DE60205406T2

DE60205406T2 - Optisches zweiwellenlängen-fluoreszenzanalysegerät

Info

Publication number: DE60205406T2
Application number: DE60205406T
Authority: DE
Inventors: Julian White
Original assignee: Genapta Ltd
Current assignee: Genapta Ltd
Priority date: 2001-11-28
Filing date: 2002-11-22
Publication date: 2005-12-29
Anticipated expiration: 2022-11-23
Also published as: DE60205406D1; ES2244815T3; US7221450B2; US20050001175A1; WO2003048744A2; EP1456626A2; ATE301288T1; AU2002343069A8; WO2003048744A3; AU2002343069A1; EP1456626B1; US20070024852A1; EP1316794A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Aufbau optischer Elemente zur Verwendung in einer Vorrichtung, die die relative Konzentration fluoreszierender Moleküle auf der Oberfläche eines Teils bzw. Werkstückes analysiert.
In den vergangenen Jahren hat sich die Strukturuntersuchung biologischer Moleküle und insbesondere von Desoxyribonukleinsäuren (DNA) und Ribonukleinsäuren (RNA) zu einer grundlegenden Aktivität in der Biologie entwickelt. Es sind insbesondere große Anstrengungen unternommen worden, die molekulare Struktur des menschlichen Genoms zu verstehen, das aus drei Milliarden molekularen Einheiten zusammengesetzt ist. Man glaubt, daß ein Verständnis dieser Struktur eine wirksamere Behandlung sowohl vererbter als auch infektiöser Krankheiten bei Menschen ermöglichen wird.
Sobald die Grundstruktur des Genoms bekannt ist, wird es dann notwendig, die Reaktion verschiedener Elemente des Genoms auf äußere Einflüsse zu testen. Dieses Gebiet, das als funktionelle Genomik bekannt ist, wird dann die Funktion und das Verhalten des Genoms auf äußere Einflüsse entschlüsseln.
Auch wenn die funktionelle Genomik lediglich mit winzigen Untereinheiten des gesamten Genoms arbeitet, sind die Forscher selbstverständlich mit erheblichen Anzahlen an Basiseinheiten und deren Kombinationen konfrontiert (die wir im allgemeinen mit A, C, T und G bezeichnet haben).
Um mit der großen Anzahl möglicher Kombinationen unterschiedlicher Experimente umzugehen, die ausgeführt werden können, ist das Konzept des Mikroarrays entwickelt worden. Der Mikroarray besteht aus einer Anordnung kleiner DNA-Spots, die auf einem Substrat gehalten werden. Solche Spots haben einen Durchmesser in der Größenordnung von 1 bis 100 μm. Wenn Zielmoleküle mit verschieden fluoreszierenden, angehängten Molekülen über die Spots gespült werden, werden sie dann abhängig von der Zusammensetzung der Ziellösung an einigen der Spots anbinden und an anderen nicht. Nach diesem Vorgang wird der Array an den Spots getrocknet und in eine Maschine geladen, die Lesegerät genannt wird. Innerhalb des Lesegeräts wird Licht auf die Spots geleuchtet, die wegen des Vorliegens der angehängten Moleküle fluoreszieren. Da die Verteilung der Fluoreszenz über der Oberfläche des Substrats abhängig von der Ausgangsverteilung der Basiseinheiten über dem Objektträger variiert, kann ausgehend vom Fluoreszenzbild die Zusammensetzung der Basiseinheiten in der Ziellösung ausgearbeitet werden.
Dieses Verfahren hat zahlreiche Vorteile gegenüber herkömmlichen Verfahren, wobei der primäre Vorteil darin liegt, eine große Anzahl unabhängiger Experimente gleichzeitig durchführen zu können, dadurch, daß jeder Spot als ein einzelnes Experiment angesehen werden kann. Mit den aktuellen Mikroarraytechniken können zwischen 50–100K Spots auf einem einzelnen Substrat sein, was die massiv parallele Natur dieser Technik verdeutlicht.
Die Herausforderung für jedes Lesegerät liegt damit darin, einen fokussierten Lichtpunkt (von einem Laser erzeugt) auf der zu untersuchenden Probe zu erzeugen, anschließend die resultierende Fluoreszenz vom Substrat effizient zu erfassen und deren Intensität zu quantifizieren. Der Laserstrahl muß punktförmig auf die Probe mit einem Strahldurchmesser von wenigen Mikrometer oder weniger fokussiert werden können, um die kleinen Merkmalsgrößen aufzulösen, die bei den modernsten Mikroarrays vorliegen können. Zum Beschleunigen des Datenerfassungsprozesses ist es ferner der Fall, daß zwei Laserstrahlen unterschiedlicher Wellenlänge das Substrat abtasten, die zwei unterschiedliche fluoreszierende Moleküle auf den Arrays beobachten. Durch gleichzeitige Verwendung von zwei Laserfarben kann die Anzahl an Abtastungen, die ein Forscher zum Erhalt der benötigten Daten durchführen muß, mehr als halbiert werden.
US-5,127,730 beschreibt ein konfokales Abbildungssystem mit mehrfarbiger Laserabtastung zur Verwendung mit einem Mikroskop, das einen an eine Laserlichtquelle mit mehreren Leitungen geschalteten, dualen Bandpaßfilter und zwei Fluoreszenzbandpaßfilter umfaßt, wobei das von einer Probe ausgestrahlte Fluoreszenzlicht mittels eines Reflektors und eines dichroitischen Spiegels in Richtung der Fluoreszenzfilter reflektiert wird.
US 5,847,400 offenbart ein koaxiales Beleuchtungs- und Erfassungslaserabtastsystem, das zwei Laserlichtquellen umfaßt, die Licht mit unterschiedlichen Wellenlängen emittieren, wobei das Laserlicht in einen einzelnen Belichtungspfad geleitet wird, der mittels eines dichroitischen Filters auf eine Probe geleitet wird, und einen Fluorenzbandpaßfilter, wobei das von der Probe emittierte Fluoreszenzlicht mittels eines Strahlteilers in Richtung des Fluoreszenzbandpaßfilters übertragen wird.
WO 00/50878 betrifft ein Abbildungssystem für einen optischen Scanner, der zwei Laserlichtquellen umfaßt, die Licht mit unterschiedlichen Wellenlängen emittieren, wobei das Licht auf einen einzelnen Belichtungspfad geleitet wird, der mittels einer Verschlußanordnung, die Strahlteiler, Verschlüsse und Spiegel umfaßt, auf eine Probe gerichtet wird, und einen Fluoreszenzbandpaßfilter, wobei das von der Probe emittierte Fluoreszenzlicht mittels eines Breitbandspiegels in Richtung des Fluoreszenzbandpaßfilters reflektiert wird.
Die nachfolgende Erfindung strebt nach der Bereitstellung eines Gerätes, das die folgenden Funktionen ausführt:

(i) Zwei unterschiedliche Laserstrahlen werden einen einzelnen Pfad hinunter kombiniert, und die beiden Strahlen werden auf den gleichen Spot auf der Probe fokussiert.
(ii) Das resultierende Fluoreszenzlicht wird vom gleichen Punkt auf der Probe erfaßt.
(iii) Die Fluoreszenzsignale mit relativ niedrigem Pegeln werden daraus ausgewählt, was ein intensives rückgestreutes Lasersignal sein könnte.
(iv) Die beiden Fluoreszenzsignale werden voneinander getrennt und in unabhängige Pfade hinunter geleitet, damit sie von verschiedenen Detektoren gemessen werden können.

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein optisches Gerät zum Leiten optischer Signale in einem fluoreszenz-basierten Analysegerätes geschaffen, der eine erste und eine zweite Laserlichtquelle zum Bereitstellen von Beleuchtungslaserlicht mit unterschiedlichen Wellenlängen aufweist, wobei das Gerät folgendes umfaßt:
einen ersten und einen zweiten Bandpaßfilter, die der ersten bzw. der zweiten Laserlichtquelle zugehören und derart ausgestaltet sind, daß sie Laserlicht der relevanten Wellenlänge ihres zugehörigen Lasers durchlassen, jedoch Licht der anderen Wellenlänge reflektieren, wobei jeder Bandpaßfilter so ausgestaltet ist, daß er Laserlicht von beiden Laserlichtquellen in einen einzelnen Pfad leitet, der auf eine bei Gebrauch zu beleuchtende Probe gerichtet ist; und
wenigstens zwei Fluoreszenzbandpaßfilter, von denen jeder derart ausgestaltet ist, daß er Licht einer ausgewählten Fluoreszenzwellenlänge durchläßt;
wobei die Laserbandpaßfilter ausgestaltet sind, von der Probe empfangenes Fluoreszenzlicht zu den Fluoreszenzfilter derart zu reflektieren, daß bei Gebrauch das von der Probe empfangene Licht durch einen ersten der Fluoreszenzfilter gelangen kann, wenn es auf einer ersten Wellenlänge liegt, und durch den zweiten der Fluoreszenzfilter, wenn es auf einer zweiten Wellenlänge liegt, um ein Ausgangssignal für die Analyse am Ausgang jedes der Fluoreszenzfilter bereitzustellen.
Ein Streufilter kann im optischen Pfad zwischen den beiden Fluoreszenzfiltern angeordnet werden, um rückgestreutes Licht von den Laserlichtquellen auszufiltern. Die Ausgabe des Streufilters kann verwendet werden, ein Fokussiersignal bereitzustellen, um bei Gebrauch eine Optik zu fokussieren, die zwischen dem Ausgang der Laser und der bei Gebrauch zu beleuchtenden Probe angeordnet ist.
Ein oder mehrere zusätzliche Filter können am Ausgang einer oder mehrerer der Fluoreszenzfilter angeordnet werden, um den Störbetrag von rückgestreutem Beleuchtungslicht zu vermindern, der dort hindurch gelangen kann.
Durch den Streufilter, der im optischen Pfad zwischen dem ersten und dem zweiten optischen Filter positioniert werden kann, empfangenes Licht kann zu einer Beleuchtungsintensitätdetektionskomponente geleitet werden, die eine lichtempfindliche Diode sein kann, um das Fokussiersignal bereitzustellen, oder um eine Intensitätsausgabe bereitzustellen, die zum Auslesen eines Barcodes, der einem oder mehreren Proben zugehört, verwendet werden kann.
Das Gerät kann ferner eine oder mehrere optische Fasern umfassen, die in den gegenseitigen Lichtpfaden angeordnet sind, durch die das Laserlicht gelangt und das zurückkehrende Probenlicht empfangen wird.
Es sei bemerkt, daß unter Anwendung der gleichen Methodik, unter sorgfältigem Auswählen der Spezifikation der wellenlängenselektiven Elemente und durch Erweitern der oben beschriebenen Prinzipien es möglich ist, ein Gerät mit der gleichen Methodik zu entwerfen, das drei Laserfarben auf dem gleichen Mikroarray verwendet. Ein solches Gerät würde weiterhin die Anzahl unterschiedlicher Experimente vermindern, die ein Forscher durchführen muß, um zum Endergebnis zu gelangen, wodurch erheblich Zeit und Kosten gespart werden.
Die Anordnung der optischen Elemente gemäß der Erfindung bildet den optischen Kern eines Geräts zum Messen der Fluoreszenz, die durch mit Fluoreszenzmarkern markierte biologische auf einem Substrat aufgebrachte Proben erzeugen.
Das Gerät verwendet lediglich optische Bandpaßfilter, die einfacher sind, um geringere Kosten zu haben, und eine breitere Anwendbarkeit als Bandsperrfilter haben. Ferner erzielt das Gerät all die Hauptfunktionen eines Mikroarray-Lesegeräts mit nur so wenig wie vier Filterelementen, was den Aufbau kompakt und kostengünstig macht.
Ein Beispiel der vorliegenden Erfindung wird nunmehr mit Bezug auf die beigefügte Zeichnung erläutert, in der:
1 ein schematisches Diagramm ist, das ein Beispiel der vorliegenden Erfindung zeigt;
2 eine Abfolge von Diagrammen ist, die die Lichtintensität bei verschiedenen Komponenten des Gerätes aus 1 zeigen;
3 ein schematisches Diagramm eines zweiten Beispiels der vorliegenden Erfindung ist;
4 ein schematisches Diagramm ist, das weitere optionale Komponenten zeigt, die mit dem Beispiel der 3 verwendet werden können;
5 ein schematisches Diagramm einer Fokussierkomponente ist, die mit der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann;
6 ein Diagramm ist, das die Intensität des durch die Vorrichtung der Erfindung empfangenen Lichtes zeigt;
7 ein schematisches Diagramm ist, das das Beispiel aus 3 zeigt, das ferner zum Liefern eines Fokussiersteuersignals ausgestaltet ist;
8 ein schematisches Diagramm eines Beispiels der vorliegenden Erfindung ist, das zum Lesen eines Barcodes, der einem Array von zu beleuchtenden Proben zugehört, verwendet wird;
9 ein schematisches Diagramm ist, das das Beispiel aus 7 zeigt, das ferner zum Bereitstellen eines Laserleistungsüberwachungssignal und eines Fokussierelementes eines zweiten Beispieles ausgestaltet ist; und
10 ein schematisches Diagramm eines weiteren Beispiels der vorliegenden Erfindung ist.
Ein Beispiel der Erfindung ist in 1 gezeigt. In dieser Anordnung gibt es einen ersten Pfad, entlang dem ein kollimierter erster Laserstrahl 1 vorliegt, der in diesem Beispiel eine Wellenlänge von 635 mm hat. Dieser Strahl 1 gelangt durch einen ersten wellenlängenselektiven Laserfilter 2, der alle Wellenlängen im Bereich von 635 ± 5 mm durchläßt, jedoch alle anderen Wellenlängen außerhalb dieses Bandes reflektiert. Falls daher Fremdlichtsignale entweder vom den Strahl 1 erzeugenden Laser auftreten oder entlang der ersten Pfades erzeugt werden, dann werden sie vom ersten Laserfilter 2 bis zu 99.99% reflektiert und daher von einem Beleuchtungspfad 3 ausgeschlossen, entlang dem der Strahl 1 nach Passieren durch den ersten Laserfilter 2 gelangt. Der Beleuchtungspfad 3 endet an der Probe 4, wo der Strahl 1 fokussiert worden ist, um ein Fluoreszenzsignal zu erzeugen, das von dem speziellen verwendeten. Fluoreszenzmarker (oftmals "Fluophor" bezeichnet) abhängt. Ein häufig verwendeter Marker ist Cy5, der bei Erregung durch Laserlicht mit 56 nm ein fluoreszierendes Lichtsignal 5 im Bereich von 670 nm erzeugt. Dieses Fluoreszenzsignal 5, zusammen mit dem Rest der ursprünglichen Anregungslaserwellenlänge, gelangt zurück den Beleuchtungspfad 3 hinunter zum ersten Laserfilter 2. 2(a) zeigt ein sche matisches Diagramm des Spektralinhaltes des entlang dieses Pfades verlaufenden Strahles. Das Fluoreszenzsignal 5 bei 670 nm wird von der Oberfläche des ersten Laserfilters 2 unter einem Winkel entlang Pfad 9 reflektiert. Umgekehrt gelangt ein großer Anteil (> 90%) des Restlaserlichtes vom Strahl 1 durch den Filter 2. Somit arbeitet der erste Laserfilter 2, die Menge des gestreuten Laserlichtes um eine Größenordnung bezüglich des bei der Probe 4 erzeugten Fluoreszenzsignals 5 zu vermindern.
Parallel hierzu wird ein zweiter Laserlichtstrahl 6 entlang eines zweiten Beleuchtungspfades eingeführt. In diesem Beispiel ist es ein grüner Laserstrahl mit einer Wellenlänge von 532 nm. Er gelangt durch einen zweiten Laserfilter 2, der, wie der erste Laserfilter 2, wellenlängenselektiv ist, jedoch in diesem Beispiel alle Wellenlängen im Bereich von 532 ± 5 nm durchläßt, und alle anderen Wellenlängen reflektiert. Wiederum ist diese Filtereigenschaft geeignet, das Spektrum des Lichtstrahles 6 zu säubern, falls er durch andere Signale auf seinem Weg zum zweiten Laserfilter 7 "kontaminiert" worden ist. Dann gelangt der zweite Lichtstrahl 6 entlang eines Pfades 8 zum ersten Laserfilter 2, wo er von der Oberfläche weg und in den Beleuchtungspfad 3 reflektiert wird. Der Winkel θ des Pfades 8 relativ zum Beleuchtungspfad 3 ist derart, daß der Lichtstrahl 6 auf einem Pfad reflektiert wird, der kolinear zum ersten Laserstrahl 1 ist, und daher die gleiche Optik (5) wie der erste Laser zum Fokussieren auf die Probe 4 verwenden kann. Es ist entscheidend, daß θ nicht zu groß ist, da die Reflektionscharakteristik des ersten Laserfilters 2 polarisationsempfindlich werden könnte (es wird angenommen, daß das Licht innerhalb des aktuellen System depolarisiert ist), was die Wirksamkeit des ersten Laserfilters 2 zum Sperren von Licht vermindert, dessen Wellenlänge außerhalb des Durchlaßbandes des ersten Laserfilters 2 liegt. In diesem Beispiel ist θ = 30° und sollte immer vorzugsweise im Bereich von 20 bis 30° liegen. Der Lichtstrahl 6 regt ein zweites Fluorophor auf der Probe an, das in diesem Beispiel Cy3 ist, das bei 570 nm fluoresziert. Wiederum gelangt das Fluoreszenzlicht 5 zurück entlang des Pfades 3 und wird vom ersten Laserfilter 2 weg reflektiert, und auf den Pfad 8 (siehe 2(b)); in diesem Fall gelangt das meiste des restlichen grünen Laserlichtes durch den zweiten Laserfilter 7 und wird effektiv um 90° hinsichtlich jeden Restbetrages gedämpft, der einen Pfad 10 hinunter in Richtung eines ersten Fluoreszenzfilters 11 (2(c)) gelangt. Daher gibt es entlang des Pfades 10 zwei Farben fluoreszierenden Lichtes bei 570 nm bzw. 670 nm, und zwei Farben an Restlaserlicht bei 532 nm und 635 nm.
Der erste Fluoreszenzfilter 11 ist ausgestaltet, Wellenlängen im Bereich von 570 ± 15 nm durchzulassen. Somit wird die Fluoreszenz vom zweiten Fluorophor Cy3 durch den ersten Fluoreszenzfilter 11 und entlang eines ersten Meßpfades 12 relativ ungehindert durchgelassen, während die anderen drei Spektralkomponenten von der Oberfläche des ersten Fluoreszenzfilters 11 entlang des Pfades 13 weg reflektiert werden. Die Ausbreitung entlang des ersten Meßpfades 12 ist daher ein relativ reiner Strahl von 570 nm Fluoreszenz von der Probe 4 (2(d)). Dieser kann erfaßt und auf einen empfindlichen Detektor (nicht dargestellt) fokussiert werden, wie eine Lawinenphotodiode (LPD) oder eine Lichtverstärkerröhre (LVR), wo seine Intensität gemessen werden kann.
Danach trifft das entlang des Pfades 3 laufende Lichtsignal auf einen optionalen Streufilter 14. In diesem Fall ist der Streufilter 14 ein selektiver Filter mit der gleichen Spezifikation wie entweder der Laserfilter 2 oder der Laserfilter 7. Somit gelangen > 90% des Lichtes von einem der Laser durch 14, wodurch die Intensität dieses Lasers im Licht gedämpft wird, das nachträglich entlang eines weiteren Pfades 16 reflektiert wird. Das durchgelassene Licht läuft vom Streufilter 14 entlang eines Pfades 15. Die Spezifikation des Streufilters 14 kann so gewählt werden, daß sie soweit erforderlich kompensiert, abhängig davon, welcher der beiden Laserlichtstrahlen 3, 4 den meisten Hintergrund im rot fluoreszie renden Detektionskanal hervorruft. In diesem Beispiel hat der Streufilter 14 die gleiche Spezifikation wie der zweite Laserfilter 7. In der gezeigten Position hat der Streufilter 14 einige Vorteile hinsichtlich seiner Eignung, beispielsweise zu analysierendes Licht in eine bevorzugte Richtung für die Analyse zu lenken, aber er könnte auch irgendwo anders im Gerät angeordnet werden und ein ähnliches Ergebnis erzielen.
Schließlich trifft das entlang des Pfades 16 laufende Licht auf einen zweiten Fluoreszenzfilter 17 auf, der Licht mit einer Wellenlänge von 670 ± 15 nm durchläßt, wodurch ein Strahl mit einem relativ reinen, vom Fluorphor Cy5 stammenden Licht gebildet wird, das durch einen zweiten empfindlichen optischen Detektor (nicht gezeigt) (2(f)) erfaßt und gemessen werden kann.
Aufgrund der spektralen Nähe der Laser- und Fluoreszenzsignale kann es erforderlich werden, eine scharfe Grenzfrequenz in der Spektralantwort einiger oder aller entlang des Ausgangspfades der Fluoreszenzsignale (in diesem Falle Fluoreszenzfilter 11 und 17) verwendeten Filter zu haben, was es erforderlich macht, mehrere dielektrische Schichten zum Aufbau der relevanten Filter zu verwenden, um die Durchlaßintensität der Frequenzen außerhalb des Bandes zu vermindern.
Es sei bemerkt, daß die Wellenlängenselektivität der Filter 11, 14 und 17 ohne großen Einfluß untereinander ausgetauscht werden kann, auch wenn bemerkt wird, daß die hier vorgestellte Ordnung einige praktische Vorteile hat, wie beispielsweise die Fähigkeit, zusätzliche Signaldaten für die nachstehend beschriebenen Verwendungen bereitzustellen und Signalausgabepositionen zu optimieren.
Die Fluoreszenzsignale von den Fluorophoren auf der Oberfläche der Probe 4 sind extrem schwach im Vergleich zur Intensität der hier zum Anregen der Signale verwendeten Laserstrahlen 1, 6. Berechnungen zeigen, daß das Intensitätsverhältnis zwischen dem Laser und dem Fluoreszenzsignal im allgemeinen in der Größenordnung von 10⁶ liegt. Daher ist es wichtig, daß der Restlaserstrahl zu einem hohen Maß in den Meßpfaden 11 und 18, den Meßkanälen gedämpft wird. Aufgrund verschiedener Sachlichkeiten des Filterdesigns und der Filterherstellung kann es der Fall sein, daß das Restlaserlicht lediglich um 10⁴ in beiden Meßpfaden 12 und 18 gedämpft wird, wodurch ein potentielles Störproblem mit den empfindlichen Detektoren hervorgerufen wird.
Hierzu stellt 3 eine Weiterentwicklung des Geräts aus 1 dar, daß eine zusätzliche Filterung im Ausgangskanal 12 und 18 aufweist. Genauer gesagt werden ein erster und ein zweiter zusätzlicher Filter 19 und 20 in den Meßpfaden 12 und 18 angeordnet. Diese Filter haben die gleiche Spezifikation wie die Fluoreszenzfilter 11 bzw. 17. Wie diskutiert, sind die Filter so ausgestaltet, daß sie arbeiten, wenn das Licht unter einem Winkel θ/2 (= 15°) auf sie auftrifft. Es ist ein wohl bekanntes Phänomen, daß beim hintereinander Anordnen zweier Interferenzfilter, deren Oberflächenebenen parallel zueinander sind, Fabry-Perot-Resonanzen im Raum zwischen ihnen gesetzt werden können, wodurch ihre Effizienz reduziert wird. Daher ist das erste zusätzliche Filter θ/2 relativ zum Meßpfad 12 angeordnet, jedoch nicht parallel zum ersten Fluoreszenzfilter 11, in der in 3 dargestellten Weise. Diese Anordnung ermöglicht, daß die Filter 11 und 19 bei einem Optimum ihrer kombinierten Leistung arbeiten. Somit ist das Filter 20 in ähnlicher Weise wie das Filter 17 angeordnet.
Auf ähnliche Weise können ferner Filter 21 und 22 entlang der Meßpfade 12 und 18 angeordnet werden. Dies sind Filter, die so ausgestaltet sind, daß sie unter einem Einfallswinkel von 0° arbeiten, und in diesem Fall kann einer dieser Filter in Serie mit den vorherigen Filtern angeordnet werden. Solche Filter haben den Vorteil, daß sie sehr viel leichter verfügbar sind und unter manchen Umständen auch als Standardteile gekauft werden können, somit kostengünstig sind.
Das Hinzufügen einer weiteren Filterung führt eine weitere Dämpfung des Restlaserlichtes (^~10³–10⁴ pro Filter) ein, während es lediglich eine Verminderung von 0.8 pro Filter für das zu messende Fluoreszenzsignal einführt.
Das Gerät der Erfindung kann in ein faseroptisches Zufuhr- und Erfassungssystem integriert sein, was es zweckmäßig macht, das Licht auf die Probe 4 zu schicken und dann das gefilterte Licht auf den Detektoren zu erfassen und zu fokussieren.
In dieser in 4 gezeigten Anordnung wird das rote Laserlicht 23 in einer optischen Faser 24 geführt, wobei die Faser so abgeschlossen ist, daß das rote Licht einen divergenten Strahl 75 bildet, der auf eine Linse trifft, die ihrerseits das Licht in einen parallelen Lichtstrahl kollimiert, der sich entlang dem gleichen Pfad wie 1 ausbreitet. Ebenso wird der grüne Laserstrahl 30 unter Verwendung der gleichen Linsen-Faser-Kombination auf das Gerät geschickt.
Von diesem Punkt bewegt sich das Licht durch das Gerät, wie oben beschrieben, außer daß eine Linsen-Faser-Anordnung 29, 35 die Laserstrahlenergie auf die Probe führt und dann das von der Probe sich ausbreitende Licht erfaßt, somit der Lichtkonus 28 bidirektional ist und aus vier Lichtfarben besteht.
Das Licht wird dann unter Verwenden der gleichen Filteranordnung durch das Gerät geleitet, mit Ausnahme, beim Austritt des Fluoreszenzlichtes entlang des Meßpfades 12, wird das Licht unter Verwendung einer Linse 32 auf die Faser 33 fokussiert, die das Licht zu einem optischen Detektor führt. Auf ähnliche Weise wird das entlang des Meßpfades 18 austretende Licht durch eine ähnliche Anordnung 34 einer Linse und einer Faser erfaßt, um das Licht weg zu einem Detektor (nicht gezeigt) zu führen. In dieser Anordnung werden alle Eingänge und Ausgänge zu und vom Gerät über faseroptische Wellenleiter geführt, was es erlaubt, daß das Gerät relativ zu den Lasern und Detektoren flexibel ausgerichtet werden kann, wodurch die Gesamtaufmachung des Systems erleichtert wird.
Durch das Einführen der Laserstrahlen über Fasern wird ferner ermöglicht, daß ein einzelner Laser von mehreren Geräten geteilt werden kann. Beispielsweise könnte das Gerät zum Endverbraucher geliefert werden, ohne daß Laser an den Enden der Anschlüsse 24 und 31 angebracht sind. Dann hat der Endverbraucher entweder einen Laser oder kauft einen solchen, der eine Anzahl an fasergekoppelten optischen Ausgängen aufweist, an denen das Punktlaserlicht durch Koppeln einer dieser Ausgänge mit den Eingangsanschlüssen 24 oder 31 eingeführt wird. Auf diese Weise kann die Komplexität und Gesamtkosten zum Installieren des Geräts der Erfindung reduziert werden, da ein 100 mW Laser zehn oder mehrere unabhängige Vorrichtungssätze versorgen kann. Dieses Merkmal ist insbesondere für Aufbauten nützlich, bei denen mehrere Geräte Seite an Seite angebracht sind.
5 zeigt ein Beispiel eines Fokussiersystems zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung. Dieses System ist ein Mittel zum Koppeln von Licht von der optischen Faser 35 auf ein halbdurchlässiges Werkstück bzw. Teil 42, wobei eine fluoreszierende Verbindung am Punkt 43 angeordnet ist, die durch das Licht angeregt wird, und infolge Fluoreszenzlicht ausstrahlt, das seinerseits durch das optische System erfaßt und zurück die gleiche optische Faser hinunter geleitet wird, wodurch ein Rückkoppelungssignal erzeugt wird, das dem Benutzer die Messung ermöglicht, wie gut das Gerät das Licht auf das Werkstück 42 fokussiert. Dies bildet die Basis eines automatischen Systems zum Optimieren der Distanz zwischen einer Objektlinse 40 und dem Werkstück 42.
Bei Gebrauch werden ein oder mehrere Laserstrahlen 1, 6 die optische Faser 35 hinunter übertragen. In diesem Fall ist die Faser eine Standardqualitätsfaser für die Nachrichtenübertragung, beispielsweise könnte diese Faser eine Faser mit 50/125 Mikrometer (Kern/Mantel) Durchmesser mit einer numerischen Apertur (NA) von 0.2 sein. Die Faser wird durch eine planar gespaltene oder polierte Stirnfläche abgeschlossen, wodurch in erster Näherung die Laserenergie über eine Scheibe 47 von 50 Mikrometer verteilt würde, ausgestrahlt in einem Konus 37 mit einem Halbwinkel von ^~11.5°. Das Licht trifft dann auf eine erste Linse 38 auf, die vom Ende der Faser mit einer Distanz im allgemeinen von dessen Brennweite beabstandet ist. In diesem Fall ist die Linse 38 eine asphärische Linse, die für die Wellenlänge des durch die Linse geleiteten Lichtes optimiert ist. Als Beispiel zur Illustration könnte die Linse eine p/n 350260 Linse sein, die von der Geltech Inc. hergestellt wird. Dort hat die Linse eine NA von 0.16, und nimmt daher lediglich Licht aus einem engeren Kegel 36 auf, der einen Halbwinkel von ^~9.2° hat, wodurch es etwas Überschuß des aus der Faser austretenden Lichtes gibt. Wie jedoch nachstehend diskutiert wird, ist dies für die Gesamtleistungsfähigkeit des Gerätes nicht wichtig. Im Ergebnis bildet das durch die Linse 38 gelangende Licht einen parallelen Strahl 39, der auf eine Objektivlinse 40 gelangt. In diesem Fall ist es wünschenswert, die NA der Objektivlinse 40 zu maximieren, um zwei Ziele zu erreichen. Erstens, indem die NA der Objektivlinse 40 größer als die der Linse 38 gemacht wird, kann eine Verkleinerung des Bildes der Scheibe 47 auf dem Werkstück 42 am Punkt 43 erreicht werden. Zweitens kann durch Maximieren der NA der Objektivlinse 40 die Menge an erfaßtem Fluoreszenzlicht maximiert werden, wodurch das Signal-zu-Rausch-Verhältnis erhöht wird.
Es ist selbstverständlich möglich, unterschiedliche Faserdurchmesser für die Faser 35 zu verwenden. Durch Ändern der Durchmesser und/oder der Eigenschaften der Linsen 38 und 40 ist es möglich, die Größe des Beleuchtungsspots am Punkt 43 einzustellen, um das Leistungsverhalten eines das Gerät anwendenden Analysegerätes hinsichtlich seiner Fähigkeit zu optimieren, Information von der Oberfläche des Substrats 42 herauszuziehen.
Daher könnte als Beispiel die Objektivlinse 40 eine p/n 350330 von Geltech Inc. sein, die die Größe des projizierten Bildes der Scheibe 47 auf dem Werkstück 42 um 4.3X (^~11.6 Mikrometer Durchmesser) reduzieren würde und ^~27% des insgesamt verfügbaren Raumwinkels überstreichen würde.
Die Objektivlinse 40 fokussiert das Licht in einem konvergierenden Kegel 41 auf das Werkstück 42 am Punkt 43. An diesem Punkt genau wird das Fluoreszenzsignal von der auf der Vorderseite des Werkstücks 42 aufgetragenen Probe erzeugt, das von der Objektivlinse 40 als ein divergierender Lichtkegel 44 erfaßt wird, der seinerseits in einen parallelen Strahl 45 durch die Objektivlinse 40 kollimiert wird, und dann durch die Linse 38 in einen konvergierenden Kegel 46 fokussiert wird, wo er zurück in die Faser 35 gekoppelt wird und sich anschließend zurück entlang der Faser 35 in entgegengesetzter Richtung zu den Anfangslaserstrahlen 1, 6 ausbreitet.
Es sei bemerkt, daß beim Koppeln des Lichtes zurück in die Faser 35 es entscheidend ist, daß die NA der Linse 38 geringer oder gleich der NA der Faser 35 ist, um sicherzustellen, daß alles Fluoreszenzsignal zurück in die Faser 35 mit geringem oder ohne Verlust aufgrund von Überschuß gekoppelt wird. Es ist nämlich wesentlich, die Laserenergiemenge zu minimieren, die zum Erfassen einer vorgegebenen Fluoreszenzsignalmenge erforderlich ist, da hohe Laserintensitäten über längere Zeitdauer zu Schäden an den auf dem Werkstück 42 aufgetragenen fluoreszierenden Verbindungen führen, was sie im Laufe der Zeit weniger effizient macht. Beim Auskoppeln des Lichtes aus der Faser 35 in die Linse 38 kann eine geringe Lichterfassungseffizienz der Linse 38 durch Erhöhen der Laserleistung zwecks Kompensation ausgeglichen werden, da dort gewöhnlich mehr als genügend überschüssige Laserleistung verfügbar ist.
Wie vorstehend diskutiert, liegt der Fall vor, daß das sich ausbreitende Licht aus dem von den Molekülen am Punkt 43 erzeugten Fluoreszenzlicht und einem Rest der zum Anregen der Fluoreszenz verwendeten Anfangslaserstrahlen zusammengesetzt ist. Der Laserrest hat verschiedene Ursachen. Zum Beispiel Fehler auf der Oberfläche und innerhalb des Körpers des Werkstückes 42, plus einer Reflektion von 4% zurück entlang des Pfades, verursacht durch eine Impedanzfehlanpassung zwischen dem Körper des Werkstückes 42, der einen Brechungsindex von ^~1.5 hat, und der Luft, die einen Brechungsindex von ^~1 hat. Daher wird es immer eine minimale Menge der zurück entlang der Faser 35 laufenden Anregungslaserstrahlen geben.
Weiterhin liegt der Fall vor, daß das Bild der Scheibe 47 am Punkt 43 von der Entfernung der Linse 38 von der Scheibe 47 (D1) und der Objektivlinse 40 vom Punkt 43 (D2) abhängt. In diesem Gerät ist D1 fest und somit kann lediglich D2 variiert werden. Daher kann durch Messen der entlang der Faser 35 sich ausbreitenden Laserlichtmenge eine Aussage getroffen werden, wie gut D2 optimiert ist. Im speziellen zeigt 6 die Antwortkurve für das System, wenn D2 variiert wird, und bei optimalem Fokus der Objektivlinse 40 relativ zum Punkt 43 wird ersichtlich, daß die Intensität des zurück die Faser 35 hinunter übertragenen Lichtes ein Maximum 48 erreicht und beiderseits des Maximums 48 die Intensität abnimmt.
In der Praxis könnte dieses Signal an mehreren unterschiedlichen Punkten in der Vorrichtung detektiert werden. Der primäre Platz ist zurück die Faser 35 hinunter in dem in den 1, 3, 4 und 7 gezeigten Gerät. Unter Bezugnahme auf 7 wird das grüne oder das rote Laserlicht in die oben beschriebene beispielhafte Vorrichtung eingekoppelt und einer der rückkehrenden Laserstrahlen weist einen Pfad aus dem Gerät heraus entlang dem Pfad 25 auf. Daher zeigt 7 beispielhafte Optionen zum Detektieren des reflektierten Laserlichts. In einer Option hat die optische Faser 24 einen Richtungskoppler 49 eingebaut, der das reflektierte Laserlicht zurück auf einen photoelektrischen Sensor 52 reflektieren kann. Da dieser hinter dem ersten Laserfilter 2 liegt, wird gewöhnlich lediglich eine einzige Frequenz der Laserenergie zurück diesen Zweig hinauf sich ausbreiten. Die Spannung V_out über dem Sensor 52 ist proportional zur Intensität des vom Werkstück 42 reflektierten Lichtes und kann daher zum Erzeugen des Autofokussignals verwendet werden, wie in 6 gezeigt.
Ebenso kann eine ähnliche Anordnung alternativ entlang der Faser 31 angeordnet werden, wo die andere Laserfrequenz eingeführt wird, wo die andere Farbe des reflektierten Laserlichtes zu einem Detektor 54 geleitet wird.
Das Anordnen der Photodetektoren 52, 54 entlang der Fasern 24, 31, in die die Laserenergie eingeführt wird, in das Gerät ist geeignet, kann für das von der Probe zurückkommende Licht geeignet sein, das im Vergleich zum Streulicht schwach ist, das in den Detektor direkt von einem Laser 1, 6 eingeführt wird. Daher ist es als Alternative auch möglich, einen Detektor 55 entlang des Pfades 15 anzuordnen, der keinen Laser aufweist. Durch Anordnen des photoelektrischen Sensors an dieser Stelle kann das Licht direkt auf die lichtempfindliche Fläche des Sensors 35 aus dem freien Raum geleuchtet werden, was eine Verbindungsfaser überflüssig macht. Somit werden Kosten gespart und das vom Sensor 55 empfangene Signal potentiell erhöht.
Die Ausgabe vom Sensor 52, 54 oder 55 kann dann zum Erzeugen eines Steuersignals verwendet werden, das seinerseits zum Antreiben eines Servomotorsystems verwendet wird, das die Distanz D2 kontinuierlich variiert, um das gemessene Fluoreszenzsignal zu optimieren. Dies ist äußerst wünschenswert, da in der Praxis das Werkstück 42 nicht flach sein wird oder keine gleichförmige Dicke haben wird. Daher wird sich D2 immer ändern, wenn sich die Linsenanordnung über die Oberfläche des Werkstückes 42 bewegt. Eine solche Echtzeitsteuerung der Distanz D2 stellt sicher, daß die Qualität des vom Gerät erzeugten Fluoreszenzbildes unter allen Umständen optimal ist.
Für einen DNA-Test mit hohem Durchsatz gibt es eine Menge Daten, die schnell und effizient katalogisiert werden müssen. Folglich gibt es einen Trend, die Substrate mit Barcodes zu markieren. Damit können die Substrate über ihren gesamten Verwendungsweg von ihrer anfänglichen Herstellung identifiziert werden, zum Drucken des Mikroarrays und schließlich zur Hybridisierung und zum Auslesen. Die nachfolgende Darstellung zeigt, wie ein Barcode unter Verwendung des erfindungsgemäßen Ausführungsbeispieles ohne zusätzliches Gerät ausgelesen werden kann.
8 zeigt einen möglichen Aufbau eines solchen Gerätes. In diesem Fall wird die gesamte Detektionselektronik, die zum Auslesen des oben diskutierten schwachen Fluoreszenzsignales verwendet wird, ausgeschaltet, zusammen mit einem der Laser 1, 6; wodurch zum Zwecke dieser Diskussion der zweite (grüne) Laser 6 zum Abtasten des Bar-Codes 57 verwendet wird. Daher wird in diesem Fall ein Substrat 56 mit einem vorgedruckten Barcode 57 in eine die Erfindung anwendende Maschine geladen und das Substrat wird unterhalb der Optik der obigen in 5 gezeigten Ausführungsbeispiele geführt, die hier mit dem Bezugszeichen 58 bezeichnet ist. Durch Überqueren des Pfades 59 wird der Barcode 57 hinter dem Brennpunkt der Optik 58 abgetastet, und somit ein zeitveränderliche Laserlichtmenge, die vom Barcode 57 reflektiert wird, von der Optik 58 erfaßt und entlang der optischen Faser 35 zurück zur Spektraloptik geleitet, wie in 1–7 dargestellt. Als Folge der Einbeziehung des Fokussiersystems, wie in 5–7 dargestellt, tritt das grüne Laserlicht aus der Spektraloptik entlang eines Pfades 62 aus und trifft auf einen Detektor 54, der wie in 7 gezeigt angeordnet ist. Eine zeitveränderliche Spannung wird an dessen Ausgang ersichtlich (siehe Einsatz), was bedeutet, daß der Informationsgehalt des Barcodes 57 von einer geeigneten Hardware und Software gelesen werden kann, falls das Substrat mit konstanter Geschwindigkeit angetrieben wird.
Es sei bemerkt, daß in diesem Fall die Brennweite der Optik 58 zum Substrat 56 weniger kritisch ist als bei der Detektion der hochauflösenden Fluoreszenz und somit die Fokusierfunktion nicht notwendig ist, und daher die Komponenten diese dop pelte Funktion ausführen können. 9 zeigt eine alternative Anordnung, die die gleiche Methodik zum Erzeugen des Autofokusiersignals anwendet, jedoch nicht die in 5 detailliert dargestellte Anordnung verwendet, um das Licht auf die Probe zu führen und es von dort zu erfassen.
9 zeigt eine Vorrichtung mit demselben Aufbau, wie detailliert in 1 dargestellt, wo eine Probe 63 mit einem Fluoreszenzmarker nahe dem Gerät angeordnet wird und ein paralleler Lichtstrahl im Gerät auf einen Fleck auf 63 hinunter durch eine Sammellinse 64 fokussiert wird. In diesem Fall gelangt eine Mischung aus dem Fluoreszenzlicht und dem reflektierten Laserstrahl 64 zurück durch das Gerät, bis es bei einem Filter 65 mit der Spezifikation des Laserfilters 2 oder 7 ankommt.
Abhängig von der Spezifikation des Filters 65 besteht der Strahl 66 aus dem Laserlicht, das von der Oberfläche der Linse 64 weg reflektiert wird, wo dieser parallele Strahl durch die Linse 68 gelangt, die ihrerseits eine Sammellinse ist, die das Licht auf das Ende der Faser 69 fokussiert, die das Licht über einen Strahl 70 im freien Raum zum Detektor 71 überträgt, der zum Bilden des gleichen Ausgangssignals V_out verwendet wird, der im Beispiel der 6 verwendet wird. In diesem Fall ist das Licht des Lichtspots auf der Probe 63 mit dem Ende der Faser 69 ausgerichtet und es wird eine Eins-zu-eins-Abbildung erzielt. Damit wird eine optimale Leistungskopplung in die Faser 69 eingespeist, wenn der Abstand D3 zwischen 63 und 64 gleich der Brennweite der Linse 64 ist. Ähnlich zum obigen Beispiel kann durch Ändern von D3 und Überwachen von V_out des Detektors 71 der optimale Wert für D3 erzielt und aufrecht erhalten werden, falls die Probe 63 dazu neigt, sich relativ zur Linse 64 zu bewegen, während sie unter der Linse 64 im Raster abgetastet wird.
Es gibt weitere Optionen zum Anordnen des Detektors. In 9 ist das Teil 72 eine der Fasern, die zum Einführen einer der Farben des Laserlichtes in das Gerät verwendet werden. Im Falle der Verwendung eines verzweigten 1–2-Kopplers anstelle eines normalen Faserstückes wird dann das zurückkehrende Laserlicht zurück in den Detektor 74 gekoppelt und ein Teil des zurückkehrenden Laserlichtes 75 kann in den Detektor 76 hinauf gekoppelt werden und zum Erzeugen eines geeigneten Signals für ein Autofokussiersystem arbeiten. Es sei bemerkt, daß die Verwendung des Detektors 74 wahrscheinlich zu einem Verlust der in das Gerät eingeführten Laserleistung führt, und somit die Gesamtleistungsfähigkeit des Systems beeinflußt.
Die Verwendung dieses Verfahrens hat funktionelle Vorteile gegenüber der Verwendung einer Zwischenfaser. Dies liegt primär an der Unterscheidbarkeit von V_out. In dem im vorstehenden Paragraph dargestellten Szenario ist die von 63 weg reflektierte Laserlichtmenge ^~4% für eine Glas-Luft-Schnittstelle, wobei Glas ein Brechungsindex von ^~1.5 hat. Da es keine Zwischenfaser zwischen dem Gerät und der Probe 63 gibt, gibt es damit in diesem Fall eine minimale Anzahl optischer Oberflächen zwischen der Probe und der Faser 69.
Dies führt hier dazu, daß 80% des auf die Faser 69 fokussierten Signals aus Licht von der in Frage stehenden Glas-Luft-Reflektion der Probe 63 zusammengesetzt ist. Dies ist in Vergleich zu setzen mit der Situation, bei der eine Faser zwischen der Probe 63 und der Linse 64 plus dem Satz an optischen Elementen angeordnet ist, wie in 5 gezeigt, bei dem das von der Oberfläche reflektierte Signal von der Probe 63 weniger als 33% des Signals beim Detektor umfaßt, da die Faser endet und die zusätzliche Linse > 2X soviel Licht wie die Oberflächenreflektion beiträgt und diese anderen Komponenten sich nicht mit D3 ändern, somit das in 6 dargestellte elektrische Signal über einem konstanten Hintergrund liegt, der 2X so groß wie das veränderliche Signal ist. Daher wird die zum Optimieren des Wertes D3 verwendete Elektronik es leichter finden, die optimale Bedingung ohne Vorliegen der Faser zu detektieren.
Es sei bemerkt, daß zum Optimieren der durch die Detektion entweder der Fluoreszenz oder des Autofokusierlichtes erfaßten Lichtmenge es erforderlich wird, die NA und den Durchmesser der Linsen 64 an die zum Koppeln des Lichtes in die Fasern verwendeten Linsen angepaßt werden. In diesem Fall ist zum Optimieren der Menge des von der Probe erfaßten gestreuten Fluoreszenzlichtes es erforderlich, daß die NA der Linse 64 so groß wie möglich ist und in der Praxis sollte sie > 0.6 sein. Im Gegensatz sollte das Licht, das zum Koppeln von Licht in die Faser 69 verwendet wird, keine NA größer als die der Faser haben, was zum Ergebnis hat, daß die NA der Linse 68 und aller anderen ähnlichen Linsen im Bereich von 0.12–0.2 liegen sollten.
Aus zahlreichen Gründen ist es wünschenswert, die Leistung des in den Block eingeführten Laserstrahles in Echtzeit zu überwachen. Um dies ohne nennenswerten Signalverlust zu tun, könnte die in 9 skizzierte Anordnung angewandt werden. Hier ist das Filter 65 identisch zum Filter 2, wie zuvor beschrieben. Während der Laserstrahl durch das Filter 75 gelangt, wird eine geringe Menge der Leistung von der Oberfläche weg reflektiert und entlang des Pfades 76 in Richtung eines optischen Detektors 77 zurück gekoppelt. Diese Menge kann so gering wie 0.2% sein, falls die richtigen mehrlagigen Beschichtungen am Filter 75 verwendet werden. Es ist jedoch selbst bei diesem geringen Anteil nach wie vor gering genug, selbst durch einen einfachen Detektor, wie eine Silizium-PIN-Diode, bequem detektiert zu werden.
Durch eine direkte Messung der in den Block eingeführten Laserleistung können mehrere Anwendungen entstehen. Über kurze Zeiträume, falls die Laserleistung über eine Abtastung fluktuiert, können die Änderungen, die diese für die Intensität der detektierten Fluoreszenz einführen, in erster Ordnung korrigiert werden. Zweitens kann bei einer Alterung des Lasers bei normalem Gebrauch dieses Signal als ein Mittel zum Überwachen des Leistungsabfalles und zum Erzeugen eines Warnsignals verwendet werden, wenn die Leistung im Gerät unter halb akzeptabler Pegel abgefallen ist und folglich der Laser ausgetauscht werden muß.
Die auf diese Weise reflektierte Energie ist intrinsisch, ihre Verwendung auf diese Weise führt jedoch nicht zur Einführung zusätzlicher optischer Elemente in den Strahl und zu keinem zusätzlichen Verlust, was es zu einem effizienten Verfahren zum Einführen eines solchen Merkmales macht. Ferner kann dieses Überwachungsverfahren überall im Gerät verwendet werden und ist nicht auf die dargestellte Position eingeschränkt.
In vielen Untersuchungsfeldern, insbesondere Untersuchungen lebender Organismen, kann es vorteilhaft sein, unterschiedlich eingefärbte Fluororphor-Farbmarker zu verwenden, um verschiedene Chemikalien oder chemikalische Prozesse, die innerhalb der Zelle stattfinden, zu markieren. Diese müssen unter Verwendung unterschiedlicher Farben der Anregungsenergie angeregt werden, und die so gebildeten Bilder müssen entsprechend ihrer Farbe getrennt werden. Dies kann auf zwei Arten durchgeführt werden; erstens kann der singuläre Strahl im soweit beschriebenen System über die Oberfläche der Probe abgetastet werden, um ein Bild aus einem Rastermuster zu bilden. Zweitens kann die Probe abgebildet werden, wie es in einem Mikroskop gemacht wird, um die resultierende Fluoreszenz zu detektieren. Da der beschriebene Geräteaufbau die im Lichtstrahl enthaltene räumliche Information beibehält, können die Prinzipien zum Kombinieren und Trennen der verschiedenen Komponenten in Multi-Fluorophor-Abbildungssystemen, wie einem Mikroskop, verwendet werden.
Ein solches Gerät ist in 10 dargestellt. In diesem Aufbau ist das Gerät auf ein Substrat 78 gerichtet, auf dem räumlich unterschiedliche Verteilung eines fluoreszierenden Farbstoffes sind, die zu Beispielszwecken als 'W' (79) und 'X' (80) gezeigt sind. Insbesondere werden die Farbstoffe, die 79 und 80 enthalten, mit λ_ew und λ_ex angeregt und fluoreszieren bei λ_ew bzw. λ_ex. In dieser Anordnung wird λ_ew in das Gerät entlang des Pfades 81 eingespeist, der durch den Bandpaßfilter 82 führt. Auf ähnliche Weise wird λ_ex entlang des Pfades 83 eingespeist, der durch den Bandpaßfilter 84 führt. Beide Filter 82 und 84 sind so abgestimmt, daß sie ein schmales Wellenlängenband durchlassen, das jeweils bei λ_ew bzw. λ_ex mit 5–10 nm Breite zentriert ist. Außerhalb dieses Bereiches wird das gesamte Licht wirksam reflektiert. Dann läuft der λ_ew-Strahl entlang des Pfades 85 zu einem Satz optischer Bauteile 86, die den parallelen Laserstrahl auf das Substrat 78 abbilden. Parallel dazu wird λ_ex entlang des Pfades 87 übertragen, trifft auf die Oberfläche des Filters 82 und wird dann auf die Optik 86 über den Pfad 85 geleitet. In diesem Fall könnte 85 ähnlich in der Form zu einem optischen Mikroskop sein, das das Mikroskopobjektiv umfaßt, das in der richtigen Distanz von der Probe angeordnet ist, um ein Bild zu geben, wobei die zugehörige Optik das Bild in einem parallelen (oder nahezu parallelen) Lichtstrahl umwandelt, der zum Einspeisen in das vordere Ende der hier beschriebenen Erfindung geeignet ist.
In diesem Punkt werden 79 und 80 angeregt und emittieren Licht bei λ_fw bzw. λ_fx, das von der Optik 86 erfaßt wird, die die Bilder in parallele Lichtstrahlen umwandelt, die zurück entlang des Pfades 88 übertragen werden. An diesem Punkt umfaßt der Strahl die Bilder von 79 und 80 bei λ_fw und λ_fx plus die Restlaseranregung bei λ_ew und λ_ex. Da der Strahl vom Filter 82 weg reflektiert wird und dann entlang des Pfades 89 weg vom Filter 84 läuft, werden sowohl λ_ew und λ_ex um ^~10X gedämpft, da die Filter 82 und 84 bei λ_ew bzw. λ_ex durchlässig sind, wodurch der Großteil der Leistung bei diesen Wellenlängen durch den Filter gelangen kann. Nachdem der Strahl vom Filter 84 weg reflektiert wurde, gelangt er dann entlang des Pfades 90 zum Filter 91. Hier ist aus Darstellungszwecken für die Erfindung das Filter 91 ein Bandpaßfilter, der so abgestimmt ist, daß er Wellenlängen im Bereich λ_ew durchläßt.
Daher enthält der Strahl 92 nach dem Filter 91 lediglich die durch 79 codierte räumliche Information, wobei diese zu einem Satz optischer Bauelemente 93 geleitet wird, die ein Bild 94 von 79 bei λ_fw bilden. Wie oben ausgeführt, könnte, unter weiterer Analogie mit einem Abbildungsmikroskop, 93 ähnlich in Form mit dem Okular eines Mikroskopes oder der erforderlichen Optik sein, die zum Projizieren von Mikrographiken auf die lichtempfindliche Fläche einer Kamera verwendet wird. Das Bild kann durch eine Reihe von Bildsensoren, wie das menschliche Auge oder wahrscheinlicher durch einen räumlich empfindlichen elektronischen Detektor, wie eine CCD oder einen CMOS-Sensor detektiert werden. Parallel hierzu wird das Licht bei λ_fx und folglich die in 80 codierte räumliche Information vom Filter 91 weg reflektiert und gelangt entlang des Pfades 95 zum Filter 96. Auf dieselbe Weise wie der Filter 91 läßt der Filter 96 alle Frequenzen im Bereich von λ_fx durch, während er alle anderen reflektiert. Somit gelangt die in 80 enthaltene räumliche Information entlang des Pfades 97 zur Optik 98, die ähnlich zur Optik 93 ist, dahingehend, daß sie einen Satz optischer Elemente ist, die ein Bild 99 aus 80 bilden.
Die Hauptvorteile dieses Gerätes liegen darin, daß es das effizienteste Verfahren zum Auftrennen von Multiwellenlängenbildern aus einem einzelnen zusammengesetzten Ziel ist. Es sei wiederum bemerkt, daß der hier beschriebene Geräteaufbau skalierbar ist, und daß der von 96 weg reflektierte Strahl 100 Bilder bei anderen Wellenlängen enthalten kann, die über eine ähnliche Anordnung an Filtern getrennt werden können, wie diejenige, die 82, 84, 91 und 96 umfaßt.

Claims

Optisches Gerät zum Leiten optischer Signale in einem fluoreszenzbasierten Analysegerät, der eine erste und eine zweite Laserlichtquelle zum Bereitstellen von Beleuchtungslaserlicht mit unterschiedlichen Wellenlängen aufweist, wobei das Gerät folgendes umfaßt: einen ersten und einen zweiten Bandpaßfilter (2, 7), die der ersten bzw. zweiten Laserlichtquelle zugehören und so ausgestaltet sind, daß sie Laserlicht der relevanten Wellenlänge des zugehörigen Lasers durchlassen, jedoch das Licht anderer Wellenlängen reflektieren, wobei jeder Bandpaßfilter so ausgestaltet ist, daß er Laserlicht von beiden Laserlichtquellen in einen einzelnen Pfad (3) leitet, der auf eine zu beleuchtende Probe (4) gerichtet ist; und wenigstens zwei Fluoreszenzbandpaßfilter (11, 17), von denen jeder so ausgestaltet ist, daß er Licht einer ausgewählten Fluoreszenzwellenlänge durchläßt; wobei die Laserbandpaßfilter (2, 7) so ausgestaltet sind, daß sie von der Probe (4) empfangenes Fluoreszenzlicht zu den Fluoreszenzfiltern (11, 17) reflektieren, derart, daß von der Probe empfangenes Licht durch einen ersten der Fluoreszenzfilter gelangen kann, wenn es auf einer ersten Wellenlänge liegt, und durch den zweiten Fluoreszenzfilter, wenn es einer zweiten Wellenlänge liegt, um ein Ausgangssignal für die Analyse am Ausgang jeder der Fluoreszenzfilter bereitzustellen.
Gerät nach Anspruch 1, das ferner ein Streufilter (14) zum Ausfiltern von rückgestreutem Laserlicht umfaßt.
Gerät nach Anspruch 2, bei dem eine Ausgabe entweder der Laserfilter (2, 7) oder des Streufilters (14) zum Bereitstellen eines Überwachungssignals verwendet wird.
Gerät nach Anspruch 3, das so ausgestaltet ist, daß es das Überwachungssignal eine Fokussiereinrichtung einspeist, die an den Ausgang des Gerätes geschaltet ist, um eine Steuerung dorthin bereitzustellen.
Gerät nach Anspruch 3 oder 4, das so ausgestaltet ist, daß es das Überwachungssignal einem Prozessor zuführt, der so eingerichtet ist, daß er das Überwachungssignal analysiert, um eine Ausgabe bereitzustellen, die einen Bar-Code anzeigt, der durch wenigstens einen der Laserlichtstrahlen abgetastet wird.
Gerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem ein oder mehrere zusätzliche Filter (19, 20, 21, 22) am Ausgang eines oder mehrerer der Fluoreszenzfilter (11, 17) angeordnet sind, um die Störmenge des rückgestreuten Beleuchtungslichtes zu vermindern, das dort hindurch gelangen kann.
Gerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das ferner ein oder mehrere optische Fasern umfaßt, die im Lichtpfad angeordnet sind, durch den das Laserlicht gelangt und das rückkehrende Fluoreszenzlicht empfangen wird.
Fluoreszenzbasiertes Analysegerät, mit: einer ersten und einer zweiten Laserlichtquelle, die zum Emittieren von Laserlicht bei unterschiedlichen Wellenlängen ausgestaltet sind; einem Gerät gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, das mit den Laserlichtquellen gekoppelt ist; und einem Analysemittel, das an die Ausgänge von jedem der Fluoreszenzfilter geschaltet ist, um darauf basierende Fluoreszenzdaten bereitzustellen.
Analysegerät nach Anspruch 8, das ferner ein Mittel zum Überwachen der Leistung des in das optische Gerät eingeführten Laserlichtes und ein Mittel zum Vergleichen des Laserlichtpegels mit dem empfangenen Fluoreszenzlichtpegel umfaßt.
Analysegerät nach Anspruch 8 oder 9, der ferner ein Mittel zum Fokussieren des Ausgangslaserlichtes auf eine Probe umfaßt; und ein Mittel zum Erzeugen einer relativen Bewegung zwischen dem Abtastlicht und der abzutastenden Probe.
Analysegerät nach Anspruch 8 oder 9, das so ausgestaltet ist, daß es Multiwellenlängenbilder aus einem einzelnen zusammengesetzten Ziel entsprechend ihrer individuellen Wellenlängen trennt.