JP2008003053A - 蛍光観察又は蛍光測光システム、及び蛍光観察又は蛍光測光方法 - Google Patents
蛍光観察又は蛍光測光システム、及び蛍光観察又は蛍光測光方法 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】微弱蛍光観察においてＳ／Ｎ比の良い画像を取得することが可能であり、また、対物レンズを用いた全反射照明のための光学調整を容易にすることが可能なイマージョン物質を用いた観察システム、測光システム、観察方法、及び測光方法を提供する。
【解決手段】低蛍光なイマージョン物質を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムであって、前記低蛍光なイマージョン物質が次の条件式を満足し、且つ、前記低蛍光なイマージョン物質におけるｄ線（５８７．５６ｎｍ）における屈折率ｎｄが１．５０以上１．７０未満である。
ＢIM'／ＢIM≦０．７
ただし、ＢIM'は前記低蛍光なイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
【選択図】図１
【解決手段】低蛍光なイマージョン物質を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムであって、前記低蛍光なイマージョン物質が次の条件式を満足し、且つ、前記低蛍光なイマージョン物質におけるｄ線（５８７．５６ｎｍ）における屈折率ｎｄが１．５０以上１．７０未満である。
ＢIM'／ＢIM≦０．７
ただし、ＢIM'は前記低蛍光なイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
【選択図】図１
Description
本発明は、蛍光観察又は蛍光測光システム、及び蛍光観察又は蛍光測光方法に関する。
近年の顕微鏡分野、蛍光顕微鏡分野、タンパク質・ＤＮＡ解析装置分野などにおける測定機器と装置の発展により、これらの分野における観察・計測の傾向が変化している。その傾向の変化としては、次の２つの大きな流れがある。
その一つは、固定された細胞の観察・計測から生細胞の観察・計測といった観察・計測対象の変貌である。ポストゲノムの時代に入り、蛍光色素一分子蛍光測定、蛍光色素の多色化による生体機能の同時解析など、微弱な蛍光を広帯域で正確に観察・計測できる技術に関する重要性が増してきている。特に、近年、最先端のリサーチ分野では、生体の機能解明やタンパク質の挙動解析・相互作用の解析などを目的として、細胞を生かしたまま、長時間（数日から数週間）に渡り観察しつづけたいというニーズが高まっており、そのような観察をする手法が種々開発されて来ている。細胞の観察手法としては、蛍光タンパク質を所望の細胞に発現させたり、蛍光色素を導入して、その蛍光を観察する手法がよく用いられている。そして、最近の技術として、究極の微弱蛍光観察といえる一分子蛍光観察などがあり、より一層の微弱蛍光の観察、計測がトレンドとなっている。また、一般の蛍光観察においても、蛍光物質を励起するための光（励起光）が強すぎると細胞へダメージを与えてしまう。このため、長時間細胞を生かしつづけるには、できるだけ励起光強度を弱くする必要がある。また、細胞観察に限らず、蛍光物質に励起光を照射するとその蛍光が褪色していくことが知られている。弱い励起光を照射することで褪色を抑制するためにも、微弱蛍光でＳ／Ｎ比よく観察できるようにすることが非常に有用である。
しかし、弱い励起光を用いると、検出される蛍光強度も弱くなり、Ｓ／Ｎ比の高い画像を得ることが困難となる。究極の微弱蛍光観察である一分子蛍光観察をはじめとして、蛍光が微弱であればあるほどノイズの寄与が大きくなり、Ｓ／Ｎ比を下げることになる。ここで、ノイズとは主に光学系や試料からの自家蛍光などを指す。
しかし、弱い励起光を用いると、検出される蛍光強度も弱くなり、Ｓ／Ｎ比の高い画像を得ることが困難となる。究極の微弱蛍光観察である一分子蛍光観察をはじめとして、蛍光が微弱であればあるほどノイズの寄与が大きくなり、Ｓ／Ｎ比を下げることになる。ここで、ノイズとは主に光学系や試料からの自家蛍光などを指す。
もう一つは、従来の顕微鏡装置のような観察する機能のみを備えた装置から、さらに蛍光強度、波長、被検出物の局在などを計測し定量化する手段を備えた装置への変貌である。ノイズも含めた正確な定量性が必要とされてきている。
ところで、蛍光顕微鏡等の蛍光観察装置やゲノム・タンパク質分析装置などの蛍光計測装置では、紫外〜赤外の広い範囲でさまざまな波長を観察・計測する。特に、Ｕ励起、Ｂ励起、Ｇ励起と呼ばれる３つの励起による蛍光観察・計測が代表的であり、Ｕ励起では、３６５ｎｍ付近の波長で励起し４５０ｎｍ付近の蛍光を、Ｂ励起では、４８８ｎｍ付近の波長で励起し５４０ｎｍ付近の蛍光を、Ｇ励起では、５５０ｎｍ付近の波長で励起し６００ｎｍ付近の蛍光を、それぞれ観察・計測する。
従来の蛍光観察装置及び蛍光計測装置としては、例えば、次の特許文献１，２に記載のものが提案されている。
特開平０８−３２０４３７号公報
特開平０８−１７８８４９号公報
また、従来、蛍光観察を行う顕微鏡としては、例えば、次の特許文献３に、通常の落射照明による蛍光観察と全反射照明による蛍光観察とを切り替えて行うように構成された顕微鏡が記載されている。
特許文献３に記載の顕微鏡など、従来の蛍光顕微鏡を介した蛍光検出システムでは、蛍光物質に励起光を照射し、蛍光物質の発する蛍光を検出器で検出することで試料を観察するように構成されている。
特開２００１−８３３１８号公報
特許文献３に記載の顕微鏡など、従来の蛍光顕微鏡を介した蛍光検出システムでは、蛍光物質に励起光を照射し、蛍光物質の発する蛍光を検出器で検出することで試料を観察するように構成されている。
しかし、特許文献１や特許文献２に開示されているような、従来の蛍光観察装置や蛍光計測装置は、蛍光観察における見えのよさや、蛍光測定における定量性に関し、装置に用いられている、光学素子に含まれる不純物（特に白金コロイド）から発した自家蛍光や、カバーガラスから発した自家蛍光や、低屈折率オイルから発した自家蛍光によるノイズの影響を大きく受けて、品質が下げられたものとなっていた。
また、特許文献３に記載の顕微鏡など、従来の蛍光顕微鏡を介した蛍光検出システムにおいては、検出器で検出される信号は、所望の深度からの蛍光のみならず、蛍光顕微鏡観察に使用する対物レンズやイマージョン物質自体など光学系や試料から発せられる自家蛍光なども検出され、これがノイズとなりＳ／Ｎ比を低下させる原因となる。
特に、高倍率・高ＮＡの（油浸）対物レンズで観察する際には、対物レンズと試料との間にイマージョン物質として、水などに比べて自家蛍光の大きなイマージョン物質を塗布する必要があり、また、一分子観察など微弱な蛍光を検出する際には、これらのノイズの寄与が大きくなるので、Ｓ／Ｎ比の劣化が顕著となっていた。
特に、高倍率・高ＮＡの（油浸）対物レンズで観察する際には、対物レンズと試料との間にイマージョン物質として、水などに比べて自家蛍光の大きなイマージョン物質を塗布する必要があり、また、一分子観察など微弱な蛍光を検出する際には、これらのノイズの寄与が大きくなるので、Ｓ／Ｎ比の劣化が顕著となっていた。
また、特許文献３に記載の顕微鏡など全反射照明による蛍光観察を行うことのできる顕微鏡では、全反射照明することにより、ノイズとなる試料の所望深度以外の他の深さからの蛍光を抑えることができるという利点がある一方、全反射照明できる範囲が非常に狭く、光学調整が煩雑であるという問題があった。
本発明は、このような問題点に鑑みてなされたものであり、自家蛍光によるノイズの影響を効率良く低減でき、高精度、高品質な蛍光観察、蛍光計測が可能で、更には微弱蛍光の観察や計測が可能な蛍光観察システム、蛍光測光システム、蛍光観察方法、及び蛍光測光方法を提供することを目的とする。
詳しくは、本発明は、微弱蛍光観察においてＳ／Ｎ比の良い画像を取得することが可能であり、また、対物レンズを用いた全反射照明のための光学調整を容易にすることが可能なイマージョン物質を用いた観察システム、測光システム、観察方法、及び測光方法を提供することを目的とする。
上記目的を達成するため、本発明による蛍光観察又は蛍光測光システムは、低蛍光なイマージョン物質を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムであって、前記低蛍光なイマージョン物質が次の条件式(1-1)を満足し、且つ、前記低蛍光なイマージョン物質におけるｄ線（５８７．５６ｎｍ）における屈折率ｎｄが１．５０以上１．７０未満であることを特徴としている。
ＢIM'／ＢIM≦０．７ …(1-1)
ただし、ＢIM'は前記低蛍光なイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
ＢIM'／ＢIM≦０．７ …(1-1)
ただし、ＢIM'は前記低蛍光なイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
また、本発明による蛍光観察又は蛍光測光方法は、次の工程Ａ，Ｂ，Ｃからなることを特徴としている。
Ａ．生細胞を用いた蛍光を発する試料を選択する工程。
Ｂ．前記工程Ａで選択した試料を観察又は測光するためのアプリケーション、及び次の条件式(1-1)を満足し、且つ、ｄ線（５８７．５６ｎｍ）における屈折率ｎｄが１．５０以上１．７０未満である低蛍光なイマージョン物質を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムを選択する工程。
Ｃ．前記工程Ｂで選択したアプリケーション及びシステムを用いて、前記工程Ａで選択した試料を蛍光観察又は蛍光測光する工程。
ＢIM'／ＢIM≦０．７ …(1-1)
ただし、ＢIM'は前記低蛍光なイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
Ａ．生細胞を用いた蛍光を発する試料を選択する工程。
Ｂ．前記工程Ａで選択した試料を観察又は測光するためのアプリケーション、及び次の条件式(1-1)を満足し、且つ、ｄ線（５８７．５６ｎｍ）における屈折率ｎｄが１．５０以上１．７０未満である低蛍光なイマージョン物質を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムを選択する工程。
Ｃ．前記工程Ｂで選択したアプリケーション及びシステムを用いて、前記工程Ａで選択した試料を蛍光観察又は蛍光測光する工程。
ＢIM'／ＢIM≦０．７ …(1-1)
ただし、ＢIM'は前記低蛍光なイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程Ａで選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-1)，(3-1)の少なくとも一方を満足するのが好ましい。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦５ …(2-1)
３ＢIM／Ｂ≧０．２ …(3-1)
ただし、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦５ …(2-1)
３ＢIM／Ｂ≧０．２ …(3-1)
ただし、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程Ｂで選択したアプリケーションがＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）であるのが好ましい。
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程Ｂで選択したアプリケーションがカルシウムイメージングであるのが好ましい。
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程Ｂで選択したアプリケーションが動画観察又はタイムラプス観察であるのが好ましい。
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであるのが好ましい。
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程Ｂで選択したシステムが全反射顕微鏡システムであるのが好ましい。
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡と全反射顕微鏡のいずれか一方を２つ又は両方を１つずつ有し、前記試料を挟んで対物光学系が対向配置された顕微鏡システムとして構成されているのが好ましい。
本発明によれば、自家蛍光によるノイズの影響を効率良く低減でき、高精度、高品質な蛍光観察、蛍光計測が可能で、更には微弱蛍光の観察や計測が可能な蛍光観察システム、蛍光測光システム、蛍光観察方法、及び蛍光測光方法が得られる。
詳しくは、本発明によれば、微弱蛍光観察においてＳ／Ｎ比の良い画像を取得することが可能であり、また、対物レンズを用いた全反射照明のための光学調整を容易にすることが可能なイマージョン物質を用いた観察システム、測光システム、観察方法、及び測光方法が得られる。
実施例の説明に先立ち、本発明を想到するに至った過程について説明する。
試料の明るさのランク分け
まず、本発明者は、高精度、高品質な蛍光観察、蛍光測光、更には微弱蛍光観察や微弱蛍光測光などのアプリケーションが可能な蛍光観察装置及び蛍光測光装置に求められるノイズレベルが、観察・測光に用いられる試料ごとに後述のようにランク分けをすることができることを見出した。
ここで、ランク分けに用いた式を定義する。
被観察物（又は被測光物）の蛍光の強度の平均値をＳ、背景（観察領域において被観察物、又は被測光物が存在しない部分）の自家蛍光の強度の平均値をＢ、それらの強度の揺らぎをそれぞれｓ，ｂとしたときのアプリケーションのＳ／Ｎ比を次式(2-0)のように定義した。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ） …(2-0)
試料の明るさのランク分け
まず、本発明者は、高精度、高品質な蛍光観察、蛍光測光、更には微弱蛍光観察や微弱蛍光測光などのアプリケーションが可能な蛍光観察装置及び蛍光測光装置に求められるノイズレベルが、観察・測光に用いられる試料ごとに後述のようにランク分けをすることができることを見出した。
ここで、ランク分けに用いた式を定義する。
被観察物（又は被測光物）の蛍光の強度の平均値をＳ、背景（観察領域において被観察物、又は被測光物が存在しない部分）の自家蛍光の強度の平均値をＢ、それらの強度の揺らぎをそれぞれｓ，ｂとしたときのアプリケーションのＳ／Ｎ比を次式(2-0)のように定義した。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ） …(2-0)
(1)一分子
まず、最も自家蛍光の影響を受けやすい試料として、微弱蛍光の観察に応用される特開２００１−２７２６０６号公報に示されているようないわゆる一分子蛍光観察のＳ／Ｎ比について考察した。一分子蛍光観察では、観察光学系または測光光学系の自家蛍光が最も観察、計測に影響を与え易く、従来用いられてきた対物レンズやイマージョン物質やカバーガラスの自家蛍光の低蛍光化が求められる。このような微弱蛍光一分子観察では、Ｓ／Ｎ比は次の条件式(2-3)を満たす。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦２ …(2-3)
まず、最も自家蛍光の影響を受けやすい試料として、微弱蛍光の観察に応用される特開２００１−２７２６０６号公報に示されているようないわゆる一分子蛍光観察のＳ／Ｎ比について考察した。一分子蛍光観察では、観察光学系または測光光学系の自家蛍光が最も観察、計測に影響を与え易く、従来用いられてきた対物レンズやイマージョン物質やカバーガラスの自家蛍光の低蛍光化が求められる。このような微弱蛍光一分子観察では、Ｓ／Ｎ比は次の条件式(2-3)を満たす。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦２ …(2-3)
(2)暗い試料
次に、現在最も利用されている生細胞を用いた蛍光観察（又は測光）について考察した。生細胞観察では、細胞の活性を長時間にわたって維持しなければならない。そこで、一般に、細胞へのダメージを軽減するため、蛍光物質の量を少なくすることや、励起光の生細胞への照射強度を弱くすることが行われている。したがって、蛍光の強度も小さくなり、Ｓ／Ｎ比は次の条件式(2-2)を満たす。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦３ …(2-2)
次に、現在最も利用されている生細胞を用いた蛍光観察（又は測光）について考察した。生細胞観察では、細胞の活性を長時間にわたって維持しなければならない。そこで、一般に、細胞へのダメージを軽減するため、蛍光物質の量を少なくすることや、励起光の生細胞への照射強度を弱くすることが行われている。したがって、蛍光の強度も小さくなり、Ｓ／Ｎ比は次の条件式(2-2)を満たす。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦３ …(2-2)
(3)通常の明るさの試料
次に、これまで一般に用いられてきた固定細胞を用いた蛍光観察（又は測光）、あるいは、生細胞を用いた蛍光観察のうち蛍光強度の強い場合について考察した。固定細胞の場合、細胞の活性を維持する必要がないため、蛍光物質の濃度を高くすることができ、また、励起光の強度も強くすることができる。したがって、比較的蛍光の強度を強くすることができる。また、生細胞を用いる場合でも、活性を維持する期間が短くてよい場合や、細胞への影響が少ない部位に蛍光タンパクを発現させる場合などが該当する。このような場合、Ｓ／Ｎ比は次の条件式(2-1)を満たす。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦５ …(2-1)
次に、これまで一般に用いられてきた固定細胞を用いた蛍光観察（又は測光）、あるいは、生細胞を用いた蛍光観察のうち蛍光強度の強い場合について考察した。固定細胞の場合、細胞の活性を維持する必要がないため、蛍光物質の濃度を高くすることができ、また、励起光の強度も強くすることができる。したがって、比較的蛍光の強度を強くすることができる。また、生細胞を用いる場合でも、活性を維持する期間が短くてよい場合や、細胞への影響が少ない部位に蛍光タンパクを発現させる場合などが該当する。このような場合、Ｓ／Ｎ比は次の条件式(2-1)を満たす。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦５ …(2-1)
アプリケーションの種類
以上のように、本発明者は、蛍光観察（又は測光）に用いられている試料について、アプリケーションのＳ／Ｎ比に応じて大きく３つに分類できることを見出した。
さらに、本発明者は、これらの試料を蛍光観察（又は測光）するためのアプリケーションの種類について考察した。
(1)形態観察、ＦＲＥＴ
上記のような試料を観察又は測光する手法として、良く利用されるものにＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）がある。
ＦＲＥＴではドナーとアクセプタの２つの蛍光物質を用い、ドナーの蛍光波長とアクセプタの励起波長が重なるようになっている。そのため、ＦＲＥＴにおける励起光の波長は、アクセプタの蛍光物質を単独で用いる場合の励起光の波長よりも、アクセプタの蛍光波長に対して短波長側に離れている。一方、観察または測光光学系からの自家蛍光は、励起光の波長が短くなるほど強くなる傾向にある。従って、ＦＲＥＴでは、同じ蛍光波長を観察または測光する場合であっても、アクセプタの蛍光物質を単独で用いる場合に比べて励起波長が短いため、観察または測光光学系からの自家蛍光が大きくなってしまうという問題がある。
以上のように、本発明者は、蛍光観察（又は測光）に用いられている試料について、アプリケーションのＳ／Ｎ比に応じて大きく３つに分類できることを見出した。
さらに、本発明者は、これらの試料を蛍光観察（又は測光）するためのアプリケーションの種類について考察した。
(1)形態観察、ＦＲＥＴ
上記のような試料を観察又は測光する手法として、良く利用されるものにＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）がある。
ＦＲＥＴではドナーとアクセプタの２つの蛍光物質を用い、ドナーの蛍光波長とアクセプタの励起波長が重なるようになっている。そのため、ＦＲＥＴにおける励起光の波長は、アクセプタの蛍光物質を単独で用いる場合の励起光の波長よりも、アクセプタの蛍光波長に対して短波長側に離れている。一方、観察または測光光学系からの自家蛍光は、励起光の波長が短くなるほど強くなる傾向にある。従って、ＦＲＥＴでは、同じ蛍光波長を観察または測光する場合であっても、アクセプタの蛍光物質を単独で用いる場合に比べて励起波長が短いため、観察または測光光学系からの自家蛍光が大きくなってしまうという問題がある。
(2)カルシウムイメージング
また、細胞内、あるいは、細胞間の信号の伝達に大きな役割を果たしている物質にカルシウムイオンがある。このカルシウムイオンの濃度勾配や濃度の変化を観察、測光することは細胞の機能解明において極めて重要である。カルシウムイオンの濃度を検出する場合によく用いられる試薬として、Fura-2、Indo-1がある。これらの試薬には励起光として300〜400nmのＵＶ域の光が利用される。そのため、観察または測光光学系からの自家蛍光が大きくなってしまうという問題があった。また、近年はＵＶ光を用いないCameleonという試薬が開発されているが、Cameleonは上述のＦＲＥＴを応用した試薬であるため、ＦＲＥＴと同様の問題が残る。
また、細胞内、あるいは、細胞間の信号の伝達に大きな役割を果たしている物質にカルシウムイオンがある。このカルシウムイオンの濃度勾配や濃度の変化を観察、測光することは細胞の機能解明において極めて重要である。カルシウムイオンの濃度を検出する場合によく用いられる試薬として、Fura-2、Indo-1がある。これらの試薬には励起光として300〜400nmのＵＶ域の光が利用される。そのため、観察または測光光学系からの自家蛍光が大きくなってしまうという問題があった。また、近年はＵＶ光を用いないCameleonという試薬が開発されているが、Cameleonは上述のＦＲＥＴを応用した試薬であるため、ＦＲＥＴと同様の問題が残る。
(3)動画、タイムラプス
また、細胞膜上の一分子を観察する場合や、上記ＦＲＥＴ、カルシウムイメージングにおいては、その強度の比だけでなく、強度比の時間変化を調べることが重要である。変化のスピードが速い場合には、ビデオレートあるいはそれ以上の高速度カメラによる動画観察が行われる。動画観察の場合、変化の速い現象を検出するため、１コマ当たりのカメラの露光時間が必然的に短くなり、得られる蛍光強度が弱くなる。したがって、動画観察では、一般的な蛍光観察または測光に比べて、蛍光が弱いために、Ｓ／Ｎ比の良いデータを得ることが難しいという問題があった。
また、変化のスピードが遅い場合には、数時間から数日にわたり観察を続けるタイムラプス観察が行われる。タイムラプス観察においては、細胞の活性を長時間にわたって維持しなければならないため、細胞へ照射する励起光の強度を可能な限り小さくすることが要求される。したがって、タイムラプス観察では、一般的な蛍光観察または測光に比べて、蛍光が弱いため、Ｓ／Ｎ比の良いデータを得ることが難しいという問題があった。
また、細胞膜上の一分子を観察する場合や、上記ＦＲＥＴ、カルシウムイメージングにおいては、その強度の比だけでなく、強度比の時間変化を調べることが重要である。変化のスピードが速い場合には、ビデオレートあるいはそれ以上の高速度カメラによる動画観察が行われる。動画観察の場合、変化の速い現象を検出するため、１コマ当たりのカメラの露光時間が必然的に短くなり、得られる蛍光強度が弱くなる。したがって、動画観察では、一般的な蛍光観察または測光に比べて、蛍光が弱いために、Ｓ／Ｎ比の良いデータを得ることが難しいという問題があった。
また、変化のスピードが遅い場合には、数時間から数日にわたり観察を続けるタイムラプス観察が行われる。タイムラプス観察においては、細胞の活性を長時間にわたって維持しなければならないため、細胞へ照射する励起光の強度を可能な限り小さくすることが要求される。したがって、タイムラプス観察では、一般的な蛍光観察または測光に比べて、蛍光が弱いため、Ｓ／Ｎ比の良いデータを得ることが難しいという問題があった。
以上のように、本発明者は、上記試料を観察するアプリケーションにおいても、アプリケーションに依存したＳ／Ｎ比を劣化させる要因があることを見出した。
実際には、上記条件式(2-1)〜(2-3)の少なくともいずれかの明るさの条件に当てはまる試料と、上記(1)〜(3)の各アプリケーションとの組み合わせによって蛍光観察または蛍光測光が行われており、Ｓ／Ｎ比も上記条件式(2-1)〜(2-3)と上記アプリケーション(1)〜(3)との組み合わせによって決まる。
実際には、上記条件式(2-1)〜(2-3)の少なくともいずれかの明るさの条件に当てはまる試料と、上記(1)〜(3)の各アプリケーションとの組み合わせによって蛍光観察または蛍光測光が行われており、Ｓ／Ｎ比も上記条件式(2-1)〜(2-3)と上記アプリケーション(1)〜(3)との組み合わせによって決まる。
自家蛍光の割合の調査
次に、本発明者は、従来の一般的な対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラスを用いた顕微鏡や測光装置などの光学システムにおける各々の自家蛍光の割合を調べた。
光源が発した光はフィルタ（例えばU-MWIB3（OLYMPUS）のようなフィルタユニット）により、適切な波長を選択され、励起光として照明光学系を通り、試料に照射される。その際、照明光学系中に配置された対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラスや、試料と一緒に封入されている物質が励起され、ノイズとなる自家蛍光を発する。本発明者は、この自家蛍光の量を観察光学系に取り付けられたフォトマル（浜松ホトニクス）や冷却ＣＣＤであるCoolSNAP HQ（Photometrics）などの検出器で測定した。
次に、本発明者は、従来の一般的な対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラスを用いた顕微鏡や測光装置などの光学システムにおける各々の自家蛍光の割合を調べた。
光源が発した光はフィルタ（例えばU-MWIB3（OLYMPUS）のようなフィルタユニット）により、適切な波長を選択され、励起光として照明光学系を通り、試料に照射される。その際、照明光学系中に配置された対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラスや、試料と一緒に封入されている物質が励起され、ノイズとなる自家蛍光を発する。本発明者は、この自家蛍光の量を観察光学系に取り付けられたフォトマル（浜松ホトニクス）や冷却ＣＣＤであるCoolSNAP HQ（Photometrics）などの検出器で測定した。
蛍光顕微鏡システムにおけるノイズは、試料からの自家蛍光と、光学系からの自家蛍光とに大別できる。正立顕微鏡BX51（OLYMPUS）を用いて測定した場合において、ノイズに含まれる試料からの自家蛍光と光学系からの自家蛍光の割合を調査した。
まず、通常の落射蛍光観察方法で試料の背景からの自家蛍光を測定する。次に試料を除いた状態で同測定を行う。これらの値の差分が試料からの自家蛍光で、残りが光学系からの自家蛍光として算出される。
算出されたノイズのうち、試料からの自家蛍光は、例えば後述する試料の洗浄度など、試料作製の条件により変動する。本発明者は、試料の作製条件により、試料からの自家蛍光のノイズのノイズ全体に及ぼす影響の度合の傾向が大きく３つに分類されることを見出した。これをノイズ全体に対する光学系からの自家蛍光のノイズの割合で示すと次のように表すことができる。
普通の（洗浄しない）試料：
（光学系からの自家蛍光のノイズ）／Ｂ≧０．２ …(3'-1)
洗浄した試料：
（光学系からの自家蛍光のノイズ）／Ｂ≧０．４ …(3'-2)
極めて綺麗に洗浄した試料：
（光学系からの自家蛍光のノイズ）／Ｂ≧０．６ …(3'-3)
但し、上記条件式(3'-1)〜(3'-3)において、Ｂは背景（観察領域において被観察物、又は被測光物が存在しない部分）の自家蛍光の強度の平均値である。
上記条件式(3'-1)〜(3'-3)において、下限値が大きいほど光学系からの自家蛍光のノイズの占める割合が大きくなり、光学系からの自家蛍光を改善したときに、その改善の効果がより顕著に現れることになる。
まず、通常の落射蛍光観察方法で試料の背景からの自家蛍光を測定する。次に試料を除いた状態で同測定を行う。これらの値の差分が試料からの自家蛍光で、残りが光学系からの自家蛍光として算出される。
算出されたノイズのうち、試料からの自家蛍光は、例えば後述する試料の洗浄度など、試料作製の条件により変動する。本発明者は、試料の作製条件により、試料からの自家蛍光のノイズのノイズ全体に及ぼす影響の度合の傾向が大きく３つに分類されることを見出した。これをノイズ全体に対する光学系からの自家蛍光のノイズの割合で示すと次のように表すことができる。
普通の（洗浄しない）試料：
（光学系からの自家蛍光のノイズ）／Ｂ≧０．２ …(3'-1)
洗浄した試料：
（光学系からの自家蛍光のノイズ）／Ｂ≧０．４ …(3'-2)
極めて綺麗に洗浄した試料：
（光学系からの自家蛍光のノイズ）／Ｂ≧０．６ …(3'-3)
但し、上記条件式(3'-1)〜(3'-3)において、Ｂは背景（観察領域において被観察物、又は被測光物が存在しない部分）の自家蛍光の強度の平均値である。
上記条件式(3'-1)〜(3'-3)において、下限値が大きいほど光学系からの自家蛍光のノイズの占める割合が大きくなり、光学系からの自家蛍光を改善したときに、その改善の効果がより顕著に現れることになる。
また、Ｓ／Ｎ比向上のためには光学系からの自家蛍光のノイズの内訳を知る必要がある。そこで、本発明者は、次に、対物レンズとイマージョン物質とカバーガラスのそれぞれのノイズ（自家蛍光）値の割合を調査した。測定方法は、前述した試料からの自家蛍光と光学系からの自家蛍光の割合を調査したときと同様の方法を用いた。
まず、照明光学系に対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラスを適切に配置した状態（実使用状態）で検出される自家蛍光量を測定する。その後、カバーガラスを光学系から除いて測定、次にイマージョンオイルを光学系から除いた状態での自家蛍光を測定し、それぞれの値の差分を取ることで対物レンズ、イマージョンオイル、カバーガラスのそれぞれからの自家蛍光値を算出した。
UPLSAPO60XO（OLYMPUS），イマージョンオイル（OLYMPUS），一般的に用いられるカバーガラス（松浪ガラス工業）のそれぞれからの自家蛍光値について測定したところ、対物レンズとイマージョンオイルとカバーガラスの自家蛍光値は同程度であった。
まず、照明光学系に対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラスを適切に配置した状態（実使用状態）で検出される自家蛍光量を測定する。その後、カバーガラスを光学系から除いて測定、次にイマージョンオイルを光学系から除いた状態での自家蛍光を測定し、それぞれの値の差分を取ることで対物レンズ、イマージョンオイル、カバーガラスのそれぞれからの自家蛍光値を算出した。
UPLSAPO60XO（OLYMPUS），イマージョンオイル（OLYMPUS），一般的に用いられるカバーガラス（松浪ガラス工業）のそれぞれからの自家蛍光値について測定したところ、対物レンズとイマージョンオイルとカバーガラスの自家蛍光値は同程度であった。
その結果、光学システムの観察光学系（又は測光光学系）全体のノイズに占める各々の自家蛍光は、対物レンズが約３割、イマージョン物質が約３割、カバーガラスが約３割を占め、その他が約１割であることが分かった。そして、微弱蛍光観察（又は測光）にとってこれら対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラスからの自家蛍光は、品質の低下を招き、システム全体の性能維持において無視できないレベルにあることが明らかとなった。
そして、本発明者は、精査の結果、Ｓ／N比を５％向上するためには、対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラスの３つの自家蛍光のうち少なくともひとつの自家蛍光を３０%低減、あるいはこれら３つの自家蛍光全体で１０％低減することが必要であることをつきとめた。
これらのことから、本発明者は、試料、アプリケーション、またその組み合わせにおけるＳ／Ｎ比と、Ｓ／Ｎ比を改善するために必要な条件を精査し、本発明に至った。
これらのことから、本発明者は、試料、アプリケーション、またその組み合わせにおけるＳ／Ｎ比と、Ｓ／Ｎ比を改善するために必要な条件を精査し、本発明に至った。
即ち、本発明の蛍光観察又は蛍光測光システムは、低蛍光なイマージョン物質を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムであって、前記低蛍光なイマージョン物質が次の条件式(1-1)を満足し、且つ、前記低蛍光なイマージョン物質におけるｄ線（５８７．５６ｎｍ）における屈折率ｎｄが１．５０以上１．７０未満である。
ＢIM'／ＢIM≦０．７ …(1-1)
ただし、ＢIM'は前記低蛍光なイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
上記条件式(1-1)の上限値は、上述した「Ｓ／Ｎ比を５％向上するためには対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラスの３つの自家蛍光のうち少なくともひとつの自家蛍光を３０％低減させる必要がある」ということより導出したものである。
ＢIM'／ＢIM≦０．７ …(1-1)
ただし、ＢIM'は前記低蛍光なイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
上記条件式(1-1)の上限値は、上述した「Ｓ／Ｎ比を５％向上するためには対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラスの３つの自家蛍光のうち少なくともひとつの自家蛍光を３０％低減させる必要がある」ということより導出したものである。
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光システムにおいては、次の条件式(1-2)を満足するのがより好ましい。
ＢIM'／ＢIM≦０．５ …(1-2)
ただし、ＢIM'は前記低蛍光なイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
さらには、本発明の蛍光観察又は蛍光測光システムにおいては、次の条件式(1-3)を満足するのがより一層好ましい。
ＢIM'／ＢIM≦０．３ …(1-3)
ただし、ＢIM'は前記低蛍光なイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
ＢIM'／ＢIM≦０．５ …(1-2)
ただし、ＢIM'は前記低蛍光なイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
さらには、本発明の蛍光観察又は蛍光測光システムにおいては、次の条件式(1-3)を満足するのがより一層好ましい。
ＢIM'／ＢIM≦０．３ …(1-3)
ただし、ＢIM'は前記低蛍光なイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法は、次の工程Ａ，Ｂ，Ｃからなる。
Ａ．生細胞を用いた蛍光を発する試料を選択する工程。
Ｂ．前記工程Ａで選択した試料を観察又は測光するためのアプリケーション、及び次の条件式(1-1)を満足し、且つ、ｄ線（５８７．５６ｎｍ）における屈折率ｎｄが１．５０以上１．７０未満である低蛍光なイマージョン物質を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムを選択する工程。
Ｃ．前記工程Ｂで選択したアプリケーション及びシステムを用いて、前記工程Ａで選択した試料を蛍光観察又は蛍光測光する工程。
ＢIM'／ＢIM≦０．７ …(1-1)
ただし、ＢIM'は前記低蛍光なイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
上記条件式(1-1)の上限値は、上述した「Ｓ／Ｎ比を５％向上するためには対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラスの３つの自家蛍光のうち少なくともひとつの自家蛍光を３０％低減させる必要がある」ということより導出したものである。
Ａ．生細胞を用いた蛍光を発する試料を選択する工程。
Ｂ．前記工程Ａで選択した試料を観察又は測光するためのアプリケーション、及び次の条件式(1-1)を満足し、且つ、ｄ線（５８７．５６ｎｍ）における屈折率ｎｄが１．５０以上１．７０未満である低蛍光なイマージョン物質を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムを選択する工程。
Ｃ．前記工程Ｂで選択したアプリケーション及びシステムを用いて、前記工程Ａで選択した試料を蛍光観察又は蛍光測光する工程。
ＢIM'／ＢIM≦０．７ …(1-1)
ただし、ＢIM'は前記低蛍光なイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
上記条件式(1-1)の上限値は、上述した「Ｓ／Ｎ比を５％向上するためには対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラスの３つの自家蛍光のうち少なくともひとつの自家蛍光を３０％低減させる必要がある」ということより導出したものである。
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程Ｂで用いる前記低蛍光なイマージョン物質が次の条件式(1-2)を満足するのがより好ましい。
ＢIM'／ＢIM≦０．５ …(1-2)
ただし、ＢIM'は前記低蛍光なイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
さらには、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程Ｂで用いる前記低蛍光なイマージョン物質が次の条件式(1-3)を満足するのがより一層好ましい。
ＢIM'／ＢIM≦０．３ …(1-3)
ただし、ＢIM'は前記低蛍光なイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
ＢIM'／ＢIM≦０．５ …(1-2)
ただし、ＢIM'は前記低蛍光なイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
さらには、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程Ｂで用いる前記低蛍光なイマージョン物質が次の条件式(1-3)を満足するのがより一層好ましい。
ＢIM'／ＢIM≦０．３ …(1-3)
ただし、ＢIM'は前記低蛍光なイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程Ａで選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-1)，(3-1)の少なくとも一方を満足するのが好ましい。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦５ …(2-1)
３ＢIM／Ｂ≧０．２ …(3-1)
ただし、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
上記条件式(2-1)の上限値は、上述した試料の明るさのランク分けにおける「通常の明るさの試料」を蛍光観察・蛍光測光する場合に求められるアプリケーションのＳ／Ｎ比に対応させたものである。
上記条件式(3-1)の下限値は、上述したノイズ全体に対する光学系からの自家蛍光のノイズの割合における「普通の（洗浄しない）試料」についての条件式(3'-1)に対応させたものである。また、上記条件式(3-1)の左辺は、上述した「光学システムの観察光学系（又は測光光学系）全体のノイズに占める各々の自家蛍光は、対物レンズが３割、イマージョン物質が３割、カバーガラスが３割を占め」、対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラスのそれぞれの光学系全体に占めるノイズの割合が同じであること、及び条件式(3'-1)より、光学系からの自家蛍光のノイズのうちの対物レンズ及びカバーガラスの自家蛍光のノイズの割合をイマージョン物質の自家蛍光のノイズの割合に置き換えることによって導出したものである。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦５ …(2-1)
３ＢIM／Ｂ≧０．２ …(3-1)
ただし、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
上記条件式(2-1)の上限値は、上述した試料の明るさのランク分けにおける「通常の明るさの試料」を蛍光観察・蛍光測光する場合に求められるアプリケーションのＳ／Ｎ比に対応させたものである。
上記条件式(3-1)の下限値は、上述したノイズ全体に対する光学系からの自家蛍光のノイズの割合における「普通の（洗浄しない）試料」についての条件式(3'-1)に対応させたものである。また、上記条件式(3-1)の左辺は、上述した「光学システムの観察光学系（又は測光光学系）全体のノイズに占める各々の自家蛍光は、対物レンズが３割、イマージョン物質が３割、カバーガラスが３割を占め」、対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラスのそれぞれの光学系全体に占めるノイズの割合が同じであること、及び条件式(3'-1)より、光学系からの自家蛍光のノイズのうちの対物レンズ及びカバーガラスの自家蛍光のノイズの割合をイマージョン物質の自家蛍光のノイズの割合に置き換えることによって導出したものである。
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程Ａで選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-2)，(3-2)の少なくとも一方を満足するのが好ましい。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦３ …(2-2)
３ＢIM／Ｂ≧０．４ …(3-2)
ただし、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
上記条件式(2-2)の上限値は、上述した試料の明るさのランク分けにおける「暗い試料」を蛍光観察・蛍光測光する場合に求められるアプリケーションのＳ／Ｎ比に対応させたものである。
上記条件式(3-2)の下限値は、上述したノイズ全体に対する光学系からの自家蛍光のノイズの割合における「洗浄した試料」についての条件式(3'-2)に対応させたものである。また、上記条件式(3-2)の左辺は、上述した「光学システムの観察光学系（又は測光光学系）全体のノイズに占める各々の自家蛍光は、対物レンズが３割、イマージョン物質が３割、カバーガラスが３割を占め」、対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラスのそれぞれの光学系全体に占めるノイズの割合が同じであること、及び条件式(3'-2)より、光学系からの自家蛍光のノイズのうちの対物レンズ及びカバーガラスの自家蛍光のノイズの割合をイマージョン物質の自家蛍光のノイズの割合に置き換えることによって導出したものである。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦３ …(2-2)
３ＢIM／Ｂ≧０．４ …(3-2)
ただし、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
上記条件式(2-2)の上限値は、上述した試料の明るさのランク分けにおける「暗い試料」を蛍光観察・蛍光測光する場合に求められるアプリケーションのＳ／Ｎ比に対応させたものである。
上記条件式(3-2)の下限値は、上述したノイズ全体に対する光学系からの自家蛍光のノイズの割合における「洗浄した試料」についての条件式(3'-2)に対応させたものである。また、上記条件式(3-2)の左辺は、上述した「光学システムの観察光学系（又は測光光学系）全体のノイズに占める各々の自家蛍光は、対物レンズが３割、イマージョン物質が３割、カバーガラスが３割を占め」、対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラスのそれぞれの光学系全体に占めるノイズの割合が同じであること、及び条件式(3'-2)より、光学系からの自家蛍光のノイズのうちの対物レンズ及びカバーガラスの自家蛍光のノイズの割合をイマージョン物質の自家蛍光のノイズの割合に置き換えることによって導出したものである。
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程Ａで選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-3)，(3-3)の少なくとも一方を満足するのが好ましい。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦２ …(2-3)
３ＢIM／Ｂ≧０．６ …(3-3)
ただし、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
上記条件式(2-3)の上限値は、上述した試料の明るさのランク分けにおける「一分子」を蛍光観察・蛍光測光する場合に求められるアプリケーションのＳ／Ｎ比に対応させたものである。
上記条件式(3-3)の下限値は、上述したノイズ全体に対する光学系からの自家蛍光のノイズの割合における「極めて綺麗に洗浄した試料」についての条件式(3'-3)に対応させたものである。また、上記条件式(3-3)の左辺は、上述した「光学システムの観察光学系（又は測光光学系）全体のノイズに占める各々の自家蛍光は、対物レンズが３割、イマージョン物質が３割、カバーガラスが３割を占め」、対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラスのそれぞれの光学系全体に占めるノイズの割合が同じであること、及び条件式(3'-3)より、光学系からの自家蛍光のノイズのうちの対物レンズ及びカバーガラスの自家蛍光のノイズの割合をイマージョン物質の自家蛍光のノイズの割合に置き換えることによって導出したものである。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦２ …(2-3)
３ＢIM／Ｂ≧０．６ …(3-3)
ただし、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
上記条件式(2-3)の上限値は、上述した試料の明るさのランク分けにおける「一分子」を蛍光観察・蛍光測光する場合に求められるアプリケーションのＳ／Ｎ比に対応させたものである。
上記条件式(3-3)の下限値は、上述したノイズ全体に対する光学系からの自家蛍光のノイズの割合における「極めて綺麗に洗浄した試料」についての条件式(3'-3)に対応させたものである。また、上記条件式(3-3)の左辺は、上述した「光学システムの観察光学系（又は測光光学系）全体のノイズに占める各々の自家蛍光は、対物レンズが３割、イマージョン物質が３割、カバーガラスが３割を占め」、対物レンズ、イマージョン物質、カバーガラスのそれぞれの光学系全体に占めるノイズの割合が同じであること、及び条件式(3'-3)より、光学系からの自家蛍光のノイズのうちの対物レンズ及びカバーガラスの自家蛍光のノイズの割合をイマージョン物質の自家蛍光のノイズの割合に置き換えることによって導出したものである。
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程Ｂで選択したアプリケーションがＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）であるのが好ましい。
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであるのが好ましい。
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程Ｂで選択したシステムが全反射顕微鏡システムであるのが好ましい。
また、本発明の蛍光観察又は蛍光測光方法においては、前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡と全反射顕微鏡のいずれか一方を２つ又は両方を１つずつ有し、前記試料を挟んで対物光学系が対向配置された顕微鏡システムとして構成されているのが好ましい。
次に、本発明の蛍光観察システム、蛍光測光システム、蛍光観察方法、蛍光測光方法の実施例について、図を用いて説明する。
まず、従来の蛍光顕微鏡システムの一構成例を示す。
図１、図２は従来の倒立蛍光顕微鏡装置の一構成例を示す側面図であって、図１はレーザ光源を用いた落射蛍光顕微鏡装置の概略図、図２は白色アーク光源を用いた落射蛍光顕微鏡装置の概略図である。図３は図１の蛍光顕微鏡装置における照明光学系の要部の配置を示す概略図であり、(a)は通常蛍光観察時の光学部材の配置、(b)は全反射蛍光観察時の光学部材の配置を示している。
なお、ここでは、便宜上、図１の顕微鏡装置について説明することとする。図２の顕微鏡装置は、光源部にアーク光源１’を用いて落射投光管６に直接接続しているが、それ以外の構成は図１の顕微鏡装置とほぼ同じである。
まず、従来の蛍光顕微鏡システムの一構成例を示す。
図１、図２は従来の倒立蛍光顕微鏡装置の一構成例を示す側面図であって、図１はレーザ光源を用いた落射蛍光顕微鏡装置の概略図、図２は白色アーク光源を用いた落射蛍光顕微鏡装置の概略図である。図３は図１の蛍光顕微鏡装置における照明光学系の要部の配置を示す概略図であり、(a)は通常蛍光観察時の光学部材の配置、(b)は全反射蛍光観察時の光学部材の配置を示している。
なお、ここでは、便宜上、図１の顕微鏡装置について説明することとする。図２の顕微鏡装置は、光源部にアーク光源１’を用いて落射投光管６に直接接続しているが、それ以外の構成は図１の顕微鏡装置とほぼ同じである。
図１に示す蛍光顕微鏡装置は、レーザ光源１と、レーザ光源１から発振されたレーザ光を光ファイバ３へ導入する導入光学系を備えたレーザ導入機構２と、光ファイバ３を射出した光を試料８に照射する照射光学系としての、落射投光管６から対物レンズ７に至る光学部材と、光ファイバ３の配置を光軸上からエバネッセント照明可能な光軸から所定量ずれた位置まで位置調整可能な機構としてのアダプタ４及びファイバ位置調整摘み５を備えた照明光学系を備えた顕微鏡として構成されている。なお、図１中、９はダイクロイックミラー、１０は吸収フィルタ、１１は顕微鏡本体、１２は観察鏡筒である。
照射光学系１５は、図３に示すように、試料８側に配置された対物レンズ７と、光ファイバ３側（例えば、落射投光管６）に配置された集光レンズ１４を有している。なお、図３中、１６は光軸、１７はカバーガラスである。また、ＦBは対物レンズ７の後側焦点位置である。なお、図３では、便宜上、ダイクロイックミラー９は省略し、光ファイバ３から対物レンズ７までを直線的に示している。
集光レンズ１４は、対物レンズ７の後側焦点位置あるいはその近傍に光ファイバ３から射出された光を集光させるように構成されている。
集光レンズ１４は、対物レンズ７の後側焦点位置あるいはその近傍に光ファイバ３から射出された光を集光させるように構成されている。
アダプタ４は、光ファイバ３の出射端を接続するとともに、落射投光管６に接続されており、光ファイバ３から出射したレーザ光を落射投光管６に導くようになっている。また、アダプタ４内においては、光ファイバ３の出射端が、ファイバ位置調整摘み５に保持されている。また、アダプタ４内には、ファイバ位置調整摘み５を外部より操作することにより、光ファイバ３の出射端を、光軸上（図３(a)参照）や、エバネッセント照明可能な光軸から所定量ずれた位置（図３(b)参照）に、移動させることができる公知の機構を備えている。そして、図１の顕微鏡では、ファイバ位置調整摘み５を操作することにより、光ファイバ３を照射光学系の光軸上に位置させた通常の落射照明（図３(a)参照）と、光ファイバ３を照射光学系の光軸から所定量離れて位置させた全反射照明（図３(b)参照）とに、切り替え可能に構成されている。
また、対物レンズ７と試料８との間は、イマージョン物質１３で満たされている。
また、対物レンズ７と試料８との間は、イマージョン物質１３で満たされている。
次に、本発明の実施例及び比較例の蛍光顕微鏡装置について説明する。本発明の実施例及び比較例の蛍光顕微鏡装置の基本的な概略構成は図１及び図２に示した従来の蛍光顕微鏡装置と同じである。以下は、実施例と比較例とで異なる構成部分のみを説明し、同一の構成部分についての説明は省略する。
比較例１
まず、図１及び図２に示した従来の蛍光顕微鏡装置を用いて観察を行った。対物レンズとしてはOLYMPUS社製UPLSAPO60XO、カバーガラスとしては松浪ガラス工業社製 MATSUNAMI MICRO COVER GLASS No.1-S、イマージョン物質としてはOLYMPUS社製イマージョンオイル（屈折率ｎｄ＝1.52）、倒立顕微鏡としてはOLYMPUS社製IX71、検出器としては浜松ホトニクス社製EM-CCDを用いて、通常落射蛍光による１分子蛍光観察を行った。また、通常蛍光観察だけでなく、図３(b)に示す全反射蛍光観察装置による全反射蛍光観察も行った。さらに、FRETおよび動画観察も行った。この試料は上述の条件式(2-3)（即ち、（Ｓ−ｓ)／（Ｂ＋ｂ）≦２）、および条件式(3-3)（即ち、３ＢIM／Ｂ≧０．６）を満たす。比較例１の蛍光顕微鏡装置では、自家蛍光による背景光が強く、１分子観察を行うことができなかった。
まず、図１及び図２に示した従来の蛍光顕微鏡装置を用いて観察を行った。対物レンズとしてはOLYMPUS社製UPLSAPO60XO、カバーガラスとしては松浪ガラス工業社製 MATSUNAMI MICRO COVER GLASS No.1-S、イマージョン物質としてはOLYMPUS社製イマージョンオイル（屈折率ｎｄ＝1.52）、倒立顕微鏡としてはOLYMPUS社製IX71、検出器としては浜松ホトニクス社製EM-CCDを用いて、通常落射蛍光による１分子蛍光観察を行った。また、通常蛍光観察だけでなく、図３(b)に示す全反射蛍光観察装置による全反射蛍光観察も行った。さらに、FRETおよび動画観察も行った。この試料は上述の条件式(2-3)（即ち、（Ｓ−ｓ)／（Ｂ＋ｂ）≦２）、および条件式(3-3)（即ち、３ＢIM／Ｂ≧０．６）を満たす。比較例１の蛍光顕微鏡装置では、自家蛍光による背景光が強く、１分子観察を行うことができなかった。
実施例１
次に、比較例１で用いた蛍光顕微鏡装置のうち、イマージョン物質のみを次のようなイマージョン物質に変更して観察を行った。実施例１のイマージョン物質は、屈折率、アッベ数が、比較例１のイマージョン物質と同等である。また、実施例１のイマージョン物質の自家蛍光をＢ'IMとし、比較例１で用いたイマージョン物質の自家蛍光をＢIMとすると、自家蛍光の比は、条件式(1-1)（即ち、Ｂ'IM／ＢIM≦０．７）を満たす。
比較例１のイマージョン物質の代わりに実施例１のイマージョン物質を用いて、比較例１と同じ試料を同じ条件で観察したところ、自家蛍光による背景光が低減され、１分子を観察することが可能となった。
次に、比較例１で用いた蛍光顕微鏡装置のうち、イマージョン物質のみを次のようなイマージョン物質に変更して観察を行った。実施例１のイマージョン物質は、屈折率、アッベ数が、比較例１のイマージョン物質と同等である。また、実施例１のイマージョン物質の自家蛍光をＢ'IMとし、比較例１で用いたイマージョン物質の自家蛍光をＢIMとすると、自家蛍光の比は、条件式(1-1)（即ち、Ｂ'IM／ＢIM≦０．７）を満たす。
比較例１のイマージョン物質の代わりに実施例１のイマージョン物質を用いて、比較例１と同じ試料を同じ条件で観察したところ、自家蛍光による背景光が低減され、１分子を観察することが可能となった。
比較例２
次に、比較例１と同じ蛍光顕微鏡装置を用いて、条件式(2-2)（即ち、（Ｓ−ｓ)／（Ｂ＋ｂ）≦３）、および条件式(3-2)（即ち、３ＢIM／Ｂ≧０．４）を満たす試料の観察を行った。また、通常蛍光観察だけでなく、図３(b)に示す全反射蛍光観察装置による全反射蛍光観察も行った。さらに、FRET、カルシウムレシオイメージング、および動画観察も行った。そのときの観察画像は図４(b)に示すように画面全体に薄く白みがかかっており、観察対象の微細な構造が非常に観察し難かった。
次に、比較例１と同じ蛍光顕微鏡装置を用いて、条件式(2-2)（即ち、（Ｓ−ｓ)／（Ｂ＋ｂ）≦３）、および条件式(3-2)（即ち、３ＢIM／Ｂ≧０．４）を満たす試料の観察を行った。また、通常蛍光観察だけでなく、図３(b)に示す全反射蛍光観察装置による全反射蛍光観察も行った。さらに、FRET、カルシウムレシオイメージング、および動画観察も行った。そのときの観察画像は図４(b)に示すように画面全体に薄く白みがかかっており、観察対象の微細な構造が非常に観察し難かった。
実施例２
次に、比較例２で用いた蛍光顕微鏡装置のうち、イマージョン物質のみを次のようなイマージョン物質に変更して観察を行った。実施例２のイマージョン物質は、屈折率、アッベ数が、比較例２のイマージョン物質と同等である。また、実施例２のイマージョン物質の自家蛍光をＢ'IMとし、比較例２で用いたイマージョン物質の自家蛍光をＢIMとすると、自家蛍光の比は、条件式(1-2)（即ち、Ｂ'IM／ＢIM≦０．５）を満たす。
比較例２のイマージョン物質の代わりに実施例２のイマージョン物質を用いて、比較例２と同じ試料を同じ条件で観察したところ、図４(a)に示すように観察対象の微細な構造を鮮明に観察でき、自家蛍光による背景光が低減され、観察像のＳ／Ｎ比が改善されていることが確認できた。
次に、比較例２で用いた蛍光顕微鏡装置のうち、イマージョン物質のみを次のようなイマージョン物質に変更して観察を行った。実施例２のイマージョン物質は、屈折率、アッベ数が、比較例２のイマージョン物質と同等である。また、実施例２のイマージョン物質の自家蛍光をＢ'IMとし、比較例２で用いたイマージョン物質の自家蛍光をＢIMとすると、自家蛍光の比は、条件式(1-2)（即ち、Ｂ'IM／ＢIM≦０．５）を満たす。
比較例２のイマージョン物質の代わりに実施例２のイマージョン物質を用いて、比較例２と同じ試料を同じ条件で観察したところ、図４(a)に示すように観察対象の微細な構造を鮮明に観察でき、自家蛍光による背景光が低減され、観察像のＳ／Ｎ比が改善されていることが確認できた。
比較例３
次に、比較例１と同じ蛍光顕微鏡装置を用いて、条件式(2-1)（即ち、（Ｓ−ｓ)／（Ｂ＋ｂ）≦５）、および条件式(3-1)（即ち、３ＢIM／Ｂ≧０．２）を満たす試料の観察を行った。また、通常蛍光観察だけでなく、図３(b)に示す全反射蛍光観察装置による全反射蛍光観察も行った。さらに、FRET、カルシウムレシオイメージング、および動画観察も行った。
次に、比較例１と同じ蛍光顕微鏡装置を用いて、条件式(2-1)（即ち、（Ｓ−ｓ)／（Ｂ＋ｂ）≦５）、および条件式(3-1)（即ち、３ＢIM／Ｂ≧０．２）を満たす試料の観察を行った。また、通常蛍光観察だけでなく、図３(b)に示す全反射蛍光観察装置による全反射蛍光観察も行った。さらに、FRET、カルシウムレシオイメージング、および動画観察も行った。
実施例３
次に、比較例３で用いた蛍光顕微鏡装置のうち、イマージョン物質のみを次のようなイマージョン物質に変更して観察を行った。実施例３のイマージョン物質は、屈折率、アッベ数が、比較例３のイマージョン物質と同等である。また、実施例３のイマージョン物質の自家蛍光をＢ'IMとし、比較例３で用いたイマージョン物質の自家蛍光をＢIMとすると、自家蛍光の比は、条件式(1-3)（即ち、Ｂ'IM／ＢIM≦０．３）を満たす。
比較例３のイマージョン物質の代わりに実施例３のイマージョン物質を用いて、比較例３と同じ試料を同じ条件で観察したところ、自家蛍光による背景光が低減され、観察像のＳ／Ｎ比が改善されていることが確認できた。
次に、比較例３で用いた蛍光顕微鏡装置のうち、イマージョン物質のみを次のようなイマージョン物質に変更して観察を行った。実施例３のイマージョン物質は、屈折率、アッベ数が、比較例３のイマージョン物質と同等である。また、実施例３のイマージョン物質の自家蛍光をＢ'IMとし、比較例３で用いたイマージョン物質の自家蛍光をＢIMとすると、自家蛍光の比は、条件式(1-3)（即ち、Ｂ'IM／ＢIM≦０．３）を満たす。
比較例３のイマージョン物質の代わりに実施例３のイマージョン物質を用いて、比較例３と同じ試料を同じ条件で観察したところ、自家蛍光による背景光が低減され、観察像のＳ／Ｎ比が改善されていることが確認できた。
上記比較例と実施例との比較により、本発明のイマージョン物質を用いると、蛍光観察のＳ／Ｎ比が改善され、より高品質な観察が可能であることが確認できた。また、本発明は上記各実施例の組み合わせに限定されるものでははない。たとえば、実施例１において、Ｂ'IM／ＢIM≦０．３を満たすイマージョン物質を用いればよりＳ／Ｎ比改善の効果が高くなる。
また、上記各実施例では、倒立顕微鏡を用いて説明したが、倒立顕微鏡に限定されるものではなく、本発明は正立顕微鏡においても同様の効果が発揮できる。
また、本発明に用いる顕微鏡としては、倒立顕微鏡と正立顕微鏡とを試料を挟んで配置した上下顕微鏡として構成してもよい。上下顕微鏡の場合は正立顕微鏡側、倒立顕微鏡側のいずれか一方に本発明の実施例に示したイマージョン物質が用いられていれば本発明の効果が発揮できる。また、正立顕微鏡側、倒立顕微鏡側は、それぞれ独立に駆動する構成、あるいは連動して駆動する構成のどちらでもよい。さらに、正立顕微鏡側で通常蛍光観察、倒立顕微鏡側で全反射蛍光観察というように、上下の顕微鏡で異なる観察方法を用いてもよい。
また、本発明に用いる顕微鏡としては、倒立顕微鏡と正立顕微鏡とを試料を挟んで配置した上下顕微鏡として構成してもよい。上下顕微鏡の場合は正立顕微鏡側、倒立顕微鏡側のいずれか一方に本発明の実施例に示したイマージョン物質が用いられていれば本発明の効果が発揮できる。また、正立顕微鏡側、倒立顕微鏡側は、それぞれ独立に駆動する構成、あるいは連動して駆動する構成のどちらでもよい。さらに、正立顕微鏡側で通常蛍光観察、倒立顕微鏡側で全反射蛍光観察というように、上下の顕微鏡で異なる観察方法を用いてもよい。
以上のように、本発明の蛍光観察又は蛍光測光システム、及び蛍光観察又は蛍光測光方法は、特許請求の範囲に記載された発明の他にも、次に示すような特徴を有している。
（１）低蛍光なイマージョン物質を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムであって、前記低蛍光なイマージョン物質が次の条件式(1-2)を満足し、且つ、前記低蛍光なイマージョン物質におけるｄ線（５８７．５６ｎｍ）における屈折率ｎｄが１．５０以上１．７０未満であることを特徴とする蛍光観察又は蛍光計測システム。
ＢIM'／ＢIM≦０．５ …(1-2)
ただし、ＢIM'は前記低蛍光なイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
ＢIM'／ＢIM≦０．５ …(1-2)
ただし、ＢIM'は前記低蛍光なイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
（２）低蛍光なイマージョン物質を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムであって、前記低蛍光なイマージョン物質が次の条件式(1-3)を満足し、且つ、前記低蛍光なイマージョン物質におけるｄ線（５８７．５６ｎｍ）における屈折率ｎｄが１．５０以上１．７０未満であることを特徴とする蛍光観察又は蛍光計測システム。
ＢIM'／ＢIM≦０．３ …(1-3)
ただし、ＢIM'は前記低蛍光なイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
ＢIM'／ＢIM≦０．３ …(1-3)
ただし、ＢIM'は前記低蛍光なイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
（３）前記工程Ａで選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-2)，(3-2)の少なくとも一方を満足することを特徴とする請求項２に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦３ …(2-2)
３ＢIM／Ｂ≧０．４ …(3-2)
ただし、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦３ …(2-2)
３ＢIM／Ｂ≧０．４ …(3-2)
ただし、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
（４）前記工程Ｂで選択したアプリケーションがＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）であることを特徴とする上記（３）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（５）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（４）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（６）前記工程Ｂで選択したシステムが全反射顕微鏡システムであることを特徴とする上記（４）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（７）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡と全反射顕微鏡のいずれか一方を２つ又は両方を１つずつ有し、前記試料を挟んで対物光学系が対向配置された顕微鏡システムとして構成されていることを特徴とする上記（４）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（８）前記工程Ｂで選択したアプリケーションがカルシウムイメージングであることを特徴とする上記（３）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（９）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（８）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（１０）前記工程Ｂで選択したシステムが全反射顕微鏡システムであることを特徴とする上記（８）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（１１）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡と全反射顕微鏡のいずれか一方を２つ又は両方を１つずつ有し、前記試料を挟んで対物光学系が対向配置された顕微鏡システムとして構成されていることを特徴とする上記（８）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（１２）前記工程Ｂで選択したアプリケーションが動画観察又はタイムラプス観察であることを特徴とする上記（３）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（１３）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（１２）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（１４）前記工程Ｂで選択したシステムが全反射顕微鏡システムであることを特徴とする上記（１２）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（１５）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡と全反射顕微鏡のいずれか一方を２つ又は両方を１つずつ有し、前記試料を挟んで対物光学系が対向配置された顕微鏡システムとして構成されていることを特徴とする上記（１２）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（１６）前記工程Ａで選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-3)，(3-3)の少なくとも一方を満足することを特徴とする請求項２に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦２ …(2-3)
３ＢIM／Ｂ≧０．６ …(3-3)
ただし、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦２ …(2-3)
３ＢIM／Ｂ≧０．６ …(3-3)
ただし、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
（１７）前記工程Ｂで選択したアプリケーションがＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）であることを特徴とする上記（１６）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（１８）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（１７）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（１９）前記工程Ｂで選択したシステムが全反射顕微鏡システムであることを特徴とする上記（１７）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（２０）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡と全反射顕微鏡のいずれか一方を２つ又は両方を１つずつ有し、前記試料を挟んで対物光学系が対向配置された顕微鏡システムとして構成されていることを特徴とする上記（１７）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（２１）前記工程Ｂで選択したアプリケーションがカルシウムイメージングであることを特徴とする上記（１６）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（２２）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（２１）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（２３）前記工程Ｂで選択したシステムが全反射顕微鏡システムであることを特徴とする上記（２１）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（２４）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡と全反射顕微鏡のいずれか一方を２つ又は両方を１つずつ有し、前記試料を挟んで対物光学系が対向配置された顕微鏡システムとして構成されていることを特徴とする上記（２１）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（２５）前記工程Ｂで選択したアプリケーションが動画観察又はタイムラプス観察であることを特徴とする上記（１６）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（２６）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（２５）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（２７）前記工程Ｂで選択したシステムが全反射顕微鏡システムであることを特徴とする上記（２５）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（２８）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡と全反射顕微鏡のいずれか一方を２つ又は両方を１つずつ有し、前記試料を挟んで対物光学系が対向配置された顕微鏡システムとして構成されていることを特徴とする上記（２５）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（２９）蛍光観察又は蛍光測光方法において、次の工程Ａ，Ｂ，Ｃからなることを特徴とする蛍光観察又は蛍光測光方法。
Ａ．生細胞を用いた蛍光を発する試料を選択する工程。
Ｂ．前記工程Ａで選択した試料を観察又は測光するためのアプリケーション、及び次の条件式(1-2)を満足し、且つ、ｄ線（５８７．５６ｎｍ）における屈折率ｎｄが１．５０以上１．７０未満である低蛍光なイマージョン物質を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムを選択する工程。
Ｃ．前記工程Ｂで選択したアプリケーション及びシステムを用いて、前記工程Ａで選択した試料を蛍光観察又は蛍光測光する工程。
ＢIM'／ＢIM≦０．５ …(1-2)
ただし、ＢIM'は前記低蛍光なイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
Ａ．生細胞を用いた蛍光を発する試料を選択する工程。
Ｂ．前記工程Ａで選択した試料を観察又は測光するためのアプリケーション、及び次の条件式(1-2)を満足し、且つ、ｄ線（５８７．５６ｎｍ）における屈折率ｎｄが１．５０以上１．７０未満である低蛍光なイマージョン物質を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムを選択する工程。
Ｃ．前記工程Ｂで選択したアプリケーション及びシステムを用いて、前記工程Ａで選択した試料を蛍光観察又は蛍光測光する工程。
ＢIM'／ＢIM≦０．５ …(1-2)
ただし、ＢIM'は前記低蛍光なイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
（３０）前記工程Ａで選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-1)，(3-1)の少なくとも一方を満足することを特徴とする上記（２９）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦５ …(2-1)
３ＢIM／Ｂ≧０．２ …(3-1)
ただし、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦５ …(2-1)
３ＢIM／Ｂ≧０．２ …(3-1)
ただし、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
（３１）前記工程Ｂで選択したアプリケーションがＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）であることを特徴とする上記（３０）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（３２）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（３１）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（３３）前記工程Ｂで選択したシステムが全反射顕微鏡システムであることを特徴とする上記（３１）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（３４）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡と全反射顕微鏡のいずれか一方を２つ又は両方を１つずつ有し、前記試料を挟んで対物光学系が対向配置された顕微鏡システムとして構成されていることを特徴とする上記（３１）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（３５）前記工程Ｂで選択したアプリケーションがカルシウムイメージングであることを特徴とする上記（３０）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（３６）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（３５）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（３７）前記工程Ｂで選択したシステムが全反射顕微鏡システムであることを特徴とする上記（３５）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（３８）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡と全反射顕微鏡のいずれか一方を２つ又は両方を１つずつ有し、前記試料を挟んで対物光学系が対向配置された顕微鏡システムとして構成されていることを特徴とする上記（３５）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（３９）前記工程Ｂで選択したアプリケーションが動画観察又はタイムラプス観察であることを特徴とする上記（３０）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（４０）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（３９）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（４１）前記工程Ｂで選択したシステムが全反射顕微鏡システムであることを特徴とする上記（３９）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（４２）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡と全反射顕微鏡のいずれか一方を２つ又は両方を１つずつ有し、前記試料を挟んで対物光学系が対向配置された顕微鏡システムとして構成されていることを特徴とする上記（３９）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（４３）前記工程Ａで選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-2)，(3-2)の少なくとも一方を満足することを特徴とする上記（２９）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦３ …(2-2)
３ＢIM／Ｂ≧０．４ …(3-2)
ただし、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦３ …(2-2)
３ＢIM／Ｂ≧０．４ …(3-2)
ただし、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
（４４）前記工程Ｂで選択したアプリケーションがＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）であることを特徴とする上記（４３）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（４５）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（４４）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（４６）前記工程Ｂで選択したシステムが全反射顕微鏡システムであることを特徴とする上記（４４）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（４７）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡と全反射顕微鏡のいずれか一方を２つ又は両方を１つずつ有し、前記試料を挟んで対物光学系が対向配置された顕微鏡システムとして構成されていることを特徴とする上記（４４）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（４８）前記工程Ｂで選択したアプリケーションがカルシウムイメージングであることを特徴とする上記（４３）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（４９）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（４８）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（５０）前記工程Ｂで選択したシステムが全反射顕微鏡システムであることを特徴とする上記（４８）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（５１）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡と全反射顕微鏡のいずれか一方を２つ又は両方を１つずつ有し、前記試料を挟んで対物光学系が対向配置された顕微鏡システムとして構成されていることを特徴とする上記（４８）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（５２）前記工程Ｂで選択したアプリケーションが動画観察又はタイムラプス観察であることを特徴とする上記（４３）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（５３）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（５２）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（５４）前記工程Ｂで選択したシステムが全反射顕微鏡システムであることを特徴とする上記（５２）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（５５）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡と全反射顕微鏡のいずれか一方を２つ又は両方を１つずつ有し、前記試料を挟んで対物光学系が対向配置された顕微鏡システムとして構成されていることを特徴とする上記（５２）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（５６）前記工程Ａで選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-3)，(3-3)の少なくとも一方を満足することを特徴とする上記（２９）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦２ …(2-3)
３ＢIM／Ｂ≧０．６ …(3-3)
ただし、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦２ …(2-3)
３ＢIM／Ｂ≧０．６ …(3-3)
ただし、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
（５７）前記工程Ｂで選択したアプリケーションがＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）であることを特徴とする上記（５６）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（５８）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（５７）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（５９）前記工程Ｂで選択したシステムが全反射顕微鏡システムであることを特徴とする上記（５７）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（６０）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡と全反射顕微鏡のいずれか一方を２つ又は両方を１つずつ有し、前記試料を挟んで対物光学系が対向配置された顕微鏡システムとして構成されていることを特徴とする上記（５７）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（６１）前記工程Ｂで選択したアプリケーションがカルシウムイメージングであることを特徴とする上記（５６）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（６２）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（６１）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（６３）前記工程Ｂで選択したシステムが全反射顕微鏡システムであることを特徴とする上記（６１）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（６４）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡と全反射顕微鏡のいずれか一方を２つ又は両方を１つずつ有し、前記試料を挟んで対物光学系が対向配置された顕微鏡システムとして構成されていることを特徴とする上記（６１）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（６５）前記工程Ｂで選択したアプリケーションが動画観察又はタイムラプス観察であることを特徴とする上記（５６）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（６６）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（６５）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（６７）前記工程Ｂで選択したシステムが全反射顕微鏡システムであることを特徴とする上記（６５）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（６８）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡と全反射顕微鏡のいずれか一方を２つ又は両方を１つずつ有し、前記試料を挟んで対物光学系が対向配置された顕微鏡システムとして構成されていることを特徴とする上記（６５）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（６９）蛍光観察又は蛍光測光方法において、次の工程Ａ，Ｂ，Ｃからなることを特徴とする蛍光観察又は蛍光測光方法。
Ａ．生細胞を用いた蛍光を発する試料を選択する工程。
Ｂ．前記工程Ａで選択した試料を観察又は測光するためのアプリケーション、及び次の条件式(1-3)を満足し、且つ、ｄ線（５８７．５６ｎｍ）における屈折率ｎｄが１．５０以上１．７０未満である低蛍光なイマージョン物質を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムを選択する工程。
Ｃ．前記工程Ｂで選択したアプリケーション及びシステムを用いて、前記工程Ａで選択した試料を蛍光観察又は蛍光測光する工程。
ＢIM'／ＢIM≦０．３ …(1-3)
ただし、ＢIM'は前記低蛍光なイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
Ａ．生細胞を用いた蛍光を発する試料を選択する工程。
Ｂ．前記工程Ａで選択した試料を観察又は測光するためのアプリケーション、及び次の条件式(1-3)を満足し、且つ、ｄ線（５８７．５６ｎｍ）における屈折率ｎｄが１．５０以上１．７０未満である低蛍光なイマージョン物質を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムを選択する工程。
Ｃ．前記工程Ｂで選択したアプリケーション及びシステムを用いて、前記工程Ａで選択した試料を蛍光観察又は蛍光測光する工程。
ＢIM'／ＢIM≦０．３ …(1-3)
ただし、ＢIM'は前記低蛍光なイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
（７０）前記工程Ａで選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-1)，(3-1)の少なくとも一方を満足することを特徴とする上記（６９）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦５ …(2-1)
３ＢIM／Ｂ≧０．２ …(3-1)
ただし、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦５ …(2-1)
３ＢIM／Ｂ≧０．２ …(3-1)
ただし、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
（７１）前記工程Ｂで選択したアプリケーションがＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）であることを特徴とする上記（７０）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（７２）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（７１）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（７３）前記工程Ｂで選択したシステムが全反射顕微鏡システムであることを特徴とする上記（７１）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（７４）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡と全反射顕微鏡のいずれか一方を２つ又は両方を１つずつ有し、前記試料を挟んで対物光学系が対向配置された顕微鏡システムとして構成されていることを特徴とする上記（７１）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（７５）前記工程Ｂで選択したアプリケーションがカルシウムイメージングであることを特徴とする上記（７０）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（７６）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（７５）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（７７）前記工程Ｂで選択したシステムが全反射顕微鏡システムであることを特徴とする上記（７５）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（７８）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡と全反射顕微鏡のいずれか一方を２つ又は両方を１つずつ有し、前記試料を挟んで対物光学系が対向配置された顕微鏡システムとして構成されていることを特徴とする上記（７５）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（７９）前記工程Ｂで選択したアプリケーションが動画観察又はタイムラプス観察であることを特徴とする上記（７０）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（８０）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（７９）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（８１）前記工程Ｂで選択したシステムが全反射顕微鏡システムであることを特徴とする上記（７９）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（８２）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡と全反射顕微鏡のいずれか一方を２つ又は両方を１つずつ有し、前記試料を挟んで対物光学系が対向配置された顕微鏡システムとして構成されていることを特徴とする上記（７９）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（８３）前記工程Ａで選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-2)，(3-2)の少なくとも一方を満足することを特徴とする上記（６９）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦３ …(2-2)
３ＢIM／Ｂ≧０．４ …(3-2)
ただし、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦３ …(2-2)
３ＢIM／Ｂ≧０．４ …(3-2)
ただし、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
（８４）前記工程Ｂで選択したアプリケーションがＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）であることを特徴とする上記（８３）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（８５）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（８４）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（８６）前記工程Ｂで選択したシステムが全反射顕微鏡システムであることを特徴とする上記（８４）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（８７）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡と全反射顕微鏡のいずれか一方を２つ又は両方を１つずつ有し、前記試料を挟んで対物光学系が対向配置された顕微鏡システムとして構成されていることを特徴とする上記（８４）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（８８）前記工程Ｂで選択したアプリケーションがカルシウムイメージングであることを特徴とする上記（８３）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（８９）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（８８）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（９０）前記工程Ｂで選択したシステムが全反射顕微鏡システムであることを特徴とする上記（８８）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（９１）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡と全反射顕微鏡のいずれか一方を２つ又は両方を１つずつ有し、前記試料を挟んで対物光学系が対向配置された顕微鏡システムとして構成されていることを特徴とする上記（８８）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（９２）前記工程Ｂで選択したアプリケーションが動画観察又はタイムラプス観察であることを特徴とする上記（８３）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（９３）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（９２）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（９４）前記工程Ｂで選択したシステムが全反射顕微鏡システムであることを特徴とする上記（９２）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（９５）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡と全反射顕微鏡のいずれか一方を２つ又は両方を１つずつ有し、前記試料を挟んで対物光学系が対向配置された顕微鏡システムとして構成されていることを特徴とする上記（９２）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（９６）前記工程Ａで選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-3)，(3-3)の少なくとも一方を満足することを特徴とする上記（６９）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦２ …(2-3)
３ＢIM／Ｂ≧０．６ …(3-3)
ただし、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦２ …(2-3)
３ＢIM／Ｂ≧０．６ …(3-3)
ただし、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。
（９７）前記工程Ｂで選択したアプリケーションがＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）であることを特徴とする上記（９６）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（９８）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（９７）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（９９）前記工程Ｂで選択したシステムが全反射顕微鏡システムであることを特徴とする上記（９７）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（１００）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡と全反射顕微鏡のいずれか一方を２つ又は両方を１つずつ有し、前記試料を挟んで対物光学系が対向配置された顕微鏡システムとして構成されていることを特徴とする上記（９７）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（１０１）前記工程Ｂで選択したアプリケーションがカルシウムイメージングであることを特徴とする上記（９６）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（１０２）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（１０１）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（１０３）前記工程Ｂで選択したシステムが全反射顕微鏡システムであることを特徴とする上記（１０１）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（１０４）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡と全反射顕微鏡のいずれか一方を２つ又は両方を１つずつ有し、前記試料を挟んで対物光学系が対向配置された顕微鏡システムとして構成されていることを特徴とする上記（１０１）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（１０５）前記工程Ｂで選択したアプリケーションが動画観察又はタイムラプス観察であることを特徴とする上記（９６）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（１０６）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする上記（１０５）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（１０７）前記工程Ｂで選択したシステムが全反射顕微鏡システムであることを特徴とする上記（１０５）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（１０８）前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡と全反射顕微鏡のいずれか一方を２つ又は両方を１つずつ有し、前記試料を挟んで対物光学系が対向配置された顕微鏡システムとして構成されていることを特徴とする上記（１０５）に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
本発明の蛍光観察又は蛍光測光システム、及び蛍光観察又は蛍光測光方法は、微弱な蛍光を広帯域で正確に観察・計測できる技術に関する重要性が増し、ノイズも含めた正確な定量性が必要とされる顕微鏡分野、蛍光顕微鏡分野、タンパク質・ＤＮＡ解析装置分野に有用である。
１ レーザ光源
２ レーザ導入機構
３ 光ファイバ
４ アダプタ
５ ファイバ位置調整摘み
６ 落射投光管
７ 対物レンズ
８ 試料
９ ダイクロイックミラー
１０ 吸収フィルタ
１１ 顕微鏡本体
１２ 観察鏡筒
１３ イマージョン物質
１４ 集光レンズ
１５ 照明光学系
１６ 光軸
１７ カバーガラス
ＦB 対物レンズの後側焦点位置
２ レーザ導入機構
３ 光ファイバ
４ アダプタ
５ ファイバ位置調整摘み
６ 落射投光管
７ 対物レンズ
８ 試料
９ ダイクロイックミラー
１０ 吸収フィルタ
１１ 顕微鏡本体
１２ 観察鏡筒
１３ イマージョン物質
１４ 集光レンズ
１５ 照明光学系
１６ 光軸
１７ カバーガラス
ＦB 対物レンズの後側焦点位置
Claims (15)
- 低蛍光なイマージョン物質を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムであって、
前記低蛍光なイマージョン物質が次の条件式(1-1)を満足し、且つ、
前記低蛍光なイマージョン物質におけるｄ線（５８７．５６ｎｍ）における屈折率ｎｄが１．５０以上１．７０未満であることを特徴とする蛍光観察又は蛍光計測システム。
ＢIM’／ＢIM≦０．７ …(1-1)
ただし、ＢIM’は前記低蛍光なイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。 - 蛍光観察又は蛍光測光方法において、次の工程Ａ，Ｂ，Ｃからなることを特徴とする蛍光観察又は蛍光測光方法。
Ａ．生細胞を用いた蛍光を発する試料を選択する工程。
Ｂ．前記工程Ａで選択した試料を観察又は測光するためのアプリケーション、及び次の条件式(1-1)を満足し、且つ、ｄ線（５８７．５６ｎｍ）における屈折率ｎｄが１．５０以上１．７０未満である低蛍光なイマージョン物質を用いてなる蛍光観察又は蛍光測光システムを選択する工程。
Ｃ．前記工程Ｂで選択したアプリケーション及びシステムを用いて、前記工程Ａで選択した試料を蛍光観察又は蛍光測光する工程。
ＢIM’／ＢIM≦０．７ …(1-1)
ただし、ＢIM’は前記低蛍光なイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。 - 前記工程Ａで選択する生細胞を用いた蛍光を発する試料が、次の条件式(2-1)，(3-1)の少なくとも一方を満足することを特徴とする請求項２に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
（Ｓ−ｓ）／（Ｂ＋ｂ）≦５ …(2-1)
３ＢIM／Ｂ≧０．２ …(3-1)
ただし、Ｓは前記試料が発する蛍光の強度の平均値、ｓは該蛍光の強度の揺らぎ幅、Ｂは試料が存在しない背景ノイズの強度の平均値、ｂは該背景ノイズの強度の揺らぎ幅、ＢIMは従来一般的に使用されているイマージョン物質の自家蛍光の強度の平均値である。 - 前記工程Ｂで選択したアプリケーションがＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）であることを特徴とする請求項３に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
- 前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする請求項４に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
- 前記工程Ｂで選択したシステムが全反射顕微鏡システムであることを特徴とする請求項４に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
- 前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡と全反射顕微鏡のいずれか一方を２つ又は両方を１つずつ有し、前記試料を挟んで対物光学系が対向配置された顕微鏡システムとして構成されていることを特徴とする請求項４に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
- 前記工程Ｂで選択したアプリケーションがカルシウムイメージングであることを特徴とする請求項３に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
- 前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする請求項８に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
- 前記工程Ｂで選択したシステムが全反射顕微鏡システムであることを特徴とする請求項８に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
- 前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡と全反射顕微鏡のいずれか一方を２つ又は両方を１つずつ有し、前記試料を挟んで対物光学系が対向配置された顕微鏡システムとして構成されていることを特徴とする請求項８に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
- 前記工程Ｂで選択したアプリケーションが動画観察又はタイムラプス観察であることを特徴とする請求項３に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
- 前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡システムであることを特徴とする請求項１２に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
- 前記工程Ｂで選択したシステムが全反射顕微鏡システムであることを特徴とする請求項１２に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
- 前記工程Ｂで選択したシステムが蛍光顕微鏡と全反射顕微鏡のいずれか一方を２つ又は両方を１つずつ有し、前記試料を挟んで対物光学系が対向配置された顕微鏡システムとして構成されていることを特徴とする請求項１２に記載の蛍光観察又は蛍光測光方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006175496A JP2008003053A (ja) | 2006-06-26 | 2006-06-26 | 蛍光観察又は蛍光測光システム、及び蛍光観察又は蛍光測光方法 |
| US11/588,646 US7696491B2 (en) | 2006-06-26 | 2006-10-27 | Fluorescence observation or fluorescence measuring system, and fluorescence observation or fluorescence measuring method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006175496A JP2008003053A (ja) | 2006-06-26 | 2006-06-26 | 蛍光観察又は蛍光測光システム、及び蛍光観察又は蛍光測光方法 |
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|---|---|
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2006175496A Abandoned JP2008003053A (ja) | 2006-06-26 | 2006-06-26 | 蛍光観察又は蛍光測光システム、及び蛍光観察又は蛍光測光方法 |
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|---|---|
| JP (1) | JP2008003053A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011075312A (ja) * | 2009-09-29 | 2011-04-14 | Sanyo Electric Co Ltd | 観察装置 |
| JP2012521541A (ja) * | 2009-03-18 | 2012-09-13 | ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデーション | ノンコヒーレント光学顕微鏡 |
| CN103827944A (zh) * | 2011-07-22 | 2014-05-28 | 雀巢产品技术援助有限公司 | 减少儿童时期肥胖和计算儿童时期肥胖风险的方法 |
-
2006
- 2006-06-26 JP JP2006175496A patent/JP2008003053A/ja not_active Abandoned
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JP2011075312A (ja) * | 2009-09-29 | 2011-04-14 | Sanyo Electric Co Ltd | 観察装置 |
| CN103827944A (zh) * | 2011-07-22 | 2014-05-28 | 雀巢产品技术援助有限公司 | 减少儿童时期肥胖和计算儿童时期肥胖风险的方法 |
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