JP2012521541A - ノンコヒーレント光学顕微鏡 - Google Patents

Abstract

分解能を高くし、三次元画像を提供することが可能な光学顕微鏡（１０１）が開示され、説明される。顕微鏡（１０１）は、複数のプローブ分子を有するサンプルを載せるサンプル台（１６０）を含み得る。少なくとも一つのノンコヒーレント光源（１２７）が提供され得る。少なくとも一つのレンズ（１４０ａ、１４０ｂ）は、少なくとも一つのノンコヒーレント光源（１２７）からの光ビームをサンプルに向けて方向付けて、プローブ分子を発光させるように構成され得る。カメラ（１５５）は、プローブ分子からの蛍光を方向付けるように構成され得る。光線パス修正モジュール（１３２、１５０）は、プローブ分子ルミネセンスのパス長を変更して、複数の対物面においてカメラルミネセンス検出を可能にする。

Description

発明の分野
本発明は、顕微鏡に関する。より具体的には、本発明は、超解像顕微鏡とそれにより得られる三次元画像の作成に関する。従って、本発明は、物理学、光学、化学、生物学の分野に関する。

背景
約１０年前までは、ファーフィールドの光学顕微鏡の分解能は、２００〜２５０ナノメートルに限定され、サブ細胞構造の詳細を隠し、その生物学的な用途を制限していると考えられた。誘導放出減損（“ＳＴＥＤ”）顕微鏡の将来の発展を助ける概念によってこの回折限界を破ることは、光を用いたナノスケールでの生物学的システムの画像化を可能にした。ＳＴＥＤ顕微鏡と可逆的飽和光学蛍光遷移（“ＲＥＳＯＬＦＴ”）ファミリの他の部材は、（蛍光）プローブ分の光学飽和遷移を通した顕微鏡の点広がり関数（“ＰＳＦ”）を設計することにより回折限界を１０倍より大きく超えた分解能を達成する。

しかし、三次元超解像イメージングの遅い進展は、二次元（“２Ｄ”）撮像する従来技術の応用を制限している。最高の３Ｄ分解能は、最近まで、従来の横方向の分解能で軸方向に１００ナノメートルをしていた。４Ｐｉ顕微鏡は、干渉計システムでは、高開口数の二つの対物レンズの組み合わせによってこれを達成した。４Ｐｉ顕微鏡は、ごく最近の生物学的イメージングに適していることが示された。ほんの最近、初の３Ｄ ＳＴＥＤ顕微鏡の画像が、１３９ナノメートルの横方向の分解能と１７０ナノメートルの軸方向の分解能と適度に、この分解能を超えて公開されている。これは従来の顕微鏡で提供されるよりも５倍より小さい解像ボリュームを表すが、例えば、シナプス小胞のようなサブの細胞成分の大多数より少なくとも１０倍はまだ大きい。さらに、最近の開発は、４Ｐｉ顕微鏡とＳＴＥＤとを組み合わせることにより、三つの方向全てで５０ｎｍ以下の３Ｄ分解能を実現している。

生体系の動的特性を測定するために、粒子追跡技術は、過去数十年にわたって開発されている。粒子追跡技術は、サブ回折の精度で生細胞内の（典型的に回折限界未満）小さなオブジェクトをローカライズし、レコーディングの時系列をとることにより時間をかけて彼らの動きを追跡することができる。単一の粒子は内部全反射照明の有無、または複数の平面配置で、従来は画像化される。すべての粒子は、回折限界像を生成する。ぼやけた画像（強度分布の幅が顕微鏡の“空間分解能”に相当する）の中心を決定することにより、粒子の位置を決定することができる。蛍光学顕微鏡で単一の粒子の空間的局在の精度は、背景と有限のピクセルサイズによる影響のない状態での粒子から検出された蛍光光子の総数の平方根である。

最近、この概念はまた、超解像顕微鏡の新たな分野に入っている。このような“ＦＰＡＬＭ”、“ＰＡＬＭ”、“ＳＴＯＲＭ”、または“ＰＡＬＭＩＲＡ”のような技術で、生体試料は、光活性化蛍光分子で標識される。高感度カメラで、いつでも、単一フルオロフォアの疎分布のみが活性化され、結果として画像化される。これは、１０ｎｍの範囲（標準偏差σ）の典型的精度で実質的にすべての蛍光分子と個々の蛍光物質の局在の回折限界の強度分布の空間的な分離が可能になる。漂白または非アクティブに蛍光分子を読み出し処理中に、同時に追加の蛍光体を活性化することによって、プローブ分子の大部分は、多くの画像フレームのシリーズを介して撮像される。通常は２０〜３０ｎｍの分解能での超解像画像は（分布の半値幅として測定；約２．４σ）最終的に決定した単一分子の位置から組み立てられる。

最近、サブセルラー蛍光成分との粒子追跡局在ベースの超解像顕微鏡技術は三次元に二次元（２Ｄ）イメージング方法から進めてきた。ｚ方向の局在は、カメラ画像が２Ｄであるという事実によって複雑になる。それが２Ｄケースにそのまま別のｚ−ポジションは、質量の中心の簡単に検出可能な変化になることはない。軸方向の位置は考慮軸方向における焦点強度分布の複雑な依存性を取って焦点がぼけ二次元強度分布から推定する必要がある。デフォーカス画像に表示されてリングの直径を分析、例えば、そのｚの位置に結論することができる。主要な障害は、強度分布の軸対称性（完全な顕微鏡で）である：観測された２Ｄ画像にＺ０の軸方向の位置は、Ａ−Ｚ０としても同様に可能である。この対称性を破るために、マルチプレーンの検出が開発されている。

異なる焦点面での録画画像を同時に一意に粒子の軸方向の位置を決定する手段を提供する。このマルチプレーンの検出のアプローチを正常細胞内の単一の量子ドットへの粒子を追跡するためにわずかに変化させるアレンジで使用されており、最近では局在ベースの３Ｄ超解像顕微鏡に適用されている。

セル内の他の構造に関して、生物学的粒子や構造の形態と運動の文脈では非常に重要になる。これを測定するには、別の写真−物理的特性（通常二つの異なる蛍光色）によって異なる構造を（たとえば、二つの異なるタンパク質）のマーキング、通常、複数のラベルが画像化される。マルチカラーの録音は、粒子追跡における超解像顕微鏡と同様に使用されている。

超解像顕微鏡と粒子追跡では、ラベルの数が少ない、多くの場合、単一蛍光分子を特色に小さな構造は、観察される。バックグラウンドの抑制はそれゆえ非常に重要である。多くの場合、適用される二次元粒子追跡の方法と二次元超解像顕微鏡は、光がカバー、試料の界面で全反射が発生しているときの角度で照明である。この“内部全反射顕微鏡”（全反射）モードの光が、この場合にのみ試料（調整可能な入射角に応じて）と背景照明なしに７０〜２００ｎｍの順に浸透することは、これ以上の平面で作成できる。深さの範囲は、したがって、劇的に、サンプルへの光浸透の量を減少させる。

伝統的に、蛍光光学顕微鏡は、多かれ少なかれノンコヒーレント光源である水銀ランプを利用している。しかし、これらはレーザーに比べてあまり明確に定義された光ビームを提供するという欠点がある。レーザーの使用は、レーザー走査型顕微鏡、全反射顕微鏡とＦＰＡＬＭのような顕微鏡のような近代的な顕微鏡の開発を導いている。一部のレーザーベースの顕微鏡、より具体的には全反射とＦＰＡＬＭのような顕微鏡は、レーザービームにより提供されるようなコヒーレント照明はフィールドの均一な照明の視界を妨げる“スペックル”（例えば、空間的な干渉パターンを予測することは困難）を作成するという事実に苦しむ。

概要
三次元の全てにおいて１００ナノメートル未満の分解能で３Ｄ画像化を提供し得る顕微鏡システムに対する必要性がある。本発明者らは、スキャンすることなく三次元イメージングに使用することができる顕微鏡システムの必要性を認識している。プローブ分子を用いて三次元画像を作成するための顕微鏡システム及び方法が記載されている。一実施形態によれば、高めの分解能を持つ光学顕微鏡は、三次元画像を生成するように構成される。顕微鏡は、プローブ分子を複数有するサンプルをマウントするためのサンプルステージが含まれている。顕微鏡には、少なくとも一つのノンコヒーレント光源が含まれている。レンズは、試料に向かって、ノンコヒーレント光源からの光のビームを向けるために使用することができる。ノンコヒーレント光源は、プローブ分子は、冷光を発するために引き起こす可能性がある。カメラが配置され、プローブ分子からの発光を検出するように構成される。光ビームのパスの修正モジュールは、オブジェクトの面の複数箇所にカメラの発光検出を可能にするプローブ分子の発光のパスの長さを変更することができる。

一態様によれば、光ビームのパスの修正モジュールは、少なくとも二つのビーム経路にプローブ分子の発光を分割するように設定ビームスプリッターが含まれている。少なくとも一つのカメラは、少なくとも二つのビーム経路からプローブ分子の発光を検出することができる。関連する態様において、システムは二色でプローブの発光にまたは分割後の前の光の少なくとも二つの波長（または波長の範囲）にプローブの発光を分離するためのダイクロイックビームスプリッターが含まれている。プローブの発光は少なくとも二つの波長の第一の波長（または範囲）に対応して分割した少なくとも二つのパスの少なくとも一つのパス。プローブの発光を分割した少なくとも二つのパスの少なくとも一つの他のパスには少なくとも二つの波長の第二の波長に対応することができる。別の態様では、光ビームの経路の修正モジュールは、少なくとも四つのビーム経路にプローブ分子の発光を分割する二つ以上構成されてビームスプリッターが含まれている。少なくとも一つのカメラは、少なくとも四つのビーム経路からプローブ分子の発光を検出することができる。

別の態様によれば、光ビームのパスの修正モジュールは、三次元画像を作成するためのオブジェクトの面の複数箇所にプローブの発光のためにサンプルをスキャンするように構成直線走査装置とすることができる。

いくつかの実施形態において、システムは、冷光を発するために引き起こされるプローブ分子の数を制限するために光ビームを制限するように構成フィールドの開口部が含まれている。システムの微調整、光源のパワーに構成された音響光学波長可変フィルタを含めることができる。内部全反射蛍光コンデンサー（全反射）は、対物レンズの背面の開口部と開口バック対物レンズの中心に近位領域の側に近位領域との間の光ビームのビーム経路を変更するために使用することができる。

高めの分解能と三次元画像を提供できると顕微鏡の操作の方法は、実施例に沿って提供される。法の一環として、試料はステージに搭載されている。サンプルでは、プローブ分子を複数持つことができる。サンプルは、最初のオブジェクトの面にプローブの発光を引き起こすために、ノンコヒーレント光で照明される。プローブ分子の最初のオブジェクトの面からの発光は、カメラを用いて検出される。プローブ分子の発光のパスの長さは、光ビームのパスの修正モジュールを使用して変更できる。パス長の変化は、番目のオブジェクトの面にプローブの発光の検出を可能に。プローブ分子の第二物体面からの発光は、カメラを用いて検出することができる。

ノンコヒーレント光を試料に照射すると、さらに上部にあるプローブの発光を引き起こすことがノンコヒーレント励起光で試料を照明し、プローブ分子の複数の少なくとも一つの部分集合をアクティブにするには、ノンコヒーレント活性化の光を試料に照射するものがある最初のオブジェクトの面。方法は、微調整音響光学波長可変フィルタを用いた光源のパワーを含めることができる。光ビームによる試料の照明は、蛍光を発する原因となったプローブ分子の数を制限するフィールドの開口部を使用して制限することができる。方法は、サンプルの最初の部分を撮影した後、サンプルの異なる部分を照らすと、画像に光ビームを操縦含めることができる。

光ビームの修正モジュールは、三次元画像を作成するためのオブジェクトの面の複数箇所にプローブの発光のためのサンプルをスキャンするように構成直線走査装置とすることができる。別の態様では、光ビームの修正モジュールは、プローブ分子の発光ビームは、少なくとも二つのビームはそれぞれ異なる長さの光路を持つに分割するための少なくとも一つのビームスプリッターを含めることができる。一態様では、この方法は、音響光学チューナブルフィルタを用いた光源の強度を制御含まれている。方法は少なくとも二つのビームスプリッターを使用して、少なくとも四つのビームに分割するプローブ分子の蛍光を含めることができる。別の態様において、方法は二色でプローブの蛍光にまたは分割後の前の光の少なくとも二つの波長にプローブの蛍光を分離する分離されている。で、最初のプローブの蛍光は少なくとも二つの波長の第一の波長に対応する分割した少なくとも二つのパスの少なくとも一つのパス、およびプローブの蛍光が先となる少なくとも二つのパスの最低１秒以上のパススプリットは、少なくとも二つの波長（または波長の範囲）の最初の波長（または範囲）に対応することができる。プローブの蛍光が分割した少なくとも二つのパスの少なくとも一つの他のパスには少なくとも二つの波長の第二の波長に対応することができる。光ビームによる試料の照明は、空間的に蛍光を発する原因となったプローブ分子を制限するために、フィールドの開口部を使用して制限することができる。サンプルの最初の部分を撮影した後、さらに、光ビームは、試料の異なる部分を照らすと、画像に操縦されることがある。

したがって、むしろ広く、以下のその詳細な説明をより良く理解されるように、そして当該分野への現在の貢献がより理解されるように、本発明の特徴をそこに概説されている。本発明の他の特徴は、添付図面及び特許請求の範囲で撮影された本発明の以下の詳細な説明、より明確になる、または本発明の実施によって知ることができる。

本発明は、添付の図面と併せて以下の説明および添付の特許請求の範囲からより完全に明らかになるであろう。これらの図面は、単に本発明の例示的な実施形態を描写し、したがって、これらが、その範囲を限定することが考慮されるべきではない。それは容易に本発明の構成要素は、のような一般的説明および図示の数字でここに、配置される可能性、サイズ、および異なるさまざまな構成で設計されたことが理解されるであろう。にもかかわらず、本発明は、添付の図面を使用することにより、追加の特異性と詳細に記述して説明する。

図１は、音響光学チューナブルフィルタと一実施形態による全反射蛍光のコンデンサーを使用して三次元画像を作成するための顕微鏡システムである。 図２は、音響光学チューナブルフィルタ、内部全反射蛍光のコンデンサーと一実施形態による、ダイクロイックビームスプリッターを用いて三次元画像を作成するための顕微鏡システムである。 図３は一実施形態による全反射蛍光のコンデンサーを使用して三次元画像を作成するための顕微鏡システムである。 図４は、ダイクロイックビームスプリッターと、一実施形態に従った複数のビームスプリッターを用いて三次元画像を作成するための顕微鏡システムである。 図５は、一実施形態によるノンコヒーレント光源を用いた三次元画像を作成するための顕微鏡システムである。 図６は、ノンコヒーレント光源、ダイクロイックビームスプリッターと、一実施形態に従ったビームスプリッターの複数を用いて三次元画像を作成するための顕微鏡システムである。 図７は、一実施形態による単一カメラのマルチカラー三次元画像を作成するための顕微鏡システムである。 図８は、一実施形態に従って、４プレーンの単一のカメラで三次元画像を作成するための顕微鏡システムであり、 図９は、一実施形態による走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）本明細書で説明しように組み合わせて顕微鏡システムである。

本発明の例示的な実施形態の以下の詳細な説明は、本発明を実施することができる例示的な実施形態を、説明のために、示されている本明細書の一部とを形成する添付図面を参照している。これらの例示的な実施形態が本発明を実施する当業者を可能にするために十分詳細に記載されているが、それは他の実施形態が実現する可能性があることを、本発明の様々な変更が本発明の精神および範囲から逸脱することなく行うことができることが理解されるべきである。従って、本発明の実施形態の以下の詳細な説明は、要求されるよう、発明の範囲を制限するものではないが、説明の目的のために本発明の特徴および特性を記述するだけではなく、制限を提示される本発明の動作の最良のモードを記載すること、および十分に発明を実施する当業者が使用可能にする。従って、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ定義されるべきである。

定義
本発明を説明および主張する際に以下の用語が使用される。

単数形“ａ”、“ａｎ”および“ｔｈｅ”は、文脈が明らかに規定しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、“ビームスプリッター”への参照は、そのようなデバイスの一つ以上への参照が含まれている。

識別されるプロパティまたは状況に関連して本明細書で使用する場合、“実質的に”適度に識別されるプロパティまたは状況を損なわないように十分小さい逸脱の度合いを表す。許容偏差の正確な程度は、いくつかのケースでは、特定のコンテキストに依存することがある。

本明細書中で使用される、用語“蛍光”と“発光”を同じ意味で使用されることがあるし、そうでない場合は明示的にそのように記載がない限り区別は意図していないまたは暗黙的に指定される。同様に、このような“蛍光を発する”および“冷光を発する”や、“蛍光”と“発光”用語の亜種にも同義的に使用されている。

本明細書で使用する場合、“近位”は二つの構造や要素の近接性を指す。特に、“近位”として識別される要素は、正確な位置にあるかもしれない。このような要素は、必ずしも正確な場所でされることなく近くまたは場所に近いかもしれない。近接の正確な程度は、いくつかのケースでは、特定のコンテキストに依存することがある。

本明細書で使用する場合、複数の項目、構造要素、組成要素、および／または材料は、利便性のための共通のリストに表示される場合がある。しかし、リストの各メンバーが個々に独立した、ユニークなメンバーとして識別されているかのように、これらのリストは、解釈されるべきである。従って、そのようなリストのない個々のメンバーは、単に反対の兆候なく、共通のグループに自分のプレゼンテーションに基づいて、同じリストの他のメンバー事実上相当すると解釈するべきではない。

濃度、量、および他の数値データを範囲形式でここに表示される場合がある。それは、数値だけではなく、明示的に範囲の限界として列挙するだけでなく、すべての個々の数値またはサブ範囲を含むように含むようにこのような範囲形式は利便性と簡潔さのために単に使用されており、柔軟に解釈されるべきであることを理解すべきである各数値及び副範囲が明示的に列挙されているかのようにその範囲内に包含。例えば、約４．５、約１〜の数値範囲は、１などだけでなく、明示的に列挙さ約４．５〜１の限界、だけでなく、２として、個々の数字を含むように、３、４、およびサブ範囲を含むように解釈されるべきである２〜４等、３に同じ原則は、上記記載の値と範囲のすべてを含むように解釈されるべきであるような唯一の数値、“約４．５未満を、”朗読の範囲に適用される。さらに、そのような解釈は関係なく、範囲の幅広さや、記述されている特性が適用されるべきである。

本開示では、用語“好ましくは”または“優先”任意の手順では、任意の方法またはプロセスクレームに記載の“。好ましくは、限定されない”、それが意味することを意図されている場所の非排他的であり、どのような順序で実行されていることがあるクレームに記載された順序に限定されない。ミーンズプラスファンクションまたはステッププラスファンクションの制限は、特定のクレームの限定のため、以下の条件のすべてがその制限内に存在するどこに採用される。）明示的に記載されている“ためのステップ”や“手段”、ａとｂ）対応する関数が明示的に記載されている。ミーンズプラスファンクションをサポートする構造、材料または行為を明示的に本明細書の記載に記載されている。従って、本発明の範囲は、もっぱら添付の特許請求の範囲およびその法的同等物ではなく、本明細書の記載および実施例により決定されるべきである。

ノンコヒーレント光学顕微鏡
三次元の光活性化または光切り替え可能な蛍光タンパク質の同時、単一分子、マルチチャンネルの買収は、スキャンすることなく達成することができる。システムが利用し、全反射顕微鏡と複葉機イメージング顕微鏡を切り替えることが可能である。これは、後述するように、追加の画像検出チャネルを可能にすることができる。図１に示した実施例に従った顕微鏡システム１００は、スキャンすることなく三次元、単一の色、複葉機のイメージングのために提供されている。このような４０５ｎｍの１１２、４８８ｎｍの１１４および５６１ｎｍの１１６のようなレーザーは、複数の光源として使用することができる。他の波長、光源の数、および光源のタイプも使用できる。たとえば、システムが活性化し、プローブ分子の三次元（３Ｄ）画像を得るためのプローブ分子の読み出しのためのノンコヒーレント光源の使用が可能になる。特定の光源は、記載されてもよいが、光源の他のタイプはまた、本明細書に記載の活性化と読み出しの機能を提供するために使用することができる。４０５ｎｍのレーザーまたは他のレーザーは、プローブ分子のサブセットを活性化するために使用することができる。強度の選択した範囲は、例えば、一度に分子の唯一の疎サブセットを変換するために使用することができる。少なくとも一つの活性化の光子との少なくとも一つの分子を活性化する。力が異なるが、約０．０１μＷから１．０ｍＷまでパワーがある場合には適していることができる。使用される電力は、特定のプローブ分子と試料の特性に依存することができる。４８８ｎｍのレーザーは、変換の前に自然な状態で光変換可能な蛍光プローブを検出するために使用される。光変換可能な蛍光プローブは、変換の前に緑色のプローブ分子として存在することができる。５６１ｎｍのレーザーは高出力を有して、直ちに４０５ｎｍのレーザーによる変換後、続いてＣＣＤカメラ１５５によって励起光のコレクションのために提供し、変換後の蛍光プローブを励起する。蛍光プローブは、その後、このように人口からプローブを削除し、退色受けることができる。特定のレーザーがここで言及されているが、他のレーザーを使用することもできる。このプロセスは、不可逆的な切り替え可能な蛍光プローブを、禁止するこれらの分子のさらなるイメージングを組み合わせた。通常は、レーザーからのハイパワーは、プロセスの全体的な時間を短縮するために使用することができる。一般的には、２５ｍＷの最小値を考慮してもよい。下の権力は、画像取得時間を増やす可能性がある、使用することができる。非常にハイパワー５６１ｎｍのレーザーを使用、例えば２００ｍＷとは、例えば、励起、収集及び低出力レーザーや光の光源に起因するよりも、漂白のかなり急速なプロセスになる可能性がある。

他のプローブ分子が適しているかもしれないが、ここで使用されるプローブ分子は、一般的に蛍光体にすることができる。蛍光体は、順次または同時に撮像することができる。システムは三次元でそれぞれの蛍光体をローカライズするために構成された蛍光体の局在のモジュールを含めることができる。サンプルでは、光活性化または光切り替え可能な蛍光タンパク質または化学結合によって接続された光活性化または光切り替え可能な蛍光分子による光活性化または光切り替え可能な蛍光脂質または脂質を含む生体膜内に存在する光活性化または光切り替え可能な蛍光分子（ＰＡＦＭｓ）を有する細胞を含むことができる。一例では、化学結合が共有結合することができる。一つのオプションの局面において、細胞は材料の少なくとも二つの異なる部分集合の同時または連続撮影を可能にするためにＰＡＦＭｓの少なくとも２種を含めることができる。ＰＡＦＭは、別のプローブ分子にエネルギーを転送したり、別の分子からのエネルギーを受け入れるようにフォースター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用するように構成できる。大まかに、ＰＡＦＭはエネルギー伝達のドナーやエネルギー移動のアクセプターすることができる。

ソフトウェアで制御アコースティック光学チューナブルフィルタ（ＡＯＴＦ）１２０は、適切に同時に光源を減衰させ、活性化、励起および漂白の効率を制御する機能を提供する。例えば、４８８ｎｍの光源では、画像への一つ許可または目に見える緑色蛍光から赤色蛍光へ、波長４０５ｎｍの光源で、変換前に光活性化蛍光タンパク質を探す。ＡＯＴＦはまた、客観的なバック開口部内での励起の角度や位置を制御することができる。

ＡＯＴＦは、変調光ビーム用光源の強度の外部制御を提供することができる。ＡＯＴＦは、光ビームの方向や位置を制御するために使用することができる。ソフトウェアは、独立して、他のフィルタの光源の照度、方向や位置を変化させるＡＯＴＦを制御するために使用することができる。ＡＯＴＦは、少なくとも一つの波長の照明の時間依存のシーケンスを提供するために、光源を制御するように構成することができる。光ファイバは、ＡＯＴＦに光源を接続することができる。光ファイバ結合器は、単一の出力光ファイバに複数の光源からのような２本の光ファイバに担持される光パワーを組み合わせることができる。システムはまた、既存のノンコヒーレント光源と全内部反射蛍光（全反射）コンデンサー１２５を使用することができる。コンデンサーは、ＴＩＲＦに必要な臨界角から再び完全と戻ってサンプルを貫通することができる定期的な照明への切り替えを可能にするピエゾ駆動モータを含む閉ボックスを含めることができる。

図１を参照すると、ＴＩＲＦのコンデンサー１２５は、（場合によっては顕微鏡スタンド１６０に見つけることができる）、励起経路のフィールド口径１４５Ａの使用を容易に取り外すことができる。ＣＣＤカメラ１５５は顕微鏡複葉画像取得の三次元面（送信および反射光路の分離）を達成するために５０分の５０ビームスプリッター１５０の使用に対応するために、スタンドから取り外すことができる。また、フィールドの開口１４５Ｂとバンドパスフィルタ１７５は、ＣＣＤカメラと顕微鏡のスタンドの間に含めることができる。三つの光源１１２、１１４、１１６は上記のように、使用することができる。光源は、光活性化分子の変換に便利である。すべての三つの光源を同時に既存のソフトウェアを介して自動化されたと減衰可能な方法でシステムに配信することができる。光学系１４０Ａ−Ｄは、セットアップ顕微鏡の励起と検出の両方のパスに追加することができる。

ＣＣＤカメラは、電荷結合素子（ＥＭＣＣＤ）１５５を多重化する電子であり得る。一つの代替態様においては、カメラは複数のカメラを備えることができる。外部の液体クーラーは、ＥＭＣＣＤを冷却するために使用することができる。液体冷却は、ＥＭＣＣＤを冷却する熱電冷却を使用することができる。ＥＭＣＣＤは、少なくとも二つの検出チャンネルを含めることができる。カメラは、透過光のチャンネルから画像をキャプチャすることができる。一態様では、透過光は、微分干渉コントラストで撮像することができる。カメラは、単一の瞬間または時間の関数として一つ以上の分子の画像をキャプチャすることができる。システムは、カメラとの通信で、粒子解析モジュールが含まれており、粒子追跡の分析を提供するように設定できる。

試料内の光活性化染料は紫外線活性化で活性化することができる。染料は、４８８ｎｍまたは５６１ｎｍの光により蛍光を発するし、漂白するように励起することができる。システムおよび方法は、スキャンすることなく、サンプルの約１〜２ミクロンの厚さに比べて三つの次元空間中の染料の収集を可能にする。

光ビームスプリッター１５０は、二つのビームに光ビームを（通常は検出パス内）に分割するために含まれている。例えば、ビームスプリッターは５０−５０ビームスプリッターや偏光ビームスプリッターすることができる。分割するビームは、カメラに集束し、検出および／またはカメラで撮影されたサンプルの、異なるオブジェクトの面を撮影、またはむしろ別のオブジェクトの面に由来するサンプルからプローブの発光できるように、別の面に焦点を当てた二つのビームの作成。異なるオブジェクトの面からの画像は、ソフトウェア、ファームウェア、あるいはハードウェアを使用して、三次元画像を作成するために使用することができる。ビームスプリッターで分割するビームは、異なる光路長を有する二つのビームになることがある。光路長の違いは、複数の異なるオブジェクトの面でイメージサンプルに利用することができる。

システムは、光ビームを向けるために１３０Ａ−Ｂ、１３２、ミラーの複数を含めることができる。様々な光学、開口部、ビームスプリッターなどのシステムで使用されては、図１に示すように建設鉄道１６５、またはマイクロダブテールレール１７０、上にインストールすることができる。図１のシステムは、テーブル１０５や他の面に設定することができ、またデータを処理し、ソフトウェアを操作するために構成されたプロセッサを有するコンピュータ１１０を含めることができる。

図２を参照すると、顕微鏡システム１０１は、図１のシステムに多くの点で似ているが示されている。しかし、図２は、光ビームの二つの波長を分離するためのダイクロイックビームスプリッター１８５を含んでいる。各波長の光ビームは、さらに５０〜５０ビームスプリッター１５０、１５０Ａで区切ることができる。追加の光学１４０ｅは、１７０Ａ １３２Ａ、マイクロ蟻レール、カメラ１５５Ａ、等にも対応し、追加のビームを捕捉するために使用されることがあることを反映している。このように、四つのビーム四ビームのパスが作成される。このシステムおよび方法は、スキャンせずに三次元、同時２色複葉機のイメージングを可能にする。サンプル内の二つの光活性化染料は、同時ＵＶの活性化を受けることができる。さらに、これら二つの今切り替え、または活性化、染料は、同時に励起することができる。カメラ１５５は、１５５Ａはほぼ同時にスキャンすることなく深さの約１〜２ミクロン以上の三次元空間における二つの色素からの画像や発光を収集するために使用されている。なお、図２の例は、二つの異なるビーム経路に沿って４ビームの生成を示し、それはビームが実際にはビームスプリッターの任意の適切な組み合わせを使用して、任意の回数を分割することができることを理解すべきである。例えば、ビームは波長、偏光などによって分離することができる８種類のビーム経路に分割されることがある。

図３−４は、図１および２に示されている実施形態と多くの点で同様である。これらの例では、全反射のコンデンサーの１２５Ａは、自動化された角度のコントロールが含まれている。また、前の例の１３０Ａ−Ｂのミラーは、角度を制御する全反射器を使用する１８０Ａ−Ｂ可視ミラーとキネマティックミラーマウントに置き換えられる。それは、全反射集光が対物レンズの中心に近対物レンズを通過する間に光パスを変更するために使用できることに留意されたい。全反射集光は、対物レンズと背面の側に近対物レンズの部分を通過するビームのパスを変更することができる。そのような改変は、光源のビームがサンプルをサポートすると光源のビームは完全に内部基板と試料との界面で反射させる基板を通過させる間を切り替えるために使用される。光源のビームは完全に内部インターフェイスで反射されている場合、サンプルの全体の深さは照射され、一方で、光源のビームは、基板とサンプルを通過するところでは、ほんの１００〜数百ナノメートル未満の厚さの層は照明される。これにより、ユーザーはさまざまなバックグラウンドの抑制とサンプルへの異なる深さのアクセスを別の画像モードを切り替えることができる。具体的には、光源のビームが基板を通過するときに、光ビームは、イメージングのための最初のオブジェクトの面を第１の光路の長さになる。光源ビームを基板内に反映されると、ビームからのエネルギーは、基板の外側の小さなエリア内に存在しており、基板に隣接するエリア内のプローブ分子の発光を引き起こす可能性がある。基板に隣接する地域からの照明は、イメージングのための第２の光路長の番目のオブジェクトの面を作成する。一方で、図１−２は、分割伝送から全反射するためにソースビームを切り替え、別のオブジェクトの面でのプローブ分子の画像を得るために複数の光路長を持つように光ビームは、同様に三次元イメージングの有用異なる光ビーム経路につながる可能性を説明する。

さらに全反射の使用に関して、光ビームを全反射するための臨界角、上記の角度でサンプルをサポートする光インターフェイスに送ることができる。全反射は、自動的に最適な全反射の角度を決定するために構成された自動化された全反射のモジュールを含むことができる。一態様では、自動化された全反射モジュールはまた、全反射と広視野顕微鏡のための臨界角の間に急速に調節することができる。ＴＩＲＦモジュールはまた、急速に別の全反射角の間で変調するように構成することができる。自動化されたビームステアリング装置は、試料内の光ビームを傾けるために使用することができる。自動化されたビームステアリング装置は、全反射顕微鏡のための、またはシートの照明を行うために使用することができる。例えば、自動化されたビームステアリング装置は、光源の平行からのサンプルを介して画像面に少なくとも一つの光ビームを操縦するように設定シートの照明ビームステアリング装置であってもよい。シートの照明は、イメージングのためのサンプル内のオブジェクトの面を提供するために使用することができる。このオブジェクトの面から撮影した画像は、本明細書に記載の三次元画像を作成するために当技術分野において公知の方法をキャプチャ記載または他の画像を説明する方法のいずれかを介してキャプチャされた他の画像と組み合わせることができる。

図３は、ＴＩＲＦは、顕微鏡スタンド１６０に向かって最初のパスに沿って光ビームを方向付けることを示している。図４は、ＴＩＲＦは、光ビームを、最初のパスに対して角度を付けられた顕微鏡スタンド１６０ａに向かって方向付ける。図４の縦の点線は、図２に示すものと、行の右にあるコンポーネントが同じである。行の左に、ＴＩＲＦコンデンサー、鏡、光ビームのパスが変更されている。また、図４の顕微鏡スタンドは、図１または３のバンドパスフィルタを含むことに留意されたい。

図５は、図５に示されるように、システム１０１のためにノンコヒーレント光源を使用する以外は、図１の実施形態に多くの点で類似した形態を示している。４チャンネル減衰可能、モジュラー発光ダイオード（ＬＥＤ）ユニット１２７は、光源として使用される。チャネルごとに＋／−５０ｎｍにおいてＬＥＤユニットは、波長３６５ｎｍ、４７０ｎｍ以下、５３０ｎｍで、および５９０ｎｍの波長を提供することがある。それは、４チャネルＬＥＤユニットが不要で、チャンネルの数が特定のアプリケーションの要件に従って変更される可能性があることを理解すべきである。それは、レーザー光源がコヒーレント光を提供するのに対し、ＬＥＤは、ノンコヒーレント光を提供するため、ＬＥＤ光源が使用できることが重要である。前の三次元プローブ分子イメージング技術は、コヒーレント光源に依存している（例えば、レーザー）とノンコヒーレントな光で動作するようにできていない。ＬＥＤはコストを用いることも有効とレーザーを扱うよりも簡単に処理することができる。ＬＥＤはまた減衰可能である。近くのプローブ分子を汚すことなく、本明細書に記載のＬＥＤなどのノンコヒーレント光源を使用すると、イメージングが可能になる。さらに、ＬＥＤの使用は、レーザーベースのシステムで問題をされている予測不可能な干渉パターンを（“スペックル”）除去することができる。ＬＥＤの光は徐々に十分な近くのプローブが検出および／または発光が低下した前にイメージングできることが広がる。２番目のサブセットを検出する準備ができておよび／または結像される前に、さらに、拡散徐々には、検出および／またはプローブ分子の第１のサブセットのイメージングが可能になる。

図６は、図４の実施の形態に多くの点で類似した形態を示している。図５のように、ＬＥＤユニット１２７は、光源として使用される。図２のように、ダイクロイック１８５は、二つのカメラが１５５、１５５Ａ上に結像することができる光ビームの複数の波長を分離するのに使用できる。いくつかの実施形態では、後述するように、単一のカメラは、図２、４または６に示すように四つの光ビーム経路から画像を取得するために使用されることがある。

図７は２色、単一のカメラ、複葉機、三次元イメージングのためのシステムの実施形態を示している。図７の上の部分は、図１に示すシステムの部分に似ており、本質的に図７の下部に示すように四方向のビーム分割を達成するために複製される。ダイクロイックビームスプリッター１８５は、二つの光ビームに、単一の光ビームからの赤色と緑色の光を分離するために使用される。これらの光ビームのそれぞれは、ビームスプリッター１５０、１５０Ａを使用して分割し、カメラのＣＣＤチップ１５５ｄ上に結像される。ＣＣＤチップは、イメージングのための四つの地域ごとに異なる入力光ビームを持つことができる。示されているシステムは、単一のカメラのチップに分割する４方向ビームを容易にするために、以前に説明されている上記の追加のミラー１３２Ｂと光１４０ｅを含めることができる。

図８は、図７に示すシステムに、多くの点で同様のシステムを示している。図７のダイクロイックビームスプリッター１８５７は５０から５０ビームスプリッター１５０Ｂで置き換えられる。この構成では、一つの色、四つの平面、単一のカメラ、三次元イメージングが可能になる。

図５−６の実施形態は、非走査型複葉機イメージングシステム／方法で使用されているＬＥＤユニットを示すが、ＬＥＤはまた、実施形態によって、同様にスキャンアプリケーションを用いた三次元イメージングシステムで使用されることがある。例えば、ＬＥＤは、一般的にＰＡＬＭイメージングと呼ばれるものに使用することができる。ＰＡＬＭ画像の詳細は知られており、詳細にここに記載されていません。しかし、ＰＡＬＭのシステムでここに記載されたノンコヒーレント光源の使用が知られているＰＡＬＭのイメージング技術を介して追加の利点を提供することができる。

それは、上記実施形態では光路分岐をスキャンすることなく厚いセクションのサンプル上のプローブ分子のイメージングを可能にするために使用されているビームスプリッターを使用してことに留意されたい。

フィールドの開口は、励起光または放射線からのサンプルの部分をブロックするようにシステムに組み込むことができる。これは、バックグラウンドノイズを低減し、またその時点で撮像されることを意図されていないサンプルの地域の活性化と漂白を避けることができる。カメラのチップをマルチプレーンの配置で同時に画像をいくつかのサンプルの面に共有されている場合、それはまた、関心の異なる領域（ＲＯＩ）の間の重複を減らすことができる。フィールドの開口部がなければ、サンプルの部分が励起され、機器の前に漂白またはユーザーは、発光を測定することができる。さらにこのような発光は、周囲のでなければ、イメージの品質や、サンプルの対象領域の検出された発光を中断される場合がある。

ビームステアリング装置やサンプル移動装置は、（一態様では、サンプルの段階であってもよい）、サンプルの画像他の部分にサンプルに沿って上下に活性化／励起ビームを移動するために使用することができる。一態様では、ビームが試料六ミクロン以上な限り一次元の画像ができるまでの操縦やダウンタイムで約１ミクロンとすることができる。システムおよび方法は、スキャンすることなく一度にすべてのサンプルの全体の１〜２ミクロンのセクションを処理することができる。さらに、深さで画像がステージを移動して、スキャンすることなく行うことができる。

サンプルのイメージング厚い光学セクションの以前の方法は、スキャニングや画像をスタッキングが含まれていた。画像を重ねるとき、焦点は変更されず、分解能が失われる。サンプルで上下に移動する場合は、より多くの歪みが作成される。例えば、実際に球状の物体と思われるものをスキャンして、スタックを介して発生する歪みに楕円表示されることがある。したがって、本明細書に記載したアプローチは、通常、これらの画像アーチファクトの多くを避けることができる。

ＴＩＲＦのコンデンサーを使用すると、一つの追加チャンネルがさらにイメージを作成することができる、一つは複葉機の検出と組み合わせて全反射照明を使用することができる。３Ｄ複葉機のイメージングを可能にしながらこれは、バックグラウンドの低減を可能にするであろう。また、全反射のコンデンサーでは、光活性化プローブを使用することを必要とされていないことは注目に値する。任意の蛍光プローブを使用することができる。

システムは、画像構成のモジュールを含めることができる。画像の構築モジュールは、回路またはプロセッサとソフトウェアを含めることができる。画像構成モジュールは別売りと顕微鏡システムやと一体的に構築することができる。画像の構築モジュールは、異なる焦点面または対物面から撮影した画像を取得し、三次元画像の出力を生成するために、それらを組み合わせることができる。カメラで撮影した画像は結合された撮影画像のリアルタイム三次元ディスプレイを提供するために、リアルタイムでの画像構成のモジュールで構成することができる。時間あたりのアクティブなフルオロフォアの数が所定のしきい値の間にあるときに画像集録モジュールは、自動的に蛍光画像、および自動的にトリガ画像取り込みを監視するために使用することができる。画像の構築モジュールは、カメラから画像を分析し、時間とともに変化する、単一のスカラー値を生成し、総蛍光と関心領域を定義したユーザー内のしきい値の蛍光の値以上の画素数の少なくとも一つを算出するように構成することができる。

本明細書に記載する染料の一部は、彼らが最初にアクティブにし、励起している意味、光活性化可能であるが、それは暗い状態に駆動し、ときに暗い状態から、彼らが再び表示撮像されている以外の光活性化染料ことを理解すべきである。シングルステップの染料やプローブを使用することもできる。例えば、シングルステップの色素は、活性化／励起してワンステップで漂白されて使用することができる。本明細書で説明する色素は赤と緑の色が含まれているが、それは色素が多くの異なる色にすることができることを理解すべきである。右の波長での適切なレーザーまたは光源は、アクティブおよび／または使用されている色を励起するために使用することができる。

一実施形態では、高めの分解能と三次元画像を提供できると光学顕微鏡のシステムが提供される。以下の議論は、特定の個々の図を参照していないものの、記載されているシステムは、図１−９と実施形態の上記の説明を参照することにより理解されることがある。顕微鏡システムは、プローブ分子を複数有するサンプルをマウントするためのサンプルステージを含めることができる。このようなノンコヒーレントまたはコヒーレント光源としての光源は、試料を照明するために使用することができる。少なくとも一つのレンズは、冷光を発するためにプローブ分子を引き起こしてサンプルに向けて少なくとも一つのノンコヒーレント光源からの光のビームを向けるように構成することができる。カメラは、プローブ分子からの発光を検出することができるし、光ビームの経路修正モジュールは、オブジェクトの面の複数箇所にカメラの発光検出を可能にするプローブ分子の発光のパスの長さを変更することができる。システムはまた、冷光を発する原因となったプローブ分子の数を制限するために光ビームを制限するように構成フィールドの開口部を含めることができる。音響光学チューナブルフィルタを微調整するために、光源のパワーを設定することができる。焦点モジュールは、自動的に試料内の光源の焦点面を維持するために使用することができる。

一態様では、光ビームのパスの修正モジュールは、少なくとも二つのビーム経路にプローブ分子の発光を分割するように設定ビームスプリッターすることができる。この例ではカメラは、少なくとも二つのビームのパスからプローブ分子の発光を検出するように設定できる。ビームスプリッターは、二色でプローブが発光したり、分割後の前の光の少なくとも二つの波長にプローブの発光を分離するためのダイクロイックビームスプリッターすることができる。プローブの発光を分割した少なくとも二つのパスの最初のパスは、少なくとも二つの波長の第一の波長に対応することができ、プローブの発光を分割した少なくとも二つのパスの２番目のパスは、に対応できる。少なくとも二つの波長の第二の波長。ビームスプリッターは、偏光ビームスプリッターすることができる。ビームスプリッターは、５０：５０ビームスプリッターすることができる。さらに、ビームスプリッターは、サンプル内に追加の焦点面のイメージングを提供するためにビームスプリッターを複数含めることができる。ビームスプリッターの複数のダイクロイックミラー、５０：５０ビームスプリッター、および偏光ビームスプリッター、またはビームスプリッターの他のタイプの任意の組み合わせを指定できる。例えば、ビームスプリッターの複数の５０：５０ビームスプリッターと二つの偏光ビームスプリッターすることができる。別の例として、ビームスプリッターの複数の２枚のダイクロイックミラーすることができる。別の例として、ビームスプリッターのビームの複数は、少なくとも一つのシリンドリカルレンズのビームスプリッターを含めることができる。

別の態様において、上記と同様、より詳細に説明してきた、光ビームのパスの修正モジュールは、少なくとも四つのビーム経路にプローブ分子の発光を分割する二つ以上構成されてビームスプリッターを含むことができる。カメラは、少なくとも四つのビーム経路からプローブ分子の発光を検出するように設定できる。

別の態様では、光ビームのパスの修正モジュールは、拡張軸方向の範囲で三次元画像を作成するためのオブジェクトの面の複数箇所にプローブの発光のためのサンプルをスキャンするように構成リニア走査装置を含むことができる。

他のコンポーネントがシステムに含まれ得る。例えば、内部全反射蛍光コンデンサー（全反射）またはＡＯＴＦは、対物レンズの側（または周辺）に近位領域との中心に近位領域との間の光ビームのビーム経路を変更するように構成することができる対物レンズ。他のスタンドが適していることができるものの、広視野の顕微鏡スタンドは、サンプルをサポートするために使用することができる。アイソレーションテーブルは、システムの振動を軽減し、収集したデータに導入されて望ましくないアーチファクトを防止するために使用することができる。

一態様では、システムは複数の光源を含めることができるし、複数の光源の少なくとも一つは、レーザーすることができる。レーザーは、刺激的な二光子蛍光または２光子光化学の可能なレーザーことができる。ノンコヒーレントおよびコヒーレント光源を組み合わせて使用することができる。一態様では、ノンコヒーレント光源は点光源にすることができる。光源には、アクティベーション光源または読み出し光源にすることができる。活性化と読み出し光源は同じ光源または別の光源にすることができる。活性化および／または読み出し光源は、コヒーレントまたはノンコヒーレント光をすることができる。活性化と読み出し光源は、両方のコヒーレントまたはノンコヒーレント光である必要はない。上述したように、ノンコヒーレント光源は、ＬＥＤまたはノンコヒーレント光源の他のタイプを含んでもよい。レーザー光源は、コヒーレント光源として使用することができる。一態様では、レーザー光源は、少なくとも一つの変調レーザーの偏光を含むことができる。複数の光源は、試料面内に複数の偏光を提供するために使用されることがある。

フィードバックモジュールは、カメラの総蛍光出力を表すアナログ電圧を使用して画像取り込みをトリガするユーザーからのフィードバックを提供するために使用することができる。一態様では、フィードバックモジュールは、画像の総蛍光に比例ピッチとオーディオ出力を提供するために、電圧に接続されたスピーカーを含めることができる。アナログ回路は、電圧が所定範囲内にあるときにＴＴＬの論理パルスを生成するために使用することができる。集積回路や電圧コンパレータは、ゲートの画像取得にカメラにＴＴＬの電圧を適用することができる。

グラフィックスプロセッシングユニット（ＧＰＵ）蛍光物質の局在のモジュールとの接続にすることができ、蛍光体をローカライズするための蛍光物質の局在のモジュールの処理を提供するように設定する。さらに、グラフィカルユーザーインターフェイスは、キャプチャした画像、三次元モデルを作成、および他のデータと対話するユーザーのためのインターフェイスを提供するために使用することができる。

一態様では、システムは自動的に画像サンプルの複数のウェルを一つのサンプルから別のサンプルに移動するように設定、マルチウェルプレートのイメージングモジュールが含まれる場合がある。マルチウェルプレートのイメージングモジュールは、自動的に最適な画像を提供するために、任意の方向にサンプルを変換するように構成することができる。また、マルチウェルプレートのイメージングモジュールは、単一の細胞内コンパートメント内で同時に画像に個々の分子の任意の数を設定することができる。

サンプル中の分子の分子と分子の結合は、分子間結合の測定モジュールを用いて測定することができる。サンプルは、必要に応じて生きている細胞を含むことができる。いくつかの状況で、それは様々な環境にし、異なる条件下におけるこれらの細胞の画像に役に立つかもしれない。システムがここに一つの代替の局面においてｉｎ ｖｉｔｒｏのサンプル、ｉｎ ｖｉｖｏのサンプル、ｅｘ ｖｉｖｏのサンプルで、サンプルに使用される説明に従って、サンプルをガスでインキュベートすることができる。ガスインキュベートしたサンプルの場合、システムはさらに、サンプルをインキュベートされているガスを制御するように構成されたガスの制御モジュールを含むことができる。よりよいサンプルの環境を制御するには、システムは、サンプルおよび／または試料の湿度を制御するように構成された湿度の制御モジュールの温度を制御するように構成された温度制御モジュールを含めることができる。

システムは、サンプルの同時または連続イメージングのための従来の顕微鏡を含めることができる。交互に、またはさらに、システムは、カメラと同時にまたは連続してサンプルの電子顕微鏡画像を取得するために構成された電子顕微鏡を含めることができる。企図電子顕微鏡のいくつかの例では、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）および透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）が含まれている。例示的な一実施形態では、システムは、ＳＥＭ内部に配置することができる。図を参照する。図９に示すように、ＳＥＭは電子顕微鏡下で倒立蛍光学顕微鏡（ＥＭ）が設けられている。ＳＥＭの構造は、通常、ＥＭの下に空洞が含まれている。システムは、ここにＳＥＭの空洞内に配置または構成されていてもよい。図は、図で説明されているシステムよりも単純な蛍光学顕微鏡を示しているけれども、図１は、例えば、人は容易に現在のシステムは、個々のＳＥＭまたは本明細書に記載の顕微鏡システムよりも多くの機能やアプリケーションと大規模なシステムを作成するためのＳＥＭ顕微鏡に統合できるかを理解することができる。電子顕微鏡は、カメラによる画像取得と同時にサンプルの画像を表示するように設定することができる。

本明細書に記載されるように、システムはｉｎ ｖｉｖｏで、ｅｘ ｖｉｖｏで、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの画像、分子、物質、細胞、組織、生物生存又は保存するかどうかできる。システムイメージは、これらの分子、組織、等できる場所潅流、温度、湿度などの環境条件を満たすことが必要。一態様では、システムに関する情報を収集および記録するために使用することができる。
ａ）のインフルエンザウイルスから発現タンパク質に結合してＰＡＦＭ
ｂ）脂質に接続されているＰＡＦＭ
ｃ）ＰＡＦＭｓは、を含む癌の生物学に装着が、がんと核アーキテクチャのすべての形態に限定されない
ｄ）膜を含む生物学ではなく、機能、細胞間相互作用や疾患に関連する欠陥の重要な蛋白質の表面での限られたウイルスの取り込みおよび発現、および
ｅ）これらに限定されない、末梢神経障害、アルツハイマー病、多発性硬化症、シナプス機能、脊髄損傷や神経の変性と再生を含む、神経科学の生物学と疾患に添付されたＰＡＦＭ。

先行技術と比較してシステムの利点は、本明細書に開示のＬＥＤを使用することである。 ＬＥＤは、ノンコヒーレント光源を提供し、はるかに安価レーザー光源よりもすることができる。もう一つの利点は、レーザーの制御だけでなく、三次元サブ回折顕微鏡システムにおける全反射のコンデンサーの使用のためのオートメーションの使用（ＡＯＴＦ）である。システムは、市販の顕微鏡プラットフォームを利用することができる。このようなプラットフォームへの調整は最小限である必要があり、消費者やメーカーにコスト削減を提供することができる。システムおよび方法の別の利点は、マルチチャネル軸、複葉機の画像取得を可能にするデュアルカメラの使用、である。

顕微鏡のシステムと方法は同じ顕微鏡に全反射し、複葉機のイメージングだけでなく、マルチチャネルの獲得の両方を提供することができる。このシステムは、一般的に二次元イメージング、および単一チャネルの買収に対応するためにだけできる従来のシステムよりも明らかな利点を提供する。他の３Ｄ画像システムは、全反射のコンデンサーを使用しないでください。システムおよび方法も同じくらい７５％未満、既存の従来のシステムよりもかなり少ないお金のために小売りすることができる。

例
例の複葉機蛍光光活性化ローカライゼーション顕微鏡（複葉ＦＰＡＬＭが）について説明する。ティルフォトニクスＩＭＩＣ顕微鏡のバージョンは、この手法で使用するために変更されました。顕微鏡自体は、従来の商用システムに比べて、非常に型破りであるという点で、それはモジュラーであり、他のシステム、例えば、接眼レンズに見られる基礎を欠いているユニークなプラットフォームを提供する。さらに、ＩＭＩＣは全体の光パスへのアクセスが容易に本明細書に記載したすべての反復で使用するためにシステムを操作することができる。さらに、システムは、全反射のコンデンサーの除去と、それが正常範囲に添付される顕微鏡、から離して配置することができる。これは、全反射ミラーと、スコープの内部コンポーネントであるビームステアリング装置との間の複葉機のための追加の光学系の配置を可能に。最後に、画像取得ソフトウェアは、ビジョンまでは、少しの適応と複葉機と複葉機ＦＰＡＬＭの画像のキャプチャに最適であることが判明した。コレクションは、ソフトウェアの内因性の関数であり、画像解析ソフトウェアで使用可能な形式にファイルをエクスポートすることができる。

システムは、振動と単一分子の分解能の画像を達成するために他の環境な障害からシステムを隔離フローティング表面を提供する、３５”×５９”×４”（技術製造会社）を測定し、アイソレーションテーブル上に建設された。さらに、テーブルはさらに四つの分離パッド、テーブルの各脚部（Ｋｅｌｌｅｔｔ企業）の下でいずれかのテーブルを配置することにより、振動から緩衝した。テーブルは、維持の両方の家のエアレギュレータと圧力計とインラインレギュレータの採用によって規定された家の空気と４０ポンドの圧力を使用して浮かんでいた。空気は、３００ｐｓｉの空気ホースを介して実行されました。サイドの棚を構築するすべてのコンポーネントを容易にするため１４”×３６”、全反射のコンデンサーのコントローラのための住宅の電気部品を測定する、テーブルに登録されました。さらに、サブシェルフは顕微鏡だけでなく、全反射のコンデンサーコントローラ用の電源用電子制御ユニットを収容する、１８を測定する、テーブルの下部に“×４０”を追加した。それが分離され、これらの部品のために必要がないとしてここで説明する二つの棚には防振がないことに注意してください、また顕微鏡やコンデンサーに電気的な接続を介して棚の伝達振動を行う。

このアプリケーションのＩＭＩＣ顕微鏡は４段階に加えて舞台と客観のタレットが配置されているトップを持つ基本スタンドで構成されている。ステージはＸ、Ｙ、Ｚ軸の微動を持って前に並進ステージであり、ティルヴィジョンソフトウェアによって制御される。さらに、顕微鏡の上部は、４種類の対物レンズまで保持し、対物レンズの変化が急速ティルヴィジョンソフトウェアを介して可能にタレットを収容する。このアプリケーションで使用されている対物レンズは、以下のとおりである。ＰＬＡＮ−アポクロマート１０ｘ／０．４５ＮＡ、ＰＬＡＮ−ＦＬＵＯＲ １００Ｘ／１．４５油；とＰＬＡＮ−ＡＰＯ１．２ＮＡ水６０倍。上から順に最初のレベルは、検出側の光と光路のための顕微鏡への入り口を提供する。内部的には、レベル１はまたフィルタースライダー、ビジョン一つが急速に複数のフィルタセットを切り替えることができるティルによって制御される自動化されたフィルタのスイッチングデバイスを収容する。フィルタースライダーはこれと他のアプリケーションに必要なフィルタキューブのためのプレースホルダが用意されている。このフィルタキューブではダイクロイック、（Ｓｅｍｒｏｃｋ＃ＤＩ０１−Ｒ５６１−２５ｘ３６、）と励起フィルタ、（Ｓｅｍｒｏｃｋ＃ＦＦ０１−６０５／６４−２５）が含まれている。フィルタは、直接タレットと対物レンズの下に位置している。レベル１と２をスパニング１４３ミリメートルの長さを持つツァイスチューブレンズである。２階にも外部励起光学列車に向かって顕微鏡本体の外励起ビームとＥＭＣＣＤカメラを映す鏡に位置している。一度アプリケーションをＦＲＥＴのためにＡｇｉｌｅｎｔが使用するレベル３は、ここで使用され、空白になっていない。ＩＭＩＣ家屋電子制御ユニットとティルヴィジョンソフトウェアを介して顕微鏡の自動化を駆動する電子機器のレベル４。

ＴＩＲＦコンデンサー、（フォトニクスティル、Ｐｏｌｙｔｒｏｐｅ）は、通常、励起ビームのパスが顕微鏡を入力するレベル１の顕微鏡に取り付ける顕微鏡のスタンドから削除されました。ＴＩＲＦのコンデンサーは、元の位置から約５５ミリメートルに置かれ、片側に約１６ｍｍで、顕微鏡本体の元のポートから相殺されている。これは、コンデンサーと入口ポートの間に一度光路を折り曲げることができました。ここでコンデンサーはビームステアリング装置として使用されました。複葉機の画像が中心や対物レンズの背面開口部の広視野の位置を使用して行われました。（これはまた、全反射の位置に戻って絞りの臨界角または側で行うことができる）。これは我々のアプリケーション用に最適化し、対物レンズへの凝縮器からのパスでビームの動きを可能にする。

ビーム経路に延びる光学系は、全反射のコンデンサーと顕微鏡スタンドの間に追加されました。これは、ＸおよびＹ軸におけるサンプルの曝露の程度を制限するために、検出側のフィールドの開口部の使用するために提供。これは、サンプリングされているフィールドのみが活性化（４０５ｎｍ）と読み出し光源（５６１ｎｍ）の両方に露出するように行われていた。自体をスタンド顕微鏡内で、対物レンズの背面開口部から開始し、全反射のコンデンサーに向かって移動すると、以下の光学系である。開口部から客観への出口は、次のビームを、焦点を合わせるビームのパス内のバック開口マウントされている色消しがあると、Ｆ＝２００ミリメートル、４００〜７００ｎｍから２００ミリメートルを測定する。この開口部の大きさはもののニーズを満たすように変更することができる（コンデンサーに向かって移動このレンズから２００ｍｍの距離は１ｍｍ×１．２ミリメートルフィールドのアパーチャは試料内の露光領域を規定する、あれ、ここに示されているサイズは、で使用されここで説明する楽器）。フィールドの開口部、追加のマウントされている色消しから２００ｍｍの距離、Ｆ＝２００ミリメートル、４００−７００ｎｍは、前の開口部にビームをコリメートするために使用される。二人は、Ｆ＝２００レンズやフィールドの開口部はすべてのスライドレールに取り付けられ、全反射のコンデンサーはＩＭＩＣに位置していた元の設定、で、ないエントリのポートとラインにあると位置付けていた。テーブルからレンズの高さは１９．５センチメートル（エントリのポートに中心）である。台座上にある、テーブルから１９．５センチメートル、および顕微鏡から遠いＦ＝２００レンズから５ｃｍで、２３ｃｍ離れた位置する第二のミラー（ミラー２）に反対ミラー（ミラー１）である。三つのミラーは全反射のコンデンサーと顕微鏡につながるレールの光学系との間の光路を折り畳む。ＴＩＲＦのコンデンサーは、ミラー２から２２ｃｍに位置していた。光路を折り曲げるための理由は二つある。最初に、慣例により、顕微鏡から最も遠い位置でＦ＝２００から２００ｍｍを可能にする。第二に、これはこの２００ミリメートルの長さのためだけでなく、部屋もスペースＴＩＲＦコンデンサーの元の焦点距離に対応できるようにすることができる。ＴＩＲＦコンデンサーフォーカルポイントとｆ＝２００レンズで必要とされる２００ミリメートルが両方とも表に追加されるとそれ故に、全反射のコンデンサーにスタンド顕微鏡のエントリポイントから直線ビームのパスの折り畳みをこの距離に対応することはできません。さらに、二つのミラーには二つ、Ｆ＝２００レンズには、このパス内で光源を調整する機能を提供している。ミラー２は顕微鏡とミラー１からｆ＝２００遠いためにビームを集束フィールドの開口部を介してビームを焦点と客観の背面開口部から２００ｍｍ位置している顕微鏡に近いＦ＝２００レンズ、に。ビームは曲がったりカーブではない、ストレートな方法で検出光学系を通って範囲に移動してください。これは、上記の調整で有効になっている。

この計測のための活性化と読み出しの波長を供給する構成は、波長４０５ｎｍと５６１ｎｍの両方の光源を含んだ。また、音響光学波長可変フィルタ（ＡＯＴＦ）、シャッター、および２Ｘビームエキスパンダーを使用した。５６１元で始まる、ビームが“ビームボックス”を介して二つの鏡と箱から出してビームを指示するために３番目のミラーまたはダイクロイックレンズのいずれかを含む小さなボックスを実行することができる。ここでは、５６１ビームのボックスに近傍界と遠方界の補正ミラー（調整可能）、サード方向ミラー（固定位置）の両方がある。放出されたビームが向けられたと遠方界の鏡に続くニアフィールドのミラーを、打撃ボックスに中央揃えされていること、そして箱の外方向のミラーで２番目のボックスに反映されているので、光源は、クローズボックスに置かれた４０５ｎｍの光源光学系を含む。二つの調整可能のミラー、（近傍と遠方界の調整ミラー）を使用すると、“光源を歩く”、または、単一の光路内に複数の光源のビームを線形化する能力を持っている一つのために貴重である。４０５ｎｍの光源は、以前は５６１ｎｍ光源のために説明したものと類似しているボックスに導かれる。しかし、４０５ｎｍのボックスは、ダイクロイックレンズと固定方向ミラーに置き換えられるが、このレンズは、このボックスに指示されている５６１の光源の光が４０５ｎｍのボックスのレンズや外を通過することができる。ダイクロイックレンズはまた、５６１の光源のビームと組み合わせること、測定波長：４５０ｎｍ光源の光を反映している。両方のビームは、５６１および４０５ｎｍのボックスの両方に沿って、３番目のボックス内に装着されるＡＯＴＦに向けられて。４０５ｎｍのボックスとＡＯＴＦボックス間に一つのＡＯＴＦに導入されて総称して光を遮断するためのシャッターである。これらのビームの２倍のコントロールがあるようにビームはａｔｏｆに送られる。私たちのアプリケーション、そして徐々に蛍光分子を切り替えるためには、疎な集合の形で、４０５ｎｍの光源、例えば、活性化の源は、非常に低いレベルまで減衰させることができる。これは、ａｔｏｆ関数を使用することで最適に達成され、このビームは、通常、ナノワットレベルに調整することができる。逆に５６１ｎｍビームは疎サブセットが切り替えられる度に、それは、分子を励起放射される光子を収集し、そして最終的に不可逆的に漂白剤分子が必要である、できるだけサンプルにとして多くの電力を提供することがある。個別にそれぞれとＮＤフィルタを使用せずに電力を規定しながらＡＯＴＦは、ビームの組み合わせを可能にする。手動でａｔｏｆ関数のリモート制御を介して各ビームの総電力レベルを設定することにより、総電力のレベルは、ソフトウェアのスライダーのタブは、光ビームのさらなる減衰を可能にするティルヴィジョンソフトウェア、に変換することができる。例として、４０５ｎｍの光が〜４００ｎＷ出力に設定することができる。これはスライダーのタブを使用してソフトウェアで可能な電力の１００％を表すことになる。したがって、０〜１００％のパワーやこのビームのための０−４０５ｎＷ可能な電力の範囲がある。最後に、ＡＯＴＦとともにティルＶｉｓｉｏｎソフトウェアの使用、ＩＭＩＣ顕微鏡とＥＭＣＣＤカメラは、システムがシステムの全体を通してのイメージの時間の取得にカメラのシャッター付きａｔｏｆ関数の光源のパルスを調整することができる。最後に、直接ＡＯＴＦ後２Ｘビームエキスパンダーがある場合もある。このビームエキスパンダーは、視野のより均一な励起の結果、ａｔｏｆ関数を残してビームを大きくすることができる。

励起し、放出された光子がために監督とＥＭＣＣＤおよび／またはカメラによって収集されている顕微鏡の検出側では、顕微鏡自体は、前述のように、残されることがある。ビームの高さは、顕微鏡の体を残して１４センチメートルいました。ビームが出射側の端をリードする顕微鏡の縁から１５センチメートル位置付けマウントされている色消し、Ｆ＝７５ミリメートル、４００−７００ｎｍのレンズを通して伝達される。からの追加２６．５センチメートルは、ａｆ＝２００ミリメートル、４００−７００ｎｍのレンズである。Ｆ＝７５を使用することはプラスで、ｆ＝２００は、一つの倍率（７５分の２００）の２．７に増加している。５．４センチメートルですぐに次のＦ＝２００レンズは、２０ミリメートルビームスプリッターキューブ、４００から７００ｎｍの、ｌａｍｂｄａ／１０である。このキューブは、放出された光子は、いずれか一つが、（ストレート）ビームスプリッター（光路を伝送される）、または２を介して直接、カメラへの近道を取ることができるビームを“分割”、またはより正確に等しい確率を提供する、ビームスプリッターからカメラへのミラーとし、長い光路（光パスを反映）に横に向けられる。反射されたパスにビームスプリッターカメラチップに光（光子）をリダイレクトするためにミラーの位置から９センチメートルがある。アンドールＥＭＣＣＤカメラは、両方の送信および反射光路が指示されているビームスプリッターキューブから７５ｃｍの距離で配置することができる。重要なことは、伝送および反射光パスは、カメラのチップの別の側面に向けられている。チップのこの分裂は、現在の光パスの両方を持つように、一つの画像で、私達が可能になる。カメラのチップの各半分均等に二つのパスを指示するために光学系を調整しながらこれらの光パスは、簡単に同時に両方の光路に、イメージングでここで既知の構造、４０ｎｍプロセスビーズを調整することができる。最後に、検出側の光学系の全体は、光タイトボックス内に収められてすることができる。そのような家の修理の店を形成して購入できるような一般的な建設資材は、ボックスを構築するために使用することができる。例えば、大きさにカット1/4合板は、木材の接着剤および検出ビームから放出顕微鏡の側にと周りしっかり収まるボックスを作成するための小さな爪を使用することができる。蓋は一ボックスを外すことなく、光学系へアクセスできるように、金属ラッチが使用してボックスを作成することができる。最後に、穴がカメラのための電子機器に入力すると、またカメラのための冷却管を可能にするために可能にするボックスに掘削することができる。

カメラを冷却すると、ノイズの比に適切な信号を提供することが重要である。アンドールＥＭＣＣＤは、ペルチェ冷却機構の一部として、内部ファンが付属している。しかしファンは、イメージ内に振動やドリフトを誘発する。ティルヴィジョンソフトウェアを介して、ファンを中断し、起因する振動やドリフトを排除する能力がある。外部の液体クーラーは、Ｋｏｏｌａｎｃｅ社から購入したクーラーとして、使用することができる。このラジエーターの冷却システムは、ファンの不凍液を使用し、ポンプは常にカメラを介して独自の冷却ポートの不凍剤を注入する。これらのポートは、液体冷却のために適応している。これは＜−９０°Ｆの温度に維持することができる。それは、液体冷却することによって達成気温だけではなく、カメラのファンの必要性をなくすだけファンが単独で提供できるカメラよりも着実にはるかに低い温度を維持し続けることは注目に値する。追加の冷却は、より良い画像を提供する。

最後に、全体のシステムは電子制御ユニットを介して顕微鏡とその部品に接続されているハイパワーのコンピュータを介して実行される。コンピュータは、ハードウェアの動きから画像の収集と分析に、システム全体を駆動するティルヴィジョンソフトウェアを使用している。

上記の詳細な説明は、特定の例示的な実施形態に関して本発明を説明する。しかし、それは様々な修正および変更が添付の特許請求の範囲に記載された本発明の範囲から逸脱することなく行うことができることが理解されるであろう。詳細な説明及び添付図面は単なる例示ではなく、のような制限とみなすべきであり、そしてすべてのそのような修正や変更は、もしあれば、説明するとここに記載された本発明の範囲内に含まれるものとする。

Claims (25)

1. 増強した分解能を有し、かつ三次元イメージを提供することが可能である光学顕微鏡であって、該光学顕微鏡は、
   複数のプローブ分子を有するサンプルを取り付けるためのサンプルステージと、
   少なくとも一つのノンコヒーレント光源と、
   該プローブ分子に発光させる、該少なくとも一つのノンコヒーレント光源からの光のビームを該サンプルに向けるように構成される少なくとも一つのレンズと、
   該プローブ分子からの発光を検出するように構成されるカメラと、
   複数の対物面においてカメラの発光検出を可能にするために、該プローブ分子の発光のパスの長さを変更するように構成される光ビームパス修正モジュールと
   を含む、光学顕微鏡。
2. 前記光ビームパス修正モジュールは、前記プローブ分子の発光を少なくとも二つのビームパスに分けるように構成されるビームスプリッターを含み、少なくとも一つのカメラは、該少なくとも二つのビームパスから該プローブ分子の発光を検出するように構成される、請求項１に記載のデバイス。
3. 前記デバイスは、前記プローブ発光を少なくとも二つの光波長に分離するための二色性ビームスプリッターをさらに含み、該プローブ発光が分けられる該少なくとも二つのビームパスのうちの第１の少なくとも一つのパスは、該少なくとも二つの波長のうちの第１の波長に対応し、該プローブ発光が分けられる該少なくとも二つのビームパスのうちの第２の少なくとも一つのパスは、該少なくとも二つの波長のうちの第２の波長に対応する、請求項２に記載のデバイス。
4. 前記光ビームパス修正モジュールは、前記プローブ分子の発光を少なくとも四つのビームパスに分けるように構成される少なくとも二つのビームスプリッターを含み、少なくとも一つのカメラは、該少なくとも四つのビームパスから該プローブ分子の発光を検出するように構成される、請求項１に記載のデバイス。
5. 前記光ビームパス修正モジュールは、三次元イメージの生成のために、前記複数の対物面においてプローブ発光に対して前記サンプルをスキャンするように構成される線形スキャンデバイスを含む、請求項１に記載のデバイス。
6. 前記システムは、対物レンズの側面に近い領域と、該対物レンズの中心に近い領域との間に前記光ビームのビームパスを変更するように構成される全内部反射蛍光（ＴＩＲＦ）集光器をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
7. 前記少なくとも一つのノンコヒーレント光源は、複数の光源を含み、該複数の光源のうちの少なくとも一つは、二光子レーザーを含む、請求項１に記載のシステム。
8. 前記カメラは、少なくとも二つの検出チャンネルを含む電子倍増型電荷結合素子（ＥＭＣＣＤ）を含む、請求項１に記載のシステム。
9. 前記システムは、任意の他のフィルタと無関係に、前記光源の照射強度および方向または位置を変えるために、ＡＯＴＦをコントロールするように構成されるソフトウェアをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
10. 前記ビームスプリッターは、異なる波長の蛍光を分離ように構成される二色性ミラーと、偏光ビームスプリッターと、５０：５０ビームスプリッターとのうちの一つ以上を含む、請求項２に記載のシステム。
11. 透過光のチャンネルは、微分干渉コントラストによってイメージ化される、請求項１に記載のシステム。
12. 前記システムは、粒子追跡の分析を提供するように構成される粒子分析モジュールをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
13. 前記サンプルは、生物的膜に存在する光活性可能または光スイッチ可能な蛍光性分子（ＰＡＦＭ）のうちの少なくとも２種を有する細胞を含み、該生物的膜は、光活性可能または光スイッチ可能な蛍光性タンパク質、または光活性可能または光スイッチ可能な蛍光性脂質、または化学結合によって付着された光活性可能または光スイッチ可能な蛍光性分子を有する脂質を含む、請求項１に記載のシステム。
14. 前記システムは、イメージ取得モジュールをさらに含み、該イメージ取得モジュールは、活性の蛍光色素分子の数が所定の閾値の間にある場合に、自動的に前記蛍光イメージを監視し、そして自動的にイメージ取得をトリガするように構成される、請求項１３に記載のシステム。
15. 前記システムは、前記カメラの全蛍光の出力を表すアナログ電圧を用いて、ユーザーにイメージ取得をトリガするフィードバックを提供するように構成されるフィードバックモジュールをさらに含み、該フィードバックモジュールは、電圧に取り付けられるスピーカーを含み、該スピーカーは、前記イメージの全蛍光に比例するピッチとしてオーディオ出力を提供する、請求項１に記載のシステム。
16. 前記プローブ分子は、色素蛍光分子を含み、前記システムは、三次元において各色素蛍光分子を局在化させるように構成される色素蛍光分子局在モジュールをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
17. 前記プローブ分子のうちの少なくとも一つは、光活性可能な蛍光分子（ＰＡＦＭ）であり、他のプローブ分子にエネルギーを転送するために、フォースターエネルギー転送を使用するように構成される、請求項１に記載のシステム。
18. 前記システムは、自動的に最適ＴＩＲＦ角を決定するように構成される自動ＴＩＲＦモジュールをさらに含む、請求項６に記載のシステム。
19. 前記システムは、ＴＩＲＦに対する限界角と広視野顕微鏡との間に高速に変調するように構成される自動ＴＩＲＦモジュールをさらに含む、請求項６に記載のシステム。
20. 前記システムは、異なるＴＩＲＦ侵入度の間に高速に変調するように構成される自動ＴＩＲＦモジュールをさらに含む、請求項６に記載のシステム。
21. 前記システムは、電子顕微鏡をさらに含み、該電子顕微鏡は、前記カメラを用いて、同時にまたは連続的に前記サンプルの電子顕微鏡イメージを取得するように構成される、請求項１に記載のシステム。
22. 増強した分解能を有し、かつ三次元イメージを提供することが可能である光学顕微鏡のための動作方法であって、該方法は、
    サンプルをステージに取り付けることであって、該サンプルは、複数のプローブ分子を有する、ことと、
    第１の対物面においてプローブ発光を引き起こすために、ノンコヒーレント光源を用いて該サンプルを照射することと、
    カメラを用いて、該プローブ分子の該第１の対物面から発光を検出することと、
    光ビームパス修正モジュールを用いて、第２の対物面においてプローブ発光の検出を可能にするために、プローブ分子の発光のパスの長さを変更することと、
    該カメラを用いて、該プローブ分子の該第２の対物面から発光を検出することと
    含む、方法。
23. ノンコヒーレント光源を用いて前記サンプルを照射することは、
    前記複数のプローブ分子のうちの少なくとも一つのサブセットを活性化させるために、ノンコヒーレント活性光を用いて該サンプルを照射することと、
    前記第１の対物面においてプローブ発光を引き起こすために、ノンコヒーレント励起光を用いて該サンプルを照射することと
    をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
24. 前記方法は、少なくとも二つのビームスプリッターを用いて、前記プローブ分子の蛍光を少なくとも四つのビームに分けることをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
25. 前記方法は、前記プローブ蛍光を分ける前に、または後に該プローブ蛍光を少なくとも二つの光波長に二色性的に分離することをさらに含み、該プローブ発光が分けられる該少なくとも四つのパスのうちの第１の少なくとも二つは、該少なくとも二つの波長のうちの第１の波長に対応し、該プローブ発光が分けられる該少なくとも四つのパスのうちの第２の少なくとも二つのパスは、該少なくとも二つの波長のうちの第２の波長に対応する、請求項２４に記載の方法。

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