JP3999479B2 - 光学装置 - Google Patents
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- G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
- G01N21/6458—Fluorescence microscopy
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料へ光を照射し、試料から放出される光特に蛍光を検出するための光学装置に関するものである。また、本発明は複数の波長の蛍光を同時に検出し得る光学装置に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
近年、生物学の研究において、生体機能を固定試料ではなく生きた試料を用いての研究が行なわれている。具体的には注目する特定のタンパク質分子に特異的に結合する蛍光分子を結合させ、蛍光顕微鏡を用いて分子の動きや分布を観察、解析しその機能の解明を行なうようにしている。それに加え、最近では蛍光物質の登場により発光性のタンパク質を細胞内に発現させることが可能になり、より生理的な活性が保たれた状態での観察や解析が可能になった。さらに細胞内のより高度な機能を解明するために蛍光色素を複数用い、複数の分子の動きや分布を同時に測定する試みもなされている。
【0003】
また、細胞工学(第17巻 6号の956−965頁)には、細胞を生きた状態で観察し得るようにするために、励起光の強度を極力弱くし、細胞へのダメージを少なくするようにした装置が記載されている。
【0004】
この文献に記載された装置は、励起光を弱くするために照明光学系中に減光フィルタ(NDフィルタ)が配置されている。
【0005】
このような蛍光物質の観察においてのNDフィルタの重要性や生きた細胞を観察する際のNDフィルタの濃度の適正な値については「GFPとバイオイメージング」(実験医学別冊 ポストゲノム時代の実験講座3、2000年、156頁、羊土社発行)に記載されている。
【0006】
更に、特開平8−320437号公報、特開平11−50052号公報、特開平11−223773号公報には、複数の蛍光色素を用いた場合の観察装置が開示されている。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】
前記特開平8−320437号公報に記載された装置は、複数の蛍光を同時に観察するためにダイクロイックミラーとして3重励起用もしくは4重励起用のものが使用されている。この多重励起用ダイクロイックミラーには、図17に示すような分光特性を有するものがある。このダイクロイックミラーは、図17に示す分光特性を有するダイクロイックミラーを得るために、基板を常温付近に保ったまま薄膜を蒸着するいわゆるソフトコート膜と呼ばれる方法で製作される。このソフトコート膜は、温湿度変化、耐薬品性、表面清掃時の拭き取り等の物理的衝撃に極めて弱いために、経時変化により分光特性が劣化することが多く、メンテナンスに多大な費用がかかる。
【0008】
また、特開平11−52252号公報にも、蛍光色素を多重染色した試料を観察する手法が記載されている。しかし、この公報に記載された手法は、多重励起のダイクロイックミラーを用いずに各蛍光色素を適した単独のダイクロイックミラーに切り替え可能に構成されている。そのために、複数の色素を用いた複数の分子の動きや分布を同時に観察することは不可能である。またダイクロイックミラーを保持する部材は、励起フィルタや吸収フィルタよりも複雑で大きいため高速でダイクロイックミラーを切り替える時振動が生ずる。また、複数蛍光色素を同時に観察するためには、蛍光色素の数だけダイクロイックミラーを用意しなければならず、コスト上も問題がある。さらに各ダイクロイックミラーの平行度の違いから各蛍光色素の観察像にずれを生ずる。この公報に記載されたずれを解消するための手段は極めて複雑であり、又、簡単で安価な手段によるずれの解消は困難である。
【0009】
又、特開平11−223773号公報には、対物レンズと観察光学系の光軸方向にダイクロイックミラーを複数配置し、複数の蛍光色素を同時に観察し得るようにした技術が開示されているが、この技術は、複数の光源を必要とする。
【0010】
本発明は、以上述べたような状況に鑑みなされたもので、生体の機能解明のために用いられている複数の蛍光色素の同時観察を効率よく行ない得るようにした光学装置を提供するものである。
【0011】
【課題を解決するための手段】
本発明の光学装置は、光源と、前記光源よりの照明光により試料を照明するための照明光学系と、前記照明光のうちの所定の波長域の光を選択的に透過する波長選択素子を少なくとも一つ有する第1の波長選択部材と、前記照明光を偏向させて試料へ向ける光分割器と、前記光分割器と試料との間に配置された対物レンズと、試料よりの光を対物レンズを通して光を検出する検出装置と、前記対物レンズと前記検出装置の間に配置され、前記試料から反射されあるいは放出された光のうちの所定の波長の光を選択的に透過させる波長選択素子を少なくとも一つ有する第2の波長選択部材とを備え、前記光分割器は少なくとも400nm以上、700nm以下の波長域において透過率が85%以上、反射率が15%以下の無コート基板ガラスを具備することを特徴とするものである。
【0012】
また、本発明の光学装置は、前記のような構成のものであって、光分割器の光学素子が平行平面板状でその光源からの照明光が入射する側の面(第1の面)とは反対側の面(第2面)に少なくとも反射防止コーティングを施したことを特徴とする。この場合第1の面と第2の面の両方にコーティングを施したものでもよい。
【0013】
また、本発明の光学装置は、前記の各構成の装置で、光分割器がダイクロイックミラーを更に含むもので光学素子とダイクロイックミラーとを切り替え可能にしたことを特徴とするものである。
【0014】
【発明の実施の形態】
次に本発明の光学装置の実施の形態を示す。
【0015】
本発明の第1の実施の形態は、図1に示す通りの構成である。この第1の実施の形態は、正立型の顕微鏡を基本構成とするもので、図1において、1は光源、2は照明光学系、3は第1の波長選択素子を有する第1の波長選択部材、4は光学素子10を有する光分割器、5は対物レンズ、6は試料、7は第2の波長選択素子7aを有する第2の波長選択部材、8は結像レンズ、9は検出装置である。又、上記構成中光源1は例えば水銀ランプが用いられる。
【0016】
水銀ランプの光源1より放射される光には紫外線から可視光および近赤外光が含まれており、この光源よりの光は照明光学系2を通り第1の波長選択部材3に入射する。この第1の波長選択部材3には、第1の波長選択素子として所定の波長特性を有する第1の光学フィルタ3aが配置されている。この第1の波長選択部材3中のフィルタ3aが光路中に位置するようにして紫外域−可視域の光のうちの所定の波長域の光のみを透過させるようにしている。このフィルタ3aを透過した光は、光分割器4に入射する。この光分割器4には、光学素子10が配置され、この光学素子10は、照明光学系2の光軸に対して45°の角度をなすよう配置されている。これによって光分割器4に入射した励起光は、対物レンズ5に向かって反射される。このように光学素子10にて反射されて光分割器4を射出した励起光は、対物レンズ5を介して試料6を照射する。
【0017】
このようにして、励起光により照射された試料6は、蛍光を発する。つまり試料から反射した励起光と蛍光とが発生する。この試料よりの蛍光と励起光とは、対物レンズ5を透過して光分割器4に入射する。光分割器4に入射した光は光学素子10を透過して第2の波長選択部材7に入射する。
【0018】
ここで、光分割器4の光学素子10として、図2に示すような二つの三角プリズム11、12を互いに接合した直方体の形状のものや、図3に示すような照明光軸に対して各々22.5°傾斜させて配置した二つの平行平面板13、14とよりなるもの等がある。
【0019】
また、第2の波長選択部材7に配置されている第2の波長選択素子である第2の光学フィルタ7aは所定の波長特性を有し、蛍光と反射光のうち、蛍光のみを透過させるようにしてある。
【0020】
このような構成の第2の波長選択部材7に入射した蛍光と反射光は、第2の光学フィルタ7aにより蛍光のみ透過する。この第2の波長選択部材7を透過した蛍光は、結像レンズ8により検出装置9の所定位置に試料の蛍光像を形成する。この蛍光像位置の近傍に接眼レンズを配置すれば、目視による蛍光像の観察ができる。この蛍光像は、非常に暗いために冷却CCD等の電子撮像素子、特に高感度の撮像素子を配置して撮像することが好ましい。
【0021】
次に本発明の第1の実施の形態の光学装置にて用いられる光分割器中の光学素子について説明する。
【0022】
この第1の実施の形態において用いられる光学素子は、例えば図1に示すように平行平面板で、少なくとも400nm以上、700nm以下の波長域において透過率が85%以上であり、反射率が15%以下の波長特性を有している。
【0023】
図4、図5は、第1の実施の形態の光学装置において用いる光学素子の波長特性の一例である。この光学素子の材料は、S−BSL7(株式会社オハラ製)を両面研磨した基板ガラスをそのまま用いたもので、図4はこの光学素子の波長300nm〜1200nmにおける分光透過率特性、図5は、同じ光学素子の波長300nm〜1200nmにおける分光反射率特性を示す。
【0024】
この第1の実施の形態で用いる光学素子は、前記のように材料S−BSL7の基板ガラスをそのまま用いたもので、つまりコートなしの状態にて用いたもので、そのため多重励起用ダイクロイックミラーに比べて経時変化や物理的衝撃等に対する耐久性が格段によい。
【0025】
この第1の実施の形態の光学装置は、光分割器の光学素子の反射率が400nmから1200nmまでの波長域においてほぼ一定であり、そのため励起光がこの波長域内であればどの波長も同じ反射率にて反射された後に試料を照射する。したがって、所望の蛍光色素に対応した第1、第2の光学フィルタを適宜選択することにより、耐性に問題のある多重励起用のダイクロイックミラーを用いる必要がなく、あるいは各蛍光色素に対応した専用のダイクロイックミラーを複数用い、それらを切り替え使用する必要がなく、またNDフィルタ等の他の光学素子を必要とせずに試料に照射させる励起光の強度を非常に小さくでき試料に与えるダメージを軽減し得る。
【0026】
以上、第1の実施の形態にて用いる光分割器のうち、図1に示す構成の光分割器について具体的に説明したが、図2、図3に示す構成の光分割器の場合も、光学素子を構成する材料の選択等により、全体として、少なくとも400nm以上、700nm以下の波長域において透過率が85%以上、反射率が15%以下になるようにすればよい。
【0027】
次に、本発明の第2の実施の形態の光学装置について述べる。
【0028】
本発明の第2の実施の形態は、光学装置全体の構成は図1に示す通りで第1の実施の形態と実質上同じである。しかし、光学装置にて用いられる光分割器が図6に示す通りで、その光学素子10の励起光が入射する面(第1の面)10aと反対側の面(第2の面)10bとに反射防止コートを施したものである。
【0029】
これらの面10a、10bに反射防止コートを施すことにより、この光学素子10の透過率が向上し、試料からの蛍光を効率よく第2の波長選択部材および検出装置へ導くことができ、また試料に照射する励起光を弱くすることができ試料に対するダメージを軽減できる。
【0030】
図7、図8、図9は、光分割器の光学素子の反射率特性を示すもので、基板ガラスは、夫々S−TIH6、S−BSL7(いずれも株式会社オハラ製)、合成石英で、厚さはすべて1mmである。これら図において、aは反射防止コートなしの場合、bは第2の面のみ反射防止コートを施した場合、cは両方の面に反射防止コートを施した場合である。この第2の実施の形態にて用いる反射防止コートは、フッ化マグネシウム(MgF2)が用いられている。しかし、経時変化や物理的耐性に問題がない範囲内で多層膜コートを反射防止コートとして用いてもよい。
【0031】
図10、図11、図12は、光学素子の透過率特性を示すもので、基板ガラスは、夫々S−TIH6、S−BSL7(いずれも株式会社オハラ製)、合成石英で、厚さはすべて1mmである。
【0032】
これらの図において、aは反射防止コートなしの場合、bは第2の面のみ反射防止コートを施した場合、cは両方の面に反射防止コートを施した場合の分光透過率特性である。
【0033】
これら図7、8、9、10、11、12より光学素子の基板ガラスとしてS−TIH6、S−BSL7、合成石英を用いることにより、少なくとも400nm以上700nm以下の波長域において透過率が85%で、反射率が15%以下の透過、反射特性を有する光学素子を実現し得る。
【0034】
この第2の実施の形態の光学装置は、光分割器の光学素子が上記の通りの特性を有するので光学素子に入射する励起光のほとんどが光学素子を透過し、光学素子にて反射する励起光は僅かである。
【0035】
合成石英で反射コートを両面に施した場合、約5%の励起光が対物レンズに向かって反射される。したがって、対物レンズを透過して試料に達する励起光は僅かである。そのため、細胞を損傷させることがなく、生きた細胞の観察が容易に行ない得る。しかし、励起光の強度が非常に小さいために、試料より発する蛍光の強度も非常に小さい。そのため、検出装置には、電子撮像素子を用いるのが好ましい。
【0036】
第3の実施の形態の光学装置は、第1、第2の実施の形態と実質上同じ構成であって、図1に示す通りである。しかしこの第3の実施の形態は、光分割器として、第1、第2の実施の形態の光学素子と、従来用いられているダイクロイックミラーとを切り替え可能に配置した点で他の実施の形態とは相違する。
【0037】
図13は、この第3の実施の形態にて用いる光分割器の構成を示すもので、光学素子15とダイクロイックミラー16とが共通の保持部材17にて保持されていて、レバー18により光路に対して挿脱可能になっている。
【0038】
前述のように、光学素子15を光路中に配置する構成では、蛍光の強度は非常に小さい。そのため、目視での蛍光観察が難しかったり、試料の位置合わせが行ないにくいということがあり得る。
【0039】
そこで、上記のような光分割器を用いると、光学素子15をダイクロイックミラー16に切り替えることによって、試料への励起光の光量を増加させることができるので、目視観察が可能になる。また、対物レンズを低倍率に切り替えれば、試料の位置出しを容易になし得る。
【0040】
また、高倍率、高開口数の対物レンズを用いた場合でも、ダイクロイックミラーに切り替えることにより、試料への励起光の光量を極端に増大させることができる。これにより、例えば、蛍光色素を意図的に褪色させその後蛍光が光量を増大させていく様子を観察することによって、細胞内の特定のたんぱく質の機能を調べる方法、すなわちフォトブリーチングと呼ばれる手法を利用することが可能になる。
【0041】
さらに第4の実施の形態は、図14に示す通りの構成で、1は光源、2は照明光学系、3は第1の波長選択部材、4は光分割器、5は対物レンズ、6は試料、7は第2の波長選択部材、8は結像レンズ、9は検出装置で、これらは基本的には図1と同様の構成である。
【0042】
しかし、この第4の実施の形態は、第1の波長選択部材と第2の波長選択部材とが夫々光学特性の異なる複数の波長選択素子を備えていて、コンピュータ20により制御されている点で他の実施の形態と相違する。ここで、第4の実施の形態の光学装置は、光学特性の異なる複数の第1のフィルタと光学特性の異なる複数の第2のフィルタとを夫々備えており、コンピュータ20により、所望の蛍光色素に最も適した第1の光学フィルタと第2の光学フィルタの組み合わせが光路中に配置されるようになっている。
【0043】
図15は、この第4の実施の形態において用いられる第1、第2の波長選択部材の構成を示すものである。この波長選択部材は、図示するよう電動にて回転し得るターレット状のフィルタホイール21に蛍光色素に対応する複数の光学フィルタ21a,21b,・・・を配置した構成であって、コンピュータ制御により任意の光学フィルタを照明光路あるいは結像光路中に挿脱し得るようにしたものである。ここで用いる光学フィルタは、図に示す多重励起対応の励起フィルタや吸収フィルタ、または図に示すような単一の蛍光色素に対応する励起フィルタや吸収フィルタである。
【0044】
また図16は本発明の第4の実施の形態の変形例であって、光分割器4にミラー22を加えたものである。この光分割器に入射する光源よりの励起光は、光分割器4内の光学素子10により反射されて試料6の側へ向けられるが、一部の光は光学素子を透過する。この光学素子10を透過した光が、鏡筒内面等の反射により光学素子に戻され、観察光路内に入射すると好ましくない。これを防ぐために、前記ミラー22により光学素子を透過した励起光を観察光路外に逃がすようにしている。したがって、ミラー22は、それにて反射した光が光学素子に戻らないように配置位置、傾斜角を定めることが好ましい。
【0045】
なお、図16に示す光分割器における不必要な励起光を逃がす手段(光トラップ機構)は、第1、第2、第3の実施の形態にも適用し得る。
【0046】
また、光トラップ機構として、図16に示すようなミラーにより反射させるようにした機構の代わりにミラーに代えて吸収フィルタを用いるかあるいは適宜箇所に光吸収部材を配置することにより光分割器の光学素子を透過した光源よりの光を吸収することによって除去するようにしてもよい。この吸収による光トラップ機構は、他の実施の形態にも適用し得る。
【0047】
以上述べた本発明の各実施の形態の光学装置は、正立型の顕微鏡を基本としているが、前記各実施の形態にて用いられている本発明の技術手段は、そのまま倒立型の顕微鏡にも用い得る。
【0048】
本発明の光学装置は、以上述べた通りの構成で特許請求の範囲に記載する構成の他に次の各項に記載する構成のものも発明の目的を達成し得る。
【0049】
(1) 特許請求の範囲の請求項1、2又は3に記載する装置で、前記光分割器の光学素子の透過、反射特性が波長330nm以上で1000nm以下の波長域において透過率が85%以上であり反射率が15%以下であることを特徴とする光学装置。
【0050】
(2) 特許請求の範囲の請求項1、2又は3に記載する装置で、前記光分割器の光学素子の透過、反射特性が波長400nm以上で1000nm以下の波長域において透過率が90%以上であり反射率が5%以下であることを特徴とする光学装置。
【0051】
(3) 特許請求の範囲の請求項1、2又は3に記載する装置で、前記光分割器の光学素子の透過、反射特性が波長200nm以上で1000nm以下の波長域において透過率が90%以上であり反射率が7%以下であることを特徴とする光学装置。
【0052】
(4) 特許請求の範囲の請求項1、2又は3あるいは前記の(1)、(2)又は(3)の項に記載する装置で、前記光分割器の光学素子が下記条件(1)を満足することを特徴とする光学装置。
(1) n<2.0
ただし、nは光学素子のd線に対する屈折率である。
【0053】
(5) 特許請求の範囲の請求項1あるいは前記の(1)、(2)、(3)又は(4)の項に記載する装置で、前記光分割器の光学素子の照明光が入射する側の面とは反対側の面に反射コートを施したことを特徴とする光学装置。
【0054】
(6) 前記の(1)、(2)、(3)、(4)又は(5)の項に記載する装置で、前記光分割器が更にダイクロイックミラーを有し、前記光学素子と前記ダイクロイックミラーとが切り替え可能に構成されていることを特徴とする光学装置。
【0055】
(7) 特許請求の範囲の請求項3あるいは前記の(6)の項に記載する装置で、前記光分割器が照明光のうちの所定の波長域の光を選択的に透過させる波長選択素子と、ダイクロイックミラーと、照明光(励起光)により照射された試料にて反射された光および放出された光のうちの所定の波長域の光を選択的に透過させる波長選択素子とが一体に保持されたユニットを有し、前記光学素子と前記ユニットとが切り替え可能に構成されていることを特徴とする光学装置。
【0056】
(8) 特許請求の範囲の請求項1、2又は3に記載する装置で、前記光分割器が前記光学素子の照明光が透過する側に光トラップ機構を備えていることを特徴とする光学装置。
【0057】
(9) 特許請求の範囲の請求項1、2又は3に記載する装置で、前記第1の波長選択部材が複数の波長選択素子とを有し、前記波長選択素子のうちから一つの波長選択素子を選択する第1の選択機構を備えたことを特徴とする光学装置。
【0058】
(10) 特許請求の範囲の請求項1、2又は3あるいは前記の(1)、(2)又は(3)の項に記載する装置で、前記第2の波長選択部材が複数の波長選択素子を有し、前記波長選択素子のうち一つの波長選択素子を選択する第2の選択機構を有することを特徴とする光学装置。
【0059】
(11) 特許請求の範囲の請求項1、2又は3あるいは前記の(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)又は(10)の項に記載する装置で、前記検出装置が電子撮像素子であることを特徴とする光学装置。
【0060】
(12) 前記の(11)の項に記載する装置で、前記電子撮像素子が高感度撮像素子であることを特徴とする光学装置。
【0061】
(13) 前記の(9)又は(10)の項に記載する装置で、コンピュータを備え、選択機構および第2の選択機構が前記コンピュータにて制御するようにしたことを特徴とする光学装置。
【0062】
(14) 前記の(13)の項に記載する装置で、前記高感度撮像素子が前記コンピュータにて制御されることを特徴とする光学装置。
【0063】
(15) 特許請求の範囲の請求項1、2又は3に記載する装置で、前記光学素子が照明光が入射する側から順に、第1の面と第2の面とを有し、第1の面に反射防止コートが施されていることを特徴とする光学装置。
【0064】
(16) 前記の(8)の項に記載する装置で、前記光トラップ機構が少なくとも一つの反射面を有することを特徴とする光学装置。
【0065】
(17) 前記の(16)の項に記載する装置で、前記反射面が入射してきた光を90度以上の角度にて反射するように配置されていることを特徴とする光学装置。
【0066】
(18) 前記の(16)の項に記載する装置で、前記反射面が複数設けられ複数の反射面が向き合って配置されていることを特徴とする光学装置。
【0067】
(19) 前記の(8)又は(16)の項に記載する装置で、前記光トラップ機構が入射した光を吸収する吸収部材を有することを特徴とする光学装置。
【0068】
【発明の効果】
本発明の光学装置によれば、経時変化等の耐性に弱く、多重励起用のダイクロイックミラーを用いることなく、更に4重蛍光染色や5重蛍光染色以上の蛍光色素にて染色した試料を同時に観察することが可能であり、生きた細胞の機能解明に最適な蛍光観察が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図1】 本発明の第1の実施の形態の光学装置の構成を示す図
【図2】 本発明の光学装置で用いる光分割器の他の例を示す図
【図3】 本発明の光学装置で用いる光分割器の他の第3の例を示す図
【図4】 本発明の第1の実施の形態の光学装置で用いる光分割器の光学素子の分光透過率特性を示す図
【図5】 前記光学素子の分光反射率特性を示す図
【図6】 本発明の第2の実施の形態の光学装置で用いる光分割器の構成を示す図
【図7】 前記第2の実施の形態で用いる光学素子で基板ガラスがS−TIH6の分光反射率特性を示す図
【図8】 前記第2の実施の形態で用いる光学素子で基板ガラスがS−BSL7の分光反射率特性を示す図
【図9】 前記第2の実施の形態で用いる光学素子で基板ガラスが合成石英の分光反射率特性を示す図
【図10】 前記第2の実施の形態で用いる光学素子で基板ガラスがS−TIH6の分光透過率特性を示す図
【図11】 前記第2の実施の形態で用いる光学素子で基板ガラスがS−BSL7の分光透過率特性を示す図
【図12】 前記第2の実施の形態で用いる光学素子で基板ガラスが合成石英の分光透過率特性を示す図
【図13】 本発明の第3の実施の形態の光学装置で用いる光分割器の構成を示す図
【図14】 本発明の第4の実施の形態の光学装置の構成を示す図
【図15】 前記第4の実施の形態の第1、第2の波長選択部材の構成を示す図
【図16】 本発明の第4の実施の形態の光学装置の変形例を示す図
【図17】 多重励起用ダイクロイックミラーの分光透過率特性を示す図
【符号の説明】
1 光源
2 照明光学系
3 第1の波長選択部材
4 光分割器
5 対物レンズ
6 試料
7 第2の波長選択部材
8 結像レンズ
9 検出装置
10 光学素子
Claims (2)
- 光源と、前記光源よりの照明光により試料を照明するための照明光学系と、前記照明光のうちの所定の波長域の光を選択的に透過する波長選択素子を少なくとも一つ有する第1の波長選択部材と、前記照明光を偏向させて試料へ向ける光分割器と、前記光分割器と試料との間に配置された対物レンズと、試料よりの光を対物レンズを通して光を検出する検出装置と、前記対物レンズと前記検出装置の間に配置され、前記試料から反射されあるいは放出された光のうちの所定の波長の光を選択的に透過させる波長選択素子を少なくとも一つ有する第2の波長選択部材とを備え、前記光分割器は少なくとも400nm以上、700nm以下の波長域において透過率が85%以上、反射率が15%以下の無コート基板ガラスを具備することを特徴とする光学装置。
- 前記光分割器がダイクロイックミラーを有し、前記光学素子と前記ダイクロイックミラーが切り替え可能であることを特徴とする請求項1の光学装置。
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