイスの凍結前に対象の各単離チャンバに少なくとも１０、１６、２０、２４、３０、又は４０の生体細胞を蓄積することが望ましい場合がある。いくつかの例では、デバイスの凍結前に対象の各単離領域にもっと多くの細胞を蓄積することが好ましい場合がある。これは、マイクロ流体デバイスに適切な大きさの単離チャンバを有するいくつかの実施形態では、凍結前に対象の各単離領域に、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００、又はそれ以上に及ぶ任意の数の細胞を蓄積することを含む。ここに開示されるマイクロ流体デバイス内で生体細胞を拡大する方法は、２０１６年４月２２日に出願された米国特許出願第１５／１３５，７０７号に記載されている。その全体的な内容は援用により本願にも含まれるものとする。

[00118] ブロッキング溶液及びブロッキング剤 理論に束縛されることは意図しないが、細胞を凍結させ、次いで解凍した後、細胞溶解の発生率は高く、結果としてマイクロ流体デバイスの内面が汚染される可能性があり（例えば、タンパク質、核酸、及びその他の生体分子を含む溶解細胞（複数の溶解細胞）の細胞含有物が、マイクロ流体デバイスの内面、特に基板表面に接着するため）、これによって、非溶解細胞がマイクロ流体デバイスの汚染した内面に接着する又は「貼り付く（ｓｔｉｃｋｉｎｇ）」可能性がある。いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの内面の１つ以上（例えば、ＤＥＰ構成マイクロ流体デバイスの電極活性化基板の内面、マイクロ流体デバイスのカバー、及び／又は回路材料の表面）を、ブロッキング溶液及び／又はブロッキング剤で処理して、細胞の接着又は貼り付きを防止又は軽減する。いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスにおいて凍結される細胞を、１つ以上のブロッキング剤を含むブロッキング溶液内で取り込む。

[00119] 他の実施形態において、マイクロ流体デバイス（例えばＤＥＰ構成マイクロ流体デバイス）の内面（複数の内面）は、マイクロ流体デバイス内に細胞を導入する前に、ブロッキング剤を含むブロッキング溶液で処理されるか又は「下塗りされる（ｐｒｉｍｅ）」。任意の好都合なブロッキング剤／ブロッキング溶液を用いることができ、これは限定ではないが、血清又は血清因子、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）、ポリマー、洗剤、酵素、及びそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの特定の実施形態では、ブロッキング剤を用いてマイクロ流体デバイスの内面（複数の内面）を処理する。一例においては、ブロッキング溶液中のブロッキング剤として、アルキレンエーテル部分を含むポリマーを含めることができる。多種多様なアルキルエーテル含有ポリマーが適切であり得る。アルキルエーテル含有ポリマーの非限定の例示的な１つのクラスは、ポリマー鎖内に異なる比及び異なる位置でポリエチレンオキシド（ＰＥＯ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ）及びポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ：ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ）サブユニットのブロックを含む両親媒性非イオン性ブロック共重合体である。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリマー（ＢＡＳＦ）は、このタイプのブロック共重合体であり、生きた細胞と接触している場合の使用に適していることが当技術分野で既知である。これらのポリマーは、平均分子量Ｍ_Ｗが約２０００Ｄａから約２０ＫＤａまでの範囲である。いくつかの実施形態において、ＰＥＯ−ＰＰＯブロック共重合体は、約１０よりも大きい親水性親油性バランス（ＨＬＢ：ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ−ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｂａｌａｎｃｅ）を有し得る（例えば１２〜１８）。調節された表面を生成するため有用な特定のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリマーには、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ４４、Ｌ６４、Ｐ８５、及びＦ１２７（Ｆ１２７ＮＦを含む）が含まれる。アルキレンエーテル含有ポリマーの別のクラスは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ Ｍ_Ｗ＜１００，０００Ｄａ）、あるいはポリエチレンオキシド（ＰＥＯ、Ｍ_Ｗ＞１００，０００）である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧのＭ_Ｗは、約１０００Ｄａ、５０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、又は２０，０００Ｄａであり得る。別の例では、ブロッキング溶液のブロッキング剤にＤＮａｓｅを含ませて、マイクロ流体デバイスの基板及び／又は壁に貼り付きを生じ得る核外ＤＮＡを除去することも可能である。

[00120] いくつかの実施形態において、ブロッキング溶液は、様々なタンパク質及び／又はペプチドをブロッキング剤として含むことができる。特定の実施形態において、本開示で使用できるブロッキング溶液は、アルブミン（例えばＢＳＡ）、及び／又はアルブミンを含む血清（又は複数の異なる血清の組み合わせ）等のタンパク質、及び／又は１つ以上の他の同様のタンパク質を、ブロッキング剤として含む。血清は、限定ではないが、ウシ胎仔血清、ヒツジ血清、ヤギ血清、ウマ血清等を含む任意の好都合なソースから得られる。いくつかの実施形態において、ブロッキング溶液中のＢＳＡは約１ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの範囲内で存在し、これには、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、又はそれ以上、又はこれらの間の任意の値が含まれる。いくつかの実施形態において、ブロッキング溶液中の血清は約２０％（ｖ／ｖ）から約５０％ｖ／ｖの範囲内で存在し、これには、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又はそれ以上、又はこれらの間の任意の値が含まれる。いくつかの実施形態において、ＢＳＡはブロッキング溶液中にブロッキング剤として５ｍｇ／ｍＬ存在し、他の実施形態では、ＢＳＡはブロッキング溶液中にブロッキング剤として７０ｍｇ／ｍＬ存在する。いくつかの実施形態では、血清はブロッキング溶液中にブロッキング剤として３０％存在する。

[00121] コーティング材料 実施形態に応じて、前述のブロッキング剤／ブロッキング溶液のいかなるものも、マイクロ流体デバイス（例えば、ＤＥＰ構成及び／又はＥＷ構成マイクロ流体デバイス）の内面（複数の内面）の１つ以上をコーティングするため用いられる様々な材料によって置き換えられるか、又はそのような様々な材料と組み合わせて使用することができる。いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの表面は、表面の汚染を軽減する及び／又は表面に細胞が貼り付くのを防止もしくは軽減するコーティング材料を含む。いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの実質的に全ての内面がコーティング材料を含む。コーティングされた内面（複数の内面）には、流れ領域（例えばチャネル）、チャンバ、又は隔離区画（ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ ｐｅｎ）、又はそれらの組み合わせが含まれ得る。いくつかの実施形態において、複数の隔離区画の各々は、コーティング材料でコーティングされた少なくとも１つの内面を有する。他の実施形態において、複数の流れ領域又はチャネルの各々は、コーティング材料でコーティングされた少なくとも１つの内面を有する。いくつかの実施形態において、複数の隔離区画の各々及び複数のチャネルの各々の少なくとも１つの内面は、コーティング材料でコーティングされている。

[00122] ポリマーベースのコーティング材料 少なくとも１つの内面は、ポリマーを含有するコーティング材料を含む。ポリマーは、少なくとも１つの表面に共有又は非共有結合（ｂｏｕｎｄ）（又はリンク（ｌｉｎｋ））している場合がある。ポリマーは、ブロックポリマー（及び共重合体）、星型ポリマー（星型共重合体）、グラフト又は櫛形ポリマー（グラフト共重合体）で見られるもの等、多種多様な構造モチーフを有することができ、これらは全て本明細書に開示される方法に適切であり得る。

[00123] ポリマーは、アルキレンエーテル部分を含有するポリマーを含み得る。多種多様なアルキレンエーテル含有ポリマーが、本明細書に記載されるマイクロ流体デバイスにおける使用に適切であり得る。アルキレンエーテル含有ポリマーの非限定の例示的な１つのクラスは、ポリマー鎖内に異なる比及び異なる位置でポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）及びポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）サブユニットのブロックを含む両親媒性非イオン性ブロック共重合体である。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリマー（ＢＡＳＦ）は、このタイプのブロック共重合体であり、生きた細胞と接触している場合の使用に適していることが当技術分野で既知である。これらのポリマーは、平均分子量Ｍ_Ｗが約２０００Ｄａから約２０ＫＤａまでの範囲である。いくつかの実施形態において、ＰＥＯ−ＰＰＯブロック共重合体は、約１０よりも大きい親水性親油性バランス（ＨＬＢ）を有し得る（例えば１２〜１８）。コーティングされた表面を生成するため有用な特定のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリマーには、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ４４、Ｌ６４、Ｐ８５、及びＦ１２７（Ｆ１２７ＮＦを含む）が含まれる。アルキレンエーテル含有ポリマーの別のクラスは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ Ｍ_Ｗ＜１００，０００Ｄａ）、あるいはポリエチレンオキシド（ＰＥＯ、Ｍ_Ｗ＞１００，０００）である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧのＭ_Ｗは、約１０００Ｄａ、５０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、又は２０，０００Ｄａであり得る。

[00124] 他の実施形態において、コーティング材料は、カルボン酸部分を含有するポリマーを含み得る。カルボン酸サブユニットは、アルキル、アルケニル、又は芳香族部分を含有するサブユニットであり得る。非限定的な１つの例は、ポリ乳酸（ＰＬＡ）である。

[00125] 他の実施形態において、コーティング材料は、スルホン酸部分を含有するポリマーを含み得る。スルホン酸サブユニットは、アルキル、アルケニル、又は芳香族部分を含有するサブユニットであり得る。非限定的な１つの例は、ポリスチレンスルホン酸（ＰＳＳＡ）又はポリアネトールスルホン酸（ｐｏｌｙａｎｅｔｈｏｌｅ ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）である。これらの後者の例示的なポリマーは高分子電解質であり、表面の特性を変えて細胞の貼り付きを阻止することができる。

[00126] いくつかの実施形態において、コーティング材料は、限定ではないがポリウレタンのようなウレタン部分を含有するポリマーを含み得る。

[00127] 他の実施形態において、コーティング材料は、ポリマー主鎖の末端において又はポリマー主鎖からペンダント状態でリン酸部分を含有するポリマーを含み得る。

[00128] 他の実施形態において、コーティング材料は、サッカライド部分を含有するポリマーを含み得る。非限定的な例では、藻類もしくは真菌類に由来するもののような多糖類、キサンタンゴムもしくはデキストラン等の多糖類が、マイクロ流体デバイスにおける細胞の貼り付きを軽減又は防止し得る材料を形成するのに適切であり得る。例えば、約３Ｋｄａの大きさを有するデキストランポリマーを用いて、マイクロ流体デバイス内の表面のコーティング材料を提供することができる。

[00129] 他の実施形態において、コーティング材料は、リボヌクレオチド部分又はデオキシリボヌクレオチド部分を有し得るヌクレオチド部分すなわち核酸を含有するポリマーである。核酸は、天然ヌクレオチド部分のみを含有するか、又は、限定ではないが、７−デアザアデニン、ペントース、メチルホスホネート、又はホスホロチオエート部分のような、核酸塩基、リボース、もしくはリン酸部分類似体を含む非天然ヌクレオチド部分を含有する場合がある。核酸含有ポリマーは、細胞の貼り付きを軽減又は防止し得る高分子電解質を含み得る。

[00130] 更に別の実施形態において、コーティング材料は、アミノ酸部分を含有するポリマーを含み得る。アミノ酸部分を含有するポリマーは、天然アミノ酸含有ポリマー又は非天然アミノ酸含有ポリマーを含むことができ、どちらも、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質を含み得る。１つの非限定的な例では、タンパク質はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であり得る。いくつかの実施形態では、コーティング材料内に細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質を与えて、細胞接着を最適化して細胞成長を促進する。コーティング材料に含まれ得る細胞マトリックスタンパク質は、限定ではないが、コラーゲン、エラスチン、ＲＧＤ含有ペプチド（例えばフィブロネクチン）、又はラミニンを含むことができる。更に別の実施形態では、マイクロ流体デバイスのコーティング材料内に、成長因子、サイトカイン、ホルモン、又はその他の細胞シグナリング種を与えてもよい。

[00131] 別の実施形態において、コーティング材料は、アミン部分を含有するポリマーを含み得る。ポリアミノポリマーは、天然ポリアミンポリマー又は合成ポリアミンポリマーを含み得る。天然ポリアミンの例には、スペルミン、スペルミジン、及びプトレシンが含まれる。

[00132] いくつかの実施形態において、コーティング材料は、アルキレンオキシド部分、カルボン酸部分、スルホン酸部分、リン酸部分、サッカライド部分、ヌクレオチド部分、又はアミノ酸部分のうち２つ以上を含有するポリマーを含み得る。他の実施形態において、ポリマー調節表面は、２つ以上のポリマーの混合物を含み、それらのポリマーの各々が、アルキレンオキシド部分、カルボン酸部分、スルホン酸部分、リン酸部分、サッカライド部分、ヌクレオチド部分、及び／又はアミノ酸部分を有し得る。これらは、独立して又は同時にコーティング材料に組み込まれ得る。

[00133] 共有結合した（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）コーティング材料 いくつかの実施形態において、少なくとも１つの内面は、マイクロ流体デバイスの表面の汚染を軽減する及び／又は表面に対する細胞の貼り付きを防止もしくは軽減する共有結合分子を含む。共有結合分子は連結基を含み、この連結基がマイクロ流体デバイスの表面に共有結合している。また、連結基は、マイクロ流体デバイスの表面の汚染を軽減する及び／又は表面に細胞が貼り付くのを防止もしくは軽減するように構成された分子に共有結合している。連結基が結合している表面は、マイクロ流体デバイスの基板の表面を含むことができ、これは、マイクロ流体デバイスがＤＥＰ構成を含む実施形態では、シリコン及び／又は二酸化シリコンを含み得る。いくつかの実施形態において、共有結合したコーティング材料は、マイクロ流体デバイスの内面の実質的に全てをコーティングする。

[00134] いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスの表面の汚染を軽減する及び／又は表面に対する細胞の貼り付きを防止もしくは軽減するように構成された共有結合部分は、アルキル又はフルオロアルキル（ペルフルオルアルキルを含む）部分；単糖類又は多糖類（限定ではないがデキストランを含み得る）；アルコール（限定ではないがプロパルギルアルコールを含む）；限定ではないがポリビニルアルコールを含む多価アルコール；限定ではないがポリエチレングリコールを含むアルキレンエーテル；高分子電解質（限定ではないがポリアクリル酸もしくはポリビニルホスホン酸を含む）；アミノ基（その誘導体を含む。限定ではないが例えば、アルキル化アミン、ヒドロキシアルキル化アミノ基、グアニジン、限定ではないがモルホリニルもしくはピペラジニル等の芳香族化されていない窒素環原子を含有する複素環基）；限定ではないがプロピオル酸を含むカルボン酸（カルボン酸アニオン表面を与え得る）；限定ではないがエチニルホスホン酸を含むホスホン酸（ホスホン酸アニオン表面を与え得る）；スルホン酸アニオン；カルボキシベタイン；スルホベタイン、スルファミン酸；又はアミノ酸を含み得る。

[00135] マイクロ流体デバイスの表面の汚染を軽減する及び／又は表面に対する細胞の貼り付きを防止もしくは軽減するように構成された共有結合部分は、本明細書に記載されているような任意のポリマーとすればよく、アルキレンオキシド部分、カルボン酸部分、サッカライド部分、スルホン酸部分、リン酸部分、アミノ酸部分、核酸部分、又はアミノ酸部分を含有する１つ以上のポリマーを含み得る。

[00136] 他の実施形態において、マイクロ流体デバイスの表面の汚染を軽減する及び／又は表面に対する細胞の貼り付きを防止もしくは軽減するように構成された共有結合部分は、アルキル部分、フルオロアルキル部分（限定ではないがペルフルオロアルキル部分を含む）等の置換アルキル部分、アミノ酸部分、アルコール部分、アミノ部分、カルボン酸部分、ホスホン酸部分、スルホン酸部分、スルファミン酸部分、又はサッカライド部分のような、非ポリマー部分を含み得る。

[00137] いくつかの実施形態において、共有結合部分は、直鎖（例えば、少なくとも１０の炭素、又は少なくとも１４、１６、１８、２０、２２、又はそれ以上の炭素の直鎖）を形成する炭素原子を含むアルキル基であり得る。従って、アルキル基は非分岐アルキルであり得る。いくつかの実施形態において、アルキル基は、置換アルキル基を含むことができる（例えば、アルキル基の炭素のいくつかがフッ素化又は過フッ素化されている（ｐｅｒｆｌｕｏｒｉｎａｔｅｄ）可能性がある）。アルキル基は、非置換炭素の直鎖に連結された置換（例えばフッ素化又は過フッ素化）炭素の直鎖を含み得る。例えばアルキル基は、ペルフルオロアルキル基を含む第１のセグメントを含み、これが、非置換アルキル基を含む第２のセグメントに連結されている場合がある。第１及び第２のセグメントは、直接に又は間接的に（例えばエーテル結合によって）連結され得る。アルキル基の第１のセグメントは連結基に対して遠位に位置し、アルキル基の第２のセグメントは連結基に対して近位に位置し得る。他の実施形態において、アルキル基は分岐アルキル基を含み、更に、アルキル基のアルキル主鎖を分断する１つ以上のアリレン基を有し得る。いくつかの実施形態において、アルキル基又はフッ素化アルキル基の分岐部分又はアリレン分断部分は、連結基及び表面に対する共有結合に対して遠位のポイントに位置している。

[00138] 他の実施形態において、共有結合部分は少なくとも１つのアミノ酸を含むことができ、これには２種以上のアミノ酸が含まれ得る。従って、共有結合部分はペプチド又はタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態において、共有結合部分は、細胞成長、生存性、可搬性、又はそれらの任意の組み合わせをサポートする両性イオン表面を与え得るアミノ酸を含むことができる。

[00139] 共有結合部分は、１つ以上のサッカライドを含むことができる。共有結合サッカライドは、単糖類、二糖類、又は多糖類であり得る。共有結合サッカライドは、表面に付着するための結合又は改善を可能にする反応性ペアリング部分（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐａｉｒｉｎｇ ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を導入するように修飾することができる。例示的な反応性ペアリング部分には、アルデヒド、アルキン、又はハロ部分が含まれ得る。多糖はランダムに修飾することができ、サッカライド単量体の各々を修飾するか、又は多糖内のサッカライド単量体の一部のみを修飾して、表面に直接又は間接的に結合し得る反応性ペアリング部分を与えることができる。１つの例は、非分岐リンカーを介して表面に間接的に結合できるデキストラン多糖を含み得る。

[00140] 共有結合部分は、１つ以上のアミノ基を含み得る。アミノ基は、置換アミン部分、グアニジン部分、窒素含有複素環部分、又はヘテロアリール部分であり得る。アミノ含有部分は、マイクロ流体デバイス内、任意選択的に隔離区画及び／又は流れ領域（例えばチャネル）内の環境のｐＨ変更を可能にする構造を有し得る。

[00141] コーティング材料は、１種類のみの共有結合部分を含むか、又は異なる２種類以上の共有結合部分を含むことができる。例えば、フルオロアルキル調節表面（ペルフルオルアルキルを含む）は、全て同じである複数の共有結合部分を有し得る。全て同じとは、例えば、表面に対する連結基及び共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）が同じであり、全長が同じであり、更に、フルオロアルキル部分を含むフルオロメチレン単位の数が同じである。あるいは、コーティング材料は、表面に付着した２種類以上の共有結合部分を有し得る。例えばコーティング材料は、指定数のメチレン又はフルオロメチレン単位を有する共有結合アルキル又はフルオロアルキル部分を有する分子を含むことができ、更に、もっと多くのメチレン又はフルオロメチレン単位を有するアルキル又はフルオロアルキル鎖に付着した共有チャージ部分を有する分子セットを含み得る。いくつかの実施形態において、２種類以上の共有結合部分を有するコーティング材料は、主鎖原子の数が多く、従って共有結合から表面までが長い第１の分子セットが、コーティングされた表面においてより大きな部分を提示する能力を与えるのに対し、これとは異なる立体的な要求の厳しくない末端を有し、主鎖原子の数が少ない第２の分子セットが、基板表面全体を官能化させ、これによって基板自体を構成するシリコン又はアルミナとの望ましくない接着又は接触を防止するのを手助けできるように設計され得る。別の例では、共有結合部分は、表面上でランダムに交互の電荷を提示する両性イオン表面を与え得る。

[00142] 調節表面の特性 いくつかの実施形態において、共有結合部分は、マイクロ流体デバイスの表面（例えばＤＥＰ構成基板表面）に共有結合された場合、単層を形成することができる。いくつかの実施形態において、共有結合部分によって形成された調節表面は、１０ｎｍ未満の厚さを有し得る（例えば５ｎｍ未満、又は約１．５〜３．０ｎｍ）。他の実施形態において、共有結合部分によって形成された調節表面は、約１０ｎｍ〜約５０ｎｍの厚さを有し得る。いくつかの実施形態において、調節表面は、ＤＥＰ構成マイクロ流体デバイス内での動作に適切に機能するため完璧に形成された単層は必要としない。

[00143] 様々な実施形態において、マイクロ流体デバイスのコーティング材料は所望の電気的特性を与え得る。理論に束縛されることは意図しないが、特定のコーティング材料でコーティングされた表面のロバスト性に影響を与える１つのファクタは、固有の電荷トラップである。様々なコーティング材料が電子をトラップする可能性があり、これはコーティング材料の破壊（ｂｒｅａｋｄｏｗｎ）を生じる恐れがある。コーティング材料に欠陥があると、電荷トラップが増大し、コーティング材料の更なる破壊を招くことがある。同様に、異なるコーティング材料はそれぞれ異なる絶縁耐力（すなわち、絶縁破壊を生じる最小の印加電界）を有し、これは電荷トラップに影響を及ぼし得る。いくつかの実施形態において、コーティング材料は、電荷トラップ量を軽減又は制限する全体構造（例えば高密度充填単層構造）を有することができる。

[00144] コーティング材料の組成の他に、コーティング材料の物理的（及び電気的）な厚さのような他のファクタも、マイクロ流体デバイスの基板によるＤＥＰ力及び／又はエレクトロウェッティング力（ｅｌｅｃｔｒｏｗｅｔｔｉｎｇ ｆｏｒｃｅ）の発生に影響を及ぼし得る。基板上にコーティング材料が堆積される方法（例えば気相堆積、液相堆積、スピンコーティング、又は静電コーティング）を含む様々なファクタによって、コーティング材料の物理的及び電気的な厚さが変化し得る。コーティング材料の物理的な厚さ及び均一性は、エリプソメータを用いて測定することができる。

[00145] 電気的特性の他に、コーティング材料は、生体分子と共に用いる際に有益である特性を有し得る。例えば、フッ素化（又は過フッ素化）アルキル基を含有するコーティング材料は、非置換アルキル基に比べ、表面汚染量の低減において利点を与えることができる。本明細書で用いる場合、表面汚染は、マイクロ流体デバイスの表面上に無差別に堆積した物質の量を指し、タンパク質及び分解産物、核酸、及び各分解産物のような、永久的又は半永久的な生体物質の堆積を含み得る。そのような汚染は、表面に対する生物学的微小物体の接着量を増大させる可能性がある。

[00146] 以下の表に、マイクロ流体デバイスにおいて使用できる異なるコーティング材料の様々な電気的特性及び機能的特性が含まれる。

[00147] 調節表面の組成の他に、疎水性材料の物理的厚さのような他のファクタも、ＤＥＰ力に影響を及ぼし得る。基板上に調節表面が形成される方法（例えば気相堆積、液相堆積、スピンコーティング、フラッディング（ｆｌｏｏｄｉｎｇ）、又は静電コーティング）のような様々なファクタによって、調節表面の物理的厚さが変化し得る。調節表面の物理的な厚さ及び均一性は、エリプソメータを用いて測定することができる。

[00148] 電気的特性の他に、調節表面は、生体分子と共に用いる際に有益である特性も有し得る。例えば、フッ素化（又は過フッ素化）炭素鎖を含有する調節表面は、アルキル終端鎖に比べ、表面汚染量の低減において利点を与えることができる。本明細書で用いる場合、表面汚染は、マイクロ流体デバイスの表面上に堆積した無差別な物質の量を指し、タンパク質及びその分解産物、核酸、及び各分解産物のような、永久的又は半永久的な生体物質の堆積を含み得る。

[00149] 以下の表には、ＤＥＰ構成において使用できる調節表面の様々な特性が含まれる。見てわかるように、全て本明細書に記載されるような共有結合調節表面であったエントリ１〜７において、エリプソメータにより測定された厚さは、非共有結合のスピンコーティングで形成したＣＹＴＯＰ表面であるエントリ８よりも一貫して厚かった（表全体を通して、Ｎ／Ａは該当データなしを表す）。フッ素化表面は典型的にアルキル（炭化水素）調節表面よりも汚染が少なかったので、汚染は、形成モードよりも表面の化学的性質に大きく依存することがわかった。

[00150]

[00151] 表面に対する連結基 コーティング材料を形成する共有結合部分は、連結基を介して表面に付着している。連結基は、シロキサン含有試薬と基板表面の酸化物との反応によって形成されたシロキシ連結基とすることができる。基板表面の酸化物は、（例えばＤＥＰ構成基板では）酸化シリコン、又は（例えばＥＷ構成基板では）酸化アルミニウムもしくは酸化ハフニウムを含み得る。他のいくつかの実施形態において、連結基は、ホスホン酸含有試薬と基板表面の酸化物との反応によって形成されたホスホン酸エステルとすることができる。

[00152] 複数部分の調節表面 共有結合コーティング材料は、マイクロ流体デバイスの表面の汚染を軽減する及び／又は表面に対する細胞の貼り付きを防止もしくは軽減するように構成された部分をすでに含有する分子の反応によって形成できる（例えば、アルキルシロキサン試薬又はフルオロ置換アルキルシロキサン試薬であり、ペルフルオロアルキルシロキサン試薬を含み得る）。これについては以下で説明する。あるいは、共有結合コーティング材料は、表面の汚染を軽減する及び／又は細胞の貼り付きを防止もしくは軽減するように構成された部分を、それ自体が表面に共有結合している表面改質リガンドに結合することによって、形成することができる。

[00153] 共有結合コーティング材料を調製する方法 いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスの表面（例えば、隔離区画及び／又は流れ領域の少なくとも１つの表面を含む）に共有結合しているコーティング材料は、式１の構造を有する。

[00154] コーティング材料は、ＤＥＰ構成基板の表面の酸化物に共有結合できる。ＤＥＰ構成基板は、酸化シリコン又は酸化アルミナ又は酸化ハフニウムを含むことができ、酸化物は、基板の天然の（ｎａｔｉｖｅ）化学構造の一部として提示されるか、又は以下で検討するように導入され得る。

[00155] コーティング材料は、連結基（「ＬＧ」）を介して酸化物に付着させることができる。連結基は、シロキサン又はホスホン酸基と酸化物との反応から形成されたシロキシ又はホスホン酸エステル基であり得る。マイクロ流体デバイスの表面の汚染を軽減する及び／又は表面に対する細胞の貼り付きを防止もしくは軽減するように構成された部分は、本明細書に記載される部分のうち任意のものとすればよい。連結基ＬＧは、マイクロ流体デバイスの表面の汚染を軽減する及び／又は表面に対する細胞の貼り付きを防止もしくは軽減するように構成された部分に対して直接又は間接的に接続され得る。連結基ＬＧがこの部分に直接接続されている場合、任意選択的なリンカー（「Ｌ」）は存在せず、ｎはゼロである。連結基ＬＧがこの部分に間接的に接続されている場合、リンカーＬは存在し、ｎは１である。リンカーＬは直線部分を有し得る。この直線部分の主鎖は、シリコン、炭素、窒素、酸素、硫黄、及びリン原子の任意の組み合わせから選択された、当技術分野において既知のように化学結合の制限を受ける、１〜２００の非水素原子を含み得る。これは、いくつかの非限定的な例において、エーテル、アミノ、カルボニル、アミド、又はホスホン酸基から成る群から選択された１つ以上の部分の任意の組み合わせによって分断され得る。これに加えて、リンカーＬは、リンカーの主鎖を分断する１つ以上のアリレン、ヘテロアリレン、又は複素環基を有し得る。いくつかの実施形態において、リンカーＬの主鎖は１０〜２０の原子を含み得る。他の実施形態において、リンカーＬの主鎖は、約５の原子から約２００の原子、約１０の原子から約８０の原子、約１０の原子から約５０の原子、又は約１０の原子から約４０の原子を含み得る。いくつかの実施形態において、主鎖原子は全て炭素原子である。他の実施形態では、主鎖原子は全てが炭素ではなく、当技術分野において既知のように化学結合の制限を受ける、シリコン、炭素、窒素、酸素、硫黄、又はリン原子の任意の可能な組み合わせを含み得る。

[00156] マイクロ流体デバイスの表面の汚染を軽減する及び／又は表面に対する細胞の貼り付きを防止もしくは軽減するように構成された部分が、１段階プロセスで基板の表面に加えられる場合、式２の分子を用いてコーティング材料を導入することができる。
部分−（Ｌ）ｎ−ＬＧ 式２

[00157] いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスの表面の汚染を軽減する及び／又は表面に対する細胞の貼り付きを防止もしくは軽減するように構成された部分は、多段階プロセスで基板の表面に加えることができる。表面の汚染を軽減する及び／又は細胞の貼り付きを防止もしくは軽減するように構成された部分が段階的に表面に結合される場合、式３に示すように、リンカーＬは更に結合基ＣＧも含み得る。

[00158] いくつかの実施形態において、結合基ＣＧは、反応性部分Ｒ_ｘと反応性ペアリング部分Ｒ_ｐｘ（すなわち、反応性部分Ｒ_ｘと反応するように構成された部分）との反応から得られた基を表す。例えば、１つの典型的な結合基ＣＧは、アミノ基と、活性化エステル、酸塩化物のようなカルボン酸の誘導体との反応から得られたカルボキサミジル基を含み得る。他のＣＧには、トリアゾリレン基、カルボキサミジル、チアミジル、オキシム、メルカプチル、ジスルフィド、エーテル、又はアルケニル基、又は、反応性部分と各反応性ペアリング部分との反応時に形成され得る他の任意の適切な基が含まれ得る。結合基ＣＧは、リンカーＬの第２の端部（すなわち、マイクロ流体デバイスの表面の汚染を軽減する及び／又は表面に対する細胞の貼り付きを防止もしくは軽減するように構成された部分に対して近位の端部）に位置し得る。いくつかの他の実施形態において、結合基ＣＧはトリアゾリレンであり、これは、どちらも反応性部分Ｒ_ｘ又は反応性ペアリング部分Ｒ_ｐｘであり得るアルキン基とアジド基との反応によって生じる。これは、クリック結合反応における使用について当技術分野では既知である。また、トリアゾリレン基は置換されている場合もある。例えば、ジベンゾシロコオクテニル（ｄｉｂｅｎｚｏｃｙｌｃｏｏｃｔｅｎｙｌ）融合トリアゾリレン基は、ジベンゾシクロオクチニル反応性ペアリング部分Ｒ_ｐｘに結合された部分と表面改質分子のアジド反応性部分Ｒ_ｘとの反応から得られる。これについては、以下の段落で更に詳しく記載されている。多種多様なジベンゾシクロオクチニル修飾分子が当技術分野では既知であり、それらを合成して、細胞成長、生存性、可搬性、又はそれらの任意の組み合わせをサポートするように構成された部分を組み込むことができる。

[00159] コーティング材料が多段階プロセスで形成される場合、マイクロ流体デバイスの表面の汚染を軽減する及び／又は表面に対する細胞の貼り付きを防止もしくは軽減するように構成された部分は、部分含有試薬（式５）と、これに共有結合している表面改質リガンドを有する基板との反応によって、導入することができる（式６）。

[00160] 式４の改質表面は、−ＬＧ−（Ｌ’’）ｊ−Ｒ_ｘの式を有する表面改質リガンドが付着し、これは基板の酸化物に結合し、式１の調節表面について上述したのと同様に形成されている。基板の表面は、上述のようなＤＥＰ構成基板表面とすることができ、基板の天然の又は基板に導入された酸化物を含み得る。連結基ＬＧは上述した通りである。リンカーＬ’’は、存在する場合もあり（ｊ＝１）、存在しない場合もある（ｊ＝０）。リンカーＬ’’は直線部分を有し得る。この直線部分の主鎖は、シリコン、炭素、窒素、酸素、硫黄、及びリン原子の任意の組み合わせから選択された、当技術分野において既知のように化学結合の制限を受ける、１〜１００の非水素原子を含み得る。これは、いくつかの非限定的な例において、エーテル、アミノ、カルボニル、アミド、又はホスホン酸基の任意の組み合わせによって分断され得る。これに加えて、リンカーＬ’’は、リンカーの主鎖を分断する１つ以上のアリレン、ヘテロアリレン、又は複素環基を有し得る。いくつかの実施形態において、リンカーＬ’’の主鎖は１０〜２０の原子を含み得る。他の実施形態において、リンカーＬ’’の主鎖は、約５の原子から約１００の原子、約１０の原子から約８０の原子、約１０の原子から約５０の原子、又は約１０の原子から約４０の原子を含み得る。いくつかの実施形態において、主鎖原子は全て炭素原子である。他の実施形態では、主鎖原子は全てが炭素ではなく、当技術分野において既知のように化学結合の制限を受ける、シリコン、炭素、窒素、酸素、硫黄、又はリン原子の任意の可能な組み合わせを含み得る。

[00161] 反応性部分Ｒ_ｘは、表面改質リガンドと表面との共有結合に対して遠位の表面改質リガンドの末端に存在する。反応部分Ｒ_ｘは、マイクロ流体デバイスの表面の汚染を軽減する及び／又は表面に対する細胞の貼り付きを防止もしくは軽減するように構成された部分を導入するための結合反応に有用である任意の適切な反応性部分である。いくつかの実施形態において、反応性部分Ｒ_ｘは、アジド、アミノ、ブロモ、チオール、活性化エステル、スクシンイミジル、又はアルキニル部分であり得る。

[00162] 部分含有試薬 部分含有試薬（式５）は、マイクロ流体デバイスの表面の汚染を軽減する及び／又は表面に対する細胞の貼り付きを防止もしくは軽減するよう構成された部分を供給するように構成されている。
部分−（Ｌ’）_ｍ−Ｒ_ｐｘ 式５

[00163] 部分含有試薬の、マイクロ流体デバイスの表面の汚染を軽減する及び／又は表面に対する細胞の貼り付きを防止もしくは軽減するように構成された部分は、反応性ペアリング部分Ｒ_ｐｘと反応性部分Ｒ_ｘとの反応によって、表面改質リガンドに結合されている。反応性ペアリング部分Ｒ_ｐｘは、各反応性部分Ｒ_ｘと反応するように構成された任意の適切な反応基である。１つの非限定的な例において、１つの適切な反応性ペアリング部分Ｒ_ｐｘはアルキンであり、反応性部分Ｒ_ｘはアジドであり得る。あるいは反応性ペアリング部分Ｒ_ｐｘがアジド部分であり、各反応性部分Ｒ_ｘがアルキンであり得る。他の実施形態において、反応性ペアリング部分Ｒ_ｐｘは活性エステル官能基であり、反応性部分Ｒ_ｘはアミノ基であり得る。他の実施形態において、反応性ペアリング部分Ｒ_ｐｘはアルデヒドであり、反応性部分Ｒ_ｘはアミノであり得る。他の反応性部分と反応性ペアリング部分の組み合わせも可能であり、これらの例は限定ではない。

[00164] 式５の部分含有試薬の、マイクロ流体デバイスの表面の汚染を軽減する及び／又は表面に対する細胞の貼り付きを防止もしくは軽減するように構成された部分は、本明細書に記載される部分の任意のものを含み得る。これは、アルキル又はフルオロアルキル（ペルフルオロアルキルを含む）部分；単糖類又は多糖類（限定ではないがデキストランを含み得る）；アルコール（限定ではないがプロパルギルアルコールを含む）；限定ではないがポリビニルアルコールを含む多価アルコール；限定ではないがポリエチレングリコールを含むアルキレンエーテル；高分子電解質（限定ではないがポリアクリル酸又はポリビニルホスホン酸を含む）；アミノ基（その誘導体を含む。限定ではないが例えば、アルキル化アミン、ヒドロキシアルキル化アミノ基、グアニジン、限定ではないがモルホリニルもしくはピペラジニル等の芳香族化されていない窒素環原子を含有する複素環基）；限定ではないがプロピオル酸を含むカルボン酸（カルボン酸アニオン表面を与え得る）；限定ではないがエチニルホスホン酸を含むホスホン酸（ホスホン酸アニオン表面を与え得る）；スルホン酸アニオン；カルボキシベタイン；スルホベタイン；スルファミン酸；又はアミノ酸を含む。

[00165] 式５の部分含有試薬の、マイクロ流体デバイスの表面の汚染を軽減する及び／又は表面に対する細胞の貼り付きを防止もしくは軽減するように構成された部分は、反応性ペアリング部分Ｒ_ｐｘに直接接続される（すなわちＬ’、ここでｍ＝０）か、又は間接的に接続され得る。反応性ペアリング部分Ｒ_ｐｘが、表面の汚染を軽減する及び／又は表面に対する細胞の貼り付きを防止もしくは軽減するように構成された部分に間接的に接続される場合、反応性ペアリング部分Ｒ_ｐｘはリンカーＬ’に接続され得る（ｍ＝１）。反応性ペアリング部分Ｒ_ｐｘはリンカーＬ’の第１の端部に接続され、表面の汚染を軽減する及び／又は表面に対する細胞の貼り付きを防止もしくは軽減するように構成された部分は、リンカーＬ’の第２の端部に接続され得る。リンカーＬ’は直線部分を有し得る。この直線部分の主鎖は、シリコン、炭素、窒素、酸素、硫黄、及びリン原子の任意の組み合わせから選択された、当技術分野において既知のように化学結合の制限を受ける、１〜１００の非水素原子を含む。これは、いくつかの非限定的な例において、エーテル、アミノ、カルボニル、アミド、又はホスホン酸基の任意の組み合わせによって分断され得る。これに加えて、リンカーＬ’は、リンカーＬ’の主鎖を分断する１つ以上のアリレン、ヘテロアリレン、又は複素環基を有し得る。いくつかの実施形態において、リンカーＬ’の主鎖は１０〜２０の原子を含み得る。他の実施形態において、リンカーＬ’の主鎖は、約５の原子から約１００の原子、約１０の原子から約８０の原子、約１０の原子から約５０の原子、又は約１０の原子から約４０の原子を含み得る。いくつかの実施形態において、主鎖原子は全て炭素原子である。他の実施形態では、主鎖原子は全てが炭素ではなく、当技術分野において既知のように化学結合の制限を受ける、シリコン、炭素、窒素、酸素、硫黄、又はリン原子の任意の可能な組み合わせを含み得る。

[00166] 部分含有試薬（式５）が、表面改質リガンドを有する表面（式３）と反応した場合、式２の調節表面を有する基板が形成される。すると、リンカーＬ’及びリンカーＬ’’は形式的にリンカーＬの一部となり、反応性ペアリング部分Ｒ_ｐｘと反応性部分Ｒ_ｘとの反応によって、式２の結合基ＣＧが得られる。

[00167] 表面改質試薬 表面改質試薬は、構造ＬＧ−（Ｌ’’）_ｊ−Ｒ_ｘを有する化合物である（式４）。連結基ＬＧは、基板の表面の酸化物に共有結合している。基板はＤＥＰ構成基板とすることができ、酸化シリコン又は酸化アルミナ又は酸化ハフニウムを含むことができ、酸化物は、基板の天然の化学構造の一部として提示されるか、又は以下で検討するように導入され得る。連結基ＬＧは、本明細書に記載されるいずれかの連結基とすればよく、例えば、シロキサン又はホスホン酸基と基板の表面上の酸化物との反応から形成されたシロキシ又はホスホン酸エステル基である。反応性部分Ｒ_ｘは上述の通りである。反応性部分Ｒ_ｘは、連結基ＬＧに直接（Ｌ’’、ｊ＝０）、又はリンカーＬ’’を介して間接的に（ｊ＝１）接続され得る。連結基ＬＧはリンカーＬ’’の第１の端部に付着され、反応性部分Ｒ_ｘは、リンカーＬ’’の第２の端部に接続され得るので、一度、式６のように表面改質試薬が表面に付着されたら、基板の表面に対して遠位となる。

[00168] リンカーＬ’’は直線部分を有し得る。この直線部分の主鎖は、シリコン、炭素、窒素、酸素、硫黄、及びリン原子の任意の組み合わせから選択された１〜１００の非水素原子を含む。これは、いくつかの非限定的な例において、エーテル、アミノ、カルボニル、アミド、又はホスホン酸基の任意の組み合わせによって分断され得る。これに加えて、リンカーＬ’’は、リンカーＬ’’の主鎖を分断する１つ以上のアリレン、ヘテロアリレン、又は複素環基を有し得る。いくつかの実施形態において、リンカーＬ’’の主鎖は１０〜２０の原子を含み得る。他の実施形態において、リンカーＬ’’の主鎖は、約５の原子から約１００の原子、約１０の原子から約８０の原子、約１０の原子から約５０の原子、又は約１０の原子から約４０の原子を含み得る。いくつかの実施形態において、主鎖原子は全て炭素原子である。他の実施形態では、主鎖原子は全てが炭素ではなく、当技術分野において既知のように化学結合の制限を受ける、シリコン、炭素、窒素、酸素、硫黄、又はリン原子の任意の可能な組み合わせを含み得る。

[00169] いくつかの実施形態において、コーティング材料（又は表面改質リガンド）は、化学気相堆積を用いてマイクロ流体デバイスの内面に堆積される。コーティング材料は、化学気相堆積によって、コーティング材料を含む分子がマイクロ流体デバイスの内面の分子に共有結合されている高密度充填単層を達成できる。所望の充填密度を達成するため、例えばアルキル終端シロキサンを含む分子を、少なくとも１１０℃の温度（例えば、少なくとも１２０℃、１３０℃、１４０℃、１５０℃、１６０℃等）で、少なくとも１５時間（例えば、少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５時間、又はそれ以上）、気相堆積することができる。そのような気相堆積は典型的に、真空下で、かつ水和硫酸塩（例えばＭｇＳＯ４・７Ｈ２０）のような水源の存在下で実行される。典型的に、気相堆積の温度及び持続時間を増大させると、特性の向上した疎水性コーティング材料が生成される。

[00170] 気相堆積プロセスは、任意選択的に、例えばカバー１１０、マイクロ流体回路材料１１６、及び／又は基板（例えば、ＤＥＰ構成基板の電極活性化基板２０６の内面２０８、又はＥＷ構成基板の支持構造１０４の誘電層）を事前に洗浄することによって改善され得る。例えば、そのような事前洗浄は、アセトン浴、エタノール浴、又はそれらの組み合わせのような溶媒浴を含み得る。溶媒浴は超音波処理を含み得る。この代わりに又はこれに加えて、そのような事前洗浄は、カバー１１０、マイクロ流体回路材料１１６、及び／又は基板を、酸素プラズマクリーナで処理することを含み得る。これによって、様々な不純物を除去すると同時に酸化表面を導入することができる（例えば、本明細書に記載されるように共有結合的に改質され得る表面の酸化物）。酸素プラズマクリーナは、例えば真空条件下で、１００Ｗで６０秒間、動作させることができる。あるいは、酸素プラズマクリーナの代わりに、表面を酸化させるため過酸化水素のような酸化剤を含む液相処理を用いることも可能である。例えば、酸素プラズマクリーナの代わりに、塩酸と過酸化水素の混合物、又は硫酸と過酸化水素の混合物（例えば、約３：１〜約７：１の範囲内の硫酸対過酸化水素の比を有し得るピラニア溶液）を用いることができる。

[00171] いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイス２００を組み立てて、マイクロ流体回路１２０を画定する筐体１０２を形成した後、気相堆積を用いてマイクロ流体デバイス２００の内面をコーティングする。完全に組み立てたマイクロ流体回路１２０に、高密度充填単層を含むコーティング材料を堆積することは、様々な機能特性を提供するため有益であり得る。理論に束縛されることは意図しないが、完全に組み立てたマイクロ流体回路１２０にそのようなコーティング材料を堆積することは、マイクロ流体回路材料１１６と電極活性化基板２０６／誘電層及び／又はカバー１１０との間の弱くなった結合によって生じる剥離を防止するため有用であり得る。

[00172] 図４Ａ〜図４Ｄは、コーティング材料の例示的なクラスを含むマイクロ流体デバイス５００の横断面図を示す。図示のように、コーティング材料５２９（概略的に示されている）は、マイクロ流体デバイス５００の基板５０４の内面５０８及びカバー５１０の内面５０９の双方に共有結合された高密度充填分子の単層を含むことができる。コーティング材料５２９は、マイクロ流体デバイス５００の筐体５０２に対して近位であり筐体５０２の内側に面した全ての内面５０８、５０９上に配置することができ、これらの内面は、いくつかの実施形態では、上述したように、マイクロ流体デバイス５００内に回路要素及び／又は構造を画定するため用いられるマイクロ流体回路材料（図示せず）の表面を含む。代替的な実施形態では、コーティング材料５２９を、マイクロ流体デバイス５００の内面のうち１つだけ又はいくつかに配置することができる。

[00173] 図５に示す実施形態において、コーティング材料５２９はアルキル終端シロキサン分子の単層を含み、各分子がシロキシ基を介してマイクロ流体デバイス５００の内面５０８、５０９に共有結合している。しかしながら、上述のコーティング材料５２９のいずれも使用可能である（例えば、アルキル終端ホスホン酸エステル分子）。より具体的には、アルキル基は、少なくとも１０の炭素原子（例えば１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、又はそれ以上の炭素原子）の直鎖を含むことができ、任意選択的に置換アルキル基であり得る。上述のように、高密度充填分子の単層を含むコーティング材料５２９は、最小限の電荷トラップ、物理的／電気的厚さの低減、及び実質的に均一な表面等、ＤＥＰ構成マイクロ流体デバイス５００で使用する際に有用な機能特性を有し得る。

[00174] いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイス５００の内面（複数の内面）５０８、５０９をコーティングするため用いられるコーティング材料５２９は、細胞接着を軽減する機能的な利点を与える。特定の実施形態において、コーティング材料５２９は、筐体に面した末端（すなわち、内面５０８、５０９に結合していない、筐体５０２に対して近位であるコーティング材料５２９の単層の部分）において、フルオロアルキル基（例えば、フッ素化アルキル基又は過フッ素化アルキル基）を含み得る。上述のように、コーティング材料５２９は、フルオロアルキル終端シロキサン又はフルオロアルキル終端ホスホン酸エステルの単層を含むことができ、フルオロアルキル基はコーティング材料５２９の筐体に面した末端に存在する。そのようなコーティング材料５２９は、汚染の低減、より一般的には、細胞の外膜上に存在するもののような生体分子の接着の低減において、機能的な利点を与える。

[00175] いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイス５００の内面５０８、５０９をコーティングするため用いられるコーティング材料５２９は、ブロッキング溶液中のブロッキング剤を結合できる１つ以上の部分の提示において機能的な利点を与える。実施形態に応じて、コーティング材料５２９は、筐体に面した末端において、カチオンを含む部分（「カチオン性部分」）（例えば第４級アンモニウム基）を含むか、又はこれを提示するように（例えば反応によって）化学的に修飾することができる。いくつかの実施形態において、コーティング材料５２９は、筐体に面した末端において、ホスホン酸、カルボン酸、又はスルホン酸部分のようなアニオンを含む部分（「アニオン性部分」）を含むか、又はこれを提示するように化学的に修飾することができる。いくつかの実施形態において、コーティング材料５２９は、筐体に面した末端において、カチオン及びアニオンの混合物を含むか、又はこれを提示するように化学的に修飾することができる。

[00176] 在庫目録の生成 再び図６を参照すると、開示される方法を実施するため必須ではないが、マイクロ流体デバイスを凍結する前に、（任意選択的な）ステップ５２０において、マイクロ流体デバイスの内容の在庫目録を生成し、将来の検索及び参照のため記憶する。例えば、更に図７も参照すると、在庫目録５２１は、１つ以上の隔離細胞の各々について基本的アイデンティティ５２２及び単離領域位置を含み得る。隔離細胞のアイデンティティは、細胞の起源、具体的には、細胞が取得されたサンプルの起源を含み得る。これは例えば、サンプル番号（例えば患者／被験者のサンプル番号）というわずかな情報、及び／又はサンプルから隔離された各細胞を表す任意のラベルであり得る。これに加えて又はこの代わりに、細胞の「アイデンティティ」は、被験者から細胞が収集された特定の解剖学的位置のアイデンティティ、及び、マイクロ流体デバイスに細胞を導入する前に、細胞が由来するサンプルがどのように処理されたかに関する情報を含み得る。そのようなサンプル処理は、組織生検もしくは細針吸引（ＦＮＡ：ｆｉｎｅ ｎｅｅｄｌｅ ａｓｐｉｒａｔｅ）のように組織サンプルから細胞を解離すること、又は、血液、尿、唾液、精液、口腔スワブ（ｂｕｃｃａｌ ｓｗａｂ）、滑液、房水、硝子体液、組織培養（例えば培養下で受精した胚）等の体液のサンプルから細胞を収集／濃縮することを含み得る。留意すべきこととして、細胞サンプルが取得された被験者はヒトである必要はない。例えば、細胞の識別は、被験者がヒト以外の哺乳類又は他の動物（例えば実験動物、飼い慣らされたペット、家畜、動物園の動物、野生動物等）であったことを示し得る。

[00177] 隔離された生体細胞の在庫目録（又は「ライブラリ」）５２１に含まれ得る追加の情報は、プロセス５２３及び５２４が存在する場合はこれらを含む。これらは、マイクロ流体デバイス内で隔離される前（５２３）又は後（５２４）に、１つ以上の隔離された生体細胞に対して実行される。追加の情報は更に、そのような隔離前又は隔離後の処理の過程において得られたデータ５２５も含む。次いで、隔離された細胞の在庫目録又はライブラリ５２１は、マイクロ流体デバイスに関連付けられたメモリに記憶される（ステップ５２６）。例えば、マイクロ流体デバイスは、バーコード、ステッカー、ＲＦＩＤ等の識別標識を含むことができ、デバイス在庫目録は、デバイスの識別標識を参照するデータベースに記憶することができる。この代わりに又はこれに加えて、デバイス在庫目録は、マイクロ流体デバイスに結合された、すなわちマイクロ流体デバイスと共に凍結されるメモリチップ（例えばＥＥＰＲＯＭ等）に記憶してもよい。

[00178] 様々な実施形態において、図６の任意選択的なステップ５３０に示すように、この方法は、（デバイスの凍結前に）マイクロ流体デバイス内にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の細胞保存試薬を導入することを含む。１つのそのような実施形態において、ＤＭＳＯは、マイクロ流体デバイスの凍結時に１つ以上の隔離された生体細胞が約１０％ＤＭＳＯを含有する溶液によって実質的に取り囲まれるように選択された濃度及び持続時間で、マイクロ流体デバイスに導入される。１つのそのような実施形態において、ＤＭＳＯは、（例えば、流れ領域の体積と単離領域の全体積との比に応じて）体積で約１５％から約２５％の濃度でマイクロ流体デバイスに導入され、隔離された生体細胞を含む１つ以上の単離領域に拡散される。１つのそのような実施形態において、ＤＭＳＯは、１つ以上の単離領域の各々において約１０％のＤＭＳＯ濃度を達成するのに充分な時間量、マイクロ流体デバイスをかん流させる。

[00179] 図８を参照すると、マイクロ流体デバイスの凍結（図６のステップ５５０）は、凍結温度付近（例えば約４℃）又は凍結温度（例えば約０℃）までのマイクロ流体デバイスの最初の制御冷却５４０、及び、その後の氷点下の温度までのマイクロ流体デバイスの追加の冷却５４４を含み得る。あるいは、最初の冷却は非制御の場合もある（５４２）。限定ではなく一例として、マイクロ流体デバイスの最初の制御冷却５４０は、毎分約１℃〜毎分約２℃の範囲内の速度であり得るが、もっと遅い速度（例えば、毎分０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、又は０．９℃）、又はもっと速い速度（例えば、毎分２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０℃、又はそれ以上）を用いてもよい。制御冷却の速度は、周囲の状況に応じて変動する可能性があり、例えば、毎分約０．１℃又は０．２℃という遅い速度から、毎分約３．０℃又は４．０℃という速い速度までの範囲である。様々な実施形態において、氷点下の温度は約−２０℃以下であり、より好適には約−８０℃以下であり、いくつかの実施形態では約−１５０℃以下を含む。

[00180] 図９を参照すると、この方法は更に、マイクロ流体デバイスを解凍することを含み得る（ステップ５７０）。これは、（ステップ５６０において）氷点下の貯蔵所からマイクロ流体デバイスを検索すること、次いでマイクロ流体デバイスの制御加熱５６２を行うこと、及び／又はマイクロ流体デバイスを室温まで自己加熱させること（ステップ５６４）を含み、解凍後に、隔離された細胞をテスト、評価、アッセイ、シークエンシング、及び／又は別のやり方で使用するため行われる。例えば、図６のステップ５９０によって概ね示すように、マイクロ流体デバイスを解凍した後、例えばマイクロ流体デバイスに流動性細胞成長媒体を連続的に又は間欠的にかん流させることで、マイクロ流体デバイス内で１つ以上の生存細胞を培養し、これによって追加の細胞を生成することが望ましい場合がある。そのような実施形態では、細胞の処理は（解凍後に）、マイクロ流体デバイスを解凍した後に、１つ以上の隔離された細胞及び／又はそこから生成した細胞のうちどれが生存しているか識別すること、及び／又は、マイクロ流体デバイスから、少なくとも１つの隔離された細胞及び／又はそこから生成した細胞を検索することも含み得る。一例として、解凍後、マイクロ流体デバイスにおいて１つ以上の細胞のアッセイを実行して、細胞分泌物（例えば、抗体もしくはサイトカインを含む免疫学的分子）又は細胞表面マーカを検出することができる。

実施例１ マイクロ流体デバイスにおける１Ｆ５ハイブリドーマ細胞（ＡＴＣＣ ＨＢ−９６４５）の凍結
[00181] 本出願の発明者らは、標準的な培養プレートで成長させた生体細胞を３６℃でマイクロ流体デバイスに導入した。次いで、細胞を操作し、マイクロ流体デバイス内の各単離領域に隔離した（引き続き３６℃）。マイクロ流体デバイス内に１５％ＤＭＳＯ溶液（媒体中）を流入させ、その後デバイスを３６℃で３０分間、追加のかん流なしでインキュベートした。次いで、マイクロ流体デバイスを１．８℃／分の制御速度で０℃まで冷却した。隔離された細胞は凍結プロセス中に移動し続けたが、温度が低下するにつれて減速したことが観察された。デバイスを発泡スチロールの箱に入れ、次いでこれを−８０℃冷凍庫内に一晩置いた。翌日、マイクロ流体デバイスを冷凍庫から（及び発泡スチロールの箱から）取り出し、高い室温（ｔｏｐ ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）まで温めた（比較的小さいデバイスサイズのため、デバイス温度は１分内に室温まで上昇したと仮定する）。次いで、デバイスを試験器械の上に置き、ペルチェ（Ｐｅｌｔｉｅｒ）を約２４℃に設定し、媒体のかん流を開始した。その後、デバイスの温度を約３℃／分で３６℃まで上昇させた。いくつかの細胞がデバイスの解凍中に移動し始めたこと、いくつかの生存（生きている）細胞が１日中移動し続けたこと、更に、１日の終わりにはごく一部が生存し、生体細胞の標準的な凍結解凍手順と一致していたことが観察された。マイクロ流体デバイスを凍結し、次いで解凍させた後、マイクロ流体デバイス（及びその中で隔離した細胞）に対してＯＥＴプロセスは引き続き機能した。

実姉例２ マイクロ流体デバイスにおける前立腺がん細胞の凍結
[00182] 組織生検を単一細胞に解離し、マイクロ流体デバイスに導入した。細胞懸濁液１２ｍＬを、１×１０^６細胞／ｍＬの濃度でデバイス内に取り込んだ。デバイスは約１．０ｍＬの全チャネル体積を有し、どの時点においても目に見える名目上の細胞量は約１０００の細胞であった。自動ペニングアルゴリズム（ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｐｅｎｎｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を用いて、細胞を個々に単離チャンバに配置した。細胞の挿入及び単離プロセスの間、デバイス温度は１２℃に設定した。次いでマイクロ流体デバイスを、凍結に充分な時間にわたって冷凍庫に入れた。次いで、デバイスを冷凍庫から取り出すことで解凍させ、器械の上に置いた（Ｔ＝１２℃で）。単離チャンバ内の生存細胞はＯＥＴを用いて可動性であり、隔離のような別の分析のため外に出せることが観察された。

[00183] 実施形態について図示し記載したが、本明細書に開示される本発明の概念の範囲から逸脱することなく様々な変更を行い得る。従って、本発明（複数の本発明）は、以下の特許請求の範囲に規定される場合を除いて限定されないものとする。

Claims (28)

1. 生体細胞を処理及び貯蔵する方法であって、
   マイクロ流体デバイス内に流動性媒体を導入することであって、前記マイクロ流体デバイスは、電極活性化基板を内面上に備えるベースと、その上に配置されたマイクロ流体回路構造と、カバーとを有し、前記マイクロ流体回路構造は、流れ領域と、１つ以上の単離チャンバとを有し、各単離チャンバは、単離領域と、前記流れ領域内への近位開口及び１つ以上の前記単離領域内への遠位開口を含む接続領域とを有し、前記単離領域は、前記接続領域への単一の開口を有し、前記単離領域は、一掃されない領域であり、
   前記マイクロ流体デバイスの前記１つ以上の単離領域に前記流動性媒体からの１つ以上の生体細胞を隔離することと、
   内部で隔離された前記１つ以上の生体細胞を含む前記マイクロ流体デバイスを一定期間凍結することと、
   前記マイクロ流体デバイスを解凍することと、
   前記マイクロ流体デバイスから、少なくとも１つの隔離された細胞及び／又はそこから生成した細胞を検索することと、
   を備える、方法。
2. 単一の生体細胞が複数の単離領域の各々において隔離されている、請求項１に記載の方法。
3. 各単離領域は１．５×１０^５立方ミクロン〜１．５×１０^６立方ミクロンの範囲内の体積を有する、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記マイクロ流体デバイスを凍結する前に、前記１つ以上の隔離された生体細胞の各々について少なくともアイデンティティ及び単離領域位置を含む在庫目録を生成することと、前記マイクロ流体デバイスに関連付けられたメモリに前記在庫目録を記憶することと、
   を更に含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記在庫目録は、（ｉ）前記流動性媒体中の前記生体細胞がどのように取得されたか、（ｉｉ）前記マイクロ流体デバイス内に導入される前又は後に前記生体細胞に実行された処理が存在する場合はこの処理、（ｉｉｉ）前記マイクロ流体デバイス内で隔離された後に前記１つ以上の隔離された生体細胞に実行された処理が存在する場合はこの処理、及び（ｉｖ）そのような隔離前又は隔離後の処理の過程において得られたデータ、のうち１つ以上を識別する情報を更に含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記マイクロ流体デバイスを凍結することは、０℃の温度までの前記マイクロ流体デバイスの最初の制御冷却、及び、その後の氷点下の温度までの前記マイクロ流体デバイスの冷却を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記最初の制御冷却は、毎分０．１℃〜毎分２℃の範囲内の速度で前記マイクロ流体デバイスを冷却することを含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記氷点下の温度は、−２０℃以下、−８０℃以下、及び−１５０℃以下のうちの１つである、請求項６又は７に記載の方法。
9. 前記マイクロ流体デバイスを凍結する前に、前記マイクロ流体デバイス内に細胞保存試薬を導入することを更に含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記細胞保存試薬はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記ＤＭＳＯは、前記マイクロ流体デバイスの凍結時に前記１つ以上の隔離された生体細胞が１０％ＤＭＳＯを含有する溶液によって実質的に取り囲まれるように選択された濃度及び持続時間で、前記マイクロ流体デバイスに導入されるか、又は、前記ＤＭＳＯは、体積で１５％から２５％の濃度で前記マイクロ流体デバイスに導入され、隔離された生体細胞を含む前記１つ以上の単離領域に拡散されるか、又は
    前記ＤＭＳＯは、前記１つ以上の単離領域の各々において１０％のＤＭＳＯ濃度を達成するのに充分な時間量、前記マイクロ流体デバイスをかん流させる、請求項１０に記載の方法。
12. 前記マイクロ流体デバイスを解凍した後、前記マイクロ流体デバイス内で１つ以上の生存細胞を培養し、これによって追加の細胞を生成することを更に含む、請求項１に記載の方法。
13. 前記マイクロ流体デバイスを解凍した後、前記１つ以上の隔離された細胞及び／又はそこから生成した細胞のうちどれが生存しているか識別することを更に含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記マイクロ流体デバイスを解凍することは、（ｉ）前記マイクロ流体デバイスの制御加熱、及び（ｉｉ）前記マイクロ流体デバイスを室温まで自己加熱させること、の一方又は双方を含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
15. 前記１つ以上の隔離された生体細胞は、第１の単離領域において隔離された少なくとも１つ以上の開始細胞を含み、前記方法は、前記マイクロ流体デバイスを凍結する前に、前記１つ以上の開始細胞を培養して前記第１の単離領域において複数の新しい細胞を生成することであって、前記複数の新しい細胞は、前記マイクロ流体デバイスを解凍した後に前記第１の単離領域に少なくとも１つの生存細胞が位置するように適切な数である、ことを更に含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記１つ以上の隔離された生体細胞のアッセイを実行することを更に含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記アッセイを用いて、細胞分泌物又は細胞表面マーカ、及び免疫学的分子を含む細胞分泌物のうちの１つを検出する、請求項１６に記載の方法。
18. 前記流れ領域及び１つ以上の単離領域はブロッキング溶液で処理されて細胞接着を防止又は軽減する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記マイクロ流体デバイスは、コーティング材料を含む内側基板表面を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記コーティング材料は、連結基及びアルキル部分を有する分子を含み、前記連結基は前記内側基板表面に共有結合している、請求項１９に記載の方法。
21. 前記連結基はシロキシ連結基であり、且つ／又は、前記アルキル部分は少なくとも１０の炭素原子を含む炭素の直鎖を含み、且つ／又は、前記コーティング材料の前記分子は、前記内側基板表面に共有結合している高密度充填単層構造を形成する、請求項２０に記載の方法。
22. 前記コーティング材料は、連結基及びカチオン性部分及び／又はアニオン性部分を有する分子を含み、前記連結基は前記内側基板表面に共有結合している、請求項１９に記載の方法。
23. 前記コーティング材料は、アルキレンエーテル部分、サッカライド部分、又はアミノ酸部分を含むポリマーを含む、請求項１９に記載の方法。
24. 前記コーティング材料はポリエチレングリコールを含む、請求項２３に記載の方法。
25. 前記流れ領域は、マイクロ流体チャネルを含み、前記接続領域は、前記マイクロ流体チャネル内への、２０ミクロンから１００ミクロンの範囲の幅Ｗｃｏｎを有する近位開口、及び前記単離領域内への遠位開口を含み、前記接続領域の前記近位開口から前記遠位開口までの長さＬｃｏｎは、前記接続領域の前記近位開口の幅Ｗｃｏｎの少なくとも１．０倍である、請求項１に記載の方法。
26. 前記接続領域の前記近位開口から前記遠位開口までの前記Ｌｃｏｎは、前記接続領域の前記近位開口の前記幅Ｗｃｏｎの少なくとも２．０倍である、請求項２５に記載の方法。
27. 前記接続領域の前記近位開口における前記マイクロ流体チャネルの高さは、２０ミクロンから１００ミクロンの間である、請求項２５又は２６に記載の方法。
28. 前記カバー及び前記ベースは、微小物体に対する誘電泳動（ＤＥＰ）力を選択的に誘発するためのＤＥＰ機構の一部であり、前記ＤＥＰ力は、前記１つ以上の単離領域内に前記１つ以上の生体細胞を選択的に隔離するように用いられ、且つ／又は前記１つ以上の単離領域から前記１つ以上の生体細胞を選択的に外に出すように用いられる、請求項１に記載の方法。
    

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