DE602005000749T2

DE602005000749T2 - Fluoreszenzabbildung mittels telezentrischer Anregungs- und Abbildungsoptiken

Info

Publication number: DE602005000749T2
Application number: DE602005000749T
Authority: DE
Inventors: Martin Gutekunst
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 2005-01-18
Filing date: 2005-01-18
Publication date: 2007-12-06
Anticipated expiration: 2025-01-19
Also published as: CA2533079A1; ATE399991T1; CN100543512C; DE602006001593D1; EP1681557B1; DK1681555T3; DK1681557T3; CN1808204A; EP1681557A1; ATE357653T1; HK1091904A1; CA2533079C; DE602005000749D1; JP4980622B2; EP1681555B1; ES2309835T3; JP2006226998A; ES2284087T3; US20060166355A1; EP1681555A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der DNA-Analyse. Insbesondere ist die vorliegende Erfindung auf eine Vorrichtung zum parallelen Abbilden von Fluoreszenzintensitäten an einer Vielzahl von Orten gerichtet.
Allgemeiner Stand der Technik
Dem Fachmann sind verschiedene Anwendungen von Fluoreszenztechniken zum Analysieren biologischer Proben bekannt. Bei elektrophoretischen Techniken werden Proteine oder DNA mit einer fluoreszierenden Sonde markiert, um ihre elektrophoretischen Bänder in Gelen oder Säulen sichtbar zu machen. Außerdem basieren die meisten bisherigen Biochip-Anwendungen auf einer Fluoreszenzablesung, wobei das spezifische Binden eines fluoreszenzmarkierten Zielmoleküls an ein Sondenmolekül, das an einem festen Träger immobilisiert ist, überwacht wird. Anwendungen der DNA-Analyse in der flüssigen Phase umfassen Fluoreszenzhybridisierungssonden wie der doppelsträngige DNA bindende Farbstoff SybrGreen I oder FRET-(Fluoreszenzresonanz-Energietransfer)-Sonden, bei denen zwei Fluoreszenzsonden und Energietransfer angewendet werden. Eine sehr wichtige Anwendung von Fluoreszenztechniken in der flüssigen Phase ist die Quantifizierung von PCR-Produkten in Echtzeit, die so genannte Echtzeit-PCR.
In all diesen Fällen wird eine Fluoreszenzlesevorrichtung benötigt, die Licht einer bestimmten Wellenlänge bereitstellt, um den Fluoreszenzmarker der Untersuchung anzuregen, und die in der Lage ist, das Fluoreszenzlicht von dem Marker, das mit einer geringfügig unterschiedlichen Wellenlänge ausgestrahlt wird, zu erfassen. Ein Hauptproblem aller Fluoreszenzlesevorrichtungen ist die enorme Intensität des Anregungslichtes im Vergleich zu dem Fluoreszenzlicht, das von dem Farbstoff ausgestrahlt wird, und daher muss sichergestellt werden, dass der Anregungsstrahl nicht auf den Detektor trifft, um die Fluoreszenz-Signale präzise zu überwachen. Mit anderen Worten: Der Strahlengang des Anregungslichtes muss sich von dem Strahlengang des Fluoreszenzlichtes mindestens teilweise unterscheiden.
Die Verwirklichung des Fluoreszenzprinzips ist ziemlich einfach, wenn nur eine Fluoreszenzsonde in der flüssigen Phase, z.B. einer Kapillare, überwacht werden muss. Hier reicht z.B. eine Weißlichtquelle zusammen mit einem Satz von dichroitischen Spiegeln und Filtern aus, um die Anforderungen zu erfüllen. Wenn jedoch mehr als ein Fluoreszenzmarker in der Probe gegenwärtig ist und eine seitliche Verteilung von Stellen auf einem festen Träger oder die Fluoreszenz einer Mikrotiterplatte überwacht werden muss, sind die Anforderungen an die Fluoreszenzlesevorrichtung schwieriger zu erfüllen.
Prinzipiell gibt es zwei verschiedene Strategien, um die Fluoreszenz einer seitlichen Verteilung von Orten anzuregen und zu überwachen. Die erste Strategie ist es, die seitliche Verteilung von Orten abzutasten, wobei die einzelnen Orte nacheinander einzeln analysiert werden. Die zweite Strategie ist es, die gesamte Verteilung von Orten gleichzeitig zu beleuchten und die entsprechende Fluoreszenz z.B. auf einem CCD-Chip abzubilden. Die Abtast-Strategie weist den offensichtlichen Nachteil auf, dass entweder der Träger in zwei Dimensionen bewegt werden muss (WO 03/069 391, DE 102 00 499 ) oder der Detektor bezogen auf den Träger bewegt werden muss (US 2002/159 057). Andererseits ist die Hauptschwierigkeit der Strategie, bei welcher der gesamte Träger gleichzeitig beleuchtet wird, eine homogene Beleuchtung quer über die gesamte Verteilung der Orte hinweg sicherzustellen. Eine Alternative zu der homogenen Beleuchtung der gesamten Verteilung von Orten ist die Benutzung eines Rasters von Lichtquellen, wobei jeder Ort von seiner eigenen Lichtquelle beleuchtet wird. DE 101 31 687 beschreibt diese Strategie zur Beurteilung von PCR in einem Thermozykler mit einer Vielzahl von Wells unter Benutzung eines Strahlteilers und eines Rasters von LED zur Beleuchtung. DE 101 55 142 beschreibt die Dunkelfeld-Überwachung von Fluoreszenz-Signalen, wobei das Mikroraster ebenfalls durch ein Raster von LED beleuchtet, in dieser Ausführungsform jedoch kein Strahlteiler benötigt wird.
Hinsichtlich der Erfordernis, den Strahlengang des Anregungsstrahles und des Fluoreszenzlichtes mindestens teilweise zu trennen, gibt es wiederum zwei verschiedene Möglichkeiten. Die erste Möglichkeit ist die so genannte Epi-Beleuchtung, wobei Strahlteiler benutzt werden und der Anregungsstrahl und das Fluoreszenzlicht sich mindestens einen Teil des optischen Strahlenganges teilen. Die zweite Möglichkeit ist die Benutzung schräger Beleuchtung. Hierbei wird der Anregungsstrahl in solch einer Weise angeordnet, dass er einen bestimmten Winkel zu der Normalen der Trägeroberfläche aufweist und die entsprechende Reflexion des Anregungsstrahles sich außerhalb des Akzeptanzwinkels des Detektionssystems befindet (z.B. US 2002/0 005 493 A1, EP 1 275 954 A2 ).
US 2003/0 011 772 A1 beschreibt eine optische Vorrichtung zum gleichzeitigen Beobachten einer Vielzahl von Fluoreszenzfarbstoffen in einer Sonde unter Benutzung eines Strahlteilers. DE 197 48 211 A1 offenbart ein System zum Überwachen der Fluoreszenz-Signale, die in den Wells einer Mikrotiterplatte erzeugt werden, unter gleichzeitiger Benutzung eines Strahlteilers, einer Feldlinse und eines Rasters von Linsen, die das Licht in jedes Well fokussieren. Die Erfassung erfolgt durch Abbilden des Lichtes auf ein Raster von Photodioden oder einen CCD-Chip. Das Fluoreszenzlicht, das in dieser Ausführungsform des Systems gesammelt wird, wird von der Menge an Farbstoffen bestimmt, die von dem Lichtkegel der Fokussierlinse angeregt wird, und hängt daher von dem Füllstand des Wells ab. WO 99/60 381 beansprucht ein Instrument zum gleichzeitigen Überwachen von PCR-Reaktionen in einer Vielzahl von Fläschchen in einem Block mit Temperaturzyklus. Die optischen Komponenten dieses Instrumentes umfassen wiederum einen Strahlteiler, eine Feldlinse, ein Raster von Fläschchenlinsen, die einzelne Lichtstrahlen in jedes Fläschchen fokussieren, und ein Detektionsmittel, welches das Emissionslicht auf z.B. einen CCD-Detektor fokussiert. Aufgrund der Notwendigkeit eines Rasters von Fläschchenlinsen sind die Größe und die seitliche Dichte der einzelnen Orte begrenzt. JP 2002 014 044 beschreibt eine fluormetrische Vorrichtung zum Überwachen der Fluoreszenz, die in einer Vielzahl von Wells erzeugt wird. Die optischen Komponenten umfassen einen Strahlteiler und ein Linsensystem zum gemeinsamen Beleuchten der Wells mit Licht, das zu der Richtung der Tiefe der Wells parallel ist. Das abbildende optische System konzentriert das Licht jedoch auf ein Detektionsmittel. US 6,498,690 B1 offenbart ein Verfahren zum Abbilden von Untersuchungen mit einem Objektiv, das eine telezentrische Linse umfasst. US 6,246,525 B1 beansprucht eine Abbildungsvorrichtung zum Abbilden eines Probenträgers, umfassend eine Fresnel-Linse.
EP 0 987 540 A offenbart eine Abbildungsvorrichtung für Fluoreszenzuntersuchungen, die eine Abbildungseinheit umfasst, die einen Satz von telezentrischen Linsen beinhaltet. EP 1 406 082 A beschreibt eine Fluoreszenzlesevorrichtung mit telezentrischer Beleuchtung.
Daher war es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine verbesserte Vorrichtung zum gleichzeitigen Überwachen von Fluoreszenz-Signalen von einer seitlichen Verteilung von Orten durch Optimieren des Strahlenganges auf homogene Beleuchtung und präzise Erfassung hin bereitzustellen. Unter einem Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung betrifft die Aufgabe, die es zu lösen galt, Verbesserungen beim Überwachen von Multiplex-Echtzeit-PCR in einem Mikrotiterplattenformat.
Kurzbeschreibung der Erfindung:
Somit ist die Erfindung auf ein optisches Instrument zum Abbilden der Fluoreszenz einer Anordnung einer Vielzahl einzelner Orte gerichtet, das eine Anregung über die gesamte Anordnungsfläche sowie ein präzises Abbilden der entsprechenden Fluoreszenz-Signale umfasst.
Genauer ist die Erfindung auf ein optisches Instrument zum gleichzeitigen Analysieren einer Vielzahl von PCR-Amplifikationen, die in den Wells einer Mikrotiterplatte stattfinden, in Echtzeit oder zum Abbilden der Fluoreszenzintensität eines Mikrorasters als ein Maß für spezifische Ziel/Sonde-Wechselwirkungen gerichtet.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein optisches Instrument zum Abbilden von Fluoreszenz-Signalen von einer Vielzahl einzelner Orte, umfassend:

– eine Haltevorrichtung zum Halten eines ebenen Trägers mit einer Anordnung einer Vielzahl einzelner Orte,
– mindestens eine Lichtquelle zur Ausstrahlung von Licht, umfassend mindestens eine Anregungsfrequenz,
– einen Wandler, so angeordnet, dass er Fluoreszenz-Signale von der Anordnung einer Vielzahl einzelner Orte empfängt, wobei der Wandler so angeordnet ist, dass er computerlesbare Primärdaten erzeugt,
– eine Feldlinse, so angeordnet, dass sie Anregungslicht von der Lichtquelle zu der Anordnung einer Vielzahl einzelner Orte und Fluoreszenz-Signale von der Anordnung einer Vielzahl einzelner Orte zum Wandler überträgt,
– eine Anregungslinsenanordnung, so angeordnet, dass Anregungslicht von der Lichtquelle zur Feldlinse übertragen wird, und
– eine Abbildungslinsenanordnung, so angeordnet, dass Fluoreszenz-Signale von der Feldlinse zum Wandler übertragen werden,

Im Zusammenhang mit dieser Erfindung fasst eine Anordnung einer Vielzahl einzelner Orte Objekte zusammen, die aus zwei oder mehr Orten zusammengesetzt sind, die räumlich getrennt und seitlich verteilt sind. Orte können z.B. Wells einer Mikrotiterplatte oder funktionalisierte Oberflächenbereiche eines Objektträgers aus Glas sein. In der Mehrzahl der Fälle wird die Anordnung einer Vielzahl einzelner Orte in einer gleichförmigen Weise angeordnet sein und jeder Ort einen unterschiedlichen Inhalt aufweisen, um Multiplex-Analyse durchzuführen. Innerhalb des Umfangs dieser Erfindung ist der ebene Träger der Anordnung eine ebene feste Phase. Im Falle eines Mikrorasters ist der ebene Träger der Anordnung die Oberfläche dieser ebenen festen Phase, auf der die Orte angeordnet sind. Im Falle einer Mikrotiterplatte ist der ebene Träger der Anordnung die Ebene, auf der die Öffnungen der Wells angeordnet sind. Der ebene Träger der Anordnung ist mittels einer Haltevorrichtung befestigt, um die Position jedes einzelnes Ortes an der gewünschten Position innerhalb des Strahlengangs zu stabilisieren.
Innerhalb des Umfanges dieser Erfindung beinhaltet der Ausdruck Lichtquelle (LS) Leuchtmittel, die Licht mit einer einzelnen Frequenz oder mit einer Vielzahl unterschiedlicher Frequenzen ausstrahlen. Außerdem kann die Lichtquelle eine Anordnung von mehr als einem der Leuchtmittel sein.
Im Zusammenhang mit dieser Erfindung ist ein Wandler (Det) eine Vorrichtung, die in der Lage ist, sichtbares Licht in elektrische Signale umzuwandeln, die von einem Computer verarbeitbar sind, z.B. ein CCD-Chip.
Innerhalb des Umfangs dieser Erfindung ist eine telezentrische Optik eine Optik, die eine sehr kleine Apertur aufweist und somit eine hohe Tiefenschärfe bereitstellt. Mit anderen Worten: das telezentrische Licht einer telezentrischen Optik ist für alle Punkte quer über das Objekt hinweg, die zu der optischen Achse im Objekt- und/oder Abbildungsraum parallel sind, quasiparallel zu den Hauptstrahlen. Daher ist die Qualität einer Anregungsoptik oder einer Abbildungsoptik, bei der Telezentrie im Objektraum benutzt wird, für den Abstand eines bestimmten Objektpunktes von der Optik unempfindlich. Die Apertur einer telezentrischen Optik wird ins Unendliche abgebildet. Die Benutzung von telezentrischem Licht stellt außerdem eine gute seitliche Homogenität quer über den Lichtstrahl hinweg sicher, und die Orte, die sich in der Mitte der Anordnung befinden, sind mit denjenigen vergleichbar, die sich an dem Rand der Anordnung befinden. In der gesamten vorliegenden Erfindung umfasst eine telezentrische Optik immer eine Feldlinse. Im Zusammenhang mit dieser Erfindung ist eine Feldlinse eine einzelne Linse, die dem Objektiv am nächsten ist, welches das Sehfeld des Instrumentes bestimmt, die eine oder mehrere Komponenten (Achromat) umfasst und die in Kombination mit zusätzlichen optischen Komponenten zu der Telezentrie im Objekt- und/oder Abbildungsraum der Vorrichtung beiträgt.
Die Feldlinse der vorliegenden Erfindung überträgt Anregungslicht von der Lichtquelle zu der Anordnung einer Vielzahl einzelner Orte und überträgt Fluoreszenz-Signale von der Anordnung einer Vielzahl einzelner Orte zum Wandler. Dies schließt nicht aus, dass zusätzliche optische Komponenten in den Strahlenverlauf eingebracht werden, z.B. zwischen der Lichtquelle und der Feldlinse, zwischen der Feldlinse und dem Wandler oder zwischen der Feldlinse und der Anordnung einer Vielzahl einzelner Orte.
Ein weiterer Gesichtspunkt dieser Erfindung ist ein Echtzeit-PCR-Instrument, umfassend:

– ein erfindungsgemäßes optisches Instrument und
– Mittel zum Heizen und Kühlen eines Trägers mit einem oder mehreren Wells, von dem jeder ein Reaktionsgemisch enthält, das zu einer PCR-Reaktion in der Lage ist.

Innerhalb des Umfangs dieser Erfindung umfassen die Mittel zum Heizen und Kühlen jegliches Mittel, das in der Lage ist, die Temperatur der Anordnung einer Vielzahl einzelner Orte in einer zyklischen Weise zu steuern und zu ändern, um zyklische PCR-Amplifikation von Nukleinsäuren durchzuführen. Die Haltevorrichtung kann vorzugsweise erhitzt und gekühlt werden, wobei sie in thermischem Kontakt mit dem ebenen Träger der Anordnung einer Vielzahl einzelner Orte ist.
In der gesamten vorliegenden Erfindung fasst eine Anordnung einer Vielzahl einzelner Untersuchungen Objekte zusammen, die aus zwei oder mehr räumlich getrennten Untersuchungen zusammengesetzt sind, um eine parallele Analyse durchzuführen. Diese Untersuchungen können z.B. in Wells einer Mikrotiterplatte oder auf funktionalisierten Oberflächenbereichen eines Objektträgers aus Glas durchgeführt werden.
Überdies wird der Ausdruck Strahlenverlauf in dieser gesamten Erfindung benutzt, um alle Bereiche zusammenzufassen, die der Lichtstrahl auf seinem Weg von der Lichtquelle durch mindestens die Feldlinse zu der Anordnung einer Vielzahl einzelner Untersuchungen und von der Anordnung einer Vielzahl einzelner Untersuchungen durch mindestens die Feldlinse zu dem Wandler durchquert.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein System zum gleichzeitigen Durchführen und Überwachen einer Vielzahl von PCR-Reaktionen in Echtzeit, umfassend:

– eine Multiwell-Platte mit einer Vielzahl einzelner Orte, von denen jeder ein Reaktionsgemisch enthält, das zu einer PCR-Reaktion in der Lage ist;
– fluoreszierende DNA-Bindungseinheiten und
– ein erfindungsgemäßes Echtzeit-PCR-Instrument, umfassend ein erfindungsgemäßes optisches Instrument zur Beleuchtung der gesamten Multiwell-Platte mit telezentrischem Licht und Erfassung der Fluoreszenz-Signale von jedem Well der Multiwell-Platte durch einen Wandler, der so angeordnet ist, dass er empfänglich ist für die entsprechenden Fluoreszenz-Signale, um computerlesbare Primärdaten zu erzeugen.

In der gesamten Erfindung sind alle fluoreszierenden DNA-Bindungseinheiten fluoreszierende Farbstoffe oder Anordnungen fluoreszierender Farbstoffe, die dem Fachmann bekannt sind und die zur Erfassung von amplifizierter DNA benutzt werden können, nämlich z.B. doppelsträngige DNA bindende Farbstoffe, TagMan-Sonden, Molecular Beacons, Einzelmarkersonden oder FRET-Hybridisierungssonden.
Ein noch weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Amplifizieren, Erfassen und/oder Quantifizieren einer Vielzahl von DNA-Zielsequenzen, umfassend

– Bereitstellen einer Zusammensetzung oder eines Reaktionsgemisches, das in der Lage ist, PCR-Reaktionen durchzuführen,
– Behandeln des Reaktionsgemisches mit einem thermozyklischen Protokoll, sodass eine Amplifikation der Vielzahl von DNA-Zielsequenzen stattfinden kann, und
– Überwachen des Vorhandenseins und der Anzahl von jeder DNA-Sequenz mindestens einmal nach mehreren Amplifikationszyklen unter Benutzung von fluoreszierenden DNA-Bindungseinheiten und eines erfindungsgemäßen Echtzeit-PCR-Instruments.

Die Zusammensetzung oder das Reaktionsgemisch, die/das in der Lage ist, PCR-Reaktionen durchzuführen, umfasst in dieser gesamten Erfindung Puffer, Nukleotide, Enzyme, Primer und die fluoreszierenden DNA-Bindungseinheiten.
Ein thermozyklisches Protokoll ist das Protokoll, das die chronologische Temperaturbehandlung der PCR-Zusammensetzung, die Schmelz- und Anlagerungstemperaturen, die Anzahl von Amplifikationszyklen sowie die Zeit zum Heizen und Kühlen definiert.
Beschreibung der Figuren
1 Schematische Darstellung einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen optischen Instrumentes
2 Schematische Darstellung einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen optischen Instrumentes.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Ein Gesichtspunkt der Erfindung ist ein optisches Instrument zum Abbilden von Fluoreszenz-Signalen von einer Vielzahl einzelner Orte, umfassend:

– eine Haltevorrichtung zum Halten eines ebenen Trägers mit einer Anordnung einer Vielzahl einzelner Orte,
– mindestens eine Lichtquelle zum Ausstrahlen von Licht, umfassend mindestens eine Anregungsfrequenz,
– einen Wandler, so angeordnet, dass er Fluoreszenz-Signale von der Anordnung einer Vielzahl einzelner Orte empfängt, wobei der Wandler so angeordnet ist, dass er computerlesbare Primärdaten erzeugt,
– eine Feldlinse, so angeordnet, dass Anregungslicht von der Lichtquelle zu der Anordnung einer Vielzahl einzelner Orte und Fluoreszenz-Signale von der Anordnung einer Vielzahl einzelner Orte zum Wandler übertragen wird,
– eine Anregungslinsenanordnung, so angeordnet, dass Anregungslicht von der Lichtquelle zur Feldlinse übertragen wird, und
– eine Abbildungslinsenanordnung, so angeordnet, dass Fluoreszenz-Signale von der Feldlinse zum Wandler übertragen werden,

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Dem Fachmann ist eine große Anzahl von Instrumenten bekannt, die in der Lage sind, Fluoreszenz-Signale abzubilden. Wenn das optische Instrument in der Lage sein soll, die Fluoreszenz-Signale einer Anordnung einer Vielzahl einzelner Orte, z.B. der Wells einer Mikrotiterplatte oder der Stellen eines Mikrorasters, gleichzeitig abzubilden, muss sichergestellt werden, dass die Anregung der Farbstoffe und die Abbildung der Fluoreszenz-Signale im Zentrum der Anordnung und am Rand der Anordnung vergleichbar sind. Zudem ist die Ausrichtung des ebenen Trägers, selbst wenn die Erfordernis einer homogenen Intensitätsverteilung quer über den Lichtstrahl hinweg erfüllt ist, dennoch von Bedeutung, um sicherzustellen, dass sich der Träger als Gesamtheit in der Brennebene der Abbildungsoptik sowie der Anregungsoptik befindet. Zusätzlich treten einige besondere Probleme auf, wenn der Träger eine Tiefe aufweist, wie in dem Fall von Mikrotiterplatten.
Eine Lösung für die oben genannten Probleme ist die Benutzung telezentrischer Optiken. In einer telezentrischen Optik befindet sich die Brennebene im Unendlichen, und der Hauptstrahl, der von jedem Objektpunkt ausgeht, ist zu der optischen Achse parallel. Infolgedessen werden alle Objektpunkte innerhalb eines begrenzten Sehfeldes mit der gleichen Perspektive und der gleichen Intensität beobachtet, mit anderen Worten: die telezentrische Optik weist eine große Feldtiefe und ein homogenes Anregungs- oder Abbildungsprofil auf.
Eine telezentrische Optik kann durch ihre numerische Apertur (NA) gekennzeichnet werden, die so klein wie möglich sein sollte, um eine große Tiefenschärfe zu verwirklichen: NA = n·sin A,wobei n der Brechungsindex des Mediums und A der Aperturwinkel ist. Eine große Tiefenschärfe ist von äußerster Wichtigkeit, wenn die Anordnung einzelner Orte eine bestimmte Tiefe aufweist, wie in dem Fall von Mikrotiterplatten.
Zum Entwerfen eines optischen Instrumentes zur telezentrischen Anregung einer seitlichen Verteilung von Orten und zum telezentrischen Abbilden von Fluoreszenz-Signalen von diesen Orten müssen mehrere Gesichtspunkte berücksichtigt werden. Unter dem Gesichtspunkt der Tiefenschärfe allein sollte der NA-Wert so klein wie möglich sein. Andererseits entspricht ein kleiner NA-Wert für die Abbildungsoptik einer schlechten Abbildungsauflösung und ein kleiner NA-Wert für die Anregungsoptik einer Verschwendung von Beleuchtungsenergie zur Anregung.
Wenn das telezentrische optische Instrument für einen gesamten Bereich von Frequenzen anwendbar sein soll, muss die Optik auch achromatisch sein. Für die Fluoreszenzabbildung selbst müssen sogar noch mehr Anforderungen berücksichtigt werden, da das Fluoreszenzabbilden den richtigen Maßstab für die richtige Wiedergabe der seitlichen Verteilung von Orten auf dem Wandler aufweisen muss. Außerdem müssen Abbildungsfehler wie sphärische oder chromatische Aberration, Koma, Astigmatismus oder Bildfeldwölbung beherrscht werden.
Es gibt verschiedene Weisen, telezentrische Optiken zu erzeugen. Im Allgemeinen ist eine telezentrische Optik eine Linsenkonstruktion mit mehreren Elementen, in der mehr als eine Linse nacheinander in dem Strahlenverlauf angeordnet sind. Eine telezentrische Optik kann als telezentrisch in der Objektebene oder als telezentrisch in der Bildebene oder als telezentrisch in beiden Ebenen, eine so genannte beidseitig telezentrische Optik, hergestellt werden. Überdies ist es möglich, ein Objekt mit telezentrischem Licht zu beleuchten und/oder ein Objekt in einer telezentrischen Weise zu überwachen. Im Allgemeinen ist es ausreichend, eine Optik mit Telezentrie in der Objektebene bereitzustellen, da dies bereits eine homogene Beleuchtung des gesamten Objekts, seitlich sowie in der dritten Dimension, und die präzise Sammlung von Licht, das von dem Objekt ausgestrahlt wird, sicherstellt.
Vom Stand der Technik her sind Instrumente bekannt, bei denen telezentrische Optiken zum Abbilden von Fluoreszenz-Signalen benutzt werden, jedoch wird die Anregung üblicherweise in einer nichttelezentrischen Weise z.B. durch Beleuchtung von hinten, schräge Beleuchtung oder durch ein Evaneszenzfeld erfolgen. In dieser gesamten Erfindung erfolgen sowohl die Anregung der Vielzahl einzelner Orte sowie das Abbilden der Fluoreszenz-Signale von der Vielzahl einzelner Orte in einer telezentrischen Weise.
1 und 2 zeigen schematische Darstellungen von zwei optischen Instrumenten gemäß bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, die im Folgenden in Einzelheiten erläutert sind.
Ein zentrales Teil aller telezentrischen Optiken ist die Feldlinse. Diese Linse ist dem Objekt am nächsten und bestimmt den Durchmesser des Sehfeldes des Instruments. Daher nimmt der Durchmesser dieser Linse gewöhnlich zu, wenn die Anordnung einer Vielzahl einzelner Orte über einen großen Bereich verteilt ist. Feldlinsen gibt es als Singuletts (eine einzelne Linse) oder als Achromaten, die z.B. zwei Linsen umfassen, die zusammengeklebt sind. Eine spezielle Feldlinse, die für diese Erfindung benutzt werden kann, ist eine Fresnel-Linse. Eine Fresnel-Linse weist eine spezielle komplexe Wölbung mit einer Vielzahl spitz zulaufender Zonen auf mindestens einer optisch wirksamen Oberfläche auf, welche die gleichen telezentrischen Eigenschaften wie eine Feldlinse bereitstellt. In den meisten Fällen weisen Fresnel-Linsen nur eine Oberfläche mit einer Vielzahl spitz zulaufender Zonen auf, die von einer ebenen Oberfläche getragen wird, die lotrecht zu der optischen Achse ist, und sind daher im Vergleich zu normalen Feldlinsen dünner. In besonderen Fällen werden Fresnel-Linsen bereitgestellt, die außerdem eine gewölbte tragende Oberfläche oder eine Vielzahl spitz zulaufender Zonen auf beiden Seiten der Linse aufweisen. Außerdem sind Fresnel-Linsen bisweilen aus Kunststoff hergestellt und können daher billiger als die großen Feldlinsen sein, die aus Glas hergestellt sind. Andererseits ist jedoch die Abbildungsqualität, insbesondere hinsichtlich Kontrast und Übersprechen, dieser Fresnel-Linsen im Vergleich zu normalen Feldlinsen aufgrund der Lichtstreuung an diesen Punkten der Linse mit diskontinuierlicher Wölbung geringer.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße optische Instrument ferner einen Strahlteiler 7, der für mindestens eine Anregungsfrequenz transparent und für die Frequenzen der Fluoreszenz-Signale reflektierend ist, oder einen Strahlteiler, der für mindestens eine Anregungsfrequenz reflektierend und für die Frequenzen der Fluoreszenz-Signale transparent ist.
Ein Strahlteiler ist normalerweise ein dichroitischer Spiegel, der Licht in Abhängigkeit von seiner Wellenlänge durchlässt oder reflektiert und der daher benutzt werden kann, um zwei Komponenten eines Lichtstrahles in verschiedene Raumrichtungen aufzutrennen. Solche dichroitischen Spiegel können aus Glas oder Kunststoff, falls erforderlich mit bestimmten optisch aktiven Beschichtungen, hergestellt werden. Es gibt sie in Form von dünnen Folien oder Prismen.
Zur Anwendung in einem optischen Instrument zum Abbilden von Fluoreszenz-Signalen muss dieser dichroitische Spiegel für das Anregungslicht reflektierend und für das Fluoreszenzlicht transparent sein (2) oder umgekehrt (1). Die Zerlegung des Lichtes, das von der Lichtquelle ausgestrahlt wird, in einen Lichtstrahl, der die eine oder mehreren Anregungsfrequenzen enthält, und in einen Lichtstrahl mit den anderen Frequenzen hilft sicherzustellen, dass die Fluoreszenzfarbstoffe nicht durch kurze Wellenlängen zerstört werden und dass unerwünschte Hintergrundstrahlung durch z.B. Anregung des Trägers verringert wird. Die Zerlegung des Lichtes von der Vielzahl einzelner Orte in eine Komponente, welche die mindestens eine Anregungsfrequenz enthält, von der Komponente, welche die Fluoreszenz-Signale enthält, verhindert, dass die Reflexion des Anregungslichtes mit seiner hohen Intensität auf den Wandler trifft. Dies verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis drastisch.
In einer weiteren anderen bevorzugten Variante der Erfindung erzeugt die Feldlinse einen Anregungslichtstrahl, der zum Träger der Anordnung einer Vielzahl einzelner Orte lotrecht ist.
Der Anregungslichtstrahl, der lotrecht zum Träger der Anordnung einer Vielzahl einzelner Orte ist, erzeugt einen Reflexionsstrahl, der ebenfalls lotrecht zum Träger der Anordnung ist. Aufgrund des Strahlteilers wird dieser Reflexionsstrahl jedoch von den Fluoreszenz-Signalen getrennt und trifft nicht auf den Wandler. Im Falle von z.B. einer Multititerplatte als der Anordnung einer Vielzahl einzelner Orte weist der lotrechte Anregungslichtstrahl den Vorteil auf, dass er in der Lage ist, in die Tiefe der Wells einzudringen. Andererseits würden, wenn ein Anregungsstrahl den Träger unter einem Einfallswinkel von größer als 0° erreicht, die Wände der Wells die vollständige Beleuchtung des Inneren des Wells behindern, und nur ein Bruchteil der Fluoreszenzfarbstoffe kann angeregt werden. Wenn ein schräger Anregungsstrahl benutzt wird, hängt zudem das Ausmaß der Fluoreszenzfarbstoff-Anregung innerhalb der Wells von dem Füllstand ab.
In einer anderen weiteren bevorzugten Variante umfasst das erfindungsgemäße optische Instrument ferner ein Anregungsfiltersystem 8, das in der Lage ist, mindestens eine Anregungsfrequenz von der Lichtquelle zu der Anordnung einer Vielzahl einzelner Orte zu übertragen, während es eine Vielzahl anderer Frequenzen blockiert.
Solch ein zusätzliches Anregungsfiltersystem kann bestimmte Frequenzen von der Lichtquelle noch vor dem Strahlteiler blockieren. Dies kann erforderlich sein, wenn die Lichtquelle Licht mit Frequenzen umfasst, die von dem Strahlteiler nicht von den Anregungsfrequenzen getrennt werden können. Ein geeignetes Anregungsfiltersystem ist z.B. ein so genanntes Filterrad, das eine bestimmte Anzahl einzelner Filter umfasst, die unterschiedliche optische Eigenschaften aufweisen. Die Benutzung solch eines Filterrades stellt ein einfaches Mittel zum Ändern der Anregungsfrequenzen bereit. Ein spezielles Anregungsfiltersystem ist z.B. ein Filter, das Infrarot-(IR)-Frequenzen oder Ultraviolett-(UV)-Licht absorbiert. Solch ein spezielles Anregungsfiltersystem kann in Form einer separaten optischen Komponente, wie z.B. eines Dünnschichtfilters, oder in Form einer optisch aktiven Beschichtung auf anderen optischen Komponenten der Vorrichtung verwirklicht sein.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße optische Instrument ferner ein Abbildungsfiltersystem 9, das in der Lage ist, die Fluoreszenz-Signale von der Anordnung einer Vielzahl einzelner Orte zum Wandler zu übertragen, wohingegen es Licht mit den Anregungsfrequenzen blockiert.
Solch ein zusätzliches Abbildungsfiltersystem kann bestimmte Frequenzen, die an der Vielzahl einzelner Orte erzeugt werden, oder von der Anregungsreflexion noch nach dem Strahlteiler blockieren. Dies kann erforderlich sein, wenn Licht mit Frequenzen, die von dem Strahlteiler nicht von den Anregungsfrequenzen getrennt werden können, an der Vielzahl einzelner Orte erzeugt wird. Wiederum ist ein Filterrad, das unterschiedliche Filter enthält, ein geeignetes Abbildungsfiltersystem. Analog dem Fall eines Anregungsfiltersystems kann ein spezielles Abbildungsfiltersystem beispielsweise ein Infrarot-(IR)-Filter oder ein Ultraviolett-(UV)-Filter sein. Die speziellen Abbildungsfiltersysteme können in Form einer separaten optischen Komponente, wie z.B. eines Dünnschichtfilters, oder in Form einer optisch aktiven Beschichtung auf anderen optischen Komponenten der Vorrichtung verwirklicht sein. Ein weiteres Abbildungsfiltersystem ist ein Filtersystem, dass die Erfassung von gestreutem Licht durch den Detektor verhindert.
Wie oben erwähnt, umfasst das erfindungsgemäße optische Instrument eine Anregungslinsenanordnung 10, wobei die Anregungslinsenanordnung Licht von der Lichtquelle 4 zur Feldlinse 6 überträgt.
Dies bedeutet, dass das Licht von der Lichtquelle unter Benutzung einer Anregungsoptik, welche die Feldlinse 6 und eine Anregungslinsenanordnung 10 umfasst, auf die Anordnung einer Vielzahl einzelner Orte abgebildet wird. Die Anregungsoptik stellt auf der Objektseite der Feldlinse 6 ein telezentrisches Anregungslicht bereit und ist daher eine telezentrische Anregungsoptik. Die Anregungslinsenanordnung umfasst mindestens eine Linse, vorzugsweise mindestens drei Linsen, um die Apertur der Anregung auf bessere Nutzung der Lichtquellenleistung zu vergrößern. Wenn die Anzahl von Linsen geringer sein soll, kann die Anregungslinsenanordnung eine Asphäre umfassen. Vorzugsweise ist die telezentrische Anregungsoptik so gestaltet, dass sie achromatisch ist, um unabhängig von der Anregungswellenlänge eine homogene Intensitätsverteilung quer über die Anordnung einer Vielzahl einzelner Orte hinweg zu verwirklichen.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung strahlt die Lichtquelle Licht aus, das eine Vielzahl von Frequenzen umfasst, wobei die Lichtquelle vorzugsweise eine Weißlichtquelle, am stärksten bevorzugt eine Gasentladungslampe, wie z.B. eine Xenonlampe oder eine Quecksilberlampe, oder eine Filamentlampe, wie z.B. eine Wolframlampe, ist.
In einer noch anderen Ausführungsform der Erfindung strahlt die Lichtquelle Licht mit einer einzigen Frequenz aus, wobei die Lichtquelle vorzugsweise ein Laser, am stärksten bevorzugt eine LED ist.
Die Benutzung einer Lichtquelle, die Licht mit unterschiedlichen Frequenzen ausstrahlt, weist den Vorteil auf, dass diese Lichtquelle durch bloßes Austauschen des Filtersatzes, der aus dem Strahlteiler und, falls notwendig, dem Anregungsfiltersystem und/oder dem Abbildungsfiltersystem zusammengesetzt ist, für verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe benutzt werden kann. Vorzugsweise werden als Anregungsfiltersystem und/oder Abbildungsfiltersystem Filterräder benutzt, die eine bestimmte Anzahl von Filtern enthalten, um in einfacher Weise von einem Fluoreszenzfarbstoff zu einem anderen zu schalten. Wenn die Lichtquelle Licht mit nur einer einzigen Frequenz ausstrahlt, können andererseits die Anforderungen an den Filtersatz leicht erfüllt werden; allerdings ist das optische Instrument auf eine begrenzte Anzahl von Fluoreszenzfarbstoffen festgelegt.
In einer Ausführungsform der Erfindung weist das Lichtquellenfenster eine optisch aktive Beschichtung auf, die als ein spezielles Anregungsfiltersystem wirkt, um IR- und/oder UV-Licht zu absorbieren.
In einer weiteren bevorzugten Variante der Erfindung umfasst die Lichtquelle eine Kombination von mehr als einem Leuchtmittel, vorzugsweise mehr als einen Laser, am stärksten bevorzugt mehr als eine LED.
In dieser bevorzugten Ausführungsform wird eine Anordnung von unterschiedlichen Leuchtmitteln benutzt, um ein erfindungsgemäßes optisches Instrument mit mehr als einer Anregungsfrequenz bereitzustellen. Eine erfindungsgemäße Ausführungsform mit zwei unterschiedlichen Lichtquellen ist in 2 gezeigt, wobei jede Lichtquelle ihr eigenes Anregungsfiltersystem 8, eine Anregungslinsenanordnung 10 und einen Strahlteiler 7 aufweist.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Variante umfasst die Lichtquelle ferner eine Vorrichtung zum Auswählen eines oder mehrerer der Leuchtmittel.
Eine Vorrichtung zum Auswählen eines der Leuchtmittel kann auf unterschiedliche Weisen verwirklicht werden. Eine Möglichkeit ist es, drehbare Spiegel zum Einführen des Lichtes eines ausgewählten Leuchtmittels in den Strahlengang zu benutzen. Eine andere Möglichkeit ist es, die Anordnung von Leuchtmitteln zu bewegen, um das Licht eines ausgewählten Leuchtmittels in den Strahlengang einzuführen.
Die erfindungsgemäße telezentrische Anregungsoptik kann außer der Feldlinse 6, dem Anregungsfiltersystem 8, der Anregungslinsenanordnung 10 und dem Strahlteiler 7 mehrere zusätzliche Komponenten umfassen. In einer Ausführungsform umfasst die telezentrische Anregungsoptik zusätzlich einen Lichtleiter, und Licht von der Lichtquelle wird mit diesem Lichtleiter gekoppelt, um das Licht von der Lichtquelle zu den optischen Komponenten des optischen Systems zu übertragen. Bei Benutzung eines Lichtleiters ist es möglich, Licht von unterschiedlichen Lichtquellen zu koppeln und dieses kombinierte Licht gleichzeitig zu den optischen Komponenten zu übertragen. Alle Arten von Lichtleitern sind zum Zwecke der vorliegenden Erfindung anwendbar. Mögliche Lichtleiter sind beispielsweise fluide Lichtleiter, Faser-Lichtleiter oder Bündel von Faser-Lichtleitern. In einer Ausführungsform der Erfindung weisen ein oder beide Enden des Lichtleiters eine optisch aktive Beschichtung auf, die als ein spezielles Anregungsfiltersystem zum Absorbieren von IR- und/oder W-Licht wirkt.
In einer noch anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform umfasst die telezentrische Anregungsoptik ferner einen Lichtmischer zum Mischen von Licht von der Lichtquelle und zum Abbilden der beleuchteten Oberfläche des Lichtmischers auf die Anordnung einer Vielzahl einzelner Orte.
Ein Lichtmischer ist eine Vorrichtung mit einer sehr homogen beleuchteten Oberfläche, die als eine Lichtquelle benutzt werden kann, die Licht mit einer homogenen Intensitätsverteilung über den gesamten Querschnitt bereitstellt. Ein Lichtmischer ist eine längliche Einheit, die aus optisch transparentem Material hergestellt ist, wobei die Ränder der Einheit parallel zum Strahlengang sind. Mit anderen Worten: ein Lichtmischer ist eine Art von optischer Faser. Licht, das in diesen Lichtmischer eingeführt wird, erfährt eine Vielzahl von Totalreflexionen an der inneren Grenzfläche des optisch transparenten Materials, wobei ein Querschnittsbereich an dem einen Ende der Faser erzeugt wird, der sehr homogen beleuchtet wird. Die Totalreflexionen an der inneren Grenzfläche des optisch transparenten Materials basieren einfach auf der Änderung des Brechungsindexes an der Grenzfläche oder können durch eine reflektierende Beschichtung erhalten werden. Das Verhältnis von der Länge des Lichtmischers zu seiner Querschnittsfläche ist wichtig für die Beleuchtungshomogenität. Das Verhältnis ist vorzugsweise größer als 2.
Das Licht von der Lichtquelle, insbesondere von der Querschnittsfläche an dem einen Ende des Lichtmischers, wird unter Benutzung der telezentrischen Anregungsoptik, umfassend die Feldlinse 6 und eine Anregungslinsenanordnung 10, auf die Anordnung einer Vielzahl einzelner Orte abgebildet. Daher erfolgt in dieser Ausführungsform der Erfindung die Anregung der Vielzahl einzelner Orte mit einer Anregungsoptik, die auf der Objektseite der Feldlinse 6 telezentrisch ist.
Das erfindungsgemäße optische Instrument ist auch an das Abbilden von Chemilumineszenz und Biolumineszenz anpassungsfähig. Da in diesen Fällen kein Anregungslicht benötigt wird, können die Lichtquelle 4, die Anregungslinsenanordnung 10 und das Anregungsfiltersystem 8 weggelassen werden.
In einer weiteren bevorzugten Variante umfasst das erfindungsgemäße optische Instrument ferner eine Lichtstrahl-Umlenkeinheit, die einen, zwei oder mehr Umlenkspiegel enthält, wobei die Umlenkeinheit Licht von der Lichtquelle und Fluoreszenz-Signale von der Anordnung einer Vielzahl einzelner Orte umlenkt.
Innerhalb des Umfangs dieser Erfindung ist eine Lichtstrahl-Umlenkeinheit eine Einheit, die einen langen Strahlengang bereitstellt, während sie gleichzeitig nur einen begrenzten Raum benötigt. Um die numerische Apertur von der Anregungsoptik einzustellen, ist ein Parameter, der modifiziert werden kann, der Strahlengang, den das Licht durchqueren muss.
Vergrößern des Strahlengangs verringert die numerische Apertur. Wenn eine kleine Apertur erwünscht ist, um die Anforderungen an die Feldtiefe und homogene Intensitätsverteilung zu erfüllen, wird daher der Strahlengang lang sein. Da große Instrumente nicht geeignet sind, können die Umlenkspiegel benutzt werden, um einen langen Strahlengang zu verwirklichen und gleichzeitig die Instrumentgröße zu begrenzen.
Wie schon erwähnt, umfasst das erfindungsgemäße optische Instrument eine Abbildungslinsenanordnung 11, wobei die Abbildungslinsenanordnung 11 Licht von der Feldlinse 6 zum Wandler 5 überträgt.
Dies bedeutet, dass die Fluoreszenz-Signale, die an der Anordnung einer Vielzahl einzelner Orte erzeugt werden, mittels einer telezentrischen Abbildungsoptik, welche die Feldlinse 6 und eine Abbildungslinsenanordnung 11 umfasst, auf einen Wandler 5 abgebildet werden. In anderen Ausführungsformen der Erfindung umfasst die telezentrische Abbildungsoptik ferner z.B. eine Lichtstrahl-Umlenkeinheit und/oder spezielle Abbildungsfiltersysteme 9.
Die telezentrische Abbildungsoptik muss auf die Größe des Wandlers und auf die Raumgröße der Anordnung einer Vielzahl einzelner Orte hin optimiert werden. Wie in dem Fall der Anregungslinsenanordnung 10 umfasst die Abbildungslinsenanordnung 11 mindestens eine Linse, vorzugsweise eine Anordnung von mindestens 5 Linsen. Eine große Anzahl von Linsen ist für die Abbildungslinsenanordnung notwendig, da im Vergleich zu der Anregungsoptik an die Abbildungsoptik noch größere Anforderungen gestellt sind. Die Fluoreszenzabbildung muss den richtigen Maßstab für die richtige Wiedergabe der seitlichen Verteilung von Orten auf dem Wandler aufweisen. Außerdem müssen Abbildungsfehler wie sphärische oder chromatische Aberration, Koma, Astigmatismus, spezieller Fehler oder Bildfeldwölbung beherrscht werden. Aufgrund der Abbildung der Fluoreszenz-Signale auf den Wandler wird das Fluoreszenzabbilden mit einer Abbildungsoptik durchgeführt, die nur auf der Objektseite der Feldlinse 6 telezentrisch ist.
In einer weiteren bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen optischen Instrumentes ist die Abbildungslinsenanordnung 11 unter Bildung der Abbildungseinheit 12 mit dem Wandler 5 gekoppelt.
Es ist zu beachten, dass sich die telezentrische Abbildungsoptik in dieser bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung von Standardobjektiven, wobei alle Linsen in einer definierten Weise angeordnet und befestigt sind und das Objektiv bilden und dieses Objektiv als eine Gesamtheit zwischen dem Wandler und dem Objekt angeordnet wird, unterscheidet. Ganz im Gegenteil dazu ist in dieser bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Abbildungslinsenanordnung 11 unter Bildung einer Abbildungseinheit 12 mit dem Wandler 5 gekoppelt. Zur Erfüllung der Anforderungen hinsichtlich der Abbildungsauflösung und -präzision ist das Positionieren der Abbildungslinsenanordnung und des Wandlers von besonderer Bedeutung. In dieser Ausführungsform sind diese Anforderungen durch Optimieren der Position zwischen der Abbildungslinsenanordnung und dem Wandler, bevor in der optimierten Position befestigt wird, erfüllt. Die Kopplung der Abbildungslinsenanordnung mit dem Wandler wird während der gesamten beabsichtigten Benutzung beibehalten und wird nur gelöst, wenn ein erneutes Optimieren der Position notwendig wird.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen optischen Instrumentes umfasst der Wandler eine Halbleitervorrichtung oder vorzugsweise ein ladungsgekoppeltes Bauteil.
Im Zusammenhang mit dieser Erfindung ist ein Wandler eine Vorrichtung, die in der Lage ist, Licht in elektrische Signale umzuwandeln, die von einem Computer verarbeitet werden können. Dies kann mittels Halbleitervorrichtungen mit einer Bandlücke erfolgen, die kleiner als die Energie ist, die den zu erfassenden Fluoreszenz-Signalen entspricht. Die Elektronen, die durch Beleuchtung der Vorrichtung in dem Leitungsband des Halbleiters erzeugt werden, erzeugen ein messbares Signal, das in computerlesbare Daten übersetzt werden kann. Beispiele für diese Halbleitervorrichtungen sind Photodioden oder ein ladungsgekoppeltes Bauteil (CCD).
Eine weitere bevorzugte Variante des erfindungsgemäßen optischen Instrumentes ist ein optisches Instrument, wobei die einzelnen Orte der Anordnung Wells sind, das Anregungslicht parallel zu den Seitenwänden der Wells ist und die Lösungen, welche die Wells füllen, fluoreszierende Farbstoffe umfassen.
Ein Beispiel für diese weitere bevorzugte Variante des optischen Instrumentes ist eine Vorrichtung zum gleichzeitigen Überwachen von PCR-(Polymerasekettenreaktion)-Amplifikationen, die in den einzelnen Wells einer Mikrotiterplatte stattfinden. Das Anregungslicht ist parallel zu den Seitenwänden der Wells, um unabhängig von der Füllhöhe der Wells den gesamten Innenraum der Wells zu beleuchten. Da eine telezentrische Optik sowohl für die Anregung als auch für die Fluoreszenzabbildung benutzt wird, sind die Ergebnisse von einem Well im Zentrum der Platte denjenigen von Wells an dem Rand der Platte vergleichbar.
Im Falle von PCR-Amplifikationen, die in einzelnen Wells durchgeführt werden, sind als fluoreszierende Farbstoffe alle Fluoreszenzeinheiten anwendbar, die sich spezifisch an doppelsträngige Nukleinsäuren binden. Im Zusammenhang mit dieser Erfindung werden die fluoreszierenden Farbstoffe fluoreszierende DNA-Bindungseinheiten genannt, wobei die fluoreszierende DNA-Bindungseinheit ein Molekül oder ein Paar von Molekülen ist, das ein charakteristisches Fluoreszenzlicht erzeugt, wenn es an eine doppelsträngige DNA gebunden ist. In dem Gebiet der Echtzeit-PCR-Überwachung sind die folgenden Erfassungsformate bekannt: DNA-Bindungsfarbstoff-Format (z.B. SybrGreen I), TagMan-Sonden, Molecular Beacons, Einzelmarkersonden-(SLP)-Format oder FRET-Hybridisierungssonden.
Eine ebenfalls bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen optischen Instrumentes ist ein optisches Instrument, wobei die einzelnen Orte der Anordnung Stellen auf einem ebenen Träger sind und die fluoreszierenden Farbstoffe an diesen Stellen befestigt sind.
Ein Beispiel für diese bevorzugte Ausführungsform des optischen Instrumentes ist eine Vorrichtung zur gleichzeitigen Abbildung von Fluoreszenz-Signalen von verschiedenen Stellen eines ebenen Rasters. In einer spezifischen Ausführungsform ist solch ein Raster ein DNA-Raster, in dem seitliche begrenzte Flächen mit DNA-Sonden mit unterschiedlichen Sequenzen funktionalisiert sind. In diesem Fall können mit dem erfindungsgemäßen optischen Instrument Hybridisierungsereignisse bei Proben überwacht werden, die Nukleinsäuren enthalten, wenn z.B. der komplementäre DNA-Strang mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist. Alternativ zum Markieren der DNA-Moleküle in der Probe können die Hybridisierungsereignisse auch durch doppelsträngige Nukleinsäure bindende Fluoreszenzfarbstoffe sichtbar gemacht werden.
Die Erfindung betrifft auch ein Echtzeit-PCR-Instrument, umfassend:

– ein erfindungsgemäßes optisches Instrument und
– Mittel zum Heizen und Kühlen eines Trägers mit einem oder mehreren Wells, von denen jeder ein Reaktionsgemisch enthält, das in der Lage ist, eine PCR-Reaktion durchzuführen.

Innerhalb des Umfangs dieser Erfindung umfassen die Mittel zum Heizen und Kühlen jegliche Mittel, die in der Lage sind, die Temperatur der Anordnung einer Vielzahl einzelner Orte in einer zyklischen Weise zu steuern und zu ändern, um zyklische PCR-Amplifikation von Nukleinsäuren durchzuführen. Jeder PCR-Zyklus umfasst mehrere unterschiedliche Schritte: einen Anlagerungsschritt mit abnehmender Temperatur, einen enzymatischen Amplifikationsschritt bei verhältnismäßig niedrigen Temperaturen zusammen mit einem Erfassungsschritt unter Benutzung von fluoreszierenden Farbstoffen und einen Schmelzschritt bei hohen Temperaturen.
In der gesamten vorliegenden Erfindung fasst eine Anordnung einer Vielzahl einzelner Untersuchungen Objekte zusammen, die aus zwei oder mehr räumlich getrennten Untersuchungen zusammengesetzt sind, um eine parallele Analyse durchzuführen. Diese Untersuchungen können z.B. in Wells einer Mikrotiterplatte oder auf funktionalisierten Oberflächenbereichen eines Objektträgers aus Glas durchgeführt werden. In der Mehrzahl der Fälle wird die Anordnung einer Vielzahl einzelner Untersuchungen in einer gleichförmigen Weise angeordnet sein und jede Untersuchung einen unterschiedlichen Inhalt aufweisen, um Multiplex-Analyse durchzuführen. Im Falle von DNA-Mikrorastern ist jede Stelle des Rasters mit einem Oligomer funktionalisiert, das eine bestimmte Sequenz aufweist, wohingegen im Falle von Immuntests jede Stelle des Rasters mit z.B. Proteinen funktionalisiert ist, die unterschiedliche Affinitäten aufweisen. Im Falle von Mikrotiterplatten wird in jedem Well z.B. eine andere PCR durchgeführt.
Ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung betrifft ein System zum gleichzeitigen Durchführen und Überwachen einer Vielzahl von PCR-Reaktionen in Echtzeit, umfassend

– eine Multiwell-Platte mit einer Vielzahl einzelner Orte, von denen jeder ein Reaktionsgemisch enthält, das zu einer PCR-Reaktion in der Lage ist,
– fluoreszierende DNA-Bindungseinheiten und
– ein Echtzeit-PCR-Instrument, umfassend ein erfindungsgemäßes optisches Instrument zur Beleuchtung der gesamten Multiwell-Platte mit telezentrischem Licht und Erfassung der Fluoreszenz-Signale von jedem Well der Multiwell-Platte durch einen Wandler, der so angeordnet ist, dass er empfänglich ist für die entsprechenden Fluoreszenz-Signale, um computerlesbare Primärdaten zu erzeugen.

Allgemein gibt es unterschiedliche Formate von fluoreszierenden DNA-Bindungseinheiten zur Echtzeit-Erfassung von amplifizierter DNA, von denen die folgenden im Fachgebiet gut bekannt und gebräuchlich sind:
a) DNA-Bindungsfarbstoff-Format
Da die Menge an doppelsträngigem Amplifikationsprodukt gewöhnlich größer ist als die Menge an Nukleinsäure, die in der zu analysierenden Probe ursprünglich vorhanden ist, können für doppelsträngige DNA spezifische Farbstoffe benutzt werden, die nach Anregung mit einer geeigneten Wellenlänge verstärkte Fluoreszenz nur dann zeigen, wenn sie an doppelsträngiger DNA gebunden sind. Vorzugsweise können nur diejenigen Farbstoffe benutzt werden, die wie beispielsweise SybrGreen I die Effizienz der PCR-Reaktion nicht beeinträchtigen.
Alle anderen Formate, die im Fachgebiet bekannt sind, erfordern das Entwerfen einer fluoreszenzmarkierten Hybridisierungssonde, die erst nach dem Binden an ihre Ziel-Nukleinsäure Fluoreszenz ausstrahlt.
b) TagMan-Sonde
Eine einsträngige Hybridisierungssonde wird mit zwei Komponenten markiert. Wenn die erste Komponente mit Licht einer geeigneten Wellenlänge angeregt wird, wird die absorbierte Energie gemäß dem Prinzip des Fluoreszenzresonanz-Energietransfers auf die zweite Komponente, den so genannten Quencher, übertragen. Während des Anlagerungsschrittes der PCR-Reaktion bindet die Hybridisierungssonde an die Ziel-DNA und wird während der nachfolgenden Verlängerungsphase durch die 5'-3'-Exonuclease-Aktivität der Taq-Polymerase abgebaut. Infolgedessen werden die angeregte fluoreszierende Komponente und der Quencher räumlich voneinander getrennt, und somit kann eine Fluoreszenzausstrahlung der ersten Komponente gemessen werden ( US 5,538,848 ).
c) Molecular Beacons
Diese Hybridisierungssonden werden ebenfalls mit einer ersten Komponente und einem Quencher markiert, wobei sich der Marker vorzugsweise an beiden Enden der Sonde befindet. Infolge der Sekundärstruktur der Sonde, befinden sich beide Komponenten in Lösung in räumlicher Nachbarschaft. Nach der Hybridisierung an die Ziel-Nukleinsäuren werden beide Komponenten voneinander getrennt, sodass nach der Anregung mit Licht mit einer geeigneten Wellenlänge die Fluoreszenzausstrahlung der ersten Komponente gemessen werden kann ( US 5,118,801 ).
d) Einzelmarkersonden-(SLP)-Format
Dieses Erfassungsformat besteht aus einem einzelnen Oligonukleotid, das entweder am 5'- oder am 3'-Ende mit einem einzelnen fluoreszierenden Farbstoff markiert wird (WO 02/14 555). Zwei unterschiedliche Ausgestaltungen können zum Oligomarkieren benutzt werden: G-Quenching-Sonden und Nitroindol-Dequenching-Sonden.
In der G-Quenching-Ausführungsform wird der fluoreszierende Farbstoff an einem C am Oligo-5'- oder -3'-Ende befestigt. Die Fluoreszenz nimmt beträchtlich ab, wenn die Sonde an das Ziel hybridisiert wird, falls zwei G sich auf dem Zielstrang gegenüber C und in Position 1 neben komplementärer Oligonukleotidsonde befinden.
In der Nitroindol-Dequenching-Ausführungsform ist der fluoreszierende Farbstoff an dem 5'- oder 3'-Ende des Oligonukleotids an dem Nitroindol befestigt. Nitroindol setzt die Fluoreszenzsignalerzeugung etwas herab. Die Fluoreszenz nimmt aufgrund eines Dequenching-Effektes zu, wenn die Sonde an die Ziel-DNA hybridisiert wird.
e) FRET-Hybridisierungssonden
Das FRET-Hybridisierungssonden-Prüfungsformat ist besonders nützlich für alle Arten von homogenen Hybridisierungsuntersuchungen (Matthews, J. A., und Kricka, L. J., Anal. Biochem. 169 (1988) 1-25). Es ist durch ein Paar von zwei einsträngigen Hybridisierungssonden gekennzeichnet, die gleichzeitig benutzt werden und komplementär zu benachbarten Orten desselben Stranges der amplifizierten Ziel-Nukleinsäure sind. Beide Sonden werden mit unterschiedlichen fluoreszierenden Komponenten markiert. Wenn sie mit Licht einer geeigneten Wellenlänge angeregt wird, überträgt eine erste Komponente die absorbierte Energie gemäß dem Prinzip des Fluoreszenzresonanz-Energietransfers auf die zweite Komponente, sodass eine Fluoreszenzausstrahlung der zweiten Komponente gemessen werden kann, wenn beide Hybridisierungssonden an benachbarte Positionen des zu erfassenden Zielmoleküls binden.
Wenn die Hybridisierungssonden an die Zielsequenz angelagert werden, müssen sie sich sehr nah beieinander befinden, in einer Kopf-Schwanz-Anordnung. Gewöhnlich ist der Spalt zwischen dem markierten 3'-Ende der ersten Sonde und dem markierten 5'-Ende der zweiten Sonde so klein wie möglich, d.h. 1 bis 5 Basen. Dies ermöglicht eine enge Nachbarschaft der FRET-Donorverbindung und der FRET-Akzeptorverbindung, die typischerweise 10 bis 100 Angström beträgt.
Alternativ zum Überwachen der Zunahme der Fluoreszenz der FRET-Akzeptorkomponente ist es auch möglich, die Fluoreszenzabnahme der FRET-Donorkomponente als eine quantitative Messung des Hybridisierungsereignisses zu überwachen.
Insbesondere kann das FRET-Hybridisierungssonden-Format zur Echtzeit-PCR benutzt werden, um die amplifizierte Ziel-DNA zu erfassen. Von allen Erfassungsformaten, die im Fachgebiet der Echtzeit-PCR bekannt sind, hat sich das FRET-Hybridisierungssonden-Format als in hohem Maße empfindlich, genau und zuverlässig herausgestellt (WO 97/46 707; WO 97/46 712; WO 97/46 714). Jedoch kann das Entwerfen geeigneter FRET-Hybridisierungssonden-Sequenzen bisweilen durch die besonderen Kennzeichen der zu erfassenden Ziel-Nukleinsäuresequenz begrenzt werden.
Als eine Alternative zur Benutzung von zwei FRET-Hybridisierungssonden ist es auch möglich, einen fluoreszenzmarkierten Primer und nur eine markierte Oligonukleotidsonde zu benutzen (Bernard, P. S., et al., Anal. Biochem. 255 (1998) 101–107). Diesbezüglich kann willkürlich gewählt werden, ob der Primer mit der FRET-Donor- oder der FRET-Akzeptorverbindung markiert wird.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Amplifizieren, Erfassen und/oder Quantifizieren einer Vielzahl von DNA-Zielsequenzen, umfassend

Beispiel
Ein optisches Instrument, wie in der ausführlichen Beschreibung erläutert und in 2 veranschaulicht (mit nur einer Lichtquelle), wurde folgendermaßen konfiguriert: die telezentrische Anregungsoptik wurde zum Umgang mit Frequenzen von 450 bis 650 nm und die telezentrische Abbildungsoptik zum Umgang mit Frequenzen von 500 bis 740 nm eingerichtet. Die Lichtquelle war eine Xenonlampe, und als Wandler wurde ein gekühlter 2/3''-CCD-Chip mit 1.024 × 1.344 Bildpunkten benutzt. Das optische Instrument war zum Abbilden einer Fläche von 83 mm × 117 mm ausgelegt, sodass Mikrotiterplatten (MTP) mit 96 Wells (Abstand 9 mm; Durchmesser 5 mm) und mit 384 (Abstand 4,5 mm; Durchmesser 3 mm) benutzt werden können. Die geeignete Wellenlänge zum Anregen und Abbilden für bestimmte Fluoreszenzfarbstoffe wurde durch Filterräder eingestellt.
Die telezentrische Anregungsoptik wies eine numerische Apertur auf der Seite der Lichtquelle von 0,35 und auf der Seite der MTP von 0,014 auf. Die Lichtquelle war lotrecht zu dem CCD-Chip angeordnet, und der Anregungslichtstrahl musste auf die MTP mit einem Strahlteiler orientiert werden, der für die notwendige Anregungsfrequenz reflektierend und transparent für die anderen Frequenzen war, die in dem Licht von der Lichtquelle enthalten waren. Der Anregungslichtstrahl von dem Strahlteiler war lotrecht zu der MTP und wies eine Intensitätsschwankung quer über das Objektfeld (88 mm × 122 mm) von weniger als 10 % auf. Die Abbildungsoptik wies auf der Objektseite ebenfalls eine Apertur von 0,014 und einen Abbildungsmaßstab von –0,075 mit einem Objekt-Bild-Abstand von 800 mm auf. Dieser große Abstand wurde mittels zweier Umlenkspiegel verwirklicht. Die Abbildungsoptik wies eine Feldtiefe von +/– 3 mm auf. Der benutzte Strahlteiler war für die Fluoreszenz-Signale, die durch die Anregung in den Wells der MTP erzeugt wurden, transparent.
Referenzliste

Bernard, P. S. et al., Anal. Biochem. 255 (1998) 101–107
DE 101 31 687
DE 101 55 142
DE 102 00 499
DE 197 48 211 A1
EP 1 275 954 A2
JP 2002 014 044
Matthews, J. A. und Kricka, L. J., Anal. Biochem. 169 (1988) 1–25
US 2002/0 005 493 A1
US 2002/159 057
US 2003/0 011 772 A1
US 5,118,801
US 5,538,848
US 6,246,525 B1
US 6,498,890 B1
WO 02/14 555
WO 03/069 391
WO 97/46 707
WO 97/46 712
WO 97/46 714
WO 99/60 381 1

Claims

Optisches Instrument zur Abbildung von Fluoreszenz-Signalen von einer Vielzahl einzelner Orte umfassend: • eine Haltevorrichtung (1) zum Halten eines ebenen Trägers (2) mit einer Anordnung einer Vielzahl einzelner Orte (3); • mindestens eine Lichtquelle (4) zur Ausstrahlung von Licht umfassend mindestens eine Anregungsfrequenz; • einen Wandler (5), so angeordnet, dass er Fluoreszenz-Signale von der Anordnung einer Vielzahl einzelner Orte (3) empfängt, wobei der Wandler (5) so angeordnet ist, dass er computerlesbare Primärdaten erzeugt; • eine Feldlinse (6), so angeordnet, dass sie Anregungslicht von der Lichtquelle (4) zu der Anordnung einer Vielzahl einzelner Orte (3) und Fluoreszenz-Signale von der Anordnung einer Vielzahl einzelner Orte (3) zum Wandler (5) überträgt; • eine Anregungslinsenanordnung (10), so angeordnet, dass Anregungslicht von der Lichtquelle (4) zur Feldlinse (6) übertragen wird, und • eine Abbildungslinsenanordnung (11), so angeordnet, dass Fluoreszenz-Signale von der Feldlinse (6) zum Wandler (5) übertragen werden, wobei der Strahlenverlauf des Anregungslichts und der Strahlenverlauf der Fluoreszenz-Signale von der Vielzahl einzelner Orte auf der Objektseite der Feldlinse (6) telezentrisch sind.
Optisches Instrument nach Anspruch 1, ferner umfassend einen Strahlteiler (7), der für mindestens eine Anregungsfrequenz transparent und für die Frequenzen der Fluoreszenz-Signale reflektierend ist oder ein Strahlteiler, der für mindestens eine Anregungsfrequenz reflektierend und für die Frequenzen der Fluoreszenz-Signale transparent ist.
Optisches Instrument nach einem der Ansprüche 1–2, wobei die Abbildungslinsenanordnung (11) mit dem Wandler (5) gekoppelt ist und eine Abbildungseinheit (12) bildet.
Optisches Instrument nach einem der Ansprüche 1–3, wobei die einzelnen Orte der Anordnung Wells darstellen, das Anregungslicht mit den Seitenwänden der Wells parallel ist und die Lösung, die die Wells füllt, fluoreszierenden Farbstoffe enthält.
Optisches Instrument nach einem der Ansprüche 1–3, wobei die einzelnen Orte der Anordnung Stellen auf einem ebenen Träger sind und fluoreszierende Farbstoffe auf diesen Stellen aufgebracht sind.
Echtzeit-PCR-Instrument umfassend • ein optisches Instrument nach einem der Ansprüche 1–5; • Mittel zur Heizung und Kühlung eines Trägers mit einem oder mehreren Wells, von denen jeder ein Reaktionsgemisch enthält, das zu einer PCR-Reaktion in der Lage ist.
System zur gleichzeitigen Durchführung und Überwachung mehrerer PCR-Reaktionen in Echtzeit umfassend • eine Multiwell-Platte mit einer Vielzahl einzelner Orte, von denen jeder ein Reaktionsgemisch enthält, das zu einer PCR-Reaktion in der Lage ist; • fluoreszierende DNA-Bindungseinheiten; • ein Echtzeit-PCR-Instrument nach Anspruch 6 umfassend ein optisches Instrument nach einem der Ansprüche 1–5 zur Beleuchtung der gesamten Multiwell-Platte mit telezentrischem Licht und Erfassung der Fluoreszenz-Signale von jedem Well der Multiwell-Platte durch einen Wandler, der so angeordnet ist, dass er empfänglich ist für die entsprechenden Fluoreszenz-Signale, um computerlesbare Primärdaten zu erzeugen.
Methode zur Amplifikation, Erfassung und/oder Quantifizierung einer Vielzahl von DNA-Zielsequenzen umfassend • Bereitstellung einer Zusammensetzung oder eines Reaktionsgemisches, das in der Lage ist, PCR-Reaktionen durchzuführen; • Behandlung des Reaktionsgemisches mit einem thermozyklischen Protokoll, so dass eine Amplifikation der Vielzahl von DNA-Zielsequenzen stattfinden kann; • Überwachung des Vorhandenseins und der Anzahl von jeder DNA-Sequenz mindestens einmal nach mehreren Amplifikationszyklen unter Benutzung von fluoreszierenden DNA-Bindungseinheiten und eines Echtzeit-PCR-Instruments nach Anspruch 6.