CN112014193A - 一种新的fj染色方法和装置 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物染色技术领域，提供了一种新的FJ染色方法和装置。其中所需实验染色溶液配制包括0.1％Acetic acid配制、0.06％高锰酸钾配制、FJ储存液、80％乙醇配制的1％NaOH、70％乙醇、0.0001％FJ‑C配制和PBS溶液配置，其中，PBS溶液配置包括精确称量8g NaCl、3.63g Na2HPO4·12H2O、0.2g KCl以及0.24g KH2PO4，将其溶于900ml d2H2O中并定容至1000ml得到所述PBS溶液。本发明能够有效的改善脑片在常规染色过程中容易发生的褶皱问题。
Description
【技术领域】
本发明涉及生物染色技术领域，特别是涉及一种新的FJ染色方法和装置。
【背景技术】
Fluoro-Jade C(FJ)是一种染料，对退化的神经元细胞有很高的亲和力和对比度，因此可特异性染色所有退化神经元。同时，它既适合于定位已经退化的神经元细胞而且不易褪色，适合几乎所有的染色方法和组织学处理。动物缺血后，缺血处的神经元发生变形，可以被FJ染色。
然而现有的常规染色方法，容易产生如图1所示被染色对象的翻折、堆叠现象(也被描述为脱片的现象)，这是因为在染色液浸泡过程中，因为外界因素造成的需要移动染色盘、染料与被染色目标对象的化学物理作用等等原因造成了被染色目标对象发生类似图1所示的结果，尤其以图1中左下角虚线框所标注的两个样本个体发生的翻折问题最为严重，这种情况会严重影响后续合格染色样本的生成，以及正常的实验过程进行。
一种现有技术中的染色过程包括：
1、配置实验所需溶液。
2、贴片：冰冻切片25um或30um贴片于载玻片(已过明胶)上。
3、晾片：室温晾片过夜，充分干燥，防止后续操作脱片。
4、漂洗：充分干燥后，70％乙醇浸洗2分钟，再次晾干过夜。
5、漂洗：蒸馏水浸洗2分钟，再次晾干过夜。
6、孵育：0.06高锰酸钾中反应10分钟。
7、漂洗：蒸馏水浸洗2分钟，风干。
8、染色：FJ工作液浸染20分钟，避光。
9、漂洗：蒸馏水浸洗3次1分钟。
10、晾片：50℃，干燥10分钟。
11、透明：二甲苯透明2次10分钟。
12、封片：DPX封片剂进行封片。
相应操作之后可能存在问题的效果图如图1和图2所示。
鉴于此，克服该现有技术所存在的缺陷是本技术领域亟待解决的问题。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题在染色过程中，脑片容易形成如图2所示的褶皱现象，影响后续的实验观察过程。进一步的，容易在设置载玻片过程中产生如图1所示被染色对象的翻折、堆叠现象，也被描述为脱片的现象。
第一方面，本发明提供了一种新的FJ染色方法，所需实验染色溶液配制包括0.1％Acetic acid配制、0.06％高锰酸钾配制、FJ储存液、80％乙醇配制的1％NaOH、70％乙醇、0.0001％FJ-C配制和PBS溶液配置，其中，PBS溶液配置包括精确称量8g NaCl、3.63gNa2HPO4·12H2O、0.2g KCl以及0.24g KH2PO4，将其溶于900mld2H2O中并定容至1000ml得到所述PBS溶液，染色方法过程包括：
先滴加5ml的80％乙醇配制的1％NaOH于多孔板中，再将缺血脑片放置于80％乙醇配制的1％NaOH中孵育3-6分钟；其中，每一孔用于容纳一待染色的脑片；
吸出80％乙醇配制的1％NaOH后，加入70％乙醇孵育1-3分钟；
再次吸出70％乙醇后，加入PBS后，再用双蒸水飘洗1-3分钟；
吸出双蒸水后，加入6ml 0.06％高锰酸钾溶液与脑片共孵育10分钟；
吸出高锰酸钾溶液后再次用加入PBS，待脑片完全展开后，再用双蒸水飘洗1-2次，每次1-2分钟；
将已展开的脑片贴于载玻片上；
室温瞭片过夜，充分干燥；
充分干燥后，双蒸水飘洗2分钟；
将贴片置于0.0001％FJ-C工作液避光浸染10分钟；
再次双蒸水飘洗1分钟，将贴片置于50℃烤箱中避光烘干；
二甲苯透明，进行封片。
优选的，所述0.1％Acetic acid配制包括0.2ml冰乙酸溶于199.8ml d2H2O。
优选的，所述0.06％高锰酸钾配制包括0.3g高锰酸钾溶于500ml d2H2O。
优选的，所述FJ储存液包括2mg FJ溶于10ml d2H2O，并且，4°避光储存。
优选的，所述80％乙醇配制的1％NaOH包括先将1g NaOH溶于19ml d2H2O后，再加入80ml的无水乙醇。
优选的，所述0.0001％FJ-C配制包括1ml FJ储存液溶于99ml的0.1％冰乙酸中。
优选的，方法还包括：
通过设置在多孔板或者载玻片上方的摄像头，采集载玻片上染色脑片的铺展状态；
若采集到一个或者多个位置区域上的脑片发生翻折或者堆叠现象，则调配相应平整喷嘴到相应一个或者多个位置区域上方指定高度，并通过平整喷嘴的预设喷气作用，使得所述发生翻折或者堆叠现象的脑片展平。
优选的，所述平整喷嘴包括垂直稳态用出气口，一个或者多个与竖直线成指定角度的侧向出气口；
其中，各个侧向出气口对应设置有出气控制电磁阀，相应电磁阀用于控制对应的侧向出气口是否出气；
控制侧向出气口对应的电磁阀导通出气，是根据摄像头所采集到的脑片的翻折或者堆叠角度来确定的，具体的，将所述垂直稳态用出气口被调整到脑切片与载玻片贴合，并且没有被翻折或者堆叠部分覆盖的区域，通过所述摄像头采集图片确定相应翻折或者堆叠区域所对应的一个或者多个侧向出气口，并控制相应电磁阀导通出气。
第二方面，本发明还提供了一种新的FJ染色的装置，所述装置用于配合实现第一方面所述的方法，其中装置包括：气泵机、摄像头、平整喷嘴、主控制器、一个或者多个电磁阀和三维伺服调控组件，具体的：
所述三维伺服调控组件被设置在实验台上，相应的伺服调控端设置有所述平整喷嘴；相应的伺服调控组件的调控电机与所述主控制器相连，以便受所述主控制器的驱使，完成X轴、Y轴和Z轴上维度上的平整喷嘴的位置调整；
所述平整喷嘴连接所述气泵机，相应的所述一个或者多个电磁阀设置在两者的连接管道中，用于控制气泵机与平整喷嘴口的导通和阻隔；其中，所述电磁阀的控制端还与所述主控制器相连，并在接收到所述主控制器的控制信号时，完成所述的导通和阻隔；
所述摄像头与所述主控制器相连，用于将采集到的图像信息传递给所述主控制器，以便所述主控制根据采集到图片分析各个脑片的位置和相应脑片的翻折/堆叠状况，从而通过控制所述三维伺服调控组件，调整平整喷嘴位置抵达目标位置状态，并进一步控制电磁阀导通气泵机与平整喷嘴口之间的通道，完成相应发生翻折/堆叠脑片的还原成平整装态。
优选的，所述平整喷嘴围绕其中心轴，每隔45°设置有一个侧面出气口，一共形成8个侧面出气口。本发明进一步要解决的技术问题是提供一种新的FJ染色方法和装置。
本发明提出了一种溶液配剂PBS(申请人自己起的一个名称)，能够有效的改善脑片在常规染色过程中容易发生的褶皱问题。使用本发明实施例的配剂，以及相应方法过程后能够取得例如图4所示的封片效果。
【附图说明】
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的现有染色方法的脑片状态效果图；
图2是本发明实施例提供的现有染色方法的脑片状态效果图；
图3是本发明实施例提供的一种新的FJ染色方法流程示意图；
图4是本发明实施例提供的染色方法下的脑片状态效果图；
图5是本发明实施例提供的一种新的FJ染色装置结构示意图；
图6是本发明实施例提供的一种新的FJ染色装置中三维伺服调控组件的结构示意图；
图7是本发明实施例提供的一种新的FJ染色装置中平整喷嘴的结构俯视图；
图8是本发明实施例提供的一种新的FJ染色装置中平整喷嘴的剖视图；
图9是本发明实施例提供的一种新的FJ染色方法控制装置工作状态示意图；
图10是本发明实施例提供的利用新的FJ染色装置处理过的脑片状态效果图。
【具体实施方式】
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在本发明的描述中，术语“内”、“外”、“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“顶”、“底”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明而不是要求本发明必须以特定的方位构造和操作，因此不应当理解为对本发明的限制。
此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1:
本发明实施例1提供了一种新的FJ染色方法，所需实验染色溶液配制包括0.1％Acetic acid配制、0.06％高锰酸钾配制、FJ储存液、80％乙醇配制的1％NaOH、70％乙醇、0.0001％FJ-C配制和PBS溶液配置，其中，PBS溶液配置包括精确称量8g NaCl、3.63gNa2HPO4·12H2O、0.2g KCl以及0.24g KH2PO4，将其溶于900mld2H2O中并定容至1000ml得到所述PBS溶液，染色方法过程，如图3所示，包括：
在步骤201中，先滴加5ml的80％乙醇配制的1％NaOH于多孔板中，再将缺血脑片(典型的一种实验用脑片厚度为24um)放置于80％乙醇配制的1％NaOH中孵育3-6分钟；其中，每一孔用于容纳一待染色的脑片。
在步骤202中，吸出80％乙醇配制的1％NaOH后，加入70％乙醇孵育1-3分钟。此时可见脑片皱缩。
在步骤203中，再次吸出70％乙醇后，加入PBS后，再用双蒸水飘洗1-3分钟；此时可见皱缩的脑片展开。此处，展现了本发明所提出的PBS溶液的功用和有效性。
在步骤204中，吸出双蒸水后，加入6ml 0.06％高锰酸钾溶液与脑片共孵育10分钟。
在步骤205中，吸出高锰酸钾溶液后再次用加入PBS，待脑片完全展开后，再用双蒸水飘洗1-2次，每次1-2分钟。
在步骤206中，将已展开的脑片贴于载玻片上(已过明胶)。
在步骤207中，室温瞭片过夜，充分干燥。
在步骤208中，充分干燥后，双蒸水飘洗2分钟。
在步骤209中，将贴片置于0.0001％FJ-C工作液避光浸染10分钟。
在步骤210中，再次双蒸水飘洗1分钟(优选的共进行3次)，将贴片置于50℃烤箱中避光烘干；相应的效果图4所示。
在步骤211中，二甲苯透明，进行封片。在封片过程汇总
本发明实施例提出了一种溶液配剂PBS(申请人自己起的一个名称)，能够有效的改善脑片在常规染色过程中容易发生的褶皱问题。使用本发明实施例的配剂，以及相应方法过程后能够取得例如图4所示的封片效果。
结合本发明实施例存在一种优选的实现方案，其中，所述0.1％Acetic acid配制包括0.2ml冰乙酸溶于199.8ml d2H2O。
结合本发明实施例存在一种优选的实现方案，其中，所述0.06％高锰酸钾配制包括0.3g高锰酸钾溶于500ml d2H2O。
结合本发明实施例存在一种优选的实现方案，其中，所述FJ储存液包括2mg FJ溶于10ml d2H2O，并且，4°避光储存。
结合本发明实施例存在一种优选的实现方案，其中，所述80％乙醇配制的1％NaOH包括先将1g NaOH溶于19ml d2H2O后，再加入80ml的无水乙醇。
结合本发明实施例存在一种优选的实现方案，其中，所述0.0001％FJ-C配制包括1ml FJ储存液溶于99ml的0.1％冰乙酸中。
实施例2:
本发明实施例提出了一种可应用于实施例1所述染色方法的装置，如图5、图6和图7所示，装置包括气泵机1、摄像头2、平整喷嘴3、主控制器4、一个或者多个电磁阀5和三维伺服调控组件6，具体的：
所述三维伺服调控组件6被设置在实验台上，相应的伺服调控端设置有所述平整喷嘴3；相应的伺服调控组件6的调控电机与所述主控制器4相连，以便受所述主控制器4的驱使，完成X轴、Y轴和Z轴上维度上的平整喷嘴3的位置调整；在本发明实施例中，三维伺服调控组件6并非实质性改进点，相应的装置结构可以采用现有的成熟技术产品来实现，而为了进一步便于理解方案，发明人仍然给予了图6的功能结构图展示；其中，三维伺服调控组件6通常包括底座61、第一支撑杆62、Z轴可调杆63、X轴可调杆64和Y轴可调杆65，以及包括加持头66，其中，Z轴可调杆63设置在第一支撑杆62上，并且可以沿竖直设置的第一支撑杆62上下位移；所述X轴可调杆64设置在Z轴可调杆63上，并且可以相对如图6所示的水平方向左右移动(即X轴方向)，在图6中也用虚线进行可移动方向的标注；所述Y轴可调杆65设置在所述X轴可调杆64上，且能够沿Y轴前后移动，图6中给与了相应图标“⊙”标识，表明其可沿垂直文档面方向前后移动。
所述平整喷嘴3连接所述气泵机1，相应的所述一个或者多个电磁阀5设置在两者的连接管道中(如图8所示，针对每一个平整喷嘴3中的导气孔，包括位于图8中心的垂直稳态用出气口，以及位于垂直稳态用出气口四周的侧向出气口，如图7所示，给予了相应平整喷嘴3中对应导气孔的俯视图结构)，用于控制气泵机1与平整喷嘴3口的导通和阻隔；其中，所述电磁阀5的控制端还与所述主控制器4相连，并在接收到所述主控制器4的控制信号时，完成所述的导通和阻隔；
所述摄像头2与所述主控制器4相连，用于将采集到的图像信息传递给所述主控制器4，以便所述主控制根据采集到图片分析各个脑片的位置和相应脑片的翻折/堆叠状况，从而通过控制所述三维伺服调控组件6，调整平整喷嘴3位置抵达目标位置状态，并进一步控制电磁阀5导通气泵机1与平整喷嘴3口之间的通道，完成相应发生翻折/堆叠脑片的还原成平整装态。
结合本发明实施例，存在一种可选的实现方案，如图8所示的结构，所述平整喷嘴3围绕其中心轴，每隔45°设置有一个侧面出气口，一共形成8个侧面出气口。
通过本发明实施例1所提供的方法，不难发现其实验结果，如图4所示，仍然存在脑片中部分区域发生的翻折现象，这对于高品质样品要求的场景中，也是不被允许的；而这种现象，在现有技术中多依赖实验人员手动去剥离开，这不仅仅带来了实验效率的降低，而且容易带来实验样品的损坏。本发明实施例所提出的装置就是为了能够进一步改善相应存在问题而提出的。
接下来，将通过实施例3具体阐述本发明所提出的装置如何应用于实施例1中，并具体阐述其使用原理和使用过程。
实施例3：
在本发明实施例中，，通过设置在多孔板或者载玻片上方的摄像头2，采集载玻片上染色脑片的铺展状态；
若采集到一个或者多个位置区域上的脑片发生翻折或者堆叠现象，则通过控制三维伺服调控组件6，调配相应平整喷嘴3到相应一个或者多个位置区域上方指定高度，并通过平整喷嘴3的预设喷气作用，使得所述发生翻折或者堆叠现象的脑片展平。
如图8所示，所述平整喷嘴3包括垂直稳态用出气口(图中位于中间区域的，相比较两侧直径更为粗的导气管道的导气孔)，一个或者多个与竖直线成指定角度的侧向出气口(图中位于中间导气管两侧的相对较细导气管道的导气孔)；
其中，各个侧向出气口对应设置有出气控制电磁阀5，相应电磁阀5用于控制对应的侧向出气口是否出气；
控制侧向出气口对应的电磁阀5导通出气，是根据摄像头2所采集到的脑片的翻折或者堆叠角度来确定的，具体的，将所述垂直稳态用出气口被调整到脑切片与载玻片贴合，并且没有被翻折或者堆叠部分覆盖的区域，通过所述摄像头2采集图片确定相应翻折或者堆叠区域所对应的一个或者多个侧向出气口，并控制相应电磁阀5导通出气。
之所以这么设计，是考虑到尽可能降低三维伺服调控组件6的控制复杂度情况下，相对的平整喷嘴被设计成无需旋转的，即其方位可相对脑片进行X轴、Y轴和Z轴上的平移，但是不会进行两者之间出气口角度的旋转，这是为了尽可能降低三维伺服调控组件的成本情况下，仍然能够保证现有技术问题的解决，才有了上述的本发明实施例3的技术方案。
以图9为例，若当前所要使用装置处理的是位于图4中的左下角的脑片，则主控制器根据摄像头所采集到的图片，确定其脑片的翻折角度和翻折程度如图9中左半图所示，则主控制器通过驱动三维伺服调控组件6，使得平整喷嘴的垂直稳态用出气口对准图9中相应中心圆锁映射区域，而控制平整喷嘴对应图9中标注黑色实体的侧向出气口所在电磁阀导通，而其他电磁阀处于关闭状态，并通过实时的摄像头采集观察目标脑片的翻折状态是否被校正回来。
如图10所示，为采用了本发明实施例2所述的装置，并采用如实施例3所述的方法之后，相比较图2所示的现有技术存在的翻折问题，得到了有效的改善。
值得说明的是，上述装置和系统内的模块、单元之间的信息交互、执行过程等内容，由于与本发明的处理方法实施例基于同一构思，具体内容可参见本发明方法实施例中的叙述，此处不再赘述。
本领域普通技术人员可以理解实施例的各种方法中的全部或部分步骤是可以通过程序来指令相关的硬件来完成，该程序可以存储于一计算机可读存储介质中，存储介质可以包括：只读存储器(ROM，Read Only Memory)、随机存取存储器(RAM，Random AccessMemory)、磁盘或光盘等。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种新的FJ染色方法，其特征在于，所需实验染色溶液配制包括0.1％Acetic acid配制、0.06％高锰酸钾配制、FJ储存液、80％乙醇配制的1％NaOH、70％乙醇、0.0001％FJ-C配制和PBS溶液配置，其中，PBS溶液配置包括精确称量8g NaCl、3.63g Na2HPO4·12H2O、0.2g KCl以及0.24g KH2PO4，将其溶于900mld2H2O中并定容至1000ml得到所述PBS溶液，染色方法过程包括：
先滴加5ml的80％乙醇配制的1％NaOH于多孔板中，再将缺血脑片放置于80％乙醇配制的1％NaOH中孵育3-6分钟；其中，每一孔用于容纳一待染色的脑片；
吸出80％乙醇配制的1％NaOH后，加入70％乙醇孵育1-3分钟；
再次吸出70％乙醇后，加入PBS后，再用双蒸水飘洗1-3分钟；
吸出双蒸水后，加入6ml 0.06％高锰酸钾溶液与脑片共孵育10分钟；
吸出高锰酸钾溶液后再次用加入PBS，待脑片完全展开后，再用双蒸水飘洗1-2次，每次1-2分钟；
将已展开的脑片贴于载玻片上；
室温瞭片过夜，充分干燥；
充分干燥后，双蒸水飘洗2分钟；
将贴片置于0.0001％FJ-C工作液避光浸染10分钟；
再次双蒸水飘洗1分钟，将贴片置于50℃烤箱中避光烘干；
二甲苯透明，进行封片。
2.根据权利要求1所述的新的FJ染色方法，其特征在于，所述0.1％Acetic acid配制包括0.2ml冰乙酸溶于199.8ml d2H2O。
3.根据权利要求1所述的新的FJ染色方法，其特征在于，所述0.06％高锰酸钾配制包括0.3g高锰酸钾溶于500ml d2H2O。
4.根据权利要求1所述的新的FJ染色方法，其特征在于，所述FJ储存液包括2mg FJ溶于10ml d2H2O，并且，4°避光储存。
5.根据权利要求1所述的新的FJ染色方法，其特征在于，所述80％乙醇配制的1％NaOH包括先将1g NaOH溶于19ml d2H2O后，再加入80ml的无水乙醇。
6.根据权利要求1所述的新的FJ染色方法，其特征在于，所述0.0001％FJ-C配制包括1ml FJ储存液溶于99ml的0.1％冰乙酸中。
7.根据权利要求1-6任一所述的新的FJ染色方法，其特征在于，还包括：
通过设置在多孔板或者载玻片上方的摄像头，采集载玻片上染色脑片的铺展状态；
若采集到一个或者多个位置区域上的脑片发生翻折或者堆叠现象，则调配相应平整喷嘴到相应一个或者多个位置区域上方指定高度，并通过平整喷嘴的预设喷气作用，使得所述发生翻折或者堆叠现象的脑片展平。
8.根据权利要求7所述的新的FJ染色方法，其特征在于，所述平整喷嘴包括垂直稳态用出气口，一个或者多个与竖直线成指定角度的侧向出气口；
其中，各个侧向出气口对应设置有出气控制电磁阀，相应电磁阀用于控制对应的侧向出气口是否出气；
控制侧向出气口对应的电磁阀导通出气，是根据摄像头所采集到的脑片的翻折或者堆叠角度来确定的，具体的，将所述垂直稳态用出气口被调整到脑切片与载玻片贴合，并且没有被翻折或者堆叠部分覆盖的区域，通过所述摄像头采集图片确定相应翻折或者堆叠区域所对应的一个或者多个侧向出气口，并控制相应电磁阀导通出气。
9.一种新的FJ染色的装置，其特征在于，所述装置用于配合实现如权利要求7或8所述的方法，其中装置包括：气泵机、摄像头、平整喷嘴、主控制器、一个或者多个电磁阀和三维伺服调控组件，具体的：
所述三维伺服调控组件被设置在实验台上，相应的伺服调控端设置有所述平整喷嘴；相应的伺服调控组件的调控电机与所述主控制器相连，以便受所述主控制器的驱使，完成X轴、Y轴和Z轴上维度上的平整喷嘴的位置调整；
所述平整喷嘴连接所述气泵机，相应的所述一个或者多个电磁阀设置在两者的连接管道中，用于控制气泵机与平整喷嘴口的导通和阻隔；其中，所述电磁阀的控制端还与所述主控制器相连，并在接收到所述主控制器的控制信号时，完成所述的导通和阻隔；
所述摄像头与所述主控制器相连，用于将采集到的图像信息传递给所述主控制器，以便所述主控制根据采集到图片分析各个脑片的位置和相应脑片的翻折/堆叠状况，从而通过控制所述三维伺服调控组件，调整平整喷嘴位置抵达目标位置状态，并进一步控制电磁阀导通气泵机与平整喷嘴口之间的通道，完成相应发生翻折/堆叠脑片的还原成平整装态。
10.根据权利要求9所述的新的FJ染色的装置，其特征在于，所述平整喷嘴围绕其中心轴，每隔45°设置有一个侧面出气口，一共形成8个侧面出气口。
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