JP2001013413A - 顕微鏡 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 光学系を変更することなくエバネッセント照
明による蛍光観察と高分解能の透過照明観察とを行うこ
とができる顕微鏡を提供する。 【解決手段】 液浸系コンデンサレンズ６０を使用し、
エバネッセント光によって水溶液８中の試料の観察を行
うことができるとともに、透過照明による観察を行うこ
とができる顕微鏡において、液浸系コンデンサレンズ６
０の先玉６１に、水溶液８に対する光の入射角が臨界角
となるように入射面と出射面とを形成し、入射面の近傍
にエバネッセント光を発生させた。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は顕微鏡に関する。

【０００２】

【従来の技術】エバネッセント光を顕微鏡の励起光とし
て利用する技術は、ノイズ成分である背景光の少ない照
明光学系が得られるため、微弱な蛍光を取り扱う生体一
分子（たんぱく質等）の蛍光観察に一般的に利用されて
いる。図４は従来のエバネッセント照明装置を備える顕
微鏡の部分拡大断面図である。

【０００３】従来のエバネッセント照明装置１５０は、
励起レーザ光Ｌ３を出射するエバネッセント投光管１５
１と自家蛍光の少ない石英で作られた台形のプリズム１
６０とを備える。

【０００４】エバネッセント投光管１５１は顕微鏡のス
テージ１３２の上方に支持台１０９によって回転可能に
支持されている。

【０００５】プリズム１６０の側面にはスライドグラス
１０５と水溶液１０８との境界面にレーザ光Ｌ３が臨界
角で入射でき出射できるように入射面１６１ａと出射面
１６１ｂとがそれぞれ形成されている。

【０００６】プリズム１６０の底面は屈折率がほぼ等し
いオイル１０６の層を介してスライドグラス１０５の上
面に接している。スライドグラス１０５の下面とカバー
グラス１０７との間には試料が存在する水溶液１０８が
挟まれている。

【０００７】入射面１６１ａから励起レーザ光を、屈折
率の高いスライドグラスと屈折率の低い水溶液とが接す
る境界面に臨界角で入射させたとき、境界面の近傍１５
０ｎｍ程度の領域にエバネッセント光が発生する。

【０００８】このエバネッセント光によって試料中の蛍
光色素が励起されて蛍光を発し、対物レンズ１３３によ
って試料の蛍光像が結像される。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】ところで、透過光によ
って蛍光観察以外の観察を行う場合がある。

【００１０】しかし、プリズム１６０は入射光の光束を
確保するために１ｍｍ以上の厚みとなることがあるた
め、開口数が大きい（分解能が高い）液浸系コンデンサ
レンズを同時に使用することができず、エバネッセント
照明による蛍光観察と高倍率かつ高分解能の透過照明観
察とを光学系を変更することなく行うことができない。

【００１１】この発明はこのような事情に鑑みてなされ
たもので、その課題は光学系を変更することなくエバネ
ッセント照明による蛍光観察と高分解能の透過照明観察
とを行うことができる顕微鏡を提供することである。

【００１２】

【課題を解決するための手段】前述の課題を解決するた
め請求項１記載の発明は、液浸系コンデンサレンズを使
用し、エバネッセント光によって水溶液中の試料の観察
を行うことができるとともに、透過照明による観察を行
うことができる顕微鏡において、前記液浸系コンデンサ
レンズの先玉に、前記水溶液に対する前記エバネッセン
ト光を発生させる光の入射角が臨界角となるように、入
射面と出射面とが形成されていることを特徴とする。

【００１３】光がコンデンサレンズの先玉に形成された
入射面から入射し、水溶液とスライドグラスとの境界面
で全反射されて出射面から出射される。このとき、境界
面の近傍１５０ｎｍ程度の領域でエバネッセント光が発
生し、励起光として水溶液中の試料の蛍光色素が励起さ
れ蛍光を発する。そして、対物レンズによって試料の蛍
光像が結像される。一方、コンデンサレンズへ導かれた
透過照明光はスライドグラスを通して水溶液中の試料を
照明する。そして、対物レンズによって試料の像が結像
される。ここで、先玉はコンデンサレンズを構成する複
数のレンズの内、観察状態においてスライドグラスを含
む試料面と対向する先端のレンズをいうものとする。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下、この発明の実施の形態を図
面に基づいて説明する。

【００１５】図１はこの発明の一実施形態に係る顕微鏡
の側面図、図２は図１のII−II矢視図である。

【００１６】倒立顕微鏡は、顕微鏡ボディ１０と、照明
支柱２０と、ステージユニット３０と、落射蛍光ユニッ
ト４０と、エバネッセント照明装置５０とを備える。

【００１７】顕微鏡ボディ１０のベース１１の一端に照
明支柱２０が設けられている。

【００１８】照明支柱２０は垂直部２１とこの垂直部２
１の上端から水平に延びる水平部２２とで構成される。
垂直部２１の上端の背面側にはランプハウス２３が設け
られ、水平部２２には取付部２４を介してコンデンサレ
ンズ６０が設けられている。ランプハウス２３には例え
ばハロゲンランプ２３ａが収容されている。

【００１９】照明支柱２０、ランプハウス２３、ミラー
２５、ポラライザ２６、ウオラストンプリズム２７、及
びコンデンサレンズ６０で微分干渉観察用透過照明光学
系が構成される。

【００２０】また、ベース１１の他端には鏡筒１２が設
けられ、鏡筒１２には対物レンズ３３によって生じた像
を肉眼で観察できるように拡大する接眼レンズ１３が設
けられている。

【００２１】ステージユニット３０は、試料が載置され
るステージ３２と、異なる種類の複数の対物レンズ３３
及びノマルスキプリズム３６を保持するレボルバ３４
と、レボルバ３４を保持するレボルバ台３５とを備え
る。

【００２２】レボルバ台３５はハンドル１５によって対
物レンズ３３の光軸Ｌ１方向へ移動できる。

【００２３】落射蛍光ユニット４０は、ランプハウス４
１と落射蛍光装置４２とフィルタユニット４３とを備え
る。

【００２４】フィルタユニット４３は複数のフィルタブ
ロックを備え、スライダ（図示せず）によって任意のフ
ィルタブロックを対物レンズＬ１の光軸上に挿入でき
る。フィルタブロックは異なる種類の光学素子（例えば
励起フィルタ４３ａ、ダイクロイックミラー４３ｂ及び
吸収フィルタ４３ｃ）を備えている。

【００２５】ランプハウス４１には例えば水銀ランプが
設けられている。

【００２６】落射蛍光装置４２には、集光レンズや視野
絞り（図示せず）が設けられている。

【００２７】ランプハウス４１、落射蛍光装置４２及び
フィルタユニット４３で落射照明光学系が構成される。

【００２８】エバネッセント照明装置５０はステージ３
２の上方に配置されている。

【００２９】図３は顕微鏡の部分拡大断面図である。

【００３０】エバネッセント照明装置５０はエバネッセ
ント投光管５１と液浸系コンデンサレンズ６０とを備え
る。

【００３１】エバネッセント投光管５１はアルゴンレー
ザ（波長：５１４．５ｎｍ）５２とコリメータレンズ５
３とを備える。このエバネッセント投光管５１は水溶液
８とスライドグラス５との境界面と光軸との交点を中心
として回転可能である。

【００３２】コンデンサレンズ６０は液浸系コンデンサ
レンズである。コンデンサレンズ６０は対物レンズ６
１，６２を備えている。またコンデンサレンズ６０には
アルゴンレーザ５２から出射された励起光Ｌを入射させ
る開口部６３と反射光を出射させる開口部６４とが設け
られている。

【００３３】開口部６４には励起光Ｌが境界面に臨界角
θ以上で境界面に入射しているか否かを確認するための
筒部６５が着脱可能に設けられている。筒部６５には拡
散フィルタ６５ａ、ＮＤフィルタ６５ｂ及び確認窓６５
ｃが取り付けられている。

【００３４】半球形の対物レンズ（先玉）６１の側面は
水溶液８とスライドグラス５との境界面の法線に対して
レーザ光が臨界角θで入射でき出射できるように削り取
られ、入射面６１ａと出射面６１ｂとがそれぞれ形成さ
れている。

【００３５】対物レンズ６１とスライドグラス５の上面
との間には対物レンズ３３の屈折率に近いイマージョン
オイル６が挟まれている。

【００３６】また、スライドグラス５の下面とカバーグ
ラス７との間には水溶液８が挟まれている。水溶液中に
はＣｙ３やローダミン等の蛍光色素によって染色された
試料が存在している。

【００３７】エバネッセント照明による蛍光観察の場
合、アルゴンレーザ５２から出射されコリメータレンズ
５３で平行光とされた励起光Ｌは、入射面６１ａから対
物レンズ６１内へ入射し、スライドグラス５と水溶液８
との境界面で反射される。

【００３８】このとき、確認窓６５ｃによって反射光を
確認する。反射光を確認できない場合には臨界角θとな
るようにエバネッセント投光管５１を回転させて全反射
するように入射角を調整し、反射光を確認できた場合に
は全反射した光がコンデンサレンズ６０の外部へ漏れな
いように筒部６５を外して蓋（図示せず）をする。

【００３９】境界面の近傍１５０ｎｍ程度の領域ではエ
バネッセント光が発生し、このエバネッセント光が励起
光として試料中の蛍光色素を励起させ、蛍光が発する。

【００４０】この蛍光は対物レンズ３３、フィルタユニ
ット４３等の光学部材を通じて接眼レンズ１３に導か
れ、試料の蛍光像が観察される。

【００４１】一方、上記顕微鏡を用いて他の照明系によ
る観察を行うこともできる。

【００４２】透過照明観察の場合、ランプハウス２３か
ら出射された光はミラー２５、ポラライザ（偏光子）２
６、ウオラスストンプリズム２７、コンデンサレンズ６
０、スライドグラス５を通じて無色透明の試料が存在す
る水溶液８へ入射する。

【００４３】水溶液８を透過した光は、カバーグラス
７、対物レンズ３３及びアナライザ（検光子）１４等を
通じて接眼レンズ１３に導かれ、干渉色のコントラスト
をつけて可視化された微分干渉像が観察される。

【００４４】落射蛍光観察の場合、落射照明光学系を装
着する。ランプハウス４１からの光は落射蛍光装置４
２、フィルタユニット４３及び対物レンズ３３を通じて
蛍光試薬によって染色された試料が存在する水溶液８へ
入射される。

【００４５】試料で反射された光は対物レンズ３３、フ
ィルタユニット４３及び対物レンズを通じて接眼レンズ
１３に導かれ、試料の蛍光像が観察される。

【００４６】この実施形態によれば、顕微鏡の光学系を
変更することなくエバネッセント照明によるノイズ成分
の少ない蛍光観察と高倍率かつ高分解能の透過照明観察
とを１台の顕微鏡で行うことができるとともに、図１に
示すように落射照明光学系を装着することによって一般
の落射蛍光観察を行うことができる。

【００４７】なお、エバネッセント照明による蛍光像の
光量は透過照明像の光量に比べて少ないが、透過照明の
ランプ電圧を下げたり、透過照明光の使用波長をＮＤフ
ィルタで光量を少なくする、あるいはバンドパスフィル
タを用いて蛍光の波長と異なる帯域に設定したりする方
法によって、エバネッセント照明による蛍光観察と透過
照明観察とを同時に行うことができる。そのため、生体
の形態像と生体の蛍光色素によって染色された特定部位
の蛍光像とを同時に観察することができるようになる。
また、観察途中で透過照明用のランプを消灯することに
よってエバネッセント照明による蛍光像だけを観察する
こともできる。

【００４８】また、レボルバ３４を切り換えて対物レン
ズ３３の倍率を変えたときであってもエバネッセント照
明の光学系の条件を変える必要がないので、観察時にお
ける作業性がよい。

【００４９】更に、上記実施形態では、エバネッセント
照明装置５０を独立したエバネッセント投光管５１と液
浸系コンデンサレンズ６０とで構成したが、エバネッセ
ント投光管５１と液浸系コンデンサレンズ６０とを一体
化してもよい。

【００５０】また、上記実施形態は倒立顕微鏡で説明し
たが、正立顕微鏡にも同様に適用することができること
は勿論である。

【００５１】

【発明の効果】以上に説明したように請求項１に記載の
発明の顕微鏡によれば、顕微鏡の光学系を変更したりす
ることなくエバネッセント照明によるノイズ成分の少な
い蛍光観察と高倍率かつ高分解能の透過照明観察とを１
台の顕微鏡で行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はこの発明の一実施形態に係る顕微鏡の側
面図である。

【図２】図２は図１のII−II矢視図である。

【図３】図３は顕微鏡の部分拡大断面図である。

【図４】図４は従来の顕微鏡の部分拡大断面図である。

【符号の説明】

８ 水溶液 ６０ コンデンサレンズ ６１ａ 入射角 ６１ｂ 出射角

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 液浸系コンデンサレンズを使用し、エバ
   ネッセント光によって水溶液中の試料の観察を行うこと
   ができるとともに、透過照明による観察を行うことがで
   きる顕微鏡において、 前記液浸系コンデンサレンズの先玉に、前記水溶液に対
   する前記エバネッセント光を発生させる光の入射角が臨
   界角となるように、入射面と出射面とが形成されている
   ことを特徴とする顕微鏡。