KR20210108970A - 플로우 셀 디바이스 및 그의 용도 - Google Patents
플로우 셀 디바이스 및 그의 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20210108970A KR20210108970A KR1020217021167A KR20217021167A KR20210108970A KR 20210108970 A KR20210108970 A KR 20210108970A KR 1020217021167 A KR1020217021167 A KR 1020217021167A KR 20217021167 A KR20217021167 A KR 20217021167A KR 20210108970 A KR20210108970 A KR 20210108970A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- flow cell
- cell device
- capillary
- reagent
- reservoir
- Prior art date
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 122
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 114
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 114
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 75
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 24
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 165
- 239000010410 layer Substances 0.000 claims description 159
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 138
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 134
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 132
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 118
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 102
- -1 polydimethylsiloxane Polymers 0.000 claims description 93
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 88
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 63
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 60
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 60
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 50
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 49
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 46
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 46
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 claims description 45
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims description 43
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 40
- 229920000089 Cyclic olefin copolymer Polymers 0.000 claims description 35
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 23
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 claims description 23
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 claims description 23
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 20
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 18
- 239000004713 Cyclic olefin copolymer Substances 0.000 claims description 16
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 claims description 14
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 claims description 14
- 229920001903 high density polyethylene Polymers 0.000 claims description 14
- 239000004700 high-density polyethylene Substances 0.000 claims description 14
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 claims description 14
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 claims description 14
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 claims description 14
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 claims description 14
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 claims description 13
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 12
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 claims description 12
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 12
- 238000001802 infusion Methods 0.000 claims description 12
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 claims description 12
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 12
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 claims description 11
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 claims description 11
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 10
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000005388 borosilicate glass Substances 0.000 claims description 9
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 claims description 9
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 claims description 9
- 239000010453 quartz Substances 0.000 claims description 9
- 238000004891 communication Methods 0.000 claims description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 7
- 239000005350 fused silica glass Substances 0.000 claims description 6
- 238000005530 etching Methods 0.000 claims description 5
- 239000011247 coating layer Substances 0.000 claims description 4
- 239000002699 waste material Substances 0.000 claims description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 3
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 claims 4
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 claims 3
- 239000004642 Polyimide Substances 0.000 claims 2
- 235000013870 dimethyl polysiloxane Nutrition 0.000 claims 2
- 239000003822 epoxy resin Substances 0.000 claims 2
- 229920000647 polyepoxide Polymers 0.000 claims 2
- 229920001721 polyimide Polymers 0.000 claims 2
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 claims 1
- 239000000806 elastomer Substances 0.000 claims 1
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 claims 1
- 238000000695 excitation spectrum Methods 0.000 claims 1
- CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N octamethyltrisiloxane Chemical compound C[Si](C)(C)O[Si](C)(C)O[Si](C)(C)C CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000004987 plasma desorption mass spectroscopy Methods 0.000 claims 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 abstract description 22
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 201
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 131
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 97
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 76
- 239000000463 material Substances 0.000 description 55
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 42
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 39
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 38
- 235000012431 wafers Nutrition 0.000 description 35
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 27
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 26
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 23
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 21
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 21
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 18
- 230000015654 memory Effects 0.000 description 18
- 238000013461 design Methods 0.000 description 16
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 16
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 16
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 15
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 14
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 14
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 14
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 14
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 14
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 14
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 14
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 12
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 11
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 11
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 11
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 11
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 11
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 11
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 11
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 11
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 10
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 10
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 10
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 9
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 8
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 229920003213 poly(N-isopropyl acrylamide) Polymers 0.000 description 8
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 8
- BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N Silane Chemical compound [SiH4] BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 7
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 7
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 7
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 7
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 7
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 7
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 7
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 6
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 6
- 108010020346 Polyglutamic Acid Proteins 0.000 description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 6
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 6
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 6
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 229920002643 polyglutamic acid Polymers 0.000 description 6
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 6
- 229910000077 silane Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 6
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 5
- WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N Hydroxyethyl methacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCCO WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920006169 Perfluoroelastomer Polymers 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 238000003486 chemical etching Methods 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 5
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 5
- 239000000087 laser glass Substances 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 229920001601 polyetherimide Polymers 0.000 description 5
- 229920002338 polyhydroxyethylmethacrylate Polymers 0.000 description 5
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 5
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 5
- 125000003396 thiol group Chemical class [H]S* 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 238000003466 welding Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-aminopropyl)triethoxysilane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SJECZPVISLOESU-UHFFFAOYSA-N 3-trimethoxysilylpropan-1-amine Chemical compound CO[Si](OC)(OC)CCCN SJECZPVISLOESU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- OHOQEZWSNFNUSY-UHFFFAOYSA-N Cy3-bifunctional dye zwitterion Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCCN1C2=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C2C(C)(C)C1=CC=CC(C(C1=CC(=CC=C11)S([O-])(=O)=O)(C)C)=[N+]1CCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O OHOQEZWSNFNUSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 4
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 239000004697 Polyetherimide Substances 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 4
- 229920006037 cross link polymer Polymers 0.000 description 4
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N glycine betaine Chemical compound C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- OFXSXYCSPVKZPF-UHFFFAOYSA-N methoxyperoxymethane Chemical compound COOOC OFXSXYCSPVKZPF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002161 passivation Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 150000004756 silanes Chemical class 0.000 description 4
- 239000005361 soda-lime glass Substances 0.000 description 4
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N Purine Natural products N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001345 alkine derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 238000003491 array Methods 0.000 description 3
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 3
- 238000013500 data storage Methods 0.000 description 3
- DUDCYUDPBRJVLG-UHFFFAOYSA-N ethoxyethane methyl 2-methylprop-2-enoate Chemical compound CCOCC.COC(=O)C(C)=C DUDCYUDPBRJVLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000008131 glucosides Chemical class 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000005660 hydrophilic surface Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 description 3
- 150000002513 isocyanates Chemical class 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 3
- 238000003754 machining Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 3
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 3
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- QGKMIGUHVLGJBR-UHFFFAOYSA-M (4z)-1-(3-methylbutyl)-4-[[1-(3-methylbutyl)quinolin-1-ium-4-yl]methylidene]quinoline;iodide Chemical compound [I-].C12=CC=CC=C2N(CCC(C)C)C=CC1=CC1=CC=[N+](CCC(C)C)C2=CC=CC=C12 QGKMIGUHVLGJBR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- PVVTWNMXEHROIA-UHFFFAOYSA-N 2-(3-hydroxypropyl)-1h-quinazolin-4-one Chemical compound C1=CC=C2NC(CCCO)=NC(=O)C2=C1 PVVTWNMXEHROIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 2
- 239000007991 ACES buffer Substances 0.000 description 2
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 description 2
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 2
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 238000004026 adhesive bonding Methods 0.000 description 2
- 239000012790 adhesive layer Substances 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N aldehydo-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 2
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- BHATUINFZWUDIX-UHFFFAOYSA-O dimethyl-(3-sulfopropyl)-tetradecylazanium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCS(O)(=O)=O BHATUINFZWUDIX-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 238000004049 embossing Methods 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 2
- LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N glyoxal Chemical compound O=CC=O LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 2
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001746 injection moulding Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000003475 lamination Methods 0.000 description 2
- 238000000608 laser ablation Methods 0.000 description 2
- IZWSFJTYBVKZNK-UHFFFAOYSA-N lauryl sulfobetaine Chemical compound CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O IZWSFJTYBVKZNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001459 lithography Methods 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000012120 mounting media Substances 0.000 description 2
- 239000012454 non-polar solvent Substances 0.000 description 2
- 239000003791 organic solvent mixture Substances 0.000 description 2
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 238000009832 plasma treatment Methods 0.000 description 2
- 239000003880 polar aprotic solvent Substances 0.000 description 2
- 229920006254 polymer film Polymers 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000003586 protic polar solvent Substances 0.000 description 2
- 230000000541 pulsatile effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- OVIKCIXFYVKSDD-UHFFFAOYSA-M (2e)-3-ethyl-2-[(1-ethylquinolin-1-ium-4-yl)methylidene]-1,3-benzothiazole;iodide Chemical compound [I-].C1=CC=C2C(/C=C3/N(C4=CC=CC=C4S3)CC)=CC=[N+](CC)C2=C1 OVIKCIXFYVKSDD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BWKILASWCLJPBO-LJQANCHMSA-N 1-lauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C BWKILASWCLJPBO-LJQANCHMSA-N 0.000 description 1
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003923 2,5-pyrrolediones Chemical class 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- GOLORTLGFDVFDW-UHFFFAOYSA-N 3-(1h-benzimidazol-2-yl)-7-(diethylamino)chromen-2-one Chemical compound C1=CC=C2NC(C3=CC4=CC=C(C=C4OC3=O)N(CC)CC)=NC2=C1 GOLORTLGFDVFDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QMGYGZCGWOKPGR-UHFFFAOYSA-N 3-(4-tert-butylpyridin-1-ium-1-yl)propane-1-sulfonate Chemical compound CC(C)(C)C1=CC=[N+](CCCS([O-])(=O)=O)C=C1 QMGYGZCGWOKPGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FUPYROAFYPQUSH-UHFFFAOYSA-N 3-[[3-(4-heptylphenyl)-3-hydroxypropyl]-dimethylazaniumyl]propane-1-sulfonate Chemical compound CCCCCCCC1=CC=C(C(O)CC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C=C1 FUPYROAFYPQUSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AQVJFUZGGMXMED-UHFFFAOYSA-N 3-[dimethyl-[3-[(4-octylbenzoyl)amino]propyl]azaniumyl]propane-1-sulfonate Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(C(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C=C1 AQVJFUZGGMXMED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUQQBLRVXOUDTN-XOHPMCGNSA-N 3-[dimethyl-[3-[[(4r)-4-[(3r,5s,7r,8r,9s,10s,12s,13r,14s,17r)-3,7,12-trihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoyl]amino]propyl]azaniumyl]-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CC(O)CS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 GUQQBLRVXOUDTN-XOHPMCGNSA-N 0.000 description 1
- AUDYZXNUHIIGRB-UHFFFAOYSA-N 3-thiophen-2-ylpyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C=2SC=CC=2)=C1 AUDYZXNUHIIGRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZFVNBVQBIZJUEY-UHFFFAOYSA-N 4-[dodecyl(dimethyl)azaniumyl]butanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCC([O-])=O ZFVNBVQBIZJUEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035657 Abasia Diseases 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M Acrylate Chemical compound [O-]C(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 229930182476 C-glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000000700 C-glycosides Chemical class 0.000 description 1
- QCMYYKRYFNMIEC-UHFFFAOYSA-N COP(O)=O Chemical class COP(O)=O QCMYYKRYFNMIEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- 241000252506 Characiformes Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108091028732 Concatemer Proteins 0.000 description 1
- VPAXJOUATWLOPR-UHFFFAOYSA-N Conferone Chemical compound C1=CC(=O)OC2=CC(OCC3C4(C)CCC(=O)C(C)(C)C4CC=C3C)=CC=C21 VPAXJOUATWLOPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MGIODCZGPVDROX-UHFFFAOYSA-N Cy5-bifunctional dye Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCCN1C2=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C2C(C)(C)C1=CC=CC=CC(C(C1=CC(=CC=C11)S([O-])(=O)=O)(C)C)=[N+]1CCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O MGIODCZGPVDROX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N Dimethyl ether Chemical compound COC LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 238000012179 MicroRNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 241000233805 Phoenix Species 0.000 description 1
- 239000004696 Poly ether ether ketone Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091036333 Rapid DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 208000034953 Twin anemia-polycythemia sequence Diseases 0.000 description 1
- 229920004738 ULTEM® Polymers 0.000 description 1
- 238000005299 abrasion Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N aldrithiol Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSC1=CC=CC=N1 HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002203 alpha-beta t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001502 aryl halides Chemical class 0.000 description 1
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- JUPQTSLXMOCDHR-UHFFFAOYSA-N benzene-1,4-diol;bis(4-fluorophenyl)methanone Chemical compound OC1=CC=C(O)C=C1.C1=CC(F)=CC=C1C(=O)C1=CC=C(F)C=C1 JUPQTSLXMOCDHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000003969 blast cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 150000004758 branched silanes Chemical class 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 239000012482 calibration solution Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 210000002358 circulating endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000012650 click reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000000748 compression moulding Methods 0.000 description 1
- JECGPMYZUFFYJW-UHFFFAOYSA-N conferone Natural products CC1=CCC2C(C)(C)C(=O)CCC2(C)C1COc3cccc4C=CC(=O)Oc34 JECGPMYZUFFYJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010226 confocal imaging Methods 0.000 description 1
- 238000002508 contact lithography Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000004759 cyclic silanes Chemical class 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- YYLGKUPAFFKGRQ-UHFFFAOYSA-N dimethyldiethoxysilane Chemical class CCO[Si](C)(C)OCC YYLGKUPAFFKGRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003708 edge detection Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 230000005670 electromagnetic radiation Effects 0.000 description 1
- 238000010894 electron beam technology Methods 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 210000005168 endometrial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 150000002118 epoxides Chemical class 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- NNCRHRDBFDCWPA-UHFFFAOYSA-N ethyl dimethyl ammonio propane sulfonate Chemical compound CC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O NNCRHRDBFDCWPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001973 fluoroelastomer Polymers 0.000 description 1
- 125000001207 fluorophenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000497 foam cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011990 functional testing Methods 0.000 description 1
- 210000004475 gamma-delta t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005816 glass manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 229940015043 glyoxal Drugs 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000005179 haloacetyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002463 imidates Chemical class 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000007641 inkjet printing Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 238000010884 ion-beam technique Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 238000010030 laminating Methods 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000010329 laser etching Methods 0.000 description 1
- 238000007648 laser printing Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000004757 linear silanes Chemical class 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003738 lymphoid progenitor cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000003801 milling Methods 0.000 description 1
- 239000002991 molded plastic Substances 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003643 myeloid progenitor cell Anatomy 0.000 description 1
- YWFWDNVOPHGWMX-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethyldodecan-1-amine Chemical compound CCCCCCCCCCCCN(C)C YWFWDNVOPHGWMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000013307 optical fiber Substances 0.000 description 1
- 238000012634 optical imaging Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000059 patterning Methods 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 150000008298 phosphoramidates Chemical class 0.000 description 1
- 238000000206 photolithography Methods 0.000 description 1
- 238000001020 plasma etching Methods 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000005498 polishing Methods 0.000 description 1
- 229920002006 poly(N-vinylimidazole) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002492 poly(sulfone) Polymers 0.000 description 1
- 229920002530 polyetherether ketone Polymers 0.000 description 1
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 1
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N purine Chemical compound N1=C[N]C2=NC=NC2=C1 IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 238000005488 sandblasting Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000007493 shaping process Methods 0.000 description 1
- 125000005372 silanol group Chemical group 0.000 description 1
- 229920002379 silicone rubber Polymers 0.000 description 1
- 210000002363 skeletal muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000003746 solid phase reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N sulfuryl dichloride Chemical class ClS(Cl)(=O)=O YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 1
- 238000006557 surface reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- QQQSFSZALRVCSZ-UHFFFAOYSA-N triethoxysilane Chemical class CCO[SiH](OCC)OCC QQQSFSZALRVCSZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 description 1
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000004832 voltammetry Methods 0.000 description 1
- 238000003631 wet chemical etching Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
- B01L3/502746—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by the means for controlling flow resistance, e.g. flow controllers, baffles
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
- B01L3/502715—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by interfacing components, e.g. fluidic, electrical, optical or mechanical interfaces
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
- B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
- B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L9/00—Supporting devices; Holding devices
- B01L9/06—Test-tube stands; Test-tube holders
- B01L9/065—Test-tube stands; Test-tube holders specially adapted for capillary tubes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B29—WORKING OF PLASTICS; WORKING OF SUBSTANCES IN A PLASTIC STATE IN GENERAL
- B29C—SHAPING OR JOINING OF PLASTICS; SHAPING OF MATERIAL IN A PLASTIC STATE, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; AFTER-TREATMENT OF THE SHAPED PRODUCTS, e.g. REPAIRING
- B29C65/00—Joining or sealing of preformed parts, e.g. welding of plastics materials; Apparatus therefor
- B29C65/02—Joining or sealing of preformed parts, e.g. welding of plastics materials; Apparatus therefor by heating, with or without pressure
- B29C65/14—Joining or sealing of preformed parts, e.g. welding of plastics materials; Apparatus therefor by heating, with or without pressure using wave energy, i.e. electromagnetic radiation, or particle radiation
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B29—WORKING OF PLASTICS; WORKING OF SUBSTANCES IN A PLASTIC STATE IN GENERAL
- B29C—SHAPING OR JOINING OF PLASTICS; SHAPING OF MATERIAL IN A PLASTIC STATE, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; AFTER-TREATMENT OF THE SHAPED PRODUCTS, e.g. REPAIRING
- B29C66/00—General aspects of processes or apparatus for joining preformed parts
- B29C66/80—General aspects of machine operations or constructions and parts thereof
- B29C66/84—Specific machine types or machines suitable for specific applications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/1404—Handling flow, e.g. hydrodynamic focusing
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
- B01L2200/02—Adapting objects or devices to another
- B01L2200/026—Fluid interfacing between devices or objects, e.g. connectors, inlet details
- B01L2200/027—Fluid interfacing between devices or objects, e.g. connectors, inlet details for microfluidic devices
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
- B01L2200/04—Exchange or ejection of cartridges, containers or reservoirs
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
- B01L2200/06—Fluid handling related problems
- B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
- B01L2200/0663—Stretching or orienting elongated molecules or particles
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
- B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
- B01L2300/0636—Integrated biosensor, microarrays
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
- B01L2300/0832—Geometry, shape and general structure cylindrical, tube shaped
- B01L2300/0838—Capillaries
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/16—Surface properties and coatings
- B01L2300/161—Control and use of surface tension forces, e.g. hydrophobic, hydrophilic
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/18—Means for temperature control
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/18—Means for temperature control
- B01L2300/1805—Conductive heating, heat from thermostatted solids is conducted to receptacles, e.g. heating plates, blocks
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/18—Means for temperature control
- B01L2300/1838—Means for temperature control using fluid heat transfer medium
- B01L2300/1844—Means for temperature control using fluid heat transfer medium using fans
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2400/00—Moving or stopping fluids
- B01L2400/06—Valves, specific forms thereof
- B01L2400/0633—Valves, specific forms thereof with moving parts
- B01L2400/0638—Valves, specific forms thereof with moving parts membrane valves, flap valves
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5025—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures for parallel transport of multiple samples
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mechanical Engineering (AREA)
- Fluid Mechanics (AREA)
- Electromagnetism (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Optical Measuring Cells (AREA)
- Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)
- External Artificial Organs (AREA)
Abstract
본원에는 핵산 시퀀싱 및 기타 화학적 또는 생물학적 분석 적용예를 위한 감소된 제조 복잡성, 절감된 소모품 비용 및 유연한 시스템 처리량을 제공하는 플로우 셀 디바이스, 카트리지 및 시스템이 기재되어 있다. 플로우 셀 디바이스는 모세관 플로우 셀 디바이스 또는 미세유체 플로우 셀 디바이스를 포함할 수 있다.
Description
교차 참조
본 출원은 2018년 12월 7일자로 출원된 미국 가출원 제62/776,827호 및 2019년 8월 27일자로 출원된 미국 가출원 제62/892,419호를 우선권주장으로 하며, 이들 출원 각각은 본원에 참조로 그 전문이 포함된다.
배경기술
플로우 셀 디바이스는 화학 및 생명공학 적용예에 널리 사용된다. 특히 차세대 시퀀싱(sequencing)(NGS) 시스템에서, 상기 디바이스는 생물학적 샘플로부터 유도된 템플레이트 핵산 분자를 고정화시킨 후, 합성 시약에 의한 시퀀싱의 반복 플로우를 도입하여 표지된 뉴클레오티드를 템플레이트 서열에서의 특정한 위치에 부착시키는데 사용된다. 일련의 표지 신호를 검출 및 디코딩하여 템플레이트 분자, 예를 들면 플로우 셀의 내부 표면에 부착된 고정화된 및/또는 증폭된 핵산 템플레이트 분자의 뉴클레오티드 서열을 밝혀낸다.
통상적인 NGS 플로우 셀(flow cell)은 평면인 표면 기재 및 기타 플로우 셀 부품으로부터 제조된 다층 구조이며(예를 들면 미국 특허 출원 공보 제 2018/0178215 A1호 참조), 그 후 이는 기계적, 화학적 또는 레이저 본딩 기술에 의하여 본딩되어 유체 플로우 채널을 형성한다. 그러한 플로우 셀은 통상적으로 요구되는 설계 요건을 달성하는데 고 비용의 다단계, 정밀 제조 기법이 요구된다. 다른 한편으로, 저렴한 기성 제품(off-shelf product)인 단일 루멘(플로우 채널) 모세관이 다양한 크기 및 형상으로 이용 가능하지만, 일반적으로는 취급 용이성 및 NGS와 같은 적용예에 요구되는 시약간 반복적인 스위칭과의 호환성에 대하여서는 적합하지 않다.
본원에는 핵산 시퀀싱을 위한 신규한 플로우 셀 디바이스 및 시스템이 기재되어 있다. 본원에 기재된 디바이스 및 시스템은 DNA 시퀀싱 과정의 비용 및 시간을 감소시키는 것을 돕는 시약의 더욱 효율적인 사용을 달성할 수 있다. 디바이스 및 시스템은 채널의 선택된 패턴을 갖는 상업적으로 입수 가능한 기성 제품인 모세관 또는 마이크로 또는 나노 규모의 유체 칩을 사용할 수 있다. 본원에 기재된 셀 디바이스 및 시스템은 신속한 DNA 시퀀싱에 적절하며, 기타 DNA 시퀀싱 기술에 비하여 고가의 시약의 보다 효율적인 사용을 달성하며, 샘플 전처리 및 복제에 요구되는 시간의 양을 감소시키는 것을 도울 수 있다. 그 결과는 훨씬 더 신속하며, 비용면에서 효율적인 시퀀싱 방법이다.
일부 실시양태는 제1의 용액을 수용하고 주입 단부 및 배출 단부를 갖는 제1의 저장소로서, 제1의 작용제가 제1의 저장소 내에서 주입 단부로부터 배출 단부로 흐르는 제1의 저장소; 제2의 용액을 수용하고 주입 단부 및 배출 단부를 갖는 제2의 저장소로서, 제2의 작용제가 제2의 저장소 내에서 주입 단부로부터 배출 단부로 흐르는 제2의 저장소; 제1의 저장소의 배출 단부 및 제2의 저장소의 배출 단부에 적어도 하나의 밸브를 통하여 유체적으로 커플링된 주입 단부를 갖는 중앙 영역을 포함하며; 여기서 제1의 저장소의 배출구로부터 중앙 영역의 주입구로 흐르는 제1의 용액의 부피가 제2의 저장소의 배출구로부터 중앙 영역의 주입구로 흐르는 제2의 용액의 부피보다 적은 플로우 셀 디바이스에 관한 것이다.
일부 실시양태는 프레임워크(framework); 플로우 셀과 호환성을 갖는 복수의 반응에 공통인 시약을 보유하는 복수의 저장소; 반응 특이성 시약을 보유하는 단일의 저장소; 1) 복수의 저장소로부터 복수의 비특이성 시약의 유입을 게이트 제어하는 제1의 격막 밸브 및 2) 제2의 격막 밸브에 근접한 공급물 저장소로부터 단일의 시약의 유입을 게이트 제어하는 제2의 격막 밸브를 갖는 제거 가능한 모세관을 포함하는 플로우 셀 디바이스에 관한 것이다.
일부 실시양태는 프레임워크; 플로우 셀과 호환성인 복수의 반응에 공통인 시약을 보유하는 복수의 저장소; 반응 특이성 시약을 보유하는 단일의 저장소; 1) 복수의 저장소로부터 복수의 비특이성 시약의 유입을 게이트 제어하는 제1의 격막 밸브 및 2) 제2의 격막 밸브에 근접한 공급물 저장소로부터 단일의 시약의 유입을 게이트 제어하는 제2의 격막 밸브를 갖는 제거 가능한 또는 제거 불가한 모세관을 포함하는 플로우 셀 디바이스에 관한 것이다. 3) 임의로, 모세관이 인덱스 장착 매체를 경유하여 유리 기재에 부착/장착되는 장착 실시양태.
일부 실시양태는 a) 교체 가능한 하나 이상의 모세관; b) 하나 이상의 모세관에 부착되며, 하나 이상의 모세관의 각각과, 플로우 셀 디바이스의 외부에 있는 유체 제어 시스템 사이에서 유체 연통을 제공하는 튜빙과 교합되도록 구성되는 2개 이상의 유체 어댑터; 및 c) 임의로, 하나 이상의 모세관이 카트리지에 대하여 고정된 배향을 유지하도록 하나 이상의 모세관과 교합하도록 구성되며, 2개 이상의 유체 어댑터가 카트리지와 통합되는 카트리지를 포함하는 플로우 셀 디바이스에 관한 것이며, 임의로, 모세관이 인덱스 장착 매체를 경유하여 유리 기재에 부착/장착되는 장착 실시양태를 포함한다.
일부 실시양태는 복수의 올리고뉴클레오티드를 적어도 부분적으로 투명한 챔버의 내부 표면에 전달하는 단계; 제1의 핵산 샘플을 내부 표면에 전달하는 단계; 복수의 비특이성 시약을 제1의 채널을 통하여 내부 표면에 전달하는 단계; 특이성 시약을 제2의 채널을 통하여 내부 표면에 전달하는 단계, 여기서 제2의 채널은 제1의 채널보다 더 적은 부피를 가지며; 적어도 부분적으로 투명한 챔버의 내부 표면 상에서 시퀀싱 반응을 가시화하는 단계; 및 제2의 시퀀싱 반응 이전에 적어도 부분적으로 투명한 챔버를 교체하는 단계를 포함하는 핵산 샘플 및 제2의 핵산 샘플을 시퀀싱하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태는 제1의 시약을 제1의 저장소 내에 제공하는 단계; 제2의 시약을 제1의 제2의 저장소 내에 제공하는 단계로서, 제1의 저장소 및 제2의 저장소의 각각이 중앙 영역에 유체적으로 커플링되고, 중앙 영역이 시퀀싱 반응을 위한 표면을 포함하는 것인 단계; 제1의 시약 및 제2의 시약을 플로우 셀 디바이스의 중앙 영역에 순차적으로 투입하는 단계를 포함하며, 여기서 제1의 저장소로부터 중앙 영역의 주입구로 흐르는 제1의 시약의 부피가 제2의 저장소로부터 중앙 영역으로 흐르는 제2의 시약의 부피보다 적은, 시퀀싱 반응에 사용되는 시약을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태는 제1의 시약을 제1의 저장소 내에 제공하는 단계; 제2의 시약을 제1의 제2의 저장소에 제공하는 단계로서, 제1의 저장소 및 제2의 저장소의 각각이 중앙 영역으로 유체적으로 커플링되고, 중앙 영역이 시퀀싱 반응을 위한 표면을 포함하는 것인 단계; 제1의 저장소로부터 중앙 영역의 주입구로 흐르는 제1의 시약의 부피를 제2의 저장소로부터 중앙 영역으로 흐르는 제2의 시약의 부피보다 적게 유지하는 단계를 포함하는, 시퀀싱 반응에서 시약의 효율적인 사용을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
인용에 의한 포함
본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 본원에 마치 각각의 개별적인 공보, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 그 전문을 포함하는 것을 나타내는 바와 동일한 정도로 참조로 그 전문이 포함된다.
특허 또는 출원 파일은 컬러로 작성된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)을 갖는 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 요청 및 필수 수수료의 지불시 특허청에 의하여 제공될 것이다.
본 발명의 일부 신규한 특징은 첨부된 청구범위에서 구체적으로 설명된다. 본 발명의 특징 및 잇점의 더 나은 이해는 본 발명의 원리를 사용하는 예시의 실시양태를 설명하는 하기 상세한 설명 및 첨부하는 도면을 참조하여 얻을 것이다.
도 1은 2개의 유체 어댑터를 갖는 단일의 모세관 플로우 셀의 한 실시양태를 도시한다.
도 2는 새시, 유체 어댑터 및 2개의 모세관을 포함하는 플로우 셀 카트리지의 한 실시양태를 도시한다.
도 3은 각종 유체 흐름 제어 부품에 연결된 단일의 모세관 플로우 셀을 포함하며, 여기서 단일 모세관이 각종 영상화 적용예에 사용하기 위한 현미경 스테이지 상에서 또는 주문형 영상화 기기에서의 장착과 호환성을 갖는 시스템의 한 실시양태를 도시한다.
도 4는 무용 부피(dead volume)를 최소화하고, 특정한 핵심 시약을 보존하기 위하여 통합된 격막 밸브를 갖는 모세관 플로우 셀 카트리지를 포함하는 시스템의 한 실시양태를 도시한다.
도 5는 모세관 플로우 셀, 현미경 셋업 및 온도 제어 메카니즘을 포함하는 시스템의 한 실시양태를 도시한다.
도 6은 플로우 셀 카트리지와 접촉 배치된 금속판의 사용에 의하여 모세관 플로우 셀의 온도 제어를 위한 비제한적인 일례를 도시한다.
도 7은 비접촉 열적 제어 메카니즘을 포함하는 모세관 플로우 셀의 온도 제어를 위한 하나의 비제한적인 접근법을 도시한다.
도 8은 모세관 루멘에서 클러스터 증폭의 가시화를 도시한다.
도 9a-9c는 플로우 셀 디바이스 제조의 비제한적인 예를 도시한다: 도 9a는 1피스 유리 플로우 셀의 제조를 도시하며; 도 9b는 2피스 유리 플로우 셀의 제조를 도시하며; 도 9c는 3피스 유리 플로우 셀의 제조를 도시한다.
도 10a-10c는 유리 플로우 셀 설계의 비제한적인 예를 도시하며: 도 10a는 1피스 유리 플로우 셀 설계를 도시하며; 도 10b는 2피스 유리 플로우 셀 설계를 도시하며; 도 10c는 3피스 유리 플로우 셀 설계를 도시한다.
본 발명의 일부 신규한 특징은 첨부된 청구범위에서 구체적으로 설명된다. 본 발명의 특징 및 잇점의 더 나은 이해는 본 발명의 원리를 사용하는 예시의 실시양태를 설명하는 하기 상세한 설명 및 첨부하는 도면을 참조하여 얻을 것이다.
도 1은 2개의 유체 어댑터를 갖는 단일의 모세관 플로우 셀의 한 실시양태를 도시한다.
도 2는 새시, 유체 어댑터 및 2개의 모세관을 포함하는 플로우 셀 카트리지의 한 실시양태를 도시한다.
도 3은 각종 유체 흐름 제어 부품에 연결된 단일의 모세관 플로우 셀을 포함하며, 여기서 단일 모세관이 각종 영상화 적용예에 사용하기 위한 현미경 스테이지 상에서 또는 주문형 영상화 기기에서의 장착과 호환성을 갖는 시스템의 한 실시양태를 도시한다.
도 4는 무용 부피(dead volume)를 최소화하고, 특정한 핵심 시약을 보존하기 위하여 통합된 격막 밸브를 갖는 모세관 플로우 셀 카트리지를 포함하는 시스템의 한 실시양태를 도시한다.
도 5는 모세관 플로우 셀, 현미경 셋업 및 온도 제어 메카니즘을 포함하는 시스템의 한 실시양태를 도시한다.
도 6은 플로우 셀 카트리지와 접촉 배치된 금속판의 사용에 의하여 모세관 플로우 셀의 온도 제어를 위한 비제한적인 일례를 도시한다.
도 7은 비접촉 열적 제어 메카니즘을 포함하는 모세관 플로우 셀의 온도 제어를 위한 하나의 비제한적인 접근법을 도시한다.
도 8은 모세관 루멘에서 클러스터 증폭의 가시화를 도시한다.
도 9a-9c는 플로우 셀 디바이스 제조의 비제한적인 예를 도시한다: 도 9a는 1피스 유리 플로우 셀의 제조를 도시하며; 도 9b는 2피스 유리 플로우 셀의 제조를 도시하며; 도 9c는 3피스 유리 플로우 셀의 제조를 도시한다.
도 10a-10c는 유리 플로우 셀 설계의 비제한적인 예를 도시하며: 도 10a는 1피스 유리 플로우 셀 설계를 도시하며; 도 10b는 2피스 유리 플로우 셀 설계를 도시하며; 도 10c는 3피스 유리 플로우 셀 설계를 도시한다.
본원에는 예를 들면 플로우 셀에서의 증폭된 핵산 어레이로부터 또는 고정된 핵산의 어레이로부터 다수의 상이한 핵산 서열을 분석하기 위한 시스템 및 디바이스가 기재되어 있다. 본원에 기재된 시스템 및 디바이스는 또한 예를 들면 비교 게놈, 추적 유전자 발현, 마이크로 RNA 서열 분석, 에피게놈 및 압타머 및 파지 디스플레이 라이브러리 특성화를 위한 시퀀싱 및 기타 시퀀싱 적용예에 유용할 수 있다. 본원의 시스템 및 디바이스는 광학적, 기계적, 유체적, 열적, 전기적 및 컴퓨팅 디바이스/측면의 다양한 조합을 포함한다. 개시된 플로우 셀 디바이스, 카트리지 및 시스템에 의하여 부여되는 잇점은 (i) 감소된 디바이스 및 시스템 제조 복잡성 및 비용, (ii) 상당하게 낮은 소모품 비용(예, 현재 입수 가능한 핵산 시퀀싱 시스템의 경우에 비하여), (iii) 통상의 플로우 셀 표면 기능화 방법과의 호환성, (iv) 미세유체 부품, 예를 들면 주사기 펌프 및 격막 밸브 등과 조합시 유연한 흐름 제어 및 (v) 유연한 시스템 처리량을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에는 또한 유체 어댑터, 카트리지 새시, 하나 이상의 통합된 유체 흐름 제어 부품 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있는 기성 제품, 일회용, 단일 루멘(예, 단일 유체 흐름 채널) 모세관으로 구성된 모세관 플로우 셀 디바이스 및 모세관 플로우 셀 카트리지가 기재되어 있다. 또한, 본원에는 하나 이상의 모세관 플로우 셀 디바이스, 하나 이상의 모세관 플로우 셀 카트리지, 유체 흐름 제어기 모듈, 온도 제어 모듈, 영상화 모듈 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있는 모세관 플로우 셀 기반 시스템이 개시되어 있다.
일부 개시된 모세관 플로우 셀 디바이스, 카트리지 및 시스템의 설계 특징은 (i) 단일 흐름 채널 구성, (ii) 시스템 및 모세관 사이의 유체 계면이 신뢰성 있게 밀폐되어 모세관 교체 및 시스템 재사용을 도우며, 온도 및 pH와 같은 반응 조건의 정확한 제어를 가능케 하도록 단순 로드/언로드 메카니즘으로 실행될 수 있는 시약 흐름 사이의 밀폐된, 신뢰성 있는 및 반복하는 스위칭, (iii) 유연한 시스템 처리량을 제공하기 위하여 교환 가능하게 사용될 수 있는 복수의 흐름 채널을 포함하는 교체 가능한 단일 유체 흐름 채널 디바이스 또는 모세관 플로우 셀 카트리지 및 (iv) 형광 영상화와 같은 다양한 검출 방법과의 호환성을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
개시된 단일 플로우 셀 디바이스 및 시스템, 모세관 플로우 셀 카트리지, 모세관 플로우 셀 기반 시스템, 미세유체 칩 플로우 셀 디바이스 및 미세유체 칩 플로우 셀 시스템이 핵산 시퀀싱 적용예를 위한 그의 사용의 문맥에서 주로 기재되기는 하였지만, 개시된 디바이스 및 시스템의 다양한 측면은 핵산 시퀀싱뿐 아니라, 화학적 분석, 생화학적 분석, 핵산 분석, 세포 분석 또는 조직 분석 적용예의 임의의 기타 유형에 적용될 수 있다. 개시된 디바이스 및 시스템의 상이한 측면은 개별적으로, 총괄적으로 또는 서로 조합하여 이해될 수 있는 것으로 이해하여야 한다.
정의: 달리 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술 용어는 본 개시내용이 속하는 분야에서 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수형은 문맥이 명백하게 달리 나타내지 않는다면 복수형을 포함한다. 본원에서 "또는"에 대한 임의의 언급은 달리 명시하지 않는다면 "및/또는"을 포함시키고자 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 '약' 숫자는 숫자 + 또는 - 숫자의 10%를 지칭한다. 범위의 문맥에서 사용시 용어 '약'은 범위 - 그의 최저값의 10% 및 + 그의 최대 값의 10%를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 시리즈의 문맥에서 어구 '~ 중 적어도 하나'는 시리즈의 단일의 구성원, 시리즈의 2개의 구성원, 시리즈의 모든 구성원까지 및 모든 구성원을 포함한 리스트를 단독으로 또는 일부 사례에서는 제시되지 않는 성분과 조합하여 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 형광은 표면 상에서 올리고의 해당 분절에 대한 역 상보성의 구역을 가지며, 상기 해당 분절에 어닐링된 핵산을 통하여서와 같이 표면에 어닐링되거나 또는 달리 테더링된(tethered) 형광단으로부터 발생되는 경우 "특이적"이다. 그러한 형광은 상기 어닐링 과정을 통하여 표면에 테더링되지 않은 형광단으로부터 발생하는 형광 또는 일부 사례에서 표면의 배경 형광과는 대조된다.
핵산: 본원에 사용된 바와 같이, "핵산"(또한 "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드", 리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산(DNA)으로 지칭됨)은 공유 인터뉴클레오시드 결합 또는 그의 변형 또는 기능적 분절에 의하여 연결된 2개 이상의 뉴클레오티드의 선형 중합체이다. 핵산의 자연 발생 예에서, 인터뉴클레오시드 결합은 통상적으로 포스포디에스테르 결합이다. 그러나, 기타 예는 기타 인터뉴클레오시드 결합, 예컨대 포스포로티올레이트 결합을 임의로 포함하며, 포스페이트 기를 포함할 수 있거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 핵산은 이중 또는 단일 가닥 DNA뿐 아니라, 이중 및 단일 가닥 RNA, DNA/RNA 하이브리드, 펩티드-핵산(PNA), PNA 및 DNA 또는 RNA 사이의 하이브리드를 포함하며, 또한 핵산 변형의 기타 유형을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "뉴클레오티드"는 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 또는 그의 유사체를 지칭한다. 일부 사례에서, 뉴클레오티드는 퓨린 또는 피리미딘 염기의 N- 또는 C-글리코시드(예, 2-데옥시-D-리보스를 함유하는 데옥시리보뉴클레오시드 또는 D-리보스를 함유하는 리보뉴클레오시드)이다. 기타 뉴클레오티드 유사체의 예는 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
핵산은 임의로 하나 이상의 비뉴클레오티드 모이어티, 예컨대 표지 및 기타 소분자, 대분자(예컨대 단백질, 지질, 당 등) 및 고체 또는 반고체 지지체에, 예를 들면 핵산의 5' 또는 3' 단부와의 공유 또는 비공유 결합을 통하여 부착될 수 있다. 표지는 해당 기술분야의 기술자에게 공지된 임의의 다양한 검출 방법을 사용하여 검출 가능하여 부착된 올리고뉴클레오티드 또는 핵산이 유사하게 검출 가능하게 되는 임의의 모이어티를 포함한다. 일부 표지는 광학적으로 검출 가능하거나 또는 가시적인 전자기 방사를 방출한다. 대안으로 또는 조합하여 일부 표지는 표지된 올리고뉴클레오티드 또는 핵산이 질량 스펙트럼 데이타에서 가시적이 되도록 하는 질량 태그 또는 표지된 올리고뉴클레오티드 또는 핵산이 전류법 또는 전압전류법에 의하여 검출 가능하게 하는 산화환원 태그를 포함한다. 일부 표지는 표지된 올리고뉴클레오티드 또는 핵산의 분리 및/또는 정제를 돕는 자기 태그를 포함한다. 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 종종 표지에 부착되지 않으며, 올리고뉴클레오티드 또는 핵산의 존재가 직접 검출된다.
플로우 셀 디바이스: 본원에는 제1의 용액을 수용하고, 주입 단부 및 배출 단부를 가지며, 제1의 작용제가 제1의 저장소에서 주입 단부로부터 배출 단부로 흐르는 제1의 저장소; 제2의 용액을 수용하고, 주입 단부 및 배출 단부를 가지며, 제2의 작용제가 제2의 저장소 내에서 주입 단부로부터 배출 단부로 흐르는 제2의 저장소; 제1의 저장소의 배출 단부 및 제2의 저장소의 배출 단부에 적어도 하나의 밸브를 통하여 유체적으로 커플링되는 주입 단부를 갖는 중앙 영역을 포함하는 플로우 디바이스가 개시되어 있다. 플로우 셀 디바이스에서, 제1의 저장소의 배출구로부터 중앙 영역의 주입구로 흐르는 제1의 용액의 부피는 제2의 저장소의 배출구로부터 중앙 영역의 주입구로 흐르는 제2의 용액의 부피보다 적다.
디바이스에서 기재된 저장소는 상이한 시약을 수용하는데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 제1의 저장소 내에 수용된 제1의 용액은 제2의 저장소 내에 수용된 제2의 용액과는 상이하다. 제2의 용액은 중앙 영역 내에서 발생하는 복수의 반응에 공통인 적어도 1종의 시약을 포함한다. 일부 측면에서, 제2의 용액은 용매, 폴리머라제 및 dNTP로 이루어진 리스트로부터 선택된 적어도 1종의 시약을 포함한다. 일부 측면에서, 제2의 용액은 저 비용 시약을 포함한다. 일부 측면에서, 제1의 저장소는 제1의 밸브를 통하여 중앙 영역에 유체적으로 커플링되며, 제2의 저장소는 제2의 밸브를 통하여 중앙 영역에 유체적으로 커플링된다. 밸브는 격막 밸브 또는 기타 적절한 밸브일 수 있다.
플로우 셀 디바이스의 설계는 특히 각종 시퀀싱 단계에 사용되는 고가의 시약의 경우 기타 시퀀싱 디바이스보다 반응 시약의 더 효율적인 사용을 달성할 수 있다. 일부 측면에서, 제1의 용액은 시약을 포함하며, 제2의 용액은 시약을 포함하며, 제1의 용액 중의 시약은 제2의 용액 중의 시약보다 더 고가이다. 일부 측면에서, 제1의 용액은 반응 특이성 시약을 포함하며, 제2의 용액은 중앙 영역 중에 발생하는 모든 반응에 대하여 공통인 비특이성 시약을 포함하며, 반응 특이성 시약은 비특이성 시약보다 더 고가이다. 일부 측면에서, 제1의 저장소는 제1의 용액의 전달을 위한 무용 부피를 감소시키기 위하여 중앙 영역의 주입구에 근접하여 배치된다. 일부 측면에서, 제1의 저장소는 제2의 저장소보다 중앙 영역의 주입구에 더 가까이 배치된다. 일부 측면에서, 반응 특이성 시약은 복수의 비특이성 시약을 복수의 저장소로부터 제1의 격막 밸브로의 전달에 대한 무용 부피를 감소시키도록 제2의 격막 밸브에 근접하게 구성된다.
중앙 영역: 중앙 영역은 모세관 또는, 하나 이상의 미세유체 채널을 갖는 미세유체 칩을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 모세관은 기성 제품이다. 모세관 또는 미세유체 칩은 또한 디바이스로부터 제거 가능할 수 있다. 일부 실시양태에서, 모세관 또는 미세유체 채널은 진핵 생물의 게놈을 시퀀싱하도록 지시된 올리고뉴클레오티드 집단을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중앙 영역 내의 모세관 또는 미세유체 채널은 제거 가능할 수 있다.
모세관 플로우 셀 디바이스: 본원에는 단일의 모세관 및, 모세관의 한 단부 또는 양 단부에 부착된 1 또는 2개의 유체 어댑터를 포함하며, 여기서 모세관은 명시된 단면적 및 길이의 유체 흐름 채널을 제공하며, 유체 어댑터는 외부 유체 흐름 제어 시스템과 편리하게, 교환 가능한 유체 연결을 제공하기 위하여 표준 튜빙과 교합되도록 배열되는 단일 모세관 플로우 셀 디바이스가 개시되어 있다.
도 1은 표준 OD 유체 튜빙과 교합되도록 설계된, 하나가 유리 모세관의 피스의 각각의 단부에 부착된 2개의 유체 어댑터를 포함하는 단일의 유리 모세관 플로우 셀 디바이스의 비제한적인 일례를 도시한다. 유체 어댑터는 압입, 접착제 본딩, 용매 본딩, 레이저 용접 등 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는 해당 기술분야의 기술자에게 공지된 임의의 다양한 기술을 사용하여 모세관에 부착될 수 있다.
일반적으로, 개시된 플로우 셀 디바이스(및 하기 기재되는 플로우 셀 카트리지)에 사용되는 모세관은 모세관의 전체 길이를 지나는 적어도 1개의 내부, 축상 정렬된 유체 흐름 채널(또는 "루멘")을 가질 것이다. 일부 측면에서, 모세관은 2, 3, 4개 5개 또는 5개 초과의 내부, 축상 정렬된 유체 흐름 채널(또는 "루멘")을 가질 수 있다.
단일의 모세관(또는 그의 루멘)에 대한 다수의 명시된 단면 기하는 원형, 타원형, 정사각형, 직사각형, 삼각형, 둥근 정사각형, 둥근 직사각형 또는 둥근 삼각형 단면 기하를 포함하나 이에 제한되지 않는 본원의 개시내용에 일치한다. 일부 측면에서, 단일 모세관(또는 그의 루멘)은 임의의 명시된 단면 치수 또는 치수 세트를 가질 수 있다. 예를 들면, 일부 측면에서 모세관 루멘의 최대 단면 치수(예, 루멘이 원형 형상인 경우 직경 또는 루멘이 정사각형 또는 직사각형 형상인 경우 대각선)는 약 10 ㎛ 내지 약 10 ㎜ 범위일 수 있다. 일부 측면에서, 모세관 루멘의 최대 단면 치수는 적어도 10 ㎛, 적어도 25 ㎛, 적어도 50 ㎛, 적어도 75 ㎛, 적어도 100 ㎛, 적어도 200 ㎛, 적어도 300 ㎛, 적어도 400 ㎛, 적어도 500 ㎛, 적어도 600 ㎛, 적어도 700 ㎛, 적어도 800 ㎛, 적어도 900 ㎛, 적어도 1 ㎜, 적어도 2 ㎜, 적어도 3 ㎜, 적어도 4 ㎜, 적어도 5 ㎜, 적어도 6 ㎜, 적어도 7 ㎜, 적어도 8 ㎜, 적어도 9 ㎜ 또는 적어도 10 ㎜일 수 있다. 일부 측면에서, 모세관 루멘의 최대 단면 치수는 최대 10 ㎜, 최대 9 ㎜, 최대 8 ㎜, 최대 7 ㎜, 최대 6 ㎜, 최대 5 ㎜, 최대 4 ㎜, 최대 3 ㎜, 최대 2 ㎜, 최대 1 ㎜, 최대 900 ㎛, 최대 800 ㎛, 최대 700 ㎛, 최대 600 ㎛, 최대 500 ㎛, 최대 400 ㎛, 최대 300 ㎛, 최대 200 ㎛, 최대 100 ㎛, 최대 75 ㎛, 최대 50 ㎛, 최대 25 ㎛ 또는 최대 10 ㎛일 수 있다. 본 단락에 기재된 임의의 하한값 및 상한값은 본 개시내용에 포함되는 범위를 형성하도록 조합될 수 있으며, 예를 들면 일부 측면에서 모세관 루멘의 최대 단면 치수는 약 100 ㎛ 내지 약 500 ㎛ 범위일 수 있다. 해당 기술분야의 기술자는 모세관 루멘의 최대 단면 치수가 상기 범위의 임의의 값, 예를 들면 약 124 ㎛을 가질 수 있다는 것을 인지할 것이다.
개시된 단일 모세관 플로우 셀 디바이스 또는 플로우 셀 카트리지를 제조하는데 사용된 하나 이상의 모세관의 길이는 약 5 ㎜ 내지 약 5 ㎝ 범위 또는 그보다 클 수 있다. 일부 경우에서, 하나 이상의 모세관의 길이는 5 ㎜ 미만, 적어도 5 ㎜, 적어도 1 ㎝, 적어도 1.5 ㎝, 적어도 2 ㎝, 적어도 2.5 ㎝, 적어도 3 ㎝, 적어도 3.5 ㎝, 적어도 4 ㎝, 적어도 4.5 ㎝ 또는 적어도 5 ㎝일 수 있다. 일부 경우에서, 하나 이상의 모세관의 길이는 최대 5 ㎝, 최대 4.5 ㎝, 최대 4 ㎝, 최대 3.5 ㎝, 최대 3 ㎝, 최대 2.5 ㎝, 최대 2 ㎝, 최대 1.5 ㎝, 최대 1 ㎝ 또는 최대 5 ㎜일 수 있다. 본 단락에 기재된 임의의 하한값 및 상한값은 본 개시내용에 포함되는 범위를 형성하도록 조합될 수 있으며, 예를 들면 일부 경우에서 하나 이상의 모세관의 길이는 약 1.5 ㎝ 내지 약 2.5 ㎝ 범위일 수 있다. 해당 기술분야의 기술자는 하나 이상의 모세관의 길이가 상기 범위의 임의의 값, 예를 들면 약 1.85 ㎝를 가질 수 있다는 것을 인지할 것이다. 일부 경우에서, 디바이스 또는 카트리지는 동일한 길이인 복수의 2개 이상의 모세관을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 디바이스 또는 카트리지는 상이한 길이를 갖는 복수의 2개 이상의 모세관을 포함할 수 있다.
모세관은 일부 사례에서 대략 또는 정확하게 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 350, 400 또는 500 ㎛ 또는 그에 의하여 정의된 범위에 속하는 임의의 값의 간극 높이를 갖는다. 일부 바람직한 실시양태는 약 50 ㎛ - 200 ㎛, 50 ㎛ 내지 150 ㎛의 간극 높이 또는 필적하는 간극 높이를 갖는다. 개시된 단일 모세관 플로우 셀 디바이스 또는 모세관 플로우 셀 카트리지를 구성하는데 사용되는 모세관은 보다 화학적으로 불활성인 대안으로서 유리(예, 보로실리케이트 유리, 소다 석회 유리 등), 용융 실리카(석영), 중합체(예, 폴리스티렌(PS), 매크로다공성 폴리스티렌(MPPS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리카르보네이트(PC), 폴리프로필렌(PP), 폴리에틸렌(PE), 고 밀도 폴리에틸렌(HDPE), 시클릭 올레핀 중합체(COP), 시클릭 올레핀 공중합체(COC), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리디메틸실록산(PDMS) 등), 폴리에테르이미드(PEI) 및 퍼플루오로엘라스토머(FFKM)를 포함하나 이에 제한되지 않는 해당 기술분야의 기술자에게 공지된 임의의 다양한 물질로부터 제조될 수 있다. PEI는 비용 및 호환성 면에서 폴리카르보네이트 및 PEEK 사이이다. FFKM은 또한 칼레즈(Kalrez) 또는 이들의 임의의 조합으로서 공지되어 있다.
개시된 단일 모세관 플로우 셀 디바이스 또는 모세관 플로우 셀 카트리지를 구성하는데 사용되는 모세관은 해당 기술분야의 기술자에게 공지된 임의의 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있으며, 여기서 제조 기술의 선택은 사용된 물질의 선택에 종종 의존하거나 또는 그 반대이다. 적절한 모세관 제조 기술의 예는 압출, 인출, 정밀 컴퓨터 수치 제어(CNC) 기계가공 및 보링(boring), 레이저 광절제 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 디바이스는 단일 피스 플로우 셀로의 조정을 위한 임의의 3차원 구조를 제조하기 위하여 붓기(pour) 성형 또는 사출 성형될 수 있다.
정밀 모세관 튜빙을 제공하는 상업적 공급업체의 예는 아큐-글래스(Accu-Glass)(미국 미주리주 세인트 루이스 소재; 정밀 유리 모세관 튜빙), 폴리마이크로 테크놀로지즈(Polymicro Technologies)(미국 아리조나주 피닉스 소재; 정밀 유리 및 용융 실리카 모세관 튜빙), 프리드리히 앤 딤목, 인코포레이티드(Friedrich & Dimmock, Inc.)(미국 뉴저지주 밀빌 소재; 주문형 정밀 유리 모세관 튜빙) 및 드러먼드 사이언티픽(Drummond Scientific)(미국 펜실베이니아주 브룸올 소재; OEM 유리 및 플라스틱 모세관 튜빙)을 포함한다.
미세유체 칩 플로우 셀 디바이스: 본원에는 또한 하나 이상의 미세유체 칩 및, 미세유체 칩의 한 단부 또는 양 단부에 부착된 1 또는 2개의 유체 어댑터를 포함하며, 여기서 미세유체 칩은 명시된 단면적 및 길이의 하나 이상의 유체 흐름 채널을 제공하며, 유체 어댑터는 외부 유체 흐름 제어 시스템과 편리하게, 교환 가능한 유체 연결을 제공하기 위하여 미세유체 칩과 교합하도록 배열되는 플로우 셀 디바이스가 개시되어 있다.
미세유체 칩 플로우 셀 디바이스의 비제한적인 예는 하나가 미세유체 칩의 각각의 단부(예, 미세유체 채널의 주입구)에 고정된 2개의 유체 어댑터를 포함한다. 유체 어댑터는 압입, 접착제 본딩, 용매 본딩, 레이저 용접 등 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는 해당 기술분야의 기술자에게 공지된 임의의 다양한 기술을 사용하여 칩 또는 채널에 부착될 수 있다. 일부 경우에서, 칩 상의 미세유체 채널의 주입구 및/또는 배출구는 칩의 상부 표면 상의 어퍼쳐이며, 유체 어댑터는 미세유체 칩의 주입구 및 배출구에 부착 또는 커플링될 수 있다.
중앙 영역이 미세유체 칩을 포함할 경우, 개시된 플로우 셀 디바이스에 사용된 칩 미세유체 칩은 하나 이상의 채널을 갖는 적어도 단일의 층을 가질 것이다. 일부 측면에서, 미세유체 칩은 함께 본딩되어 하나 이상의 채널을 형성하는 2개의 층을 갖는다. 일부 측면에서, 미세유체 칩은 함께 본딩되어 하나 이상의 채널을 형성하는 3개의 층을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 미세유체 채널은 개방 상부(open top)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 미세유체 채널은 상부층 및 하부층 사이에 배치된다.
일반적으로, 개시된 플로우 셀 디바이스(및 하기 기재되는 플로우 셀 카트리지)에 사용된 미세유체 칩은 칩의 전체 길이 또는 부분 길이를 지나는 적어도 1개의 내부, 축상 정렬된 유체 흐름 채널(또는 "루멘")을 가질 것이다. 일부 측면에서, 미세유체 칩은 2. 3. 4, 5개 또는 5개 초과의 내부, 축상 정렬된 미세유체 채널(또는 "루멘")을 가질 수 있다. 미세유체 채널은 복수의 프레임으로 분할될 수 있다.
본원에서 원형, 타원형, 정사각형, 직사각형, 삼각형, 둥근 정사각형, 둥근 직사각형 또는 둥근 삼각형 단면 기하를 포함하나 이에 제한되지 않는 단일의 채널에 대한 다수의 명시된 단면 기하는 본원의 개시내용과 일치한다. 일부 측면에서, 채널은 임의의 명시된 단면 치수 또는 치수 세트를 가질 수 있다.
개시된 플로우 셀 디바이스 또는 플로우 셀 카트리지를 구성하는데 사용된 미세유체 칩은 보다 화학적으로 불활성 대안으로서 유리(예, 보로실리케이트 유리, 소다 석회 유리 등), 석영, 중합체(예, 폴리스티렌(PS), 매크로다공성 폴리스티렌(MPPS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리카르보네이트(PC), 폴리프로필렌(PP), 폴리에틸렌(PE), 고 밀도 폴리에틸렌(HDPE), 시클릭 올레핀 중합체(COP), 시클릭 올레핀 공중합체(COC), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리디메틸실록산(PDMS) 등), 폴리에테르이미드(PEI) 및 퍼플루오로엘라스토머(FFKM)를 포함하나 이에 제한되지 않는 해당 기술분야의 기술자에게 공지된 임의의 다양한 물질로부터 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 미세유체 칩은 석영을 포함한다. 일부 실시양태에서, 미세유체 칩은 보로실리케이트 유리를 포함한다.
기재된 플로우 셀 디바이스 또는 플로우 셀 카트리지를 구성하는데 사용된 미세유체 칩은 해당 기술분야의 기술자에게 공지된 임의의 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있으며, 여기서 제조 기술의 선택은 종종 사용된 물질의 선택에 의존하거나 또는 그 반대이다. 칩 상의 미세유체 채널은 표면 상의 마이크로-구조 또는 마이크로-패턴을 형성하는데 적절한 기술을 사용하여 구성될 수 있다. 일부 측면에서, 채널은 레이저 조사에 의하여 형성된다. 일부 측면에서, 미세유체 채널은 집속 펨토세컨드 레이저 조사에 의하여 형성된다. 일부 측면에서, 미세유체 채널은 화학적 또는 레이저 에칭을 포함하나 이에 제한되지 않는 에칭에 의하여 형성된다.
미세유체 채널이 미세유체 칩 상에 에칭에 의하여 형성되는 경우, 미세유체 칩은 적어도 하나의 에칭된 층을 포함할 것이다. 일부 측면에서, 미세유체 칩은 하나의 비에칭된 층 및 하나의 비에칭된 층을 포함할 수 있으며, 비에칭된 층이 하부층 또는 채널을 위한 커버층을 형성하도록 에칭된 층은 비에칭된 층에 본딩된다. 일부 측면에서, 미세유체 칩은 1개의 비에칭된 층 및 2개의 비에칭된 층을 포함할 수 있으며, 에칭된 층은 2개의 비에칭된 층 사이에 배치된다.
본원에 기재된 칩은 칩의 표면 상에 에칭된 하나 이상의 미세유체 채널을 포함한다. 미세유체 채널은 <1 ㎚ 내지 1,000 ㎛의 적어도 1개의 최소 치수를 갖는 유체 도관으로서 정의된다. 미세유체 채널은 수개의 상이한 방법, 예컨대 레이저 조사(예, 펨토세컨드 레이저 조사), 리토그래피, 화학적 에칭 및 임의의 기타 적절한 방법에 의하여 제조될 수 있다. 칩 표면 상의 채널은 선택적 패턴형성 및 플라즈마 또는 화학적 에칭에 의하여 생성될 수 있다. 채널은 개방될 수 있거나 또는 칩에서 표면하 또는 매립된 채널을 생성하기 위하여 상부에서 등방성 증착된 필름 또는 층에 의하여 밀폐될 수 있다. 일부 실시양태에서, 채널은 칩 상의 희생층의 제거로부터 생성된다. 그러한 방법은 벌크 웨이퍼를 에칭 제거할 필요는 없다. 그 대신, 채널은 웨이퍼의 표면 상에 배치된다. 직접 리토그래피의 예는 전자 빔 직접 기록 및 집속 이온 빔 밀링을 포함한다.
미세유체 채널 시스템은 DNA 염기의 신호를 캡쳐 또는 검출하는 영상화 시스템과 커플링된다. 유리 또는 실리콘 기재 상에 제조된 미세유체 채널 시스템은 <1 ㎚ 내지 1,000 ㎛ 정도의 채널 높이 및 폭을 갖는다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 채널은 1-50 ㎛, 1-100 ㎛, 1-150 ㎛, 1-200 ㎛, 1-250 ㎛, 1-300 ㎛, 50-100 ㎛, 50-200 ㎛ 또는 50-300 ㎛ 또는 300 ㎛ 초과 또는 상기 값 중 임의의 2개에 의하여 정의된 범위의 깊이를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 채널은 3 ㎜ 이상의 깊이를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 채널은 30 ㎜ 이상의 깊이를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 채널은 0.1 ㎜ 미만, 0.1 ㎜ 내지 0.5 ㎜, 0.1 ㎜ 내지 1 ㎜, 0.1 ㎜ 내지 5 ㎜, 0.1 ㎜ 내지 10 ㎜, 0.1 ㎜ 내지 25 ㎜, 0.1 ㎜ 내지 50 ㎜, 0.1 ㎜ 내지 100 ㎜, 0.1 ㎜ 내지 150 ㎜, 0.1 ㎜ 내지 200 ㎜, 0.1 ㎜ 내지 250 ㎜, 1 ㎜ 내지 5 ㎜, 1 ㎜ 내지 10 ㎜, 1 ㎜ 내지 25 ㎜, 1 ㎜ 내지 50 ㎜, 1 ㎜ 내지 100 ㎜, 1 ㎜ 내지 150 ㎜, 1 ㎜ 내지 200 ㎜, 1 ㎜ 내지 250 ㎜, 5 ㎜ 내지 10 ㎜, 5 ㎜ 내지 25 ㎜, 5 ㎜ 내지 50 ㎜, 5 ㎜ 내지 100 ㎜, 5 ㎜ 내지 150 ㎜, 5 ㎜ 내지 200 ㎜, 1 ㎜ 내지 250 ㎜ 또는 250 ㎜ 초과 또는 상기 값 중 임의의 2개에 의하여 정의된 범위의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 채널은 2 m 이상의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 채널은 20 m 이상의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 채널은 0.1 ㎜ 미만, 0.1 ㎜ 내지 0.5 ㎜, 0.1 ㎜ 내지 1 ㎜, 0.1 ㎜ 내지 5 ㎜, 0.1 ㎜ 내지 10 ㎜, 0.1 ㎜ 내지 15 ㎜, 0.1 ㎜ 내지 20 ㎜, 0.1 ㎜ 내지 25 ㎜, 0.1 ㎜ 내지 30 ㎜, 0.1 ㎜ 내지 50 ㎜ 또는 50 ㎜ 초과 또는 상기 값 중 임의의 2개에 의하여 정의된 범위의 폭을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 채널은 500 ㎜ 이상의 폭을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 채널은 5 m 이상의 폭을 가질 수 있다. 채널 길이는 마이크로미터 범위일 수 있다.
개시된 디바이스에 대한 모세관 또는 미세유체 칩을 제조하는데 사용되는 하나 이상의 물질은 종종 분광학적 또는 영상화에 기초한 검출 기술의 사용을 돕기 위하여 광학적으로 투명하다. 전체 모세관은 광학적으로 투명할 것이다. 대안으로, 모세관의 일부(예, 광학적으로 투명한 "윈도우")만이 광학적으로 투명할 것이다. 일부 경우에서, 전체 미세유체 칩은 광학적으로 투명할 것이다. 일부 경우에서, 미세유체 칩의 일부(예, 광학적으로 투명한 "윈도우")만이 광학적으로 투명할 것이다.
상기에서 언급한 바와 같이, 본원에 개시된 플로우 셀 디바이스 및 카트리지의 모세관 또는 미세유체 채널에 부착된 유체 어댑터는 표준 OD 중합체 또는 유리 유체 튜빙 또는 미세유체 채널과 교합되도록 설계된다. 도 1에 도시된 바와 같이, 유체 어댑터의 한 단부는 특정한 치수 및 단면 기하를 갖는 모세관에 교합되도록 설계될 수 있는 한편, 다른 단부는 동일하거나 또는 상이한 치수 및 단면 기하를 갖는 유체 튜빙과 교합되도록 설계될 수 있다. 어댑터는 각종 적절한 기술(예, 압출 성형, 압축 성형, 정밀 CNC 기계가공 등) 및 물질(예, 유리, 용융 실리카, 세라믹, 금속, 폴리디메틸실록산, 폴리스티렌(PS), 매크로다공성 폴리스티렌(MPPS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리카르보네이트(PC), 폴리프로필렌(PP), 폴리에틸렌(PE), 고 밀도 폴리에틸렌(HDPE), 시클릭 올레핀 중합체(COP), 시클릭 올레핀 공중합체(COC), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 등)을 사용하여 제조될 수 있으며, 여기서 제조 기술의 선택은 종종 사용된 물질의 선택에 의존하거나 또는 그 반대이다.
표면 코팅: 미세유체 칩 상의 하나 이상의 모세관 또는 채널의 내부 표면(모세관 루멘의 표면)은 종종 해당 기술분야의 기술자에게 공지된 임의의 다양한 표면 변형 기술 또는 중합체 코팅을 사용하여 코팅된다.
적절한 표면 변형 또는 코팅 기술의 예는 작용기 또는 분자의 모세관 루멘 표면으로의 공유 부착을 위한 실란 화학(예, 아미노프로필트리메톡시실란(APTMS), 아미노프로필트리에톡시실란(APTES), 트리에톡시실란, 디에톡시디메틸실란 및 기타 선형, 분지형 또는 시클릭 실란), 공유 또는 비공유 부착된 중합체 층(예, 스트렙타비딘, 폴리아크릴아미드, 폴리에스테르, 덱스트란, 폴리-리신, 폴리아크릴아미드/폴리-리신 공중합체, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리(n-이소프로필아크릴아미드)(PNIPAM), 폴리(2-히드록시에틸 메타크릴레이트)(PHEMA), 폴리(올리고(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타크릴레이트(POEGMA), 폴리아크릴산(PAA), 폴리(비닐피리딘), 폴리(비닐이미다졸) 및 폴리-리신 공중합체의 층) 또는 이들의 임의의 조합의 사용을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
물질의 하나 이상의 층(예, 중합체 층)을 지지 표면에 그래프팅시키고 및/또는 층을 서로 가교시키는데 사용될 수 있는 콘쥬게이션 화학의 예는 비오틴-스트렙타비딘 상호작용(또는 그의 변형), his 태그-Ni/NTA 콘쥬게이션 화학, 메톡시 에테르 콘쥬게이션 화학, 카르복실레이트 콘쥬게이션 화학, 아민 콘쥬게이션 화학, NHS 에스테르, 말레이미드, 티올, 에폭시, 아지드, 히드라지드, 알킨, 이소시아네이트 및 실란 화학을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
내부 또는 루멘 표면 상의 중합체의 층 또는 기타 화학적 층의 개수는 1 내지 약 10개 또는 10개 초과 범위일 수 있다. 일부 경우에서, 층의 개수는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개이다. 일부 경우에서, 층의 개수는 최대 10개, 최대 9개, 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 최대 2개 또는 최대 1개일 수 있다. 본 단락에 기재된 임의의 하한값 및 상한값은 본 개시내용에 포함되는 범위를 형성하도록 조합될 수 있으며, 예를 들면 일부 경우에서 층의 개수는 약 2 내지 약 4개 범위일 수 있다. 일부 경우에서, 모든 층은 동일한 물질을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 각각의 층은 상이한 물질을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 복수의 층은 복수의 물질을 포함할 수 있다.
바람직한 측면에서, 코팅 물질의 하나 이상의 층은 모세관 루멘 표면 또는, 미세유체 칩 상의 채널의 내부 표면에 적용될 수 있으며, 여기서 층의 개수 및/또는 각각의 층의 물질 조성은 미국 특허 출원 제16/363,842호에 언급된 바와 같이 모세관 또는 채널 루멘의 하나 이상의 표면 성질을 조절하기 위하여 선택된다.
조절될 수 있는 표면 성질의 예는 표면 친수성/소수성, 전체 코팅 두께, 화학적 반응성 작용기의 표면 밀도, 그래프팅된 링커 분자의 표면 밀도 또는 올리고뉴클레오티드 프라이머 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 바람직한 적용예에서, 모세관 또는 채널 루멘의 하나 이상의 표면 성질은 예를 들면 (i) 고상 핵산 증폭 및/또는 시퀀싱 적용을 포함한, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 형광단 및, 화학적 또는 생물학적 분석 적용예의 기타 분자 성분의 매우 낮은 비특이성 결합을 제공하며, (ii) 개선된 고상 핵산 하이브리드화 특이성 및 효율을 제공하며, (iii) 개선된 고상 핵산 증폭률, 특이성 및 효율을 제공하기 위하여 조절된다.
하나 이상의 표면 변형 및/또는 중합체 층은 그의 의도한 적용예에 사용전 모세관 또는 채널을 통한 하나 이상의 적절한 화학적 커플링 또는 코팅 시약을 흐르게 하여 적용될 수 있다. 하나 이상의 코팅 시약은 사용된 완충제, 예를 들면 핵산 하이브리드화, 증폭 반응 및/또는 시퀀싱 반응에 첨가하여 모세관 루멘 표면의 동적 코팅을 제공할 수 있다.
낮은 비특이성 결합 표면: 본원에 기재된 채널 및 모세관의 내부 표면은 개선된 핵산 하이브리드화 및 증폭 성능을 가능케 하는 낮은 비특이성 결합 표면 조성을 포함하는 조성물로 그래프팅 또는 코팅될 수 있다.
일부 경우에서, 하이브리드화된 또는 클론 증폭된 핵산 분자(예, 형광단으로 직접적으로 또는 간접적으로 표지된) 클러스터를 생성하기 위하여 핵산 하이브리드화 또는 증폭 적용예에 사용시 개시된 낮은 비특이성 결합 표면의 형광 화상은 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 210, 220, 230, 240, 250 또는 250 초과의 콘트라스트 대 노이즈비(CNR)를 나타낸다.
프라이머 표면 밀도를 증가시키고, 친수성 또는 양쪽성 표면에 추가적인 치수를 부가하기 위하여, PEG 및 기타 친수성 중합체의 다층 코팅을 포함하는 기재가 개발되었다. 하기 기재된 중합체/공중합체 물질을 포함하나 이에 제한되지 않는 친수성 및 양쪽성 표면 레이어링 접근법을 사용하여 표면 상의 프라이머 로딩 밀도를 크게 증가시킬 수 있다. 통상의 PEG 코팅 접근법은 단층 프라이머 증착을 사용하며, 이는 일반적으로 단일 분자 적용예에 대하여서는 보고되었으나, 핵산 증폭 적용예에 대한 높은 복제수를 산출하지는 않았다. 본원에 기재된 바와 같이, "레이어링"은 2개 이상의 고도로 가교된 층을 포함하는 표면이 순차적으로 구축될 수 있도록 임의의 호환성 중합체 또는 단량체 서브유닛을 갖는 통상적인 가교 접근법을 사용하여 달성될 수 있다. 적절한 중합체의 예는 스트렙타비딘, 폴리아크릴아미드, 폴리에스테르, 덱스트란, 폴리-리신 및, 폴리-리신과 PEG의 공중합체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에서, 상이한 층은 비오틴-스트렙타비딘 결합, 아지드-알킨 클릭 반응, 아민-NHS 에스테르 반응, 티올-말레이미드 반응 및, 양으로 하전된 중합체 및 음으로 하전된 중합체 사이의 이온성 상호작용을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 다양한 콘쥬게이션 반응을 통하여 서로 부착될 수 있다. 일부 경우에서, 높은 프라이머 밀도 물질은 용액 중에 구성된 후, 표면 상에 복수의 단계로 레이어링될 수 있다.
해당 기술분야의 기술자는 본 개시내용의 주어진 친수성, 낮은 결합 지지체 표면이 50°미만의 값을 갖는 물 접촉각을 나타낼 수 있다는 것을 인지할 것이다.
채널 및 모세관의 개시된 내부 표면은 기재(또는 지지 구조체), 공유 또는 비공유 부착된 낮은 결합, 화학적 변형 층 중 하나 이상의 층, 예를 들면 실란 층, 중합체 필름 및, 단일 가닥 템플레이트 올리고뉴클레오티드를 지지체 표면에 테더링시키는데 사용될 수 있는 하나 이상의 공유 또는 비공유 부착된 프라이머 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 단백질, 핵산 분자 및 기타 하이브리드화 및 증폭 반응 성분의 지지체 표면으로의 비특이성 결합이 필적하는 단층에 비하여 최소화 또는 감소되도록 표면의 배합, 예를 들면 하나 이상의 층의 화학적 조성, 하나 이상의 층을 지지체 표면에 및/또는 서로에게 가교되는데 사용되는 커플링 화학 및 층의 총수는 변경될 수 있다. 종종, 지지체 표면 상에서 비특이적 하이브리드화가 필적하는 단층에 비하여 최소화 또는 감소되도록 표면의 배합은 변경될 수 있다. 지지체 표면 상의 비특이성 증폭이 필적하는 단층에 비하여 최소화 또는 감소되도록 표면의 배합은 변경될 수 있다. 지지체 표면 상에서 특정한 증폭률 및/또는 수율이 최대화되도록 표면의 배합은 변경될 수 있다. 검출에 적절한 증폭 수준은 일부 사례에서 본원에 개시된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30회 이하 또는 30회 초과의 증폭 사이클로 달성된다.
기재 또는 지지체 구조가 제조될 수 있는 물질의 예는 유리, 용융 실리카, 실리콘, 중합체(예, 폴리스티렌(PS), 매크로다공성 폴리스티렌(MPPS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리카르보네이트(PC), 폴리프로필렌(PP), 폴리에틸렌(PE), 고 밀도 폴리에틸렌(HDPE), 시클릭 올레핀 중합체(COP), 시클릭 올레핀 공중합체(COC), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET)) 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 유리 및 플라스틱 기재 둘다의 다양한 조성이 고려된다.
기재 또는 지지체 구조는 해당 기술분야의 기술자에게 공지된 임의의 다양한 기하 및 치수로 이루어질 수 있으며, 해당 기술분야의 기술자에게 공지된 임의의 다양한 물질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 일부 경우에서 기재 또는 지지체 구조는 국소적으로 편평할 수 있다(예, 현미경 슬라이드 또는 현미경 슬라이드의 표면을 포함함). 총체적으로, 기재 또는 지지체 구조는 원통형(예, 모세관 또는 모세관의 내부 표면을 포함함), 구체형(예, 비다공성 비드의 외부 표면을 포함함) 또는 불규칙형(예, 불규칙한 형상의 비다공성 비드 또는 입자의 외부 표면을 포함함)일 수 있다. 일부 경우에서, 핵산 하이브리드화 및 증폭에 사용된 기재 또는 지지체 구조의 표면은 고체, 비다공성 표면일 수 있다. 일부 경우에서, 핵산 하이브리드화 및 증폭에 사용된 기재 또는 지지체 구조의 표면은 다공성일 수 있어서 본원에 기재된 코팅이 다공성 표면을 투과하며, 그 위에서 수행된 핵산 하이브리드화 및 증폭 반응은 공극 내에서 발생될 수 있게 된다.
하나 이상의 화학적 변형된 층, 예를 들면 낮은 비특이성 결합 중합체의 층을 포함하는 기재 또는 지지체 구조는 독립적일 수 있거나 또는 또 다른 구조 또는 어셈블리로 통합될 수 있다. 예를 들면, 일부 경우에서, 기재 또는 지지체 구조는 통합되거나 또는 어셈블리된 미세유체 플로우 셀 내에서 하나 이상의 표면을 포함할 수 있다. 기재 또는 지지체 구조는 마이크로플레이트 포맷 내에서의 하나 이상의 표면, 예를 들면 마이크로플레이트 내의 웰의 하부 표면을 포함할 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 일부 바람직한 실시양태에서, 기재 또는 지지체 구조는 모세관의 내부 표면(예컨대 루멘 표면)을 포함한다. 대안의 바람직한 실시양태에서, 기재 또는 지지체 구조는 평면 칩에 에칭된 모세관의 내부 표면(예컨대 루멘 표면)을 포함한다.
화학적 변형층은 기재 또는 지지체 구조의 표면 전체에 걸쳐 균일하게 적용될 수 있다. 대안으로, 기재 또는 지지체 구조의 표면은 불균일하게 분포 또는 패턴형성될 수 있어서 화학적 변형 층이 기재의 하나 이상의 불연속 영역에 국한된다. 예를 들면, 기재 표면은 표면 상의 화학적 변형된 구역의 규칙 어레이 또는 랜덤 패턴을 생성하는 포토리토그래피 기술을 사용하여 패턴형성될 수 있다. 대안으로 또는 조합하여, 기재 표면은 예를 들면 접촉 프린팅 및/또는 잉크젯 프린팅 기술을 사용하여 패턴형성될 수 있다. 일부 경우에서, 화학적 변형된 불연속 영역의 규칙 어레이 또는 랜덤 패턴은 적어도 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000 또는 10,000개 또는 그보다 많은 불연속 영역 또는 본원의 범위에 의하여 걸쳐 있는 임의의 중간값을 포함할 수 있다.
낮은 비특이성 결합 표면(또한 본원에서 "낮은 결합" 또는 "부동태화된" 표면으로 지칭함)을 달성하기 위하여, 친수성 중합체는 기재 또는 지지체 표면에 비특이성 흡착 또는 공유 그래프팅될 수 있다. 통상적으로, 부동태화는 예를 들면 실란 화학을 사용한 표면과 관련된 상이한 분자량 및 말단기를 갖는 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG, 또한 폴리에틸렌 옥시드(PEO) 또는 폴리옥시에틸렌으로서 공지됨), 폴리(비닐 알콜)(PVA), 폴리(비닐 피리딘), 폴리(비닐 피롤리돈)(PVP), 폴리(아크릴산)(PAA), 폴리아크릴아미드, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(PNIPAM), 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMA), 폴리(2-히드록실에틸 메타크릴레이트)(PHEMA), 폴리(올리고(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타크릴레이트)(POEGMA), 폴리글루탐산(PGA), 폴리-리신, 폴리-글루코시드, 스트렙타비딘, 덱스트란 또는 기타 친수성 중합체를 사용하여 수행된다. 표면으로부터 원위의 말단기는 비오틴, 메톡시 에테르, 카르복실레이트, 아민, NHS 에스테르, 말레이미드 및 비스-실란을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에서, 친수성 중합체, 예를 들면 선형 중합체, 분지형 중합체 또는 다분지형 중합체의 2개 이상의 층은 표면 상에 증착될 수 있다. 일부 경우에서, 2개 이상의 층은 생성된 표면의 안정성을 개선시키기 위하여 서로 공유 커플링될 수 있거나 또는 내부 가교될 수 있다. 일부 경우에서, 상이한 염기 서열 및 염기 변형을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머(또는 기타 생체분자, 예를 들면 효소 또는 항체)는 생성된 표면층에 다양한 표면 밀도에서 테더링될 수 있다. 일부 경우에서, 예를 들면, 표면 작용기 밀도 및 올리고뉴클레오티드 농도 둘다는 특정한 프라이머 밀도 범위를 표적으로 하여 변경될 수 있다. 추가적으로, 프라이머 밀도는 올리고뉴클레오티드를 동일한 작용기를 지니는 기타 분자로 희석하여 제어될 수 있다. 예를 들면, 아민 표지된 올리고뉴클레오티드는 NHS-에스테르 코팅된 표면을 사용한 반응에서 아민 표지된 폴리에틸렌 글리콜로 희석하여 최종 프라이머 밀도를 감소시킬 수 있다. 하이브리드화 구역 및 표면 부착 작용기 사이의 상이한 길이의 링커를 갖는 프라이머는 또한 표면 밀도를 제어하기 위하여 적용될 수 있다. 적절한 링커의 예는 프라이머(예, 0 내지 20개의 염기), PEG 링커(예, 3 내지 20개의 단량체 단위) 및 탄소쇄(예, C6, C12, C18 등)의 5' 말단에서 폴리-T 및 폴리-A 가닥을 포함한다. 프라이머 밀도를 측정하기 위하여, 형광 표지된 프라이머는 표면에 테더링한 후, 형광 판독을 공지의 농도의 염료 용액에 대한 것과 비교한다.
일부 실시양태에서, 친수성 중합체는 가교된 중합체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 가교된 중합체는 또 다른 유형의 중합체와 가교된 한 유형의 중합체를 포함할 수 있다. 가교된 중합체의 예는 폴리에틸렌 옥시드(PEO) 또는 폴리옥시에틸렌), 폴리(비닐 알콜)(PVA), 폴리(비닐 피리딘), 폴리(비닐 피롤리돈)(PVP), 폴리(아크릴산)(PAA), 폴리아크릴아미드, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(PNIPAM), 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMA), 폴리(2-히드록실에틸 메타크릴레이트)(PHEMA), 폴리(올리고(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타크릴레이트)(POEGMA), 폴리글루탐산(PGA), 폴리-리신, 폴리-글루코시드, 스트렙타비딘, 덱스트란 또는 기타 친수성 중합체로부터 선택된 또 다른 중합체와 가교된 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 가교된 중합체는 폴리아크릴아미드로 가교된 폴리(에틸렌 글리콜)일 수 있다.
미세유체 칩 상의 하나 이상의 모세관 또는 채널 또는 모세관의 벽의 내부 표면은 단백질 및 기타 증폭 반응 시약 또는 성분의 낮은 비특이성 결합 및 상이한 용매로의 반복된 노출, 온도의 변화, 화학적 결함, 예컨대 낮은 pH 또는 장기간 저장에 대한 개선된 안정성을 나타낼 수 있다.
하나 이상의 중합체 코팅, 예를 들면 PEG 중합체 필름을 포함하는 개시된 낮은 비특이성 결합 지지체는 고체 지지체에 대한 단백질 및 표지된 뉴클레오티드의 비특이성 결합을 최소화한다. 개선된 핵산 하이브리드화 및 증폭률 및 특이성의 후속 입증은 본 개시내용의 하기 추가적인 측면 중 하나 이상을 통하여 달성될 수 있다: (i) 프라이머 설계(서열 및/또는 변형), (ii) 고체 지지체 상의 테더링된 프라이머 밀도의 제어, (iii) 고체 지지체의 표면 조성, (iv) 고체 지지체의 표면 중합체 밀도, (v) 증폭 이전 및 도중에 개선된 하이브리드화 조건의 사용 및/또는 (vi) 비특이성 프라이머 증폭을 감소시키거나 또는 템플레이트 증폭 효율을 증가시키는 개선된 증폭 배합의 사용.
개시된 낮은 비특이성 결합 지지체 및 관련된 하이브리드화 및 증폭 방법의 잇점은 임의의 시퀀싱 시스템의 하기 추가적인 잇점 중 하나 이상을 부여한다: (i) 감소된 유체 세정 시간(감소된 비특이성 결합 및 더 빠른 시퀀싱 사이클 시간으로 인함), (ii) 감소된 영상화 시간(및 검정 판독 및 시퀀싱 사이클에 대한 더 빠른 회송 시간), (iii) 감소된 전체 작업 흐름 시간 요건(감소된 사이클 시간으로 인함), (iv) 감소된 검출 기기 비용(CNR에서의 개선으로 인함), (v) 개선된 판독(염기 해독) 정확도(CNR에서의 개선으로 인함), (vi) 개선된 시약 안정성 및 감소된 시약 사용 요건(및 그에 따라 감소된 시약 비용) 및 (vii) 핵산 증폭 실패로 인한 더 적은 런타임 실패.
표면 바이오검정, 예를 들면 유전형 및 시퀀싱 검정에 대한 낮은 결합 친수성 표면(다층 및/또는 단층)은 하기의 임의의 조합을 사용하여 생성된다.
선형 또는 다분지형 친수성 중합체 서브유닛을 기재 표면 상에서 증착 및/또는 커플링시키기 위한 극성 양성자성, 극성 비양성자성 및/또는 비극성 용매. 일부 다중분지형 친수성 중합체 서브유닛은 기타 중합체 서브유닛과의 공유 커플링 또는 비공유 결합 상호작용을 촉진시키기 위하여 작용성 말단기를 함유할 수 있다. 적절한 작용성 말단기의 예는 비오틴, 메톡시 에테르, 카르복실레이트, 아민, 에스테르 화합물, 아지드, 알킨, 말레이미드, 티올 및 실란 기를 포함한다.
변경된 커플링 화학/용매/완충 시스템에 의한 후속 적층 첨가를 통하여 커플링된 선형, 분지형 또는 다분지형 중합체 서브유닛의 임의의 조합은 직교 말단 커플링 화학 또는 임의의 각각의 조합을 갖는 개개의 서브유닛을 포함할 수 있으며, 그리하여 생성된 표면이 친수성이 되며, 단백질 및 기타 분자 검정 성분의 낮은 비특이성 결합을 나타낸다. 일부 경우에서, 본 개시내용의 친수성, 작용화된 기재 표면은 35°를 넘지 않는 접촉 각도 측정을 나타낸다.
낮은 결합/친수성 기재 상에서 하기 기재되는 임의의 다양한 개별적인 콘쥬게이션 화학 또는 이들의 임의의 조합에 의한 후속 생체분자 부착(예, 단백질, 펩티드, 핵산, 올리고뉴클레오티드 또는 세포의). 층 적층 및/또는 콘쥬게이션 반응은 임의의 비의 하기 성분을 함유할 수 있는 용매 혼합물을 사용하여 수행될 수 있다: 에탄올, 메탄올, 아세토니트릴, 아세톤, DMSO, DMF, H2O 등. 게다가, 5-10의 바람직한 pH 범위의 호환성 완충 시스템은 증착 및 커플링의 속도 및 효율의 제어에 사용될 수 있으며, 그리하여 통상의 수성 완충계 방법의 것의 >5x 초과의 커플링 속도가 달성될 수 있다.
개시된 낮은 비특이성 결합 지지체 및 관련 핵산 하이브리드화 및 증폭 방법은 해당 기술분야의 기술자에게 공지된 임의의 다양한 상이한 세포, 조직 또는 샘플 유형으로부터 유도된 핵산 분자의 분석에 사용될 수 있다. 예를 들면, 핵산은 진핵생물(예컨대 동물, 식물, 진균, 원생생물), 원시세균 또는 유박테리아로부터 유도된 하나 이상의 유형의 세포를 포함하는 조직 샘플 또는 세포로부터 추출될 수 있다. 일부 사례에서, 핵산은 원핵 또는 진핵 세포, 예컨대 유착성 또는 비유착성 진핵 세포로부터 추출된다. 핵산은 예를 들면 1차 또는 무한증식 설치류, 돼지, 고양이, 개, 소, 말, 영장류 또는 사람 세포주로부터 다양하게 추출된다. 핵산은 임의의 다양한 상이한 세포, 기관 또는 조직 유형(예, 백혈구, 적혈구, 혈소판, 상피 세포, 내피 세포, 뉴런, 신경아교세포, 성상세포, 섬유모세포, 골격근세포, 평활근 세포, 생식세포 또는, 심장, 폐, 뇌, 간, 심장, 비장, 췌장, 흉선, 방광, 위장, 결장 또는 소장으로부터의 세포)으로부터 추출될 수 있다. 핵산은 정상의 또는 건강한 세포로부터 추출될 수 있다. 대안으로 또는 조합하여 핵산은 질병이 있는 세포, 예컨대 암성 세포로부터 또는 숙주를 감염시키는 병원성 세포로부터 추출된다. 일부 핵산은 뚜렷한 서브세트의 세포형, 예를 들면 면역 세포(예컨대 T 세포, 세포독성 (킬러) T 세포, 헬퍼 T 세포, 알파 베타 T 세포, 감마 델타 T 세포, T 전구 세포, B 세포, B-전구 세포, 림프성 모세포, 골수성 전구 세포, 림프구, 과립백혈구, 자연 킬러 세포, 형질 세포, 기억 세포, 중성구, 호산구, 호염기구, 비만 세포, 단핵구, 수지상 세포 및/또는 대식세포 또는 이들의 임의의 조합), 미분화 사람 줄기 세포, 분화를 유도하는 사람 줄기 세포, 희귀 세포(예, 순환 종양 세포(CTC), 순환 상피 세포, 순환 내피 세포, 순환 자궁내막 세포, 골수 세포, 전구 세포, 포말 세포, 중간엽 세포 또는 영양모세포)로부터 추출될 수 있다. 기타 세포도 고려되며, 본원의 개시내용과 일치한다.
본원에 개시된 표면 부동태화 기술의 결과로서, 단백질, 핵산 및 기타 생체분자는 기재를 관통하지 않으며, 즉 낮은 비특이성 결합(NSB)을 나타낸다. 그의 예는 변경되는 유리 제조 조건으로 표준 단층 표면 제조를 사용하여 하기에 제시된다. 단백질 및 핵산에 대한 극초저 NSB를 달성하기 위하여 부동태화된 친수성 표면은 프라이머 증착 반응 효율, 하이브리드화 성능을 개선시키며, 효율적인 증폭을 유도하는 신규한 반응 조건을 필요로 한다. 모든 상기 과정은 올리고뉴클레오티드 부착 및 후속 단백질 결합 및 낮은 결합 표면으로의 전달을 필요로 한다. 하기 기재된 바와 같이, 신규한 프라이머 표면 콘쥬게이션 배합(Cy3 올리고뉴클레오티드 그래프트 적정) 및 생성된 극초저 비특이성 배경(적색 및 녹색 형광 염료를 사용하여 수행된 NSB 작용성 테스트)의 조합은 개시된 접근법의 생육성을 입증하는 결과를 산출하였다. 본원에 개시된 일부 표면은 적어도 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 50:1, 75:1, 100:1 또는 100:1 초과 또는 본원의 범위에 걸친 임의의 중간값의 형광단, 예컨대 Cy3의 특이성 결합(예, 테더링된 프라이머 또는 프로브로의 하이브리드화) 대 비특이성 결합(예, B계간)의 비를 나타낸다. 본원에 개시된 일부 표면은 적어도 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 50:1, 75:1, 100:1 또는 100:1 초과 또는 본원의 범위에 의하여 걸쳐 있는 임의의 중간값의 형광단, 예컨대 Cy3에 대한 특이성 대 비특이성 형광 신호의 비(예, 특이적 하이브리드화된 대 비특이적 결합된 표지된 올리고뉴클레오티드의 경우 또는 특이적 증폭된 대 비특이적 결합된(B계간) 또는 비특이적 증폭된(B계내) 표지된 올리고뉴클레오티드의 경우 또는 그의 조합(B계간 + B계내))를 나타낸다.
낮은 비특이성 결합 층의 그래프팅: 제1의 화학적 변형된 층을 플로우 셀(모세관 또는 채널)의 내부 표면에 그래프팅하는데 사용된 부착 화학은 일반적으로 지지체가 제조되는 물질 및 층의 화학적 성질 둘다에 의존할 것이다. 일부 경우에서, 제1의 층은 지지체 표면에 공유 부착될 수 있다. 일부 경우에서, 제1의 층은 표면 및 제1의 층의 분자 성분 사이의 비공유 상호작용, 예컨대 정전 상호작용, 수소 결합 또는 반데르 발스 상호작용을 통하여 표면에 비공유 부착, 예를 들면 흡착될 수 있다. 그러한 경우에서, 기재 표면은 제1의 층의 부착 또는 증착전 처리될 수 있다. 해당 기술분야의 기술자에게 공지된 임의의 다양한 표면 제조 기술은 지지체 표면을 세정 또는 처리하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 유리 또는 실리콘 표면은 피라냐(Piranha) 용액(황산(H2SO4) 및 과산화수소(H2O2)의 혼합물)을 사용하여 산 세정될 수 있거나 및/또는 산소 플라즈마 처리 방법을 사용하여 세정될 수 있다.
실란 화학은 반응성이 더 큰 작용기(예, 아민 또는 카르복실 기)를 부착시키기 위하여 실란올 기를 유리 또는 실리콘 표면 상에서 공유 변형시키기 위한 비제한적인 접근법의 일례를 구성하며, 이는 링커 분자(예, 다양한 길이의 선형 탄화수소 분자, 예컨대 C6, C12, C18 탄화수소 또는 선형 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자) 또는 층 분자(예, 분지형 PEG 분자 또는 기타 중합체)를 표면에 커플링시키는데 사용될 수 있다. 임의의 개시된 낮은 결합 지지체 표면을 생성하는데 사용될 수 있는 적절한 실란의 예는 (3-아미노프로필) 트리메톡시실란(APTMS), (3-아미노프로필) 트리에톡시실란(APTES), 임의의 다양한 PEG-실란(예, 1K, 2K, 5K, 10K, 20K 등의 분자량 포함), 아미노-PEG 실란(즉, 유리 아미노 작용기 포함), 말레이미드-PEG 실란, 비오틴-PEG 실란 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 기타 단량체 또는 중합체 또는 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는 해당 기술분야의 기술자에게 공지된 임의의 다양한 분자는 하나 이상의 화학적 변형된 층을 지지체 표면 상에 생성하는데 사용될 수 있으며, 여기서 사용된 성분의 선택은 지지체 표면의 하나 이상의 성질, 예를 들면 작용기 및/또는 테더링된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 표면 밀도, 지지체 표면의 친수성/소수성 또는 지지체 표면의 3차원 성질(즉, "두께")을 변경시키기 위하여 변경될 수 있다. 임의의 개시된 지지체 표면에서 낮은 비특이성 결합 물질의 하나 이상의 층을 생성하는데 사용될 수 있는 바람직한 중합체의 예는 다양한 분자량 및 분지 구조의 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 스트렙타비딘, 폴리아크릴아미드, 폴리에스테르, 덱스트란, 폴리-리신 및 폴리-리신 공중합체 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 물질의 하나 이상의 층(예, 중합체 층)을 지지체 표면에 그래프팅시키고 및/또는 층을 서로 가교시키는데 사용될 수 있는 콘쥬게이션 화학의 예는 비오틴-스트렙타비딘 상호작용(또는 그의 변형), his 태그 - Ni/NTA 콘쥬게이션 화학, 메톡시 에테르 콘쥬게이션 화학, 카르복실레이트 콘쥬게이션 화학, 아민 콘쥬게이션 화학, NHS 에스테르, 말레이미드, 티올, 에폭시, 아지드, 히드라지드, 알킨, 이소시아네이트 및 실란을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
다층 표면의 하나 이상의 층은 분지형 중합체를 포함할 수 있거나 또는 선형일 수 있다. 적절한 분지형 중합체의 예는 분지형 PEG, 분지형 폴리(비닐 알콜)(분지형 PVA), 분지형 폴리(비닐 피리딘), 분지형 폴리(비닐 피롤리돈)(분지형 PVP), 분지형 ), 폴리(아크릴산)(분지형 PAA), 분지형 폴리아크릴아미드, 분지형 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(분지형 PNIPAM), 분지형 폴리(메틸 메타크릴레이트)(분지형 PMA), 분지형 폴리(2-히드록실에틸 메타크릴레이트)(분지형 PHEMA), 분지형 폴리(올리고(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타크릴레이트)(분지형 POEGMA), 분지형 폴리글루탐산(분지형 PGA), 분지형 폴리-리신, 분지형 폴리-글루코시드 및 덱스트란을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 경우에서, 본원에 개시된 임의의 다층 표면의 하나 이상의 층을 생성하는데 사용된 분지형 중합체는 적어도 4개의 분지, 적어도 5개의 분지, 적어도 6개의 분지, 적어도 7개의 분지, 적어도 8개의 분지, 적어도 9개의 분지, 적어도 10개의 분지, 적어도 12개의 분지, 적어도 14개의 분지, 적어도 16개의 분지, 적어도 18개의 분지, 적어도 20개의 분지, 적어도 22개의 분지, 적어도 24개의 분지, 적어도 26개의 분지, 적어도 28개의 분지, 적어도 30개의 분지, 적어도 32개의 분지, 적어도 34개의 분지, 적어도 36개의 분지, 적어도 38개의 분지 또는 적어도 40개의 분지를 포함할 수 있다. 분자는 종종 '2의 거듭제곱' 개수의 분지, 예컨대 2, 4, 8, 16, 32, 64 또는 128개의 분지를 나타낸다.
예시의 PEG 다층은 PEG-아민-APTES 상의 PEG(8 아암, 16 아암, 8 아암)를 포함한다. 유사한 농도는 16 아암 및 64 아암을 교체하기 위하여 성상 형상의 PEG-아민을 사용하여 8 μM 프라이머에 노출된 PEG-아민-APTES 상의 3층 멀티 아암 PEG(8 아암, 16 아암, 8 아암) 및 (8 아암, 64 아암, 8 아암) 및 3층 멀티 아암 PEG(8 아암, 8 아암, 8 아암)에 대하여 유사한 농도가 관찰되었다. 필적하는 제1의, 제2의 및 제3의 PEG 층을 갖는 PEG 다층도 또한 고려된다.
본원에 개시된 임의의 다층 표면의 하나 이상의 층을 생성하는데 사용된 선형, 분지형 또는 다분지형 중합체는 적어도 500, 적어도 1,000, 적어도 1,500, 적어도 2,000, 적어도 2,500, 적어도 3,000, 적어도 3,500, 적어도 4,000, 적어도 4,500, 적어도 5,000, 적어도 7,500, 적어도 10,000, 적어도 12,500, 적어도 15,000, 적어도 17,500, 적어도 20,000, 적어도 25,000, 적어도 30,000, 적어도 35,000, 적어도 40,000, 적어도 45,000 또는 적어도 50,000 달톤의 분자량을 가질 수 있다. 일부 경우에서, 본원에 개시된 임의의 다층 표면의 하나 이상의 층을 생성하는데 사용된 선형, 분지형 또는 다분지형 중합체는 최대 50,000, 최대 45,000, 최대 40,000, 최대 35,000, 최대 30,000, 최대 25,000, 최대 20,000, 최대 17,500, 최대 15,000, 최대 12,500, 최대 10,000, 최대 7,500, 최대 5,000, 최대 4,500, 최대 4,000, 최대 3,500, 최대 3,000, 최대 2,500, 최대 2,000, 최대 1,500, 최대 1,000 또는 최대 500 달톤의 분자량을 가질 수 있다. 본 단락에 기재된 임의의 하한값 및 상한값은 본 개시내용에 포함되는 범위를 형성하도록 조합될 수 있으며, 예를 들면 일부 경우에서 본원에 개시된 임의의 다층 표면의 하나 이상의 층을 생성하는데 사용된 선형, 분지형 또는 다분지형 중합체의 분자량은 약 1,500 내지 약 20,000 달톤 범위일 수 있다. 해당 기술분야의 기술자는 본원에 개시된 임의의 다층 표면의 하나 이상의 층을 생성하는데 사용된 선형, 분지형 또는 다분지형 중합체의 분자량이 상기 범위의 임의의 값, 예를 들면 약 1,260 달톤을 가질 수 있다는 것을 인지할 것이다.
예를 들면 다층 표면의 적어도 1개의 층이 분지형 중합체를 포함하는 일부 경우에서, 증착된 층의 분지형 중합체 분자 및 이전 층의 분자 사이의 공유 결합의 개수는 분자당 약 1개의 공유 결합 및 분자당 약 32개의 공유 결합 범위일 수 있다. 일부 경우에서, 새로운 층의 분지형 중합체 분자 및 이전의 층의 분자 사이의 공유 결합의 개수는 분자당 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 12개, 적어도 14개, 적어도 16개, 적어도 18개, 적어도 20개, 적어도 22개, 적어도 24개, 적어도 26개, 적어도 28개, 적어도 30개 또는 적어도 32개 또는 32개 초과의 공유 결합일 수 있다. 일부 경우에서, 새로운 층의 분지형 중합체 분자 및 이전 층의 분자 사이의 공유 결합의 개수는 최대 32개, 최대 30개, 최대 28개, 최대 26개, 최대 24개, 최대 22개, 최대 20개, 최대 18개, 최대 16개, 최대 14개, 최대 12개, 최대 10개, 최대 9개, 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 최대 2개 또는 최대 1개일 수 있다. 본 단락에 기재된 임의의 하한값 및 상한값은 본 개시내용에 포함되는 범위를 형성하도록 조합될 수 있으며, 예를 들면 일부 경우에서 새로운 층의 분지형 중합체 분자 및 이전 층의 분자 사이의 공유 결합의 개수는 약 4개 내지 약 16개 범위일 수 있다. 해당 기술분야의 기술자는 새로운 층의 분지형 중합체 분자 및 이전 층의 분자 사이의 공유 결합의 개수가 상기 범위의 임의의 값, 예를 들면 일부 경우에서 약 11개 또는 기타 경우에서 약 4.6개의 평균 개수를 가질 수 있다는 것을 인지할 것이다.
물질 층을 지지체 표면에 커플링시킨 후 잔존하는 임의의 반응성 작용기는 고 수율 커플링 화학을 사용하여 작은, 불활성 분자를 커플링시켜 임의로 차폐될 수 있다. 예를 들면, 새로운 물질 층을 이전의 층에 부착시키기 위하여 아민 커플링 화학을 사용하는 경우, 임의의 잔류 아민기는 후에 작은 아미노산, 예컨대 글리신과의 커플링에 의하여 아세틸화 또는 불활성화될 수 있다.
개시된 낮은 결합 지지체의 표면 상에 증착된 낮은 비특이성 결합 물질, 예를 들면 친수성 중합체 물질의 층의 개수는 1 내지 약 10개 범위일 수 있다. 일부 경우에서, 층의 개수는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개이다. 일부 경우에서, 층의 개수는 최대 10개, 최대 9개, 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 최대 2개 또는 최대 1개일 수 있다. 본 단락에 기재된 임의의 하한값 및 상한값은 본 개시내용에 포함되는 범위를 형성하도록 조합될 수 있으며, 예를 들면 일부 경우에서 층의 개수는 약 2 내지 약 4개 범위일 수 있다. 일부 경우에서, 층 전부는 동일한 물질을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 각각의 층은 상이한 물질을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 복수의 층은 복수의 물질을 포함할 수 있다. 일부 경우에서 적어도 1개의 층은 분지형 중합체를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 모든 층은 분지형 중합체를 포함할 수 있다.
낮은 비특이성 결합 물질의 하나 이상의 층은 일부 사례에서 극성 양성자성 용매, 극성 비양성자성 용매, 비극성 용매 또는 이들의 임의의 조합을 사용하여 기재 표면 상에 증착 및/또는 그에 콘쥬게이트될 수 있다. 일부 경우에서 층 증착 및/또는 커플링에 사용된 용매는 알콜(예, 메탄올, 에탄올, 프로판올 등), 또 다른 유기 용매(예, 아세토니트릴, 디메틸 술폭시드(DMSO), 디메틸 포름아미드(DMF) 등), 물, 수성 완충 용액(예, 인산염 완충제, 인산염 완충 염수, 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산(MOPS) 등) 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 사용된 용매 혼합물의 유기 성분은 본원의 범위에 걸쳐 또는 그에 인접한 전체 또는 임의의 비율의 적어도 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%를 포함할 수 있으며, 나머지는 물 또는 수성 완충 용액으로 이루어진다. 일부 경우에서, 사용된 용매 혼합물의 수성 성분은 본원의 범위에 걸쳐 또는 그에 인접한 전체 또는 임의의 비율의 적어도 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%를 포함할 수 있으며, 나머지는 유기 용매로 이루어진다. 사용된 용매 혼합물의 pH는 5, 5, 5, 5, 6, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10 미만 또는 10 초과 또는 본원에 기재된 범위에 걸쳐 또는 그에 인접한 임의의 값일 수 있다.
일부 경우에서, 낮은 비특이성 결합 물질의 하나 이상의 층은 유기 용매의 혼합물을 사용하여 기재 표면 상에 증착 또는 그에 콘쥬게이트될 수 있으며, 적어도 1종의 성분의 유전 상수는 40 미만이며, 전체 혼합물의 적어도 50 부피%를 구성한다. 일부 경우에서, 적어도 1종의 성분의 유전 상수는 10 미만, 20 미만, 30 미만, 40 미만일 수 있다. 일부 경우에서, 적어도 1종의 성분은 전체 혼합물의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70% 또는 적어도 80 부피%를 구성한다.
언급한 바와 같이, 본 개시내용의 낮은 비특이성 결합 지지체는 고상 핵산 증폭에 사용되는 하이브리드화 및/또는 증폭 배합물의 단백질, 핵산 및 기타 성분의 감소된 비특이성 결합을 나타낸다. 주어진 지지체 표면에 의하여 나타난 비특이성 결합의 정도는 정성적으로 또는 정량적으로 평가될 수 있다. 예를 들면, 일부 경우에서, 표준화된 세트의 조건 하에서 형광 염료(예, Cy3, Cy5 등), 형광 표지된 뉴클레오티드, 형광 표지된 올리고뉴클레오티드 및/또는 형광 표지된 단백질(예, 폴리머라제)로의 표면의 노출에 이어서 명시된 헹굼 프로토콜 및 형광 영상화는 상이한 표면 배합물을 포함하는 지지체 상에서 비특이성 결합의 비교를 위한 정성적 도구로서 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 표준화된 세트의 조건 하에서 형광 염료, 형광 표지된 뉴클레오티드, 형광 표지된 올리고뉴클레오티드 및/또는 형광 표지된 단백질(예, 폴리머라제)로의 표면의 노출에 이어서 명시된 헹굼 프로토콜 및 형광 영상화는 상이한 표면 배합물을 포함하는 지지체 상에서 비특이성 결합의 비교를 위한 정량적 도구로서 사용될 수 있되, 단 형광 신호가 지지체 표면 상의 형광단의 개수에 대하여 1차로 관련된(또는 예측 가능한 방식으로 관련된) 조건 하에서(예, 형광단의 신호 포화 및/또는 자동 시퀀싱이 문제가 되지 않는 조건 하에서) 형광 영상화가 수행되며, 적절한 보정 표준을 사용하는지를 확인하기 위하여 주의를 기울여야 한다. 일부 경우에서, 해당 기술분야의 기술자에게 공지된 기타 기술, 예를 들면, 방사성동위원소 표지 및 계수 방법은 비특이성 결합이 본 개시내용의 상이한 지지체 표면 배합물에 의하여 나타나는 정도의 정량적 평가에 사용될 수 있다.
본원에 개시된 일부 표면은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 또는 100 초과 또는 본원의 범위에 의하여 걸쳐 있는 임의의 중간값의 형광단, 예컨대 Cy3의 특이성 대 비특이성 결합의 비를 나타낸다. 본원에 개시된 일부 표면은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 또는 100 초과 또는 본원의 범위에 의하여 걸쳐 있는 임의의 중간값의 형광단, 예컨대 Cy3의 특이성 대 비특이성 형광의 비를 나타낸다.
언급한 바와 같이, 일부 경우에서, 개시된 낮은 결합 지지체에 의하여 나타난 비특이성 결합의 정도는 표준화된 세트의 인큐베이션 및 헹굼 조건 하에서 표면을 표지된 단백질(예, 소 혈청 알부민(BSA), 스트렙타비딘, DNA 폴리머라제, 역전사 효소, 헬리카제, 단일 가닥 결합 단백질(SSB) 등 또는 이들의 임의의 조합), 표지된 뉴클레오티드, 표지된 올리고뉴클레오티드 등과 접촉시킨 후, 표면 상에 잔존하는 표지의 양의 검출 및 그로부터 발생한 신호와 적절한 보정 표준의 비교를 위한 표준화된 프로토콜을 사용하여 평가할 수 있다. 일부 경우에서, 표지는 형광 표지를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 표지는 방사성동위원소를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 표지는 해당 기술분야의 기술자에게 공지된 임의의 기타 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 주어진 지지체 표면 배합에 의하여 나타난 비특이성 결합의 정도는 단위 면적당 비특이성 결합된 단백질 분자(또는 기타 분자)의 개수에 관하여 평가될 수 있다. 일부 경우에서, 본 개시내용의 낮은 결합 지지체는 1 ㎛2당 0.001 분자 미만, 1 ㎛2당 0.01 분자 미만, 0.1 분자 미만, 1 ㎛2당 0.25 분자 미만, 1 ㎛2당 0.5 분자 미만, 1 ㎛2당 1 분자 미만, 1 ㎛2당 10 분자 미만, 1 ㎛2당 100 분자 또는 1 ㎛2당 1,000 분자 미만의 비특이성 단백질 결합(또는 기타 명시된 분자, 예를 들면 Cy3 염료의 비특이성 결합)을 나타낼 수 있다. 해당 기술분야의 기술자는 예를 들면 1 ㎛2당 86 분자 미만의 본 개시내용의 주어진 지지체 표면이 상기 범위에 속하는 비특이성 결합을 나타낼 수 있다는 것을 인지할 것이다. 예를 들면, 본원에 개시된 일부 변형된 표면은 인삼염 완충 염수(PBS) 완충제 중에서 15 분 동안 Cy3 표지된 스트렙타비딘(지이 애머샴(GE Amersham))의 1 μM 용액과 접촉에 이어서 탈이온수로 3회 헹군 후 1 ㎛2당 0.5 분자 미만의 비특이성 단백질 결합을 나타낸다. 본원에 개시된 일부 변형된 표면은 1 ㎛2당 2 분자 미만의 Cy3 염료 분자의 비특이성 결합을 나타낸다. 독립적 비특이성 결합 검정에서, 1 μM 표지된 Cy3 SA(써모피셔((ThermoFisher)), 1 μM Cy5 SA 염료(써모피셔), 10 μM 아미노알릴-dUTP - ATTO-647N(예나 바이오사이언시즈(Jena Biosciences)), 10 μM 아미노알릴-dUTP - ATTO-Rho11(예나 바이오사이언시즈), 10 μM 아미노알릴-dUTP - ATTO-Rho11(예나 바이오사이언시즈), 10 μM 7-프로파르길아미노-7-데아자-dGTP-Cy5(예나 바이오사이언시즈) 및 10 μM 7-프로파르길아미노-7-데아자-dGTP-Cy3(예나 바이오사이언시즈)을 낮은 결합 기재 상에서 37℃에서 15 분 동안 384 웰 평판 포맷으로 인큐베이션하였다. 각각의 웰을 50 ㎕ 탈이온화된 무-RNase/DNase 물로 2-3회, 25 mM ACES 완충액 pH 7.4로 2-3회 헹구었다. 384웰 평판을 지이 타이푼(GE Typhoon)(지이 헬쓰케어 라이프사이언시즈(GE Healthcare Lifesciences), 미국 펜실베이니아주 피츠버그 소재) 기기 상에서 Cy3, AF555 또는 Cy5 필터 세트를 사용하여(수행된 염료 테스트에 따라) 제조업자에 의하여 명시된 바와 같이 800의 PMT 이득 설정 및 50-100 ㎛의 분해능에서 영상화하였다. 더 높은 해상도 영상화의 경우, 올림푸스(Olympus) IX83 현미경(올림푸스 코포레이션(Olympus Corp.), 미국 펜실베이니아주 센터 밸리 소재) 상에서 총 내부 반사율 형광(TIRF) 대물렌즈(20x, 0.75 NA 또는 100X, 1.5 NA, 올림푸스), sCMOS 앤도(Andor) 카메라(자일라(Zyla) 4.2) 상에서 화상을 수집하였다. 다이크로익(Dichroic) 미러는 섬록(Semrock)(아이덱스 헬쓰 앤 사이언스, 엘엘씨(IDEX Health & Science, LLC), 미국 뉴욕주 로체스터 소재)으로부터 구입하였으며, 예를 들면 405, 488, 532 또는 633 ㎚ 다이크로익 반사기/빔분할기 및 밴드패스 필터는 적절한 여기 파장과 일치하는 532 LP 또는 645 LP로서 선택하였다. 본원에 개시된 일부 변형된 표면은 1 ㎛2당 0.25 분자 미만의 염료 분자의 비특이성 결합을 나타낸다.
일부 경우에서, 본원에 개시된 표면은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 또는 100 초과 또는 본원의 범위에 의하여 걸쳐 있는 임의의 중간값의 형광단, 예컨대 Cy3의 특이성 대 비특이성 결합의 비를 나타낸다. 일부 경우에서, 본원에 개시된 표면은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 또는 100 초과 또는 본원의 범위에 의하여 걸쳐 있는 임의의 중간값의 형광단, 예컨대 Cy3에 대한 특이성 대 비특이성 형광 신호의 비를 나타낸다.
본 개시내용과 일치하는 낮은 배경 표면은 적어도 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1의 특이성 염료 부착(예, Cy3 부착) 대 비특이성 염료 흡착(예, Cy3 염료 흡착) 또는 비특이성 흡착된 분자당 50 초과의 부착된 특이성 염료 분자를 나타낼 수 있다. 유사하게, 여기 에너지로 처리시, 형광단, 예를 들면 Cy3이 부착된 본원의 개시내용과 일치하는 낮은 배경 표면은 적어도 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1 또는 50:1 초과의 특이성 형광 신호(예, 표면에 부착된 Cy3-표지된 올리고뉴클레오티드로부터 발생함) 대 비특이성 흡착된 염료 형광 신호의 비를 나타낼 수 있다.
일부 경우에서, 개시된 지지체 표면의 친수성 정도(또는 수성 용액과의 "습윤성")은 예를 들면 물의 작은 액적이 표면 상에 배치되고, 표면과의 그의 접촉각을 예를 들면 광학 장력계를 사용하여 측정하는 물 접촉각의 측정에 의하여 평가될 수 있다. 일부 경우에서, 정적 접촉각을 측정할 수 있다. 일부 경우에서, 전진 또는 후진 접촉각을 측정할 수 있다. 일부 경우에서, 본원에 개시된 친수성, 낮은 결합 지지체 표면에 대한 물 접촉각은 약 0°내지 약 50°범위일 수 있다. 일부 경우에서, 본원에 개시된 친수성, 낮은 결합 지지체 표면에 대한 물 접촉각은 50°, 45°, 40°, 35°, 30°, 25°, 20°, 18°, 16°, 14°, 12°, 10°, 8°, 6°, 4°, 2° 또는 1°이하일 수 있다. 다수의 경우에서, 접촉각은 상기 범위의 임의의 값 이하, 예를 들면 40°이하이다. 해당 기술분야의 기술자는 본 개시내용의 주어진 친수성, 낮은 결합 지지체 표면이 상기 범위의 값, 예를 들면 약 27°를 갖는 물 접촉각을 나타낼 수 있다는 것을 인지할 것이다.
일부 경우에서, 본원에 개시된 친수성 표면은 종종 낮은 결합 표면에 대한 생체분자의 감소된 비특이적 결합으로 인하여 생물학적 검정을 위한 감소된 세척 시간을 돕는다. 일부 경우에서, 적절한 세척 단계는 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 초 미만 또는 10 초 미만으로 수행될 수 있다. 예를 들면, 일부 경우에서 적절한 세척 단계는 30 초 미만에 수행될 수 있다.
올리고뉴클레오티드 프라이머 및 어댑터 서열: 일반적으로, 낮은 비특이성 결합 물질의 하나 이상의 층 중 적어도 하나의 층은 올리고뉴클레오티드 분자, 예를 들면 어댑터 또는 프라이머 서열을 공유 또는 비공유 부착시키기 위한 작용기를 포함할 수 있거나 또는 적어도 하나의 층은 지지체 표면 상에 증착될 때 공유 또는 비공유 부착된 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 프라이머 서열을 이미 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 적어도 1/3 층의 중합체 분자에 테더링된 올리고뉴클레오티드는 층 전체에서의 복수의 깊이에서 분포될 수 있다.
일부 경우에서, 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 프라이머 분자는 즉 표면 상에서 중합체를 커플링 또는 증착시키기 전에 용액 중의 중합체에 공유 커플링된다. 일부 경우에서, 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 프라이머 분자는 표면 상에 커플링 또는 증착된 후 중합체에 공유 커플링될 수 있다. 일부 경우에서, 적어도 하나의 친수성 중합체 층은 복수의 공유 부착된 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 프라이머 분자를 포함한다. 일부 경우에서, 친수성 중합체의 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 적어도 5개의 층은 복수의 공유 부착된 어댑터 또는 프라이머 분자를 포함한다.
일부 경우에서, 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 프라이머 분자는 친수성 중합체의 하나 이상의 층에 해당 기술분야의 기술자에게 공지된 임의의 다양한 적절한 콘쥬게이션 화학을 사용하여 커플링될 수 있다. 예를 들면, 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 프라이머 서열은 아민 기, 카르복실 기, 티올 기 등과 반응성인 모이어티를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 적절한 아민 반응성 콘쥬게이션 화학의 예는 이소티오시아네이트, 이소시아네이트, 아실 아지드, NHS 에스테르, 술포닐 클로라이드, 알데히드, 글리옥살, 에폭시드, 옥시란, 카르보네이트, 아릴 할라이드, 이미도에스테르, 카르보디이미드, 무수물 및 플루오로페닐 에스테르 기를 수반하는 반응을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적절한 카르복실 반응성 콘쥬게이션 화학의 예는 카르보디이미드 화합물, 예를 들면 수용성 EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드·HCL)를 수반한 반응을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적절한 술프히드릴 반응성 콘쥬게이션 화학의 예는 말레이미드, 할로아세틸 및 피리딜 디술피드를 포함한다.
올리고뉴클레오티드 분자 중 하나 이상의 유형은 지지체 표면에 부착 또는 테더링될 수 있다. 일부 경우에서, 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 프라이머 중 하나 이상의 유형은 스페이서 서열, 어댑터-라이게이션된 템플레이트 라이브러리 핵산 서열로의 하이브리드화에 대한 어댑터 서열, 정방향 증폭 프라이머, 역방향 증폭 프라이머, 시퀀싱 프라이머 및/또는 분자 바코딩 서열 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 1개의 프라이머 또는 어댑터 서열은 표면 중 적어도 하나의 층에 테더링될 수 있다. 일부 경우에서, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 10개 초과의 상이한 프라이머 또는 어댑터 서열은 표면의 적어도 하나의 층에 테더링될 수 있다.
일부 경우에서, 테더링된 올리고뉴클레오티드 어댑터 및/또는 프라이머 서열은 약 10개의 뉴클레오티드 내지 약 100개의 뉴클레오티드 범위의 길이를 가질 수 있다. 일부 경우에서, 테더링된 올리고뉴클레오티드 어댑터 및/또는 프라이머 서열은 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개 또는 적어도 100개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 경우에서, 테더링된 올리고뉴클레오티드 어댑터 및/또는 프라이머 서열은 최대 100개, 최대 90개, 최대 80개, 최대 70개, 최대 60개, 최대 50개, 최대 40개, 최대 30개, 최대 20개 또는 최대 10개의 뉴클레오티드의 길이일 수 있다. 본 단락에 기재된 임의의 하한값 및 상한값은 본 개시내용에 포함되는 범위를 형성하도록 조합될 수 있으며, 예를 들면 일부 경우에서 테더링된 올리고뉴클레오티드 어댑터 및/또는 프라이머 서열의 길이는 약 20개의 뉴클레오티드 내지 약 80개의 뉴클레오티드 범위일 수 있다. 해당 기술분야의 기술자는 테더링된 올리고뉴클레오티드 어댑터 및/또는 프라이머 서열의 길이가 상기 범위의 임의의 값, 예를 들면 약 24개의 뉴클레오티드를 가질 수 있다는 것을 인지할 것이다.
일부 경우에서, 테더링된 어댑터 또는 프라이머 서열은 낮은 결합 지지체 상에서 수행된 바와 같이 핵산 증폭의 특이성 및 효율을 돕도록 설계된 변형을 포함할 수 있다. 예를 들면, 일부 경우에서 프라이머는 표면 콘쥬게이션 지점 및 변형 부위 사이의 프라이머 서열의 신장이 항상 단일 가닥 형태로 존재하며, 일부 헬리카제 의존성 등온 증폭 방법에서 5' 내지 3' 헬리카제에 대한 로딩 부위로서 기능하도록 폴리머라제 정지 지점을 포함할 수 있다. 폴리머라제 정지점을 생성하도록 사용될 수 있는 프라이머 변형의 기타 예는 5' 단부를 향한 2개의 뉴클레오티드 사이의 프라이머의 백본에 PEG 쇄의 삽입, 무염기성 뉴클레오티드(즉 퓨린 또는 피리미딘 염기를 갖지 않는 뉴클레오티드)의 삽입 또는 헬리카제에 의하여 우회될 수 있는 병변 부위를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
하기 실시예에서 추가로 논의되는 바와 같이, 주어진 증폭 방법의 사용시 최적의 성능을 위한 지지체를 "조율"하기 위하여 지지체 표면 상의 테더링된 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 프라이머의 표면 밀도 및/또는 지지체 표면으로부터 테더링된 어댑터 또는 프라이머의 이격을 변경시키는 것(예, 어댑터 또는 프라이머를 표면에 테더링하는데 사용된 링커 분자의 길이를 변경시켜)이 바람직할 수 있다. 하기 논의된 바와 같이, 테더링된 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 프라이머의 표면 밀도의 조절은 선택된 증폭 방법에 따라 변경되는 방식으로 지지체 상에서 관찰되는 특이성 및/또는 비특이성 증폭의 수준에 영향을 미칠 수 있다. 일부 경우에서, 테더링된 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 프라이머의 표면 밀도는 지지체 표면을 생성하는데 사용된 분자 성분의 비를 조절하여 변경될 수 있다. 예를 들면, 올리고뉴클레오티드 프라이머-PEG 콘쥬게이트가 낮은 결합 지지체의 최종 층을 생성하는데 사용되는 경우, 올리고뉴클레오티드 프라이머-PEG 콘쥬게이트 대 비콘쥬게이트된 PEG 분자의 비는 변경될 수 있다. 그 후, 테더링된 프라이머 분자의 생성된 표면 밀도는 해당 기술분야의 기술자에게 공지된 임의의 다양한 기술을 사용하여 추정 또는 측정될 수 있다. 그의 예는 방사성동위원소 표지 및 계수 방법, 구획된 부위의 지지체 표면으로부터 분열되고, 적절한 용매의 고정된 부피로 수집한 후, 형광 신호와 공지의 광학 태그 농도의 보정 용액의 비교에 의하여 정량화될 수 있는 광학 검출 가능한 태그(예, 형광 태그)를 포함하는 분열 가능한 분자의 공유 커플링의 사용 또는 형광 영상화 기술의 사용을 포함하나 이에 제한되지 않되, 단 형광 신호가 표면 상의 형광단의 개수와 1차로 관련되어 있다(예, 표면 상에 형광단의 상당한 자동 켄칭이 존재하지 않는다)는 것을 확인하기 위하여 표지 반응 조건 및 화상 획득 설정에 주의를 기울여야 한다.
일부 경우에서, 본 개시내용의 낮은 결합 지지체 표면 상의 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 프라이머의 생성된 표면 밀도는 1 ㎛2당 약 100 프라이머 분자 내지 1 ㎛2당 약 1,000,000 프라이머 분자 범위일 수 있다. 일부 경우에서, 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 프라이머의 표면 밀도는 1 ㎛2당 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 600, 적어도 700, 적어도 800, 적어도 900, 적어도 1,000, 적어도 1,500, 적어도 2,000, 적어도 2,500, 적어도 3,000, 적어도 3,500, 적어도 4,000, 적어도 4,500, 적어도 5,000, 적어도 5,500, 적어도 6,000, 적어도 6,500, 적어도 7,000, 적어도 7,500, 적어도 8,000, 적어도 8,500, 적어도 9,000, 적어도 9,500, 적어도 10,000, 적어도 15,000, 적어도 20,000, 적어도 25,000, 적어도 30,000, 적어도 35,000, 적어도 40,000, 적어도 45,000, 적어도 50,000, 적어도 55,000, 적어도 60,000, 적어도 65,000, 적어도 70,000, 적어도 75,000, 적어도 80,000, 적어도 85,000, 적어도 90,000, 적어도 95,000, 적어도 100,000, 적어도 150,000, 적어도 200,000, 적어도 250,000, 적어도 300,000, 적어도 350,000, 적어도 400,000, 적어도 450,000, 적어도 500,000, 적어도 550,000, 적어도 600,000, 적어도 650,000, 적어도 700,000, 적어도 750,000, 적어도 800,000, 적어도 850,000, 적어도 900,000, 적어도 950,000 또는 적어도 1,000,000 분자일 수 있다. 일부 경우에서, 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 프라이머의 표면 밀도는 1 ㎛2당 최대 1,000,000, 최대 950,000, 최대 900,000, 최대 850,000, 최대 800,000, 최대 750,000, 최대 700,000, 최대 650,000, 최대 600,000, 최대 550,000, 최대 500,000, 최대 450,000, 최대 400,000, 최대 350,000, 최대 300,000, 최대 250,000, 최대 200,000, 최대 150,000, 최대 100,000, 최대 95,000, 최대 90,000, 최대 85,000, 최대 80,000, 최대 75,000, 최대 70,000, 최대 65,000, 최대 60,000, 최대 55,000, 최대 50,000, 최대 45,000, 최대 40,000, 최대 35,000, 최대 30,000, 최대 25,000, 최대 20,000, 최대 15,000, 최대 10,000, 최대 9,500, 최대 9,000, 최대 8,500, 최대 8,000, 최대 7,500, 최대 7,000, 최대 6,500, 최대 6,000, 최대 5,500, 최대 5,000, 최대 4,500, 최대 4,000, 최대 3,500, 최대 3,000, 최대 2,500, 최대 2,000, 최대 1,500, 최대 1,000, 최대 900, 최대 800, 최대 700, 최대 600, 최대 500, 최대 400, 최대 300, 최대 200 또는 최대 100 분자일 수 있다. 본 단락에 기재된 임의의 하한값 및 상한값은 본 개시내용에 포함되는 범위를 형성하도록 조합될 수 있으며, 예를 들면 일부 경우에서 어댑터 또는 프라이머의 표면 밀도는 1 ㎛2당 약 10,000 분자 내지 1 ㎛2당 약 100,000 분자 범위일 수 있다. 해당 기술분야의 기술자는 어댑터 또는 프라이머 분자의 표면 밀도가 상기 범위의 임의의 값, 예를 들면 일부 경우에서 1 ㎛2당 약 3,800 분자 또는 기타 경우에서 1 ㎛2당 약 455,000 분자라는 것을 인지할 것이다. 일부 경우에서, 하기에서 추가로 논의되는 바와 같이, 지지체 표면 상의 어댑터 또는 프라이머 서열로 초기에 하이브리드화된 템플레이트 라이브러리 핵산 서열(예, 샘플 DNA 분자)의 표면 밀도는 테더링된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 표면 밀도에 대하여 나타낸 것보다 적거나 또는 그와 동일할 수 있다. 일부 경우에서, 또한 하기에 추가로 논의되는 바와 같이, 지지체 표면 상에서 어댑터 또는 프라이머 서열로 하이브리드화된 클론 증폭된 템플레이트 라이브러리 핵산 서열의 표면 밀도는 테더링된 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 프라이머의 표면 밀도에 대하여 나타낸 바와 동일한 범위 또는 상이한 범위에 걸칠 수 있다.
상기 제시된 바와 같이 어댑터 또는 프라이머 분자의 국소 표면 밀도는 표면 전체에 걸쳐 밀도의 변화를 배제하지 않아서 표면이 예를 들면 500,000/㎛2의 올리고 밀도를 갖는 구역을 포함할 수 있는 한편, 실질적으로 상이한 국소 밀도를 갖는 적어도 제2의 구역을 포함한다.
낮은 결합 지지체로의 핵산 분자의 하이브리드화: 본 개시내용의 일부 측면에서, 개시된 낮은 결합 결합체와 조합하여 개선된 하이브리드화 비율, 하이브리드화 특이성(또는 엄중성) 및 하이브리드화 효율(또는 수율)을 제공하는 하이브리드화 완충제 배합물이 기재되어 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 하이브리드화 특이성은 테더링된 어댑터 서열, 프라이머 서열 또는 올리고뉴클레오티드 서열이 일반적으로 완전 상보성 서열로만 정확하게 하이브리드화되는 능력의 측정이면서, 하이브리드화 효율은 일반적으로 상보성 서열로 하이브리드화된 총 입수 가능한 테더링된 어댑터 서열, 프라이머 서열 또는 올리고뉴클레오티드 서열의 비율의 측정이다.
개선된 하이브리드화 특이성 및/또는 효율은 개시된 낮은 결합 표면과 함께 사용된 하이브리드화 완충제 배합물의 최적화를 통하여 달성될 수 있으며, 하기 실시예에서 상세하게 논의될 것이다. 개선된 성능을 달성하기 위하여 조절될 수 있는 하이브리드화 완충제 성분의 예는 완충제 유형, 유기 용매 혼합물, 완충제 pH, 완충제 점도, 세정제 및 양쪽성 성분, 이온 강도(1가 및 2가 이온 농도 둘다의 조절 포함), 산화방지제, 환원제, 탄수화물, BSA, 폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란 술페이트, 베타인, 기타 첨가제 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
비제한적인 예로서, 하이브리드화 완충제를 배합하는데 사용되는 적절한 완충제는 인산염 완충 염수(PBS), 숙시네이트, 시트레이트, 히스티딘, 아세테이트, 트리스(Tris), TAPS, MOPS, PIPES, HEPES, MES 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적절한 완충제의 선택은 일반적으로 하이브리드화 완충제 용액의 표적 pH에 의존할 것이다. 일반적으로, 완충제 용액의 원하는 pH는 약 pH 4 내지 약 pH 8.4 범위일 것이다. 일부 실시양태에서, 완충제 pH는 적어도 4.0, 적어도 4.5, 적어도 5.0, 적어도 5.5, 적어도 6.0, 적어도 6.2, 적어도 6.4, 적어도 6.6, 적어도 6.8, 적어도 7.0, 적어도 7.2, 적어도 7.4, 적어도 7.6, 적어도 7.8, 적어도 8.0, 적어도 8.2 또는 적어도 8.4일 수 있다. 일부 실시양태에서, 완충제 pH는 최대 8.4, 최대 8.2, 최대 8.0, 최대 7.8, 최대 7.6, 최대 7.4, 최대 7.2, 최대 7.0, 최대 6.8, 최대 6.6, 최대 6.4, 최대 6.2, 최대 6.0, 최대 5.5, 최대 5.0, 최대 4.5 또는 최대 4.0일 수 있다. 본 단락에 기재된 임의의 하한값 및 상한값은 본 개시내용에 포함되는 범위를 형성하도록 조합될 수 있으며, 예를 들면 일부 경우에서, 원하는 pH는 약 6.4 내지 약 7.2 범위일 수 있다. 해당 기술분야의 기술자는 완충제 pH가 상기 범위의 임의의 값, 예를 들면, 약 7.25를 가질 수 있다는 것을 인지할 것이다.
하이브리드화 완충제 배합물에 사용하기 위한 적절한 세정제는 양쪽성 세정제(예, 1-도데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 3-(4-tert-부틸-1-피리디니오)-1-프로판술포네이트, 3-(N,N-디메틸미리스틸암모니오)프로판술포네이트, 3-(N,N-디메틸미리스틸암모니오)프로판술포네이트, ASB-C80, C7BzO, CHAPS, CHAPS 수화물, CHAPSO, DDMAB, 디메틸에틸암모늄프로판 술포네이트, N,N-디메틸도데실아민 N옥시드, N-도데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판술포네이트 또는 N-도데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판술포네이트) 및 음이온성, 양이온성 및 비이온성 세정제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 비이온성 세정제의 예는 폴리(옥시에틸렌) 에테르 및 관련 중합체(예, Brij®, 트윈(TWEEN)®, 트리톤(TRITON)®, 트리톤 X-100 및 이게팔(IGEPAL)® CA-630), 담즙산염 및 글리코시드 세정제를 포함한다.
개시된 낮은 결합 지지체 단독으로 또는 최적화된 완충제 배합물과 조합한 사용은 통상의 하이브리드화 프로토콜에 대한 것보다 신속한 약 2 내지 약 20배 범위의 상대적 하이브리드화 비율을 산출할 수 있다. 일부 경우에서, 상대적 하이브리드화 비율은 통상의 하이브리드화 프로토콜의 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 12배, 적어도 14배, 적어도 16배, 적어도 18배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배 또는 적어도 40배일 수 있다.
일부 경우에서, 개시된 낮은 결합 지지체를 단독으로 또는 최적화된 완충제 배합물과 조합한 사용은 임의의 상기 완료 측량에 대하여 60 분, 50 분, 40 분, 30 분, 20 분, 15 분, 10 분 또는 5 분 미만의 총 하이브리드화 반응 시간(즉 하이브리드화 반응의 90%, 95%, 98% 또는 99% 완료에 도달하는데 소요되는 시간)을 산출할 수 있다.
일부 경우에서, 개시된 낮은 결합 지지체를 단독으로 또는 최적화된 완충제 배합물과 조합하여 사용하는 것은 통상의 하이브리드화 프로토콜의 것에 비하여 개선된 하이브리드화 특이성을 산출할 수 있다. 일부 경우에서, 달성될 수 있는 하이브리드화 특이성은 10 하이브리드화 이벤트에서 1 염기 부정합, 20 하이브리드화 이벤트에서 1 염기 부정합, 30 하이브리드화 이벤트에서 1 염기 부정합, 40 하이브리드화 이벤트에서 1 염기 부정합, 50 하이브리드화 이벤트에서 1 염기 부정합, 75 하이브리드화 이벤트에서 1 염기 부정합, 100 하이브리드화 이벤트에서 1 염기 부정합, 200 하이브리드화 이벤트에서 1 염기 부정합, 300 하이브리드화 이벤트에서 1 염기 부정합, 400 하이브리드화 이벤트에서 1 염기 부정합, 500 하이브리드화 이벤트에서 1 염기 부정합, 600 하이브리드화 이벤트에서 1 염기 부정합, 700 하이브리드화 이벤트에서 1 염기 부정합, 800 하이브리드화 이벤트에서 1 염기 부정합, 900 하이브리드화 이벤트에서 1 염기 부정합, 1,000 하이브리드화 이벤트에서 1 염기 부정합, 2,000 하이브리드화 이벤트에서 1 염기 부정합, 3,000 하이브리드화 이벤트에서 1 염기 부정합, 4,000 하이브리드화 이벤트에서 1 염기 부정합, 5,000 하이브리드화 이벤트에서 1 염기 부정합, 6,000 하이브리드화 이벤트에서 1 염기 부정합, 7,000 하이브리드화 이벤트에서 1 염기 부정합, 8,000 하이브리드화 이벤트에서 1 염기 부정합, 9,000 하이브리드화 이벤트 또는 10,000 하이브리드화 이벤트에서 1 염기 부정합보다 더 우수하다.
일부 경우에서, 개시된 낮은 결합 지지체를 단독으로 또는 최적화된 완충제 배합물과 조합하여 사용하는 것은 통상의 하이브리드화 프로토콜의 것에 비하여 개선된 하이브리드화 효율(예, 표적 올리고뉴클레오티드 서열로 성공적으로 하이브리드화된 지지체 표면 상의 입수 가능한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 분율)을 산출할 수 있다. 일부 경우에서, 달성할 수 있는 하이브리드화 효율은 하기 명시된 임의의 입력 표적 올리고뉴클레오티드 농도에 대하여 및 상기 명시된 임의의 하이브리드화 반응 시간에서 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%보다 더 우수하다. 예를 들면 하이브리드화 효율이 100% 미만인 일부 경우에서, 지지체 표면에 하이브리드화된 표적 핵산 서열의 생성된 표면 밀도는 표면 상의 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 프라이머 서열의 표면 밀도보다 적을 수 있다.
일부 경우에서, 통상의 하이브리드화(또는 증폭) 프로토콜 또는 최적화된 하이브리드화(또는 증폭) 프로토콜을 사용한 핵산 하이브리드화(또는 증폭) 적용예에 대한 개시된 낮은 결합 지지체의 사용은 지지체 표면과 접촉된 표적(또는 샘플) 핵산 분자의 입력 농도에 대한 감소된 요건을 초래할 수 있다. 예를 들면, 일부 경우에서, 표적(또는 샘플) 핵산 분자는 약 10 pM 내지 약 1 μM 범위의 농도에서(즉 어닐링 또는 증폭 이전에) 지지체 표면과 접촉될 수 있다. 일부 경우에서, 표적(또는 샘플) 핵산 분자는 적어도 10 pM, 적어도 20 pM, 적어도 30 pM, 적어도 40 pM, 적어도 50 pM, 적어도 100 pM, 적어도 200 pM, 적어도 300 pM, 적어도 400 pM, 적어도 500 pM, 적어도 600 pM, 적어도 700 pM, 적어도 800 pM, 적어도 900 pM, 적어도 1 nM, 적어도 10 nM, 적어도 20 nM, 적어도 30 nM, 적어도 40 nM, 적어도 50 nM, 적어도 60 nM, 적어도 70 nM, 적어도 80 nM, 적어도 90 nM, 적어도 100 nM, 적어도 200 nM, 적어도 300 nM, 적어도 400 nM, 적어도 500 nM, 적어도 600 nM, 적어도 700 nM, 적어도 800 nM, 적어도 900 nM 또는 적어도 1 μM의 농도로 투여될 수 있다. 일부 경우에서, 표적(또는 샘플) 핵산 분자는 최대 1 μM, 최대 900 nM, 최대 800 nM, 최대 700 nM, 최대 600 nM, 최대 500 nM, 최대 400 nM, 최대 300 nM, 최대 200 nM, 최대 100 nM, 최대 90 nM, 최대 80 nM, 최대 70 nM, 최대 60 nM, 최대 50 nM, 최대 40 nM, 최대 30 nM, 최대 20 nM, 최대 10 nM, 최대 1 nM, 최대 900 pM, 최대 800 pM, 최대 700 pM, 최대 600 pM, 최대 500 pM, 최대 400 pM, 최대 300 pM, 최대 200 pM, 최대 100 pM, 최대 90 pM, 최대 80 pM, 최대 70 pM, 최대 60 pM, 최대 50 pM, 최대 40 pM, 최대 30 pM, 최대 20 pM 또는 최대 10 pM의 농도에서 투여될 수 있다. 본 단락에 기재된 임의의 하한값 및 상한값은 본 개시내용에 포함되는 범위를 형성하도록 조합될 수 있으며, 예를 들면 일부 경우에서 표적(또는 샘플) 핵산 분자는 약 90 pM 내지 약 200 nM 범위의 농도에서 투여될 수 있다. 해당 기술분야의 기술자는 표적(또는 샘플) 핵산 분자가 상기 범위의 임의의 값을 갖는 농도, 예를 들면 약 855 nM에서 투여될 수 있다라는 것을 인지할 것이다.
일부 경우에서, 개시된 낮은 결합 지지체를 단독으로 또는 최적화된 하이브리드화 완충제 배합물과 조합하여 사용하는 것은 1 ㎛2당 약 0.0001 표적 올리고뉴클레오티드 분자 내지 1 ㎛2당 약 1,000,000 표적 올리고뉴클레오티드 분자 범위의 하이브리드화된 표적(또는 샘플) 올리고뉴클레오티드 분자의 표면 밀도를 초래할 수 있다(즉, 임의의 후속 고상 또는 클로날 증폭 반응을 수행하기 전). 일부 경우에서, 하이브리드화된 표적 올리고뉴클레오티드 분자의 표면 밀도는 1 ㎛2당 적어도 0.0001, 적어도 0.0005, 적어도 0.001, 적어도 0.005, 적어도 0.01, 적어도 0.05, 적어도 0.1, 적어도 0.5, 적어도 1, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 600, 적어도 700, 적어도 800, 적어도 900, 적어도 1,000, 적어도 1,500, 적어도 2,000, 적어도 2,500, 적어도 3,000, 적어도 3,500, 적어도 4,000, 적어도 4,500, 적어도 5,000, 적어도 5,500, 적어도 6,000, 적어도 6,500, 적어도 7,000, 적어도 7,500, 적어도 8,000, 적어도 8,500, 적어도 9,000, 적어도 9,500, 적어도 10,000, 적어도 15,000, 적어도 20,000, 적어도 25,000, 적어도 30,000, 적어도 35,000, 적어도 40,000, 적어도 45,000, 적어도 50,000, 적어도 55,000, 적어도 60,000, 적어도 65,000, 적어도 70,000, 적어도 75,000, 적어도 80,000, 적어도 85,000, 적어도 90,000, 적어도 95,000, 적어도 100,000, 적어도 150,000, 적어도 200,000, 적어도 250,000, 적어도 300,000, 적어도 350,000, 적어도 400,000, 적어도 450,000, 적어도 500,000, 적어도 550,000, 적어도 600,000, 적어도 650,000, 적어도 700,000, 적어도 750,000, 적어도 800,000, 적어도 850,000, 적어도 900,000, 적어도 950,000 또는 적어도 1,000,000 분자일 수 있다. 일부 경우에서, 하이브리드화된 표적 올리고뉴클레오티드 분자의 표면 밀도는 1 ㎛2당 최대 1,000,000, 최대 950,000, 최대 900,000, 최대 850,000, 최대 800,000, 최대 750,000, 최대 700,000, 최대 650,000, 최대 600,000, 최대 550,000, 최대 500,000, 최대 450,000, 최대 400,000, 최대 350,000, 최대 300,000, 최대 250,000, 최대 200,000, 최대 150,000, 최대 100,000, 최대 95,000, 최대 90,000, 최대 85,000, 최대 80,000, 최대 75,000, 최대 70,000, 최대 65,000, 최대 60,000, 최대 55,000, 최대 50,000, 최대 45,000, 최대 40,000, 최대 35,000, 최대 30,000, 최대 25,000, 최대 20,000, 최대 15,000, 최대 10,000, 최대 9,500, 최대 9,000, 최대 8,500, 최대 8,000, 최대 7,500, 최대 7,000, 최대 6,500, 최대 6,000, 최대 5,500, 최대 5,000, 최대 4,500, 최대 4,000, 최대 3,500, 최대 3,000, 최대 2,500, 최대 2,000, 최대 1,500, 최대 1,000, 최대 900, 최대 800, 최대 700, 최대 600, 최대 500, 최대 400, 최대 300, 최대 200, 최대 100, 최대 90, 최대 80, 최대 70, 최대 60, 최대 50, 최대 40, 최대 30, 최대 20, 최대 10, 최대 5, 최대 1, 최대 0.5, 최대 0.1, 최대 0.05, 최대 0.01, 최대 0.005, 최대 0.001, 최대 0.0005 또는 최대 0.0001 분자일 수 있다. 본 단락에 기재된 임의의 하한값 및 상한값은 본 개시내용에 포함되는 범위를 형성하도록 조합될 수 있으며, 예를 들면 일부 경우에서 하이브리드화된 표적 올리고뉴클레오티드 분자의 표면 밀도는 1 ㎛2당 약 3,000 분자 내지 1 ㎛2당 약 20,000 분자 범위일 수 있다. 해당 기술분야의 기술자는 하이브리드화된 표적 올리고뉴클레오티드 분자의 표면 밀도가 상기 범위의 임의의 값, 예를 들면 1 ㎛2당 약 2,700 분자를 가질 수 있다는 것을 인지할 것이다.
달리 말하자면, 일부 경우에서 개시된 낮은 결합 지지체를 단독으로 또는 최적화된 하이브리드화 완충제 배합물과 조합하여 사용하는 것은 1 ㎟당 약 100 하이브리드화된 표적 올리고뉴클레오티드 분자 내지 1 ㎟당 약 1×107 올리고뉴클레오티드 분자 또는 1 ㎟당 약 100 하이브리드화된 표적 올리고뉴클레오티드 분자 내지 1 ㎟당 약 1×1012 하이브리드화된 표적 올리고뉴클레오티드 분자 범위의 하이브리드화된 표적(또는 샘플) 올리고뉴클레오티드 분자의 표면 밀도를 초래할 수 있다(즉 임의의 후속 고상 또는 클로날 증폭 반응을 수행하기 전). 일부 경우에서, 하이브리드화된 표적 올리고뉴클레오티드 분자의 표면 밀도는 1 ㎟당 적어도 100, 적어도 500, 적어도 1,000, 적어도 4,000, 적어도 5,000, 적어도 6,000, 적어도 10,000, 적어도 15,000, 적어도 20,000, 적어도 25,000, 적어도 30,000, 적어도 35,000, 적어도 40,000, 적어도 45,000, 적어도 50,000, 적어도 55,000, 적어도 60,000, 적어도 65,000, 적어도 70,000, 적어도 75,000, 적어도 80,000, 적어도 85,000, 적어도 90,000, 적어도 95,000, 적어도 100,000, 적어도 150,000, 적어도 200,000, 적어도 250,000, 적어도 300,000, 적어도 350,000, 적어도 400,000, 적어도 450,000, 적어도 500,000, 적어도 550,000, 적어도 600,000, 적어도 650,000, 적어도 700,000, 적어도 750,000, 적어도 800,000, 적어도 850,000, 적어도 900,000, 적어도 950,000, 적어도 1,000,000, 적어도 5,000,000, 적어도 1×107, 적어도 5×107, 적어도 1×108, 적어도 5×108, 적어도 1×109, 적어도 5×109, 적어도 1×1010, 적어도 5×1010, 적어도 1×1011, 적어도 5×1011 또는 적어도 1×1012 분자일 수 있다. 일부 경우에서, 하이브리드화된 표적 올리고뉴클레오티드 분자의 표면 밀도는 1 ㎟당 최대 1×1012, 최대 5×1011, 최대 1×1011, 최대 5×1010, 최대 1×1010, 최대 5×109, 최대 1×109, 최대 5×108, 최대 1×108, 최대 5×107, 최대 1×107, 최대 5,000,000, 최대 1,000,000, 최대 950,000, 최대 900,000, 최대 850,000, 최대 800,000, 최대 750,000, 최대 700,000, 최대 650,000, 최대 600,000, 최대 550,000, 최대 500,000, 최대 450,000, 최대 400,000, 최대 350,000, 최대 300,000, 최대 250,000, 최대 200,000, 최대 150,000, 최대 100,000, 최대 95,000, 최대 90,000, 최대 85,000, 최대 80,000, 최대 75,000, 최대 70,000, 최대 65,000, 최대 60,000, 최대 55,000, 최대 50,000, 최대 45,000, 최대 40,000, 최대 35,000, 최대 30,000, 최대 25,000, 최대 20,000, 최대 15,000, 최대 10,000, 최대 5,000, 최대 1,000, 최대 500 또는 최대 100 분자일 수 있다. 본 단락에 기재된 임의의 하한값 및 상한값은 본 개시내용에 포함되는 범위를 형성하도록 조합될 수 있으며, 예를 들면 일부 경우에서 하이브리드화된 표적 올리고뉴클레오티드 분자의 표면 밀도는 1 ㎟당 약 5,000 분자 내지 1 ㎟당 약 50,000 분자 범위일 수 있다. 해당 기술분야의 기술자는 하이브리드화된 표적 올리고뉴클레오티드 분자의 표면 밀도가 상기 범위의 임의의 값, 예를 들면 1 ㎟당 약 50,700 분자를 가질 수 있다는 것을 인지할 것이다.
일부 경우에서, 낮은 결합 지지체 표면에 부착된 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 프라이머에 하이브리드화된 표적(또는 샘플) 올리고뉴클레오티드 분자(또는 핵산 분자)는 약 0.02 킬로베이스(kb) 내지 약 20 kb 또는 약 0.1 킬로베이스(kb) 내지 약 20 kb 범위의 길이를 갖는다. 일부 경우에서, 표적 올리고뉴클레오티드 분자는 적어도 0.001 kb, 적어도 0.005 kb, 적어도 0.01 kb, 적어도 0.02 kb, 적어도 0.05 kb, 적어도 0.1 kb의 길이, 적어도 0.2 kb의 길이, 적어도 0.3 kb의 길이, 적어도 0.4 kb의 길이, 적어도 0.5 kb의 길이, 적어도 0.6 kb의 길이, 적어도 0.7 kb의 길이, 적어도 0.8 kb의 길이, 적어도 0.9 kb의 길이, 적어도 1 kb의 길이, 적어도 2 kb의 길이, 적어도 3 kb의 길이, 적어도 4 kb의 길이, 적어도 5 kb의 길이, 적어도 6 kb의 길이, 적어도 7 kb의 길이, 적어도 8 kb의 길이, 적어도 9 kb의 길이, 적어도 10 kb의 길이, 적어도 15 kb의 길이, 적어도 20 kb의 길이, 적어도 30 kb의 길이 또는 적어도 40 kb의 길이 또는 본원에 기재된 범위에 걸친 임의의 중간값, 예를 들면 적어도 0.85 kb의 길이일 수 있다.
일부 경우에서, 표적(또는 샘플) 올리고뉴클레오티드 분자(또는 핵산 분자)는 규칙 발생 단량체 단위의 반복을 추가로 포함하는 단일 가닥 또는 이중 가닥, 다합체 핵산 분자를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 단일 가닥 또는 이중 가닥, 다합체 핵산 분자는 적어도 0.001 kb, 적어도 0.005 kb, 적어도 0.01 kb, 적어도 0.02 kb, 적어도 0.05 kb, 적어도 0.1 kb의 길이, 적어도 0.2 kb의 길이, 적어도 0.3 kb의 길이, 적어도 0.4 kb의 길이, 적어도 0.5 kb의 길이, 적어도 1 kb의 길이, 적어도 2 kb의 길이, 적어도 3 kb의 길이, 적어도 4 kb의 길이, 적어도 5 kb의 길이, 적어도 6 kb의 길이, 적어도 7 kb의 길이, 적어도 8 kb의 길이, 적어도 9 kb의 길이, 적어도 10 kb의 길이, 적어도 15 kb의 길이 또는 적어도 20 kb의 길이, 적어도 30 kb의 길이 또는 적어도 40 kb의 길이 또는 본원에 기재된 범위에 걸친 임의의 중간값, 예를 들면 약 2.45 kb의 길이일 수 있다.
일부 경우에서, 표적(또는 샘플) 올리고뉴클레오티드 분자(또는 핵산 분자)는 약 2 내지 약 100 복제의 규칙 반복 단량체 단위를 포함하는 단일 가닥 또는 이중 가닥 다합체 핵산 분자를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 복제의 규칙 반복 단량체 단위의 개수는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 55, 적어도 60, 적어도 65, 적어도 70, 적어도 75, 적어도 80, 적어도 85, 적어도 90, 적어도 95 및 적어도 100일 수 있다. 일부 경우에서, 복제의 규칙 반복 단량체 단위의 개수는 최대 100, 최대 95, 최대 90, 최대 85, 최대 80, 최대 75, 최대 70, 최대 65, 최대 60, 최대 55, 최대 50, 최대 45, 최대 40, 최대 35, 최대 30, 최대 25, 최대 20, 최대 15, 최대 10, 최대 5, 최대 4, 최대 3 또는 최대 2일 수 있다. 본 단락에 기재된 임의의 하한값 및 상한값은 본 개시내용에 포함되는 범위를 형성하도록 조합될 수 있으며, 예를 들면 일부 경우에서 복제의 규칙 반복 단량체 단위의 개수는 약 4 내지 약 60 범위일 수 있다. 해당 기술분야의 기술자는 복제의 규칙 반복 단량체 단위의 개수가 상기 범위의 임의의 값, 예를 들면 약 17을 가질 수 있다는 것을 인지할 것이다. 그래서, 일부 경우에서, 지지체 표면의 단위 면적당 표적 서열의 복제수에 관하여 하이브리드화 효율이 100% 미만이더라도 하이브리드화된 표적 서열의 표면 밀도는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 표면 밀도를 넘을 수 있다.
핵산 표면 증폭(NASA): 본원에서 사용된 바와 같이, 어구 "핵산 표면 증폭"(NASA)은 어구 "고상 핵산 증폭"(또는 단순히 "고상 증폭")과 번갈아 사용된다. 본 개시내용의 일부 측면에서, 핵산 증폭 배합물은 개시된 낮은 결합 지지체와 조합하여 개선된 증폭률, 증폭 특이성 및 증폭 효율을 제공하는 것으로 기재된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 특이성 증폭은 고체 지지체에 공유 또는 비공유 테더링된 템플레이트 라이브러리 올리고뉴클레오티드 가닥의 증폭을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 비특이성 증폭은 프라이머-이량체 또는 기타 비-템플레이트 핵산의 증폭을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 증폭 효율은 주어진 증폭 사이클 또는 증폭 반응 중에 성공적으로 증폭된 지지체 표면 상의 테더링된 올리고뉴클레오티드의 비율의 측정이다. 본원에 개시된 표면 상에서 수행된 핵산 증폭은 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 95% 초과, 예컨대 98% 또는 99%의 증폭 효율을 얻을 수 있다.
임의의 다양한 열적 사이클링 또는 등온 핵산 증폭 방식은 개시된 낮은 결합 지지체와 함께 사용될 수 있다. 개시된 낮은 결합 지지체와 함께 사용될 수 있는 핵산 증폭 방법의 예는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 다중 전위 증폭(MDA), 전사 매개 증폭(TMA), 핵산 서열 기반 증폭(NASBA), 가닥 전치 증폭(SDA), 실시간 SDA, 브릿지 증폭, 등온 브릿지 증폭, 롤링-써클 증폭, 원-대-원 증폭, 헬리카제 종속 증폭, 재조합효소 종속 증폭 또는 단일 가닥 결합(SSB) 단백질 종속 증폭을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
종종, 증폭률, 증폭 특이성 및 증폭 효율에서의 개선은 개시된 낮은 결합 지지체를 단독으로 또는 증폭 반응 성분의 배합물과 조합하여 사용하여 달성될 수 있다. 뉴클레오티드, 하나 이상의 폴리머라제, 헬리카제, 단일 가닥 결합 단백질 등(또는 이들의 임의의 조합)의 포함 이외에, 증폭 반응 혼합물은 완충제 유형, 완충제 pH, 유기 용매 혼합물, 완충제 점도, 세정제 및 양쪽성 성분, 이온 강도(1가 및 2가 이온 농도 둘다의 조절 포함), 산화방지제 및 환원제, 탄수화물, BSA, 폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란 술페이트, 베타인, 기타 첨가제 등의 선택을 포함하나 이에 제한되지 않는 개선된 성능을 달성하기 위한 다양한 방법으로 조절될 수 있다.
개시된 낮은 결합 지지체를 단독으로 또는 최적화된 증폭 반응 배합물과 조합하여 사용하는 것은 통상의 지지체 및 증폭 프로토콜을 사용하여 얻은 것에 비하여 증가된 증폭률을 산출할 수 있다. 일부 경우에서, 달성될 수 있는 상대적 증폭률은 상기 기재된 임의의 증폭 방법에 대한 통상의 지지체 및 증폭 프로토콜 사용의 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 12배, 적어도 14배, 적어도 16배, 적어도 18배 또는 적어도 20배일 수 있다.
일부 경우에서, 개시된 낮은 결합 지지체를 단독으로 또는 최적화된 완충제 배합물과 조합하여 사용하는 것은 임의의 상기 완료 측량의 경우 180 분, 120 분, 90 분, 60 분, 50 분, 40 분, 30 분, 20 분, 15 분, 10 분, 5 분, 3 분, 1 분, 50 초, 40 초, 30 초, 20 초 또는 10 초 미만의 총 증폭 반응 시간(즉, 증폭 반응의 90%, 95%, 98% 또는 99% 완료에 도달하는데 소요되는 시간)을 산출할 수 있다.
본원에 개시된 일부 낮은 결합 지지체 표면은 적어도 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 50:1, 75:1, 100:1 또는 100:1 초과 또는 본원의 범위에 의하여 걸쳐 있는 임의의 중간값의 형광단, 예컨대 Cy3의 특이성 결합 대 비특이성 결합의 비를 나타낸다. 본원에 개시된 일부 표면은 적어도 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 50:1, 75:1, 100:1 또는 100:1 초과 또는 본원의 범위에 의하여 걸쳐 있는 임의의 중간값의 형광단, 예컨대 Cy3에 대한 특이성 대 비특이성 형광 신호의 비를 나타낸다.
일부 경우에서, 개시된 낮은 결합 지지체를 단독으로 또는 최적화된 증폭 완충제 배합물과 조합하여 사용하는 것은 60 분, 50 분, 40 분, 30 분, 20 분 또는 10 분 이하의 더 빠른 증폭 반응 시간(즉, 증폭 반응의 90%, 95%, 98% 또는 99% 완료를 달성하는데 소요되는 시간)이 가능할 수 있다. 유사하게, 개시된 낮은 결합 지지체를 단독으로 또는 최적화된 완충제 배합물과 조합하여 사용하는 것은 증폭 반응이 일부 사례에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 사이클 이하 또는 30 사이클 이하로 완료되도록 할 수 있다.
일부 경우에서, 개시된 낮은 결합 지지체를 단독으로 또는 최적화된 증폭 반응 배합물과 조합하여 사용하는 것은 통상의 지지체 및 증폭 프로토콜을 사용하여 얻은 것에 비하여 증가된 특이성 증폭 및/또는 감소된 비특이성 증폭을 산출할 수 있다. 일부 경우에서, 달성될 수 있는 특이성 증폭-대-비특이성 증폭의 비는 적어도 4:1 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 200:1, 300:1, 400:1, 500:1, 600:1, 700:1, 800:1, 900:1 또는 1,000:1이다.
일부 경우에서, 낮은 결합 지지체를 단독으로 또는 최적화된 증폭 반응 배합물과 조합하여 사용하는 것은 통상의 지지체 및 증폭 프로토콜을 사용하여 얻은 것보다 증가된 증폭 효율을 산출할 수 있다. 일부 경우에서, 달성될 수 있는 증폭 효율은 상기 명시된 임의의 증폭 반응 시간에서 50%, 60%, 70% 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%보다 우수하다.
일부 경우에서, 낮은 결합 지지체 표면에 부착된 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 프라이머 분자에 하이브리드화된 클론 증폭된 표적(또는 샘플) 올리고뉴클레오티드 분자(또는 핵산 분자)는 약 0.02 킬로베이스(kb) 내지 약 20 kb 또는 약 0.1 킬로베이스(kb) 내지 약 20 kb의 길이의 범위일 수 있다. 일부 경우에서, 클론 증폭된 표적 올리고뉴클레오티드 분자는 적어도 0.001 kb, 적어도 0.005 kb, 적어도 0.01 kb, 적어도 0.02 kb, 적어도 0.05 kb, 적어도 0.1 kb의 길이, 적어도 0.2 kb의 길이, 적어도 0.3 kb의 길이, 적어도 0.4 kb의 길이, 적어도 0.5 kb의 길이, 적어도 1 kb의 길이, 적어도 2 kb의 길이, 적어도 3 kb의 길이, 적어도 4 kb의 길이, 적어도 5 kb의 길이, 적어도 6 kb의 길이, 적어도 7 kb의 길이, 적어도 8 kb의 길이, 적어도 9 kb의 길이, 적어도 10 kb의 길이, 적어도 15 kb의 길이 또는 적어도 20 kb의 길이 또는 본원에 기재된 범위에 걸친 임의의 중간값, 예를 들면 적어도 0.85 kb의 길이일 수 있다.
일부 경우에서, 클론 증폭된 표적(또는 샘플) 올리고뉴클레오티드 분자(또는 핵산 분자)는 규칙 발생 단량체 단위의 반복을 추가로 포함하는 단일 가닥 또는 이중 가닥, 다합체 핵산 분자를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 클론 증폭된 단일 가닥 또는 이중 가닥, 다합체 핵산 분자는 적어도 0.1 kb의 길이, 적어도 0.2 kb의 길이, 적어도 0.3 kb의 길이, 적어도 0.4 kb의 길이, 적어도 0.5 kb의 길이, 적어도 1 kb의 길이, 적어도 2 kb의 길이, 적어도 3 kb의 길이, 적어도 4 kb의 길이, 적어도 5 kb의 길이, 적어도 6 kb의 길이, 적어도 7 kb의 길이, 적어도 8 kb의 길이, 적어도 9 kb의 길이, 적어도 10 kb의 길이, 적어도 15 kb의 길이 또는 적어도 20 kb의 길이 또는 본원에 기재된 범위에 걸친 임의의 중간값, 예를 들면 약 2.45 kb의 길이일 수 있다.
일부 경우에서, 클론 증폭된 표적(또는 샘플) 올리고뉴클레오티드 분자(또는 핵산 분자)는 약 2 내지 약 100 복제의 규칙 반복 단량체 단위를 포함하는 단일 가닥 또는 이중 가닥 다합체 핵산 분자를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 복제의 규칙 반복 단량체 단위의 개수는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 55, 적어도 60, 적어도 65, 적어도 70, 적어도 75, 적어도 80, 적어도 85, 적어도 90, 적어도 95 및 적어도 100일 수 있다. 일부 경우에서, 복제의 규칙 반복 단량체 단위의 개수는 최대 100, 최대 95, 최대 90, 최대 85, 최대 80, 최대 75, 최대 70, 최대 65, 최대 60, 최대 55, 최대 50, 최대 45, 최대 40, 최대 35, 최대 30, 최대 25, 최대 20, 최대 15, 최대 10, 최대 5, 최대 4, 최대 3 또는 최대 2일 수 있다. 본 단락에 기재된 임의의 하한값 및 상한값은 본 개시내용에 포함되는 범위를 형성하도록 조합될 수 있으며, 예를 들면 일부 경우에서 복제의 규칙 반복 단량체 단위의 개수는 약 4 내지 약 60 범위일 수 있다. 해당 기술분야의 기술자는 복제의 규칙 반복 단량체 단위의 개수가 상기 범위의 임의 값, 예를 들면 약 12를 가질 수 있다는 것을 인지할 것이다. 그래서, 일부 경우에서, 지지체 표면의 단위 면적당 표적 서열의 복제의 개수에 관하여 클론 증폭된 표적 서열의 표면 밀도는 하이브리드화 및/또는 증폭 효율이 100% 미만이더라도 올리고뉴클레오티드 프라이머의 표면 밀도를 넘을 수 있다.
일부 경우에서, 개시된 낮은 결합 지지체를 단독으로 또는 최적화된 증폭 반응 배합물과 조합하여 사용하는 것은 통상의 지지체 및 증폭 프로토콜을 사용하여 얻은 것에 비하여 증가된 클로날 복제수를 산출할 수 있다. 예를 들면 클론 증폭된 표적(또는 샘플) 올리고뉴클레오티드 분자가 단량체 표적 서열의 농축된, 다합체 반복을 포함하는 일부 경우에서, 클로날 복제수는 통상의 지지체 및 증폭 프로토콜을 사용하여 얻은 것에 비하여 실질적으로 더 작을 수 있다. 그래서, 일부 경우에서, 클로날 복제수는 증폭된 콜로니당 약 1 분자 내지 약 100,000 분자(예, 표적 서열 분자) 범위일 수 있다. 일부 경우에서, 클로날 복제수는 증폭된 콜로니당 적어도 1, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 500, 적어도 1,000, 적어도 2,000, 적어도 3,000, 적어도 4,000, 적어도 5,000, 적어도 6,000, 적어도 7,000, 적어도 8,000, 적어도 9,000, 적어도 10,000, 적어도 15,000, 적어도 20,000, 적어도 25,000, 적어도 30,000, 적어도 35,000, 적어도 40,000, 적어도 45,000, 적어도 50,000, 적어도 55,000, 적어도 60,000, 적어도 65,000, 적어도 70,000, 적어도 75,000, 적어도 80,000, 적어도 85,000, 적어도 90,000, 적어도 95,000 또는 적어도 100,000 분자일 수 있다. 일부 경우에서, 클로날 복제수는 증폭된 콜로니당 최대 100,000, 최대 95,000, 최대 90,000, 최대 85,000, 최대 80,000, 최대 75,000, 최대 70,000, 최대 65,000, 최대 60,000, 최대 55,000, 최대 50,000, 최대 45,000, 최대 40,000, 최대 35,000, 최대 30,000, 최대 25,000, 최대 20,000, 최대 15,000, 최대 10,000, 최대 9,000, 최대 8,000, 최대 7,000, 최대 6,000, 최대 5,000, 최대 4,000, 최대 3,000, 최대 2,000, 최대 1,000, 최대 500, 최대 100, 최대 50, 최대 10, 최대 5 또는 최대 1 분자일 수 있다. 본 단락에 기재된 임의의 하한값 및 상한값은 본 개시내용에 포함되는 범위를 형성하도록 조합될 수 있으며, 예를 들면 일부 경우에서 클로날 복제수는 약 2,000 분자 내지 약 9,000 분자 범위일 수 있다. 해당 기술분야의 기술자는 클로날 복제수가 상기 범위의 임의의 값, 예를 들면 일부 경우에서 약 2,220 분자 또는 기타 경우에서 약 2 분자를 가질 수 있다는 것을 인지할 것이다.
상기 언급한 바와 같이, 일부 경우에서 증폭된 표적(또는 샘플) 올리고뉴클레오티드 분자(또는 핵산 분자)는 단량체 표적 서열의 농축된 다합체 반복을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 증폭된 표적(또는 샘플) 올리고뉴클레오티드 분자(또는 핵산 분자)는 각각 단일의 단량체 표적 서열을 포함하는 복수의 분자를 포함할 수 있다. 그래서, 개시된 낮은 결합 지지체를 단독으로 또는 최적화된 증폭 반응 배합물과 조합하여 사용하는 것은 1 ㎟당 약 100 표적 서열 복제 내지 1 ㎟당 약 1×1012 표적 서열 복제 범위인 표적 서열 복제의 표면 밀도를 초래할 수 있다. 일부 경우에서, 표적 서열 복제의 표면 밀도는 1 ㎟당 적어도 100, 적어도 500, 적어도 1,000, 적어도 5,000, 적어도 10,000, 적어도 15,000, 적어도 20,000, 적어도 25,000, 적어도 30,000, 적어도 35,000, 적어도 40,000, 적어도 45,000, 적어도 50,000, 적어도 55,000, 적어도 60,000, 적어도 65,000, 적어도 70,000, 적어도 75,000, 적어도 80,000, 적어도 85,000, 적어도 90,000, 적어도 95,000, 적어도 100,000, 적어도 150,000, 적어도 200,000, 적어도 250,000, 적어도 300,000, 적어도 350,000, 적어도 400,000, 적어도 450,000, 적어도 500,000, 적어도 550,000, 적어도 600,000, 적어도 650,000, 적어도 700,000, 적어도 750,000, 적어도 800,000, 적어도 850,000, 적어도 900,000, 적어도 950,000, 적어도 1,000,000, 적어도 5,000,000, 적어도 1×107, 적어도 5×107, 적어도 1×108, 적어도 5×108, 적어도 1×109, 적어도 5×109, 적어도 1×1010, 적어도 5×1010, 적어도 1×1011, 적어도 5×1011 또는 적어도 1×1012의 클로날 증폭된 표적 서열 분자일 수 있다. 일부 경우에서, 표적 서열 복제의 표면 밀도는 1 ㎟당 최대 1×1012, 최대 5×1011, 최대 1×1011, 최대 5×1010, 최대 1×1010, 최대 5×109, 최대 1×109, 최대 5×108, 최대 1×108, 최대 5×107, 최대 1×107, 최대 5,000,000, 최대 1,000,000, 최대 950,000, 최대 900,000, 최대 850,000, 최대 800,000, 최대 750,000, 최대 700,000, 최대 650,000, 최대 600,000, 최대 550,000, 최대 500,000, 최대 450,000, 최대 400,000, 최대 350,000, 최대 300,000, 최대 250,000, 최대 200,000, 최대 150,000, 최대 100,000, 최대 95,000, 최대 90,000, 최대 85,000, 최대 80,000, 최대 75,000, 최대 70,000, 최대 65,000, 최대 60,000, 최대 55,000, 최대 50,000, 최대 45,000, 최대 40,000, 최대 35,000, 최대 30,000, 최대 25,000, 최대 20,000, 최대 15,000, 최대 10,000, 최대 5,000, 최대 1,000, 최대 500 또는 최대 100 표적 서열 복제일 수 있다. 본 단락에 기재된 임의의 하한값 및 상한값은 본 개시내용에 포함되는 범위를 형성하도록 조합될 수 있으며, 예를 들면 일부 경우에서 표적 서열 복제의 표면 밀도는 1 ㎟당 약 1,000 표적 서열 복제 내지 1 ㎟당 약 65,000 표적 서열 복제 범위일 수 있다. 해당 기술분야의 기술자는 표적 서열 복제의 표면 밀도가 상기 범위의 임의의 값, 예를 들면 1 ㎟당 약 49,600 표적 서열 복제를 가질 수 있다는 것을 인지할 것이다.
일부 경우에서, 개시된 낮은 결합 지지체를 단독으로 또는 최적화된 증폭 완충제 배합물과 조합하여 사용하는 것은 1 ㎟당 약 100 분자 내지 1 ㎟당 약 1×1012 콜로니 범위의 클론 증폭된 표적(또는 샘플) 올리고뉴클레오티드 분자(또는 클러스터)의 표면 밀도를 초래할 수 있다. 일부 경우에서, 클론 증폭된 분자의 표면 밀도는 1 ㎟당 적어도 100, 적어도 500, 적어도 1,000, 적어도 5,000, 적어도 10,000, 적어도 15,000, 적어도 20,000, 적어도 25,000, 적어도 30,000, 적어도 35,000, 적어도 40,000, 적어도 45,000, 적어도 50,000, 적어도 55,000, 적어도 60,000, 적어도 65,000, 적어도 70,000, 적어도 75,000, 적어도 80,000, 적어도 85,000, 적어도 90,000, 적어도 95,000, 적어도 100,000, 적어도 150,000, 적어도 200,000, 적어도 250,000, 적어도 300,000, 적어도 350,000, 적어도 400,000, 적어도 450,000, 적어도 500,000, 적어도 550,000, 적어도 600,000, 적어도 650,000, 적어도 700,000, 적어도 750,000, 적어도 800,000, 적어도 850,000, 적어도 900,000, 적어도 950,000, 적어도 1,000,000, 적어도 5,000,000, 적어도 1×107, 적어도 5×107, 적어도 1×108, 적어도 5×108, 적어도 1×109, 적어도 5×109, 적어도 1×1010, 적어도 5×1010, 적어도 1×1011, 적어도 5×1011 또는 적어도 1×1012 분자일 수 있다. 일부 경우에서, 클론 증폭된 분자의 표면 밀도는 1 ㎟당 최대 1×1012, 최대 5×1011, 최대 1×1011, 최대 5×1010, 최대 1×1010, 최대 5×109, 최대 1×109, 최대 5×108, 최대 1×108, 최대 5×107, 최대 1×107, 최대 5,000,000, 최대 1,000,000, 최대 950,000, 최대 900,000, 최대 850,000, 최대 800,000, 최대 750,000, 최대 700,000, 최대 650,000, 최대 600,000, 최대 550,000, 최대 500,000, 최대 450,000, 최대 400,000, 최대 350,000, 최대 300,000, 최대 250,000, 최대 200,000, 최대 150,000, 최대 100,000, 최대 95,000, 최대 90,000, 최대 85,000, 최대 80,000, 최대 75,000, 최대 70,000, 최대 65,000, 최대 60,000, 최대 55,000, 최대 50,000, 최대 45,000, 최대 40,000, 최대 35,000, 최대 30,000, 최대 25,000, 최대 20,000, 최대 15,000, 최대 10,000, 최대 5,000, 최대 1,000, 최대 500 또는 최대 100 분자일 수 있다. 본 단락에 기재된 임의의 하한값 및 상한값은 본 개시내용에 포함되는 범위를 형성하도록 조합될 수 있으며, 예를 들면 일부 경우에서 클론 증폭된 분자의 표면 밀도는 1 ㎟당 약 5,000 분자 내지 1 ㎟당 약 50,000 분자 범위일 수 있다. 해당 기술분야의 기술자는 클론 증폭된 콜로니의 표면 밀도가 상기 범위의 임의의 값, 예를 들면 1 ㎟당 약 48,800 분자를 가질 수 있다는 것을 인지할 것이다.
일부 경우에서, 개시된 낮은 결합 지지체를 단독으로 또는 최적화된 증폭 완충제 배합물과 조합하여 사용하는 것은 1 ㎟당 약 100 분자 내지 1 ㎟당 약 1×109 콜로니 범위의 클론 증폭된 표적(또는 샘플) 올리고뉴클레오티드 분자(또는 클러스터)의 표면 밀도를 초래할 수 있다. 일부 경우에서, 클론 증폭된 분자의 표면 밀도는 1 ㎟당 적어도 100, 적어도 500, 적어도 1,000, 적어도 5,000, 적어도 10,000, 적어도 15,000, 적어도 20,000, 적어도 25,000, 적어도 30,000, 적어도 35,000, 적어도 40,000, 적어도 45,000, 적어도 50,000, 적어도 55,000, 적어도 60,000, 적어도 65,000, 적어도 70,000, 적어도 75,000, 적어도 80,000, 적어도 85,000, 적어도 90,000, 적어도 95,000, 적어도 100,000, 적어도 150,000, 적어도 200,000, 적어도 250,000, 적어도 300,000, 적어도 350,000, 적어도 400,000, 적어도 450,000, 적어도 500,000, 적어도 550,000, 적어도 600,000, 적어도 650,000, 적어도 700,000, 적어도 750,000, 적어도 800,000, 적어도 850,000, 적어도 900,000, 적어도 950,000, 적어도 1,000,000, 적어도 5,000,000, 적어도 1×107, 적어도 5×107, 적어도 1×108, 적어도 5×108, 적어도 1×109의 분자일 수 있다. 일부 경우에서, 클론 증폭된 분자의 표면 밀도는 1 ㎟당 1×109, 최대 5×108, 최대 1×108, 최대 5×107, 최대 1×107, 최대 5,000,000, 최대 1,000,000, 최대 950,000, 최대 900,000, 최대 850,000, 최대 800,000, 최대 750,000, 최대 700,000, 최대 650,000, 최대 600,000, 최대 550,000, 최대 500,000, 최대 450,000, 최대 400,000, 최대 350,000, 최대 300,000, 최대 250,000, 최대 200,000, 최대 150,000, 최대 100,000, 최대 95,000, 최대 90,000, 최대 85,000, 최대 80,000, 최대 75,000, 최대 70,000, 최대 65,000, 최대 60,000, 최대 55,000, 최대 50,000, 최대 45,000, 최대 40,000, 최대 35,000, 최대 30,000, 최대 25,000, 최대 20,000, 최대 15,000, 최대 10,000, 최대 5,000, 최대 1,000, 최대 500 또는 최대 100 분자일 수 있다. 본 단락에 기재된 임의의 하한값 및 상한값은 본 개시내용에 포함되는 범위를 형성하도록 조합될 수 있으며, 예를 들면 일부 경우에서 클론 증폭된 분자의 표면 밀도는 1 ㎟당 약 5,000 분자 내지 1 ㎟당 약 50,000 분자 범위일 수 있다. 해당 기술분야의 기술자는 클론 증폭된 콜로니의 표면 밀도가 상기 범위의 임의의 값, 예를 들면 1 ㎟당 약 48,800 분자를 가질 수 있다는 것을 인지할 것이다.
일부 경우에서, 개시된 낮은 결합 지지체를 단독으로 또는 최적화된 증폭 완충제 배합물과 조합하여 사용하는 것은 1 ㎟당 약 100 콜로니 내지 1 ㎟당 약 1×109 콜로니 범위의 클론 증폭된 표적(또는 샘플) 올리고뉴클레오티드 콜로니(또는 클러스터)의 표면 밀도를 초래할 수 있다. 일부 경우에서, 클론 증폭된 콜로니의 표면 밀도는 1 ㎟당 적어도 100, 적어도 500, 적어도 1,000, 적어도 5,000, 적어도 10,000, 적어도 15,000, 적어도 20,000, 적어도 25,000, 적어도 30,000, 적어도 35,000, 적어도 40,000, 적어도 45,000, 적어도 50,000, 적어도 55,000, 적어도 60,000, 적어도 65,000, 적어도 70,000, 적어도 75,000, 적어도 80,000, 적어도 85,000, 적어도 90,000, 적어도 95,000, 적어도 100,000, 적어도 150,000, 적어도 200,000, 적어도 250,000, 적어도 300,000, 적어도 350,000, 적어도 400,000, 적어도 450,000, 적어도 500,000, 적어도 550,000, 적어도 600,000, 적어도 650,000, 적어도 700,000, 적어도 750,000, 적어도 800,000, 적어도 850,000, 적어도 900,000, 적어도 950,000, 적어도 1,000,000, 적어도 5,000,000, 적어도 1×107, 적어도 5×107, 적어도 1×108, 적어도 5×108,적어도 1×109, 적어도 5×109, 적어도 1×1010, 적어도 5×1010, 적어도 1×1011, 적어도 5×1011 또는 적어도 1×1012 콜로니일 수 있다. 일부 경우에서, 클론 증폭된 콜로니의 표면 밀도는 1 ㎟당 최대 1×1012, 최대 5×1011, 최대 1×1011, 최대 5×1010, 최대 1×1010, 최대 5×109, 최대 1×109, 최대 5×108, 최대 1×108, 최대 5×107, 최대 1×107, 최대 5,000,000, 최대 1,000,000, 최대 950,000, 최대 900,000, 최대 850,000, 최대 800,000, 최대 750,000, 최대 700,000, 최대 650,000, 최대 600,000, 최대 550,000, 최대 500,000, 최대 450,000, 최대 400,000, 최대 350,000, 최대 300,000, 최대 250,000, 최대 200,000, 최대 150,000, 최대 100,000, 최대 95,000, 최대 90,000, 최대 85,000, 최대 80,000, 최대 75,000, 최대 70,000, 최대 65,000, 최대 60,000, 최대 55,000, 최대 50,000, 최대 45,000, 최대 40,000, 최대 35,000, 최대 30,000, 최대 25,000, 최대 20,000, 최대 15,000, 최대 10,000, 최대 5,000, 최대 1,000, 최대 500 또는 최대 100 콜로니일 수 있다. 본 단락에 기재된 임의의 하한값 및 상한값은 본 개시내용에 포함되는 범위를 형성하도록 조합될 수 있으며, 예를 들면 일부 경우에서 클론 증폭된 콜로니의 표면 밀도는 1 ㎟당 약 5,000 콜로니 내지 1 ㎟당 약 50,000 콜로니 범위일 수 있다. 해당 기술분야의 기술자는 클론 증폭된 콜로니의 표면 밀도가 상기 범위의 임의의 값, 예를 들면 1 ㎟당 약 48,800 콜로니를 가질 수 있다는 것을 인지할 것이다.
일부 사례에서 개시된 낮은 결합 지지체를 단독으로 또는 최적화된 증폭 반응 배합물과 조합하여 사용하는 것은 50% 이하, 예컨대 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 5% 또는 5% 미만의 변동 계수를 갖는 증폭된 및 표지된 핵산 집단으로부터의 신호(예, 형광 신호)를 산출할 수 있다.
유사하게, 일부 사례에서 개시된 낮은 결합 지지체와 조합된 최적화된 증폭 반응 배합물의 사용은 50% 이하, 예컨대 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 10% 미만의 변동 계수를 갖는 핵산 집단으로부터의 신호를 산출한다.
일부 사례에서, 본원에 개시된 바와 같은 지지체 표면 및 방법은 증폭을 증가된 신장 온도, 예컨대 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 40℃ 또는 더 높거나 또는 예를 들면 약 21℃ 또는 23℃에서 허용한다.
일부 사례에서, 본원에 개시된 바와 같은 지지체 표면 및 방법의 사용은 단순화된 증폭 반응을 허용한다. 예를 들면, 일부 사례에서 증폭 반응은 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 별개의 시약을 사용하여 실행된다.
일부 사례에서, 본원에 개시된 바와 같은 지지체 표면 및 방법의 사용은 증폭 중에 단순화된 온도 프로파일을 사용할 수 있으며, 그리하여 반응은 15℃, 20℃, 25℃, 30℃ 또는 40℃의 저온으로부터 40℃, 45℃, 50℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 80℃ 또는 80℃ 초과의 고온, 예를 들면 20℃ 내지 65℃ 범위내의 온도에서 실행된다.
증폭 반응은 또한 소량의 템플레이트(예, 표적 또는 샘플 분자)가 표면 상의 식별 가능한 신호, 예컨대 1 pM, 2 pM, 5 pM, 10 pM, 15 pM, 20 pM, 30 pM, 40 pM, 50 pM, 60 pM, 70 pM, 80 pM, 90 pM, 100 pM, 200 pM, 300 pM, 400 pM, 500 pM, 600 pM, 700 pM, 800 pM, 900 pM, 1,000 pM, 2,000 pM, 3,000 pM, 4,000 pM, 5,000 pM, 6,000 pM, 7,000 pM, 8,000 pM, 9,000 pM, 10,000 pM 또는 10,000 pM 초과의 샘플, 예컨대 500 nM를 초래하기에 충분하도록 개선된다. 예시의 실시양태에서, 약 100 pM의 투입은 신뢰성 있는 신호 측정을 위한 신호를 생성하기에 충분하다.
지지체 표면의 형광 영상화: 개시된 고상 핵산 증폭 반응 배합물 및 낮은 결합 지지체는 임의의 다양한 핵산 분석 적용예, 예를 들면 핵산 염기 식별, 핵산 염기 분류, 핵산 염기 해독, 핵산 검출 적용예, 핵산 시퀀싱 적용예 및 핵산 기반(유전자 및 게놈) 진단 적용예에 사용될 수 있다. 다수의 상기 적용예에서, 형광 영상화 기술은 낮은 결합 지지체 상에 수행된 하이브리드화, 증폭 및/또는 시퀀싱 반응을 모니터링하는데 사용될 수 있다.
형광 영상화는 해당 기술분야의 기술자에게 공지된 임의의 다양한 형광단, 형광 영상화 기술 및 형광 영상화 기기를 사용하여 수행될 수 있다. 사용될 수 있는 적절한 형광 염료(예, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 또는 단백질로의 콘쥬게이션에 의한)의 예는 플루오레세인, 로다민, 쿠마린, 시아닌 및, 시아닌 유도체인 시아닌(Cyanine) 염료-3(Cy3), 시아닌 염료-5(Cy5), 시아닌 염료-7(Cy7) 등을 포함한 그의 유도체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 사용할 수 있는 형광 영상화 기술의 예는 광역 형광 현미경 영상화, 형광 공초점 영상화, 2-광자 형광 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 사용할 수 있는 형광 영상화 기기의 예는 화상 센서 또는 카메라가 장착된 형광 현미경, 광역 형광 현미경, 공초점 형광 현미경, 2-광자 형광 현미경 또는, 광원, 렌즈, 미러, 프리즘, 다이크로익 반사기, 어퍼쳐 및 화상 센서 또는 카메라 등의 적절한 선택을 포함하는 주문형 기기를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 그 표면 상에서 하이브리드화된 표적 핵산 서열의 개시된 낮은 결합 지지체 표면 및 클론 증폭된 콜로니(또는 클러스터)의 화상을 획득하기 위하여 장착된 형광 현미경의 비제한적인 예는 20x, 0.75 NA, 532 ㎚ 광원, 밴드패스 및 532 ㎚ 롱 패스 여기를 위하여 최적화된 다이크로익 미러 필터 세트 및 Cy3 형광 방출 필터, 섬록 532 ㎚ 다이크로익 반사기 및 카메라(앤도 sCMOS, Zyla 4.2)가 장착된 올림푸스 IX83 역전 형광 현미경이며, 여기서 신호 포화를 방지하기 위하여 여기 광 강도를 조절한다. 종종, 화상을 획득하면서 지지체 표면을 완충제(예, 25 mM ACES, pH 7.4 완충제) 중에 침지시킬 수 있다.
일부 경우에서, 개시된 반응 배합물 및 낮은 결합 지지체를 사용한 핵산 하이브리드화 및/또는 증폭 반응의 성능은 형광 영상화 기술을 사용하여 평가할 수 있으며, 여기서 화상의 콘트라스트 대 노이즈비(CNR)는 지지체 상의 증폭 특이성 및 비특이성 결합을 평가하기 위한 핵심 측량을 제공한다. CNR은 CNR=(신호-배경)/노이즈로서 통상적으로 정의된다. 배경 조건은 명시된 관심 영역(ROI)에서 특정한 특징을 둘러싼 계간 구역(회절 한계 지점, DLS)에 대하여 측정된 신호로 통상적으로 간주된다. 신호-대-노이즈비(SNR)는 종종 전체 신호 품질의 척도인 것으로 간주되는 한편, 하기 실시예에 제시된 바와 같이 개선된 CNR은 신속한 화상 캡쳐를 필요로 하는 적용예(예, 사이클 시간이 최소화되어야 하는 시퀀싱 적용예)에서 신호 품질에 대한 척도로서 SNR에 비하여 상당한 잇점을 제공할 수 있는 것으로 밝혀질 수 있다. 높은 CNR에서 정확한 식별(및 시퀀싱 적용예의 경우 정확한 염기 해독)에 도달하는데 소요되는 영상화 시간은 CNR에서 적절한 개선을 갖더라도 크게 감소될 수 있다.
대부분의 어셈블리 기반 시퀀싱 접근법에서, 배경 조건은 통상적으로 '계간' 구역과 관련된 신호로서 측정된다. "계간" 배경(B계간) 이외에, "계내" 배경(B계내)은 증폭된 DNA 콜로니가 차지하는 구역 내에 존재한다. 상기 2종의 배경 신호의 조합은 달성 가능한 CNR을 지시하며, 그 후 광학 기기 요건, 아키텍쳐 비용, 시약 비용, 실시간, 비용/게놈에 직접적으로 영향을 미치며, 궁극적으로 시클릭 어레이 기반 시퀀싱 적용예에 대한 정확도 및 데이타 품질에 영향을 미친다. B계간 배경 신호는 다양한 소스로부터 발생하며; 수개의 예는 소모 가능한 플로우 셀로부터의 자동 형광, ROI로부터의 신호를 모호하게 할 수 있는 의사 형광 신호를 산출하는 검출 분자의 비특이성 흡착, 비특이성 DNA 증폭 생성물(예, 프라이머 이량체로부터 발생하는 것)의 존재를 포함한다. 통상의 차세대 시퀀싱(NGS) 적용예에서, 현재의 시야각(FOV)에서의 상기 배경 신호를 시간에 대하여 평균을 구하고, 차감하였다. 개별적인 DNA 콜로니로부터 발생하는 신호(즉 FOV에서의 (S)-B계간)는 분류될 수 있는 식별 가능한 특징을 산출한다. 일부 경우에서, 계내 배경(B계내)은 관심 표적에 대하여 특이적이지는 않지만, 동일한 ROI에서 존재하여 평균을 구하고, 차감하기 훨씬 더 어렵게 하는 교란 형광 신호에 기여할 수 있다
하기 실시예에서 예시되는 바와 같이, 본 개시내용의 낮은 결합 기재 상에서의 핵산 증폭의 실행은 비특이성 결합을 감소시켜 B계간 배경 신호를 감소시킬 수 있으며, 특이성 핵산 증폭에서의 개선을 초래할 수 있으며, 계간 및 계내 구역 둘다로부터 발생하는 배경 신호에 영향을 미칠 수 있는 비특이성 증폭에서의 감소를 초래할 수 있다. 일부 경우에서, 개시된 하이브리드화 및/또는 증폭 반응 배합물과 조합하여 임의로 사용되는 개시된 낮은 결합 지지체 표면은 통상의 지지체 및 하이브리드화, 증폭, 및/또는 시퀀싱 프로토콜을 사용하여 달성될 수 있는 것보다 2, 5, 10, 100 또는 1,000배 정도로 CNR에서의 개선을 초래할 수 있다. 판독 또는 검출 방식으로서 형광 영상화를 사용하는 문맥에서 기재되기는 하였으나, 광학 및 비광학 검출 방식 둘다를 포함한 기타 검출 방식에 대하여 개시된 낮은 결합 지지체 및 핵산 하이브리드화 및 증폭 배합물의 사용에도 동일한 원리를 적용한다.
개시된 하이브리드화 및/또는 증폭 프로토콜과 조합하여 임의로 사용된 개시된 낮은 결합 지지체는 (i) 단백질 및 기타 반응 성분의 무시할 정도의 비특이성 결합을 나타내며(그리하여 기재 배경을 최소로 함), (ii) 무시할 정도의 비특이성 핵산 증폭 생성물 및 (iii) 조정 가능한 핵산 증폭 반응을 제공하는 고상 반응을 산출한다. 본원에는 핵산 하이브리드화, 증폭 및 시퀀싱 검정의 문맥에서 주로 기재되기는 하였으나, 해당 기술분야의 기술자는 개시된 낮은 결합 지지체는 샌드위치 면역검정, 효소 관련 면역흡착 검정(ELISA) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 생물학적 검정 포맷으로 사용될 수 있는 것으로 이해할 것이다.
플라스틱 표면: 기재 또는 지지체 구조가 제조될 수 있는 물질의 예는 유리, 용융 실리카, 실리콘, 중합체(예, 폴리스티렌(PS), 매크로다공성 폴리스티렌(MPPS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리카르보네이트(PC), 폴리프로필렌(PP), 폴리에틸렌(PE), 고 밀도 폴리에틸렌(HDPE), 시클릭 올레핀 중합체(COP), 시클릭 올레핀 공중합체(COC), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 유리 및 플라스틱 기재 둘다의 다양한 조성도 고려한다.
본원에 개시된 목적을 위한 표면의 변형은 아민을 포함한 다수의 화학적 기(-R)에 대하여 표면이 반응성을 갖게 하는 것을 포함한다. 적절한 기재 상에서 제조시, 상기 반응성 표면은 실온에서 예를 들면 적어도 3 개월 이상 동안 장시간 보관할 수 있다. 상기 표면은 본원에 기재된 바와 같이 핵산의 표면 증폭을 위하여 R-PEG 및 R-프라이머 올리고머로 추가로 그래프팅할 수 있다. 플래스틱 표면, 예컨대 시클릭 올레핀 중합체(COP)는 해당 기술분야에 공지된 임의의 다수의 방법을 사용하여 변형될 수 있다. 예를 들면, 이들은 Ti:사파이어 레이저 절제, UV 매개된 에틸렌 글리콜 메타크릴레이트 포토그래프팅, 플라즈마 처리 또는 기계적 진탕(예, 샌드 블래스팅 또는 연마 등)으로 처리하여 다수의 화학적 기, 예컨대 아민에 대하여 수개월 동안 반응성을 유지할 수 있는 친수성 표면을 생성할 수 있다. 상기 기는 생화학적 활성을 잃지 않으면서 부동태화 중합체, 예컨대 PEG 또는 생체분자. 예컨대 DNA 또는 단백질의 콘쥬게이션을 허용할 수 있다. 예를 들면, DNA 프라이머 올리고머의 부착은 부동태화된 플라스틱 표면 상에서의 DNA 증폭을 허용하면서 단백질, 형광단 분자 또는 기타 소수성 분자의 비특이성 흡착을 최소화한다.
추가적으로, 표면 변형은 예를 들면 레이저 프린팅 또는 UV 차폐와 조합하여 패턴형성된 표면을 생성할 수 있다. 이는 DNA 올리고머, 단백질 또는 기타 모이어티의 패턴형성된 부착을 허용하여 표면 기반 효소 활성, 결합, 검출 또는 가공을 제공한다. 예를 들면, DNA 올리고머는 패턴형성된 특징 내에서만 DNA를 증폭시키거나 또는 증폭된 장 DNA 콘카테머를 패턴형성 방식으로 캡쳐하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용액 기반 기재와 반응할 수 있는 패턴형성된 부위에서 효소 아일랜드가 생성될 수 있다. 플라스틱 표면은 특히 상기 가공 방식으로 처리할 수 있으므로, 본원에서 고려되는 바와 같은 일부 실시양태에서 플라스틱 표면은 특히 이로운 것으로 인식될 수 있다.
더욱이, 플라스틱은 사출 성형, 엠보싱 또는 3D 프린팅되어 유리 기재보다는 훨씬 더 쉽게 미세유체 디바이스를 포함한 임의의 형상을 형성할 수 있으며, 그리하여 복수의 배열로 생물학적 샘플, 예를 들면 바이오마커 검출 또는 DNA 시퀀싱을 위한 미세유체 칩을 생성하는 샘플의 결합 및 분석을 위한 표면을 생성하는데 사용될 수 있다.
변형된 플라스틱 표면 상에서의 특이성 국소화된 DNA 증폭이 생성될 수 있으며, 형광 표지로 프로브 처리시 극도로 높은 콘트라스트 대 노이즈비 및 매우 낮은 배경을 갖는 지점을 생성할 수 있다.
아민-프라이머 및 아민-PEG을 갖는 친수화된 및 아민 반응성 시클릭 올레핀 중합체 표면이 생성될 수 있으며, 이는 롤링 사이클 증폭을 지지한다. 형광단 표지된 프라이머로 프로브 처리시 또는 표지된 dNTP를 폴리머라제에 의하여 하이브리드화된 프라이머에 첨가시 극도로 낮은 배경으로 100 초과의 신호 대 노이즈비를 나타내는 DNA 앰플리콘의 밝은 지점이 관찰되었으며, 이는 높은 정확성 검출 시스템, 예컨대 형광 기반 DNA 서열의 특징이 되는 높은 특이성 증폭 및 초저 수준의 단백질 및 소수성 형광단 결합을 나타낸다.
올리고뉴클레오티드 프라이머 및 어댑터 서열: 일반적으로, 모세관 또는 채널 루멘 표면에 적용된 하나 이상의 표면 변형 또는 중합체 층 중 적어도 1개의 층은 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 프라이머 서열을 공유 또는 비공유 부착시키기 위한 작용기를 포함할 수 있거나 또는 지지체 표면에 그래프팅되거나 또는 표면 상에 증착되는 시점에서 적어도 1개의 층은 공유 또는 비공유 부착된 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 프라이머 서열을 이미 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 모세관 또는 미세유체 채널은 원핵 생물의 게놈을 시퀀싱하도록 지시한 올리고뉴클레오티드 집단을 포함한다. 일부 측면에서, 모세관 또는 미세유체 채널은 전사체를 시퀀싱하도록 지시한 올리고뉴클레오티드 집단을 포함한다.
플로우 셀 디바이스 또는 시스템의 중앙 영역은 이에 테더링된 적어도 1개의 올리고뉴클레오티드를 갖는 표면을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표면은 미세유체 채널 또는 모세관의 내부 표면이 될 수 있다. 일부 측면에서, 표면은 국소적으로 평면인 표면이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 표면에 직접 테더링된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 중간 분자를 통하여 표면에 테더링된다.
중앙 영역의 내부 표면에 테더링된 올리고뉴클레오티드는 상이한 표적에 결합된 분절을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 올리고뉴클레오티드는 진핵 생물의 게놈 핵산 분절에 특이적으로 하이브리드화하는 분절을 나타낸다. 일부 경우에서, 올리고뉴클레오티드는 원핵 생물의 게놈 핵산 분절에 특이적으로 하이브리드화하는 분절을 나타낸다. 일부 경우에서, 올리고뉴클레오티드는 바이러스 핵산 분절에 특이적으로 하이브리드화하는 분절을 나타낸다. 일부 경우에서, 올리고뉴클레오티드는 전사체 핵산 분절에 특이적으로 하이브리드화하는 분절을 나타낸다.
중앙 영역이 그에 테더링된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 갖는 표면을 포함할 경우, 중앙 영역의 내부 부피는 수행된 시퀀싱의 유형에 기초하여 조절될 수 있다. 일부 실시양태에서, 중앙 영역은 진핵 생물의 게놈을 시퀀싱하기에 적절한 내부 부피를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중앙 영역은 원핵 생물의 게놈을 시퀀싱하기에 적절한 내부 부피를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중앙 영역은 전사체를 시퀀싱하기에 적절한 내부 부피를 포함한다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 중앙 영역의 내부 부피는 0.05 ㎕ 미만, 0.05 ㎕ 내지 0.1 ㎕, 0.05 ㎕ 내지 0.2 ㎕, 0.05 ㎕ 내지 0.5 ㎕, 0.05 ㎕ 내지 0.8 ㎕, 0.05 ㎕ 내지 1 ㎕, 0.05 ㎕ 내지 1.2 ㎕, 0.05 ㎕ 내지 1.5 ㎕, 0.1 ㎕ 내지 1.5 ㎕, 0.2 ㎕ 내지 1.5 ㎕, 0.5 ㎕ 내지 1.5 ㎕, 0.8 ㎕ 내지 1.5 ㎕, 1 ㎕ 내지 1.5 ㎕, 1.2 ㎕ 내지 1.5 ㎕ 또는 1.5 ㎕ 초과 또는 상기 중 임의의 2개에 의하여 정의된 범위의 부피를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 중앙 영역의 내부 부피는 0.5 ㎕ 미만, 0.5 ㎕ 내지 1 ㎕, 0.5 ㎕ 내지 2 ㎕, 0.5 ㎕ 내지 5 ㎕, 0.5 ㎕ 내지 8 ㎕, 0.5 ㎕ 내지 10 ㎕, 0.5 ㎕ 내지 12 ㎕, 0.5 ㎕ 내지 15 ㎕, 1 ㎕ 내지 15 ㎕, 2 ㎕ 내지 15 ㎕, 5 ㎕ 내지 15 ㎕, 8 ㎕ 내지 15 ㎕, 10 ㎕ 내지 15 ㎕, 12 ㎕ 내지 15 ㎕ 또는 15 ㎕ 초과 또는 상기 중 임의의 2개에 의하여 정의된 범위의 부피를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 중앙 영역의 내부 부피는 5 ㎕ 미만, 5 ㎕ 내지 10 ㎕, 5 ㎕ 내지 20 ㎕, 5 ㎕ 내지 500 ㎕, 5 ㎕ 내지 80 ㎕, 5 ㎕ 내지 100 ㎕, 5 ㎕ 내지 120 ㎕, 5 ㎕ 내지 150 ㎕, 10 ㎕ 내지 150 ㎕, 20 ㎕ 내지 150 ㎕, 50 ㎕ 내지 150 ㎕, 80 ㎕ 내지 150 ㎕, 100 ㎕ 내지 150 ㎕, 120 ㎕ 내지 150 ㎕ 또는 150 ㎕ 초과 또는 상기 중 임의의 2개에 의하여 정의된 범위의 부피를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 중앙 영역의 내부 부피는 50 ㎕ 미만, 50 ㎕ 내지 100 ㎕, 50 ㎕ 내지 200 ㎕, 50 ㎕ 내지 500 ㎕, 50 ㎕ 내지 800 ㎕, 50 ㎕ 내지 1,000 ㎕, 50 ㎕ 내지 1200 ㎕, 50 ㎕ 내지 1,500 ㎕, 100 ㎕ 내지 1,500 ㎕, 200 ㎕ 내지 1,500 ㎕, 500 ㎕ 내지 1,500 ㎕, 800 ㎕ 내지 1,500 ㎕, 1,000 ㎕ 내지 1,500 ㎕, 1200 ㎕ 내지 1,500 ㎕ 또는 1,500 ㎕ 초과 또는 상기 중 임의의 2개에 의하여 정의된 범위의 부피를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 중앙 영역의 내부 부피는 500 ㎕ 미만, 500 ㎕ 내지 1,000 ㎕, 500 ㎕ 내지 2,000 ㎕, 500 ㎕ 내지 5 ㎖, 500 ㎕ 내지 8 ㎖, 500 ㎕ 내지 10 ㎖, 500 ㎕ 내지 12 ㎖, 500 ㎕ 내지 15 ㎖, 1 ㎖ 내지 15 ㎖, 2 ㎖ 내지 15 ㎖, 5 ㎖ 내지 15 ㎖, 8 ㎖ 내지 15 ㎖, 10㎖ 내지 15 ㎖, 12 ㎖ 내지 15 ㎖ 또는 15 ㎖ 초과 또는 상기 중 임의의 2개에 의하여 정의된 범위의 부피를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 중앙 영역의 내부 부피는 5 ㎖ 미만, 5 ㎖ 내지 10 ㎖, 5 ㎖ 내지 20 ㎖, 5 ㎖ 내지 50 ㎖, 5 ㎖ 내지 80 ㎖, 5 ㎖ 내지 100 ㎖, 5 ㎖ 내지 120 ㎖, 5 ㎖ 내지 150 ㎖, 10 ㎖ 내지 150 ㎖, 20 ㎖ 내지 150 ㎖, 50 ㎖ 내지 150 ㎖, 80 ㎖ 내지 150 ㎖, 100 ㎖ 내지 150 ㎖, 120 ㎖ 내지 150 ㎖ 또는 150 ㎖ 초과 또는 상기 중 임의의 2개에 의하여 정의된 범위의 부피를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 시스템은 다수의 불연속 모세관, 미세유체 채널, 유체 채널, 챔버 또는 루멘 구역을 포함하는 플로우 셀 디바이스 또는 시스템의 어레이 또는 수집을 포함하며, 여기서 합한 내부 부피는 본원에 개시된 범위의 값 중 하나 이상이거나 또는 이를 포함한다.
올리고뉴클레오티드 프라이머의 하나 이상의 유형은 지지체 표면에 부착 또는 테더링될 수 있다. 일부 경우에서, 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 프라이머의 하나 이상의 유형은 스페이서 서열, 어댑터-라이게이션된 템플레이트 라이브러리 핵산 서열로의 하이브리드화를 위한 어댑터 서열, 정방향 증폭 프라이머, 역방향 증폭 프라이머, 시퀀싱 프라이머 및/또는 분자 바코딩 서열 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
테더링된 올리고뉴클레오티드 어댑터 및/또는 프라이머 서열은 약 10 뉴클레오티드 내지 약 100 뉴클레오티드의 길이 범위일 수 있다. 일부 경우에서, 테더링된 올리고뉴클레오티드 어댑터 및/또는 프라이머 서열은 10 이하, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90 또는 적어도 100 뉴클레오티드의 길이일 수 있다. 일부 경우에서, 테더링된 올리고뉴클레오티드 어댑터 및/또는 프라이머 서열은 최대 100, 최대 90, 최대 80, 최대 70, 최대 60, 최대 50, 최대 40, 최대 30, 최대 20 또는 최대 10 뉴클레오티드의 길이일 수 있다. 본 단락에 기재된 임의의 하한값 및 상한값은 본 개시내용에 포함되는 범위를 형성하도록 조합될 수 있으며, 예를 들면 일부 경우에서 테더링된 올리고뉴클레오티드 어댑터 및/또는 프라이머 서열의 길이는 약 20 뉴클레오티드 내지 약 80 뉴클레오티드 범위일 수 있다. 해당 기술분야의 기술자는 테더링된 올리고뉴클레오티드 어댑터 및/또는 프라이머 서열이 상기 범위의 임의의 값, 예를 들면 약 24 뉴클레오티드를 가질 수 있다는 것을 인지할 것이다.
코팅층의 개수 및/또는 각각의 층의 물질 조성은 코팅된 모세관 루멘 표면 상의 올리고뉴클레오티드 프라이머(또는 기타 부착된 분자)의 표면 밀도를 조절하도록 선택된다. 일부 경우에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머의 표면 밀도는 1 ㎛2당 약 1,000 프라이머 분자 내지 1 ㎛2당 약 1,000,000 프라이머 분자 범위일 수 있다. 일부 경우에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머의 표면 밀도는 1 ㎛2당 적어도 1,000, 적어도 10,000, 적어도 100,000 또는 적어도 1,000,000 분자일 수 있다. 일부 경우에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머의 표면 밀도는 1 ㎛2당 최대 1,000,000, 최대 100,000, 최대 10,000 또는 최대 1,000 분자일 수 있다. 본 단락에 기재된 임의의 하한값 및 상한값은 본 개시내용에 포함되는 범위를 형성하도록 조합될 수 있으며, 예를 들면 일부 경우에서 프라이머의 표면 밀도는 1 ㎛2당 약 10,000 분자 내지 1 ㎛2당 약 100,000 분자 범위일 수 있다. 해당 기술분야의 기술자는 프라이머 분자의 표면 밀도가 상기 범위의 임의의 값, 예를 들면 1 ㎛2당 약 455,000 분자를 가질 수 있다는 것을 인지할 것이다. 일부 경우에서, 테더링된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 표면 밀도를 포함한 모세관 또는 채널 루멘 코팅의 표면 성질은 예를 들면 고상 핵산 하이브리드화 특이성 및 효율 및/또는 고상 핵산 증폭률, 특이성 및 효율을 최적화시키도록 조절될 수 있다.
모세관 플로우 셀 카트리지: 또한, 본원에는 독립 흐름 채널을 생성하기 위하여 1, 2 또는 3개의 모세관을 포함할 수 있는 모세관 플로우 셀 카트리지가 개시되어 있다. 도 2는 모세관이 카트리지에 대하여 고정된 배향으로 유지되도록 2개의 유리 모세관, 유체 어댑터(본 예에서는 모세관 1개당 2개) 및, 모세관 및/또는 유체 어댑터와 교합되는 카트리지 새시를 포함하는 모세관 플로우 셀 카트리지의 비제한적인 예를 제공한다. 일부 경우에서, 유체 어댑터는 카트리지 새시와 통합될 수 있다. 일부 경우에서, 카트리지는 모세관 및/또는 모세관 유체 어댑터와 교합되는 추가적인 어댑터를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 모세관은 카트리지 내에 영구 장착된다. 일부 경우에서, 카트리지 새시는 플로우 셀 카트리지의 하나 이상의 모세관이 교환 가능하게 제거 및 교체되도록 설계된다. 예를 들면, 일부 경우에서, 카트리지 새시는 하나 이상의 모세관이 제거 및 교체될 수 있도록 개방되는 힌지가 있는 "클램셸" 배열을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 카트리지 새시는 예를 들면 현미경 시스템의 스테이지 상에 또는 기기 시스템의 카트리지 홀더 내에 배열된다.
본 개시내용의 모세관 플로우 셀 카트리지는 단일의 모세관을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 본 개시내용의 모세관 플로우 셀 카트리지는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 20개 초과의 모세관을 포함할 수 있다. 플로우 셀 카트리지의 하나 이상의 모세관은 단일 모세관 플로우 셀 디바이스에 대하여 상기 기재된 바와 같이 임의의 기하, 치수, 물질 조성 및/또는 코팅을 가질 수 있다. 유사하게, 일부 경우에서 유체 어댑터가 도 2에 예시된 바와 같이 카트리지 새시와 직접 통합될 수 있는 것을 제외하고, 카트리지 내의 개별적인 모세관을 위한 유체 어댑터(통상적으로 모세관 1개당 유체 어댑터 2개)는 단일 모세관 플로우 셀 디바이스에 대하여 상기 기재된 바와 같이 임의의 기하, 치수 및 물질 조성을 가질 수 있다. 일부 경우에서, 카트리지는 모세관 및/또는 유체 어댑터와 교합되며, 모세관을 카트리지 내에 배치하는 것을 돕는 추가적인 어댑터(즉 유체 어댑터 이외에)를 포함할 수 있다. 상기 어댑터는 유체 어댑터에 대하여 상기 상술된 바와 동일한 제조 기술 및 물질을 사용하여 구성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의한 하나 이상의 디바이스는 흐름 채널의 내부와 일반적으로 대면하는 배향으로 제1의 표면을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 표면은 본원에 기재된 바와 같은 중합체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 표면은 본원에 개시된 바와 같이 하나 이상의 올리고뉴클레오티드, 예컨대 캡쳐 올리고뉴클레오티드, 어댑터 올리고뉴클레오티드 또는 임의의 기타 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 디바이스는 일반적으로 흐름 채널의 내부에 대면하며 및 추가로 일반적으로 제1의 표면과 대면하거나 또는 그와 평행한 배향으로 제2의 표면을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 상기 표면은 본원에 개시된 바와 같이 중합체 코팅을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 표면은 본원에 개시된 바와 같이 하나 이상의 올리고뉴클레오티드, 예컨대 캡쳐 올리고뉴클레오티드, 어댑터 올리고뉴클레오티드 또는 임의의 기타 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 디바이스는 일반적으로 흐름 채널의 내부와 대면하는 배향으로 제1의 표면, 일반적으로 흐름 채널의 내부와 대면하며, 추가로 일반적으로 제1의 표면과 대면하거나 또는 그와 평행한 제2의 표면, 일반적으로 제2의 흐름 채널의 내부와 대면하는 제3의 표면 및, 일반적으로 제2의 흐름 채널의 내부와 대면하며, 일반적으로 제3의 표면에 대면하거나 또는 그와 평행한 제4의 표면을 포함할 수 있으며; 여기서 상기 제2의 및 제3의 표면은 반사성, 투명한 또는 반투명한 기재일 수 있는 일반적으로 편평한 기재의 대향면 상에 배치되거나 또는 그에 부착될 수 있다. 일부 실시양태에서, 플로우셀 내의 영상화 표면 또는 영상화 표면들은 플로우셀의 중심 내에서 또는 2개의 서브유닛 사이의 분할 또는 플로우셀의 세분 내에서 또는 그의 일부로서 배치될 수 있으며, 여기서 상기 플로우셀은 상부 표면 및 하부 표면을 포함할 수 있으며, 이들 중 하나 또는 둘다는 사용될 수 있는 상기 검출 방식에 대하여 투명할 수 있으며; 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 및/또는 하나 이상의 중합체 코팅을 포함하는 표면은 플로우셀의 루멘 내에 배치 또는 삽입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상부 및/또는 하부 표면은 부착된 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 상부 및/또는 하부 표면은 부착된 올리고뉴클레오티드 및/또는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 상부 또는 상기 하부 표면은 부착된 올리고뉴클레오티드 및/또는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 플로우셀의 루멘 내에 배치 또는 삽입된 표면 또는 표면들은 반사성, 투명한 또는 반투명 기재일 수 있는 일반적으로 편평한 기재의 한면, 대향면 또는 양면 상에 배치 또는 그에 부착될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 바와 같이 또는 달리 해당 기술분야에 공지된 바와 같은 광학 장치는 제1의 표면, 제2의 표면, 제3의 표면, 제4의 표면, 플로우셀의 루멘 내에 삽입된 표면 또는 그에 부착된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있는 본원에 제공된 임의의 기타 표면의 화상을 제공하는데 사용된다.
미세유체 칩 플로우 셀 카트리지: 또한, 본원에는 복수의 독립 흐름 채널을 포함할 수 있는 미세유체 채널 플로우 셀 카트리지가 개시되어 있다. 칩이 카트리지에 대하여 고정된 배향으로 배치되도록 미세유체 칩 플로우 셀 카트리지의 비제한적인 예는 칩 상에 형성된 2개 이상의 평행한 유리 채널을 갖는 칩, 칩에 커플링된 유체 어댑터 및, 칩 및/또는 유체 어댑터와 교합하는 카트리지 새시를 포함한다. 일부 경우에서, 유체 어댑터는 카트리지 새시와 통합될 수 있다. 일부 경우에서, 카트리지는 칩 및/또는 유체 어댑터와 교합되는 추가적인 어댑터를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 칩은 카트리지 내에 영구 장착된다. 일부 경우에서, 카트리지 새시는 플로우 셀 카트리지의 하나 이상의 칩이 교체 가능하게 제거 및 교체되도록 설계된다. 예를 들면, 일부 경우에서, 카트리지 새시는 하나 이상의 모세관이 제거 및 교체될 수 있도록 개방되게 하는 힌지가 있는 "클램셸" 배열을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 카트리지 새시는 예를 들면 현미경 시스템의 스테이지 상에서 또는 기기 시스템의 카트리지 홀더 내에 장착되도록 배열된다. 단 1개의 칩이 비제한적인 예로 기재되기는 하였으나, 1개 초과의 칩은 미세유체 채널 플로우 셀 카트리지 내에 사용될 수 있는 것으로 이해한다.
본 개시내용의 플로우 셀 카트리지는 단일의 미세유체 칩 또는 복수의 미세유체 칩을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 본 개시내용의 플로우 셀 카트리지는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 20개 초과의 미세유체 칩을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 미세유체 칩은 1개의 채널을 가질 수 있다. 일부 경우에서, 미세유체 칩은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 20개 초과의 채널을 가질 수 있다. 플로우 셀 카트리지의 하나 이상의 칩은 단일 미세유체 칩 플로우 셀 디바이스에 대하여 상기 기재된 바와 같이 임의의 기하, 치수, 물질 조성 및/또는 코팅을 가질 수 있다. 유사하게, 일부 경우에서 유체 어댑터가 카트리지 새시와 직접 통합될 수 있는 점을 제외하고, 카트리지 내의 개별적인 칩을 위한 유체 어댑터(통상적으로 모세관 1개당 유체 어댑터 2개)는 단일 미세유체 칩 플로우 셀 디바이스를 위한 상기 기재된 바와 같은 임의의 기하, 치수 및 물질 조성을 가질 수 있다. 일부 경우에서, 카트리지는 칩 및/또는 유체 어댑터와 교합되며, 카트리지 내에서 칩을 배치하는 것을 돕는 추가적인 어댑터(즉, 유체 어댑터 이외에)를 포함할 수 있다. 상기 어댑터는 유체 어댑터에 대하여 상기 상술된 바와 동일한 제조 기술 및 물질을 사용하여 구성될 수 있다.
카트리지 새시(또는 "하우징")는 금속 및/또는 중합체 물질, 예컨대 알루미늄, 양극처리된 알루미늄, 폴리카르보네이트(PC), 아크릴(PMMA) 또는 울템(Ultem)(PEI)으로부터 제조될 수 있는 한편, 기타 물질은 또한 본 개시내용과 일치한다. 하우징은 CNC 기계가공 및/또는 성형 기술을 사용하여 제조되고, 1, 2개 또는 2개 초과의 모세관이 독립 흐름 채널을 생성하기 위하여 고정된 배향으로 새시에 의하여 구속되도록 설계될 수 있다. 모세관은 예를 들면 압축 압입 설계를 사용하거나 또는 실리콘 또는 플루오로엘라스토머로 생성된 압축성 어댑터와 교합시켜 새시 내에 장착될 수 있다. 일부 경우에서, 카트리지 새시의 2개 이상의 부품(예, 상반부 및 하반부)이 예를 들면 스크류, 클립, 클램프 또는 기타 패스너를 사용하여 조립되어 상반부 및 하반부가 분리 가능하게 된다. 일부 경우에서, 카트리지 새시의 2개 이상의 부품은 예를 들면 접착제, 용매 본딩 또는 레이저 용접을 사용하여 조립되어 2개 이상의 부품이 영구 부착되도록 한다.
본 개시내용의 일부 플로우 셀 카트리지는 특정한 적용예에 대하여 향상된 성능을 제공하기 위하여 카트리지와 통합되는 추가적인 부품을 추가로 포함한다. 카트리지에 통합될 수 있는 추가적인 부품의 예는 유체 흐름 제어 부품(예, 미니어쳐 밸브, 미니어쳐 펌프, 혼합 매니폴드 등), 온도 제어 부품(예, 저항 가열 소자, 열원 또는 싱크로서 기능하는 금속판, 가열 또는 냉각을 위한 압전(펠티어) 디바이스, 온도 센서) 또는 광학 부품(예, 하나 이상의 모세관 흐름 채널의 분광 측정 및/또는 영상화를 돕기 위하여 총괄적으로 사용될 수 있는 광학 렌즈, 윈도우, 필터, 미러, 프리즘, 섬유 광학 및/또는 발광 다이오드(LED) 또는 기타 미니어쳐 광원)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
시스템 및 시스템 부품: 본원에 개시된 플로우 셀 디바이스 및 플로우 셀 카트리지는 다양한 화학 분석, 생화학 분석, 핵산 분석, 세포 분석 또는 조직 분석 적용예를 위하여 설계된 시스템의 부품으로서 사용될 수 있다. 일반적으로, 상기 시스템은 하나 이상의 유체 흐름 제어 모듈, 온도 제어 모듈, 분광 측정 및/또는 영상화 모듈 및 프로세스 또는 컴퓨터뿐 아니라, 본원에 기재된 단일 모세관 플로우 셀 디바이스 및 모세관 플로우 셀 카트리지 또는 미세유체 칩 플로우 셀 디바이스 및 플로우 셀 카트리지 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 시스템은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 10개 초과의 단일 모세관 플로우 셀 디바이스 또는 모세관 플로우 셀 카트리지를 포함할 수 있다. 일부 경우에서 단일 모세관 플로우 셀 디바이스 또는 모세관 플로우 셀 카트리지는 개시된 시스템의 제거 가능한, 교환 가능한 부품일 수 있다. 일부 경우에서, 단일 모세관 플로우 셀 디바이스 또는 모세관 플로우 셀 카트리지는 개시된 시스템의 일회용 또는 소모성 부품일 수 있다. 본원에 개시된 시스템은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 10개 초과의 단일 미세유체 채널 플로우 셀 디바이스 또는 미세유체 채널 플로우 셀 카트리지를 포함할 수 있다. 일부 경우에서 단일 미세유체 채널 플로우 셀 디바이스 또는 미세유체 채널 플로우 셀 카트리지는 개시된 시스템의 제거 가능한, 교환 가능한 부품일 수 있다. 일부 경우에서, 플로우 셀 디바이스 또는 플로우 셀 카트리지는 개시된 시스템의 일회용 또는 소모성 부품일 수 있다.
도 3은 다양한 유체 흐름 제어 부품에 연결된 단일의 모세관 플로우 셀을 포함하는 단일 시스템의 한 실시양태를 도시하며, 여기서 단일 모세관은 광학 접근 가능하며, 다양한 영상화 적용예에 사용하기 위하여 현미경 스테이지 상에서 또는 주문형 영상화 기기 내에서의 장착과 호환성을 갖는다. 복수의 시약 저장소는 단일 모세관 플로우 셀 디바이스의 주입 단부와 유체 커플링되며, 여기서 임의의 주어진 시점에서 모세관을 통하여 흐르는 시약은 사용자가 시약 흐름의 타이밍 및 기간을 제어하도록 하는 프로그래밍 가능한 회전 밸브에 의하여 제어된다. 본 비제한적인 예에서, 유체 흐름은 부피 유체 흐름의 정확한 제어 및 타이밍 및 유체 흐름 속도를 제공하는 프로그래밍 가능한 주사기 펌프에 의하여 제어된다.
도 4는 무용 부피를 최소화하며, 특정한 핵심 시약을 보존하기 위하여 통합된 격막 밸브를 갖는 모세관 플로우 셀 카트리지를 포함하는 시스템의 한 실시양태를 도시한다. 미니어쳐 격막 밸브를 카트리지에 통합시키는 것은 밸브를 모세관의 주입구에 근접하게 배치하도록 하여 디바이스 내의 무용 부피를 최소로 하며, 고가의 시약의 소비를 감소시킨다. 모세관 플로우 셀 카트리지 내의 밸브 및 기타 유체 제어 부품의 통합은 또한 더 큰 유체 흐름 제어 기능이 카트리지 설계에 혼입되도록 한다.
도 5는 현미경 기구와 조합하여 사용된 모세관 플로우 셀 카트리지 기반 유체 시스템의 일례를 도시하며, 여기서 카트리지는 카트리지 내의 모세관과 접촉하게 하는 온도 제어 부품, 예컨대 금속판을 혼입하거나 또는 이와 교합되며, 열원/싱크로서 기능한다. 현미경 기구는 조명 시스템(예, 열원으로서 레이저, LED 또는 할로겐 램프 등 포함), 대물 렌즈, 영상화 시스템(예, CMOS 또는 CCD 카메라) 및, 카트리지를 광학 시스템에 대하여 이동시키며, 예를 들면 스테이지가 이동함에 따라 형광 및/또는 명시야 화상을 모세관 플로우 셀의 상이한 구역에 대하여 획득하도록 하는 전위 스테이지로 구성된다.
도 6은 플로우 셀 카트리지와 접촉 배치되는 금속 판의 사용에 의하여 플로우 셀(예, 모세관 또는 미세유체 채널 플로우 셀)의 온도 제어에 대한 비제한적인 일례를 도시한다. 일부 경우에서, 금속판은 카트리지 새시와 통합될 수 있다. 일부 경우에서, 금속판은 펠티어 또는 저항 가열기를 사용하여 온도 제어될 수 있다.
도 7은 비접촉 열적 제어 메카니즘을 포함하는 플로우 셀(예, 모세관 또는 미세유체 채널 플로우 셀)의 온도 제어에 대한 비제한적인 접근법을 도시한다. 상기 접근법에서, 온도 제어 공기 흐름은 플로우 셀 카트리지를 통하여(예, 단일의 모세관 플로우 셀 디바이스 또는 미세유체 채널 플로우 셀 디바이스를 향하여) 공기 온도 제어 시스템을 사용하여 보낸다. 공기 온도 제어 시스템은 공기를 가열 및/또는 냉각시킬 수 있으며, 이를 일정한 사용자가 명시한 온도에서 유지할 수 있는 열 교환기, 예를 들면 저항 가열기 코일, 펠티어 디바이스에 부착된 핀(fin) 등을 포함한다. 공기 온도 제어 시스템은 또한 가열된 또는 냉각된 공기의 흐름을 모세관 플로우 셀 카트리지로 보내는 공기 전달 디바이스, 예컨대 팬을 포함한다. 일부 경우에서, 공기 흐름 및 그에 따른 플로우 셀 또는 카트리지(예, 모세관 플로우 셀 또는 미세유체 채널 플로우 셀)가 일부 사례에서 환경 온도, 공기 흐름 속도 등에 의존하여 설정 온도 T1과는 상이할 수 있는 일정한 온도 T2에서 유지되도록 공기 온도 제어 시스템은 일정한 온도 T1로 설정될 수 있다. 일부 경우에서, 공기 온도 제어 시스템 중 하나가 주어진 시간에서 작동중인 제어에 의하여 수개의 상이한 온도 사이에서 모세관 또는 카트리지가 신속하게 순환될 수 있도록 2종 이상의 상기 공기 온도 제어 시스템은 모세관 플로우 셀 디바이스 또는 플로우 셀 카트리지 주위에 설치될 수 있다. 또 다른 접근법에서, 모세관 플로우 셀 또는 카트리지의 온도가 그에 따라 변경될 수 있도록 공기 온도 제어 시스템의 온도 설정은 변경될 수 있다.
유체 흐름 제어 모듈: 일반적으로, 개시된 기기 시스템은 샘플 또는 시약을 시스템에 연결된 하나 이상의 플로우 셀 디바이스 또는 플로우 셀 카트리지(예, 단일 모세관 플로우 셀 디바이스 또는 미세유체 채널 플로우 셀 디바이스)에 전달하기 위한 유체 흐름 제어 능력을 제공할 것이다. 시약 및 완충제는 튜빙 및 밸브 매니폴드에 의하여 플로우 셀 주입구에 연결된 병, 시약 및 완충제 카트리지 또는 기타 적절한 용기 내에 보관될 수 있다. 개시된 시스템은 또한 모세관 플로우 셀 디바이스 또는 모세관 플로우 셀 카트리지의 하류에서 유체를 수집하기 위하여 가공된 샘플 및 폐기물 저장소를 병, 카트리지 또는 기타 적절한 용기의 형태로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유체 흐름 제어(또는 "유체공학") 모듈은 상이한 공급원, 예를 들면 기기 및 배치된 샘플 또는 시약 저장소 또는 병 및 중앙 영역(예, 모세관 또는 미세유체 채널) 주입구(들) 사이에서 흐름의 프로그래밍 가능한 스위칭을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유체 흐름 제어 모듈은 중앙 영역(예, 모세관 또는 미세유체 채널) 배출구(들) 및 상이한 수집 지점, 예를 들면 시스템에 연결된 가공된 샘플 저장소, 폐기물 저장소 등의 사이에서 흐름의 프로그래밍 가능한 스위칭을 제공할 수 있다. 일부 경우에서, 샘플, 시약 및/또는 완충제는 플로우 셀 카트리지 그 자체에 통합된 저장소 내에 보관될 수 있다. 일부 경우에서, 가공된 샘플, 소비된 시약 및/또는 사용된 완충제는 플로우 셀 카트리지 그 자체로 통합된 저장소 내에 보관될 수 있다.
개시된 시스템을 통한 유체 흐름의 제어는 통상적으로 펌프(또는 기타 유체 작동화 메카니즘) 및 밸브(예, 프로그래밍 가능한 펌프 및 밸브)의 사용에 의하여 수행될 것이다. 적절한 펌프의 예는 주사기 펌프, 프로그래밍 가능한 주사기 펌프, 연동 펌프, 격막 펌프 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적절한 밸브의 예는 체크 밸브, 전기기계 2방향 또는 3방향 밸브, 공기압 2방향 및 3방향 밸브 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 시스템을 통한 유체 흐름은 공기압 양압을 시약 및 완충제 용기의 하나 이상의 주입구에 또는 플로우 셀 카트리지(들)(예, 모세관 또는 미세유체 채널 플로우 셀 카트리지)에 혼입된 주입구에 적용하여 제어될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시스템을 통한 유체 흐름은 진공을 폐기물 저장소(들)의 하나 이상의 배출구에서 또는 플로우 셀 카트리지(들)(예, 모세관 또는 미세유체 채널 플로우 셀 카트리지)에 혼입된 하나 이상의 배출구에서 인출시켜 제어될 수 있다.
일부 경우에서, 상이한 방식의 유체 흐름 제어는 검정 또는 분석 절차에서 상이한 지점에서, 예를 들면 순방향 흐름(주어진 모세관 플로우 셀 디바이스에 대한 주입구 및 배출구에 대하여), 역방향 흐름, 진동식 또는 박동식 흐름 또는 그의 조합으로 사용된다. 일부 적용예에서, 진동식 또는 박동식 흐름은 예를 들면 하나 이상의 플로우 셀 디바이스 또는 플로우 셀 카트리지(예, 단일 모세관 플로우 셀 디바이스 또는 카트리지 및 미세유체 칩 플로우 셀 디바이스 또는 카트리지) 내에서 유체의 완전한 및 효율적인 교환을 돕는 검정 세척/헹굼 단계 중에 적용될 수 있다.
유사하게, 일부 사례에서 상이한 유체 흐름 속도는 검정 또는 분석 공정 작업 흐름에서 상이한 지점에서 사용될 수 있으며, 예를 들면 일부 경우에서, 부피 유속은 -100 ㎖/sec 내지 +100 ㎖/sec에서 변경될 수 있다. 일부 실시양태에서, 부피 유속의 절대값은 적어도 0.001 ㎖/sec, 적어도 0.01 ㎖/sec, 적어도 0.1 ㎖/sec, 적어도 1 ㎖/sec, 적어도 10 ㎖/sec 또는 적어도 100 ㎖/sec일 수 있다. 일부 실시양태에서, 부피 유속의 절대값은 최대 100 ㎖/sec, 최대 10 ㎖/sec, 최대 1 ㎖/sec, 최대 0.1 ㎖/sec, 최대 0.01 ㎖/sec 또는 최대 0.001 ㎖/sec일 수 있다. 주어진 시점에서의 부피 유속은 상기 범위의 임의의 값, 예를 들면 2.5 ㎖/sec의 순방향 유속, -0.05 ㎖/sec의 역방향 유속 또는 0 ㎖/sec의 값(즉, 정지된 흐름)을 가질 수 있다.
온도 제어 모듈: 상기 언급된 바와 같이, 일부 경우에서 개시된 시스템은 검정 또는 분석 결과의 정확성 및 재현 가능성을 돕기 위하여 온도 제어 기능을 포함할 것이다. 기기 시스템(또는 모세관 플로우 셀 카트리지) 설계에 혼입될 수 있는 온도 제어 부품의 예는 저항 가열 소자, 적외선 광원, 펠티어 가열 또는 냉각 디바이스, 열 싱크, 서미스터, 열전쌍 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에서, 온도 제어 모듈(또는 "온도 제어기")은 특이성 검정 또는 분석 단계를 수행하기 이전에 명시된 조절 가능한 시간에서 프로그래밍 가능한 온도 변화를 제공할 수 있다. 일부 경우에서, 온도 제어기는 명시된 시간 간격에 걸쳐 온도에서의 프로그래밍 가능한 변화를 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 온도 제어기는 증폭 반응을 위한 열적 순환이 수행될 수 있도록 명시된 빈도 및 변동률로 2개 이상의 설정 온도 사이의 온도의 순환을 추가로 제공할 수 있다.
분광학 또는 영상화 모듈: 상기에서 나타낸 바와 같이, 일부 경우에서 개시된 시스템은 광학 영상화 또는 기타 분광학 측정 능력을 포함할 것이다. 예를 들면, 해당 기술분야의 기술자에게 공지되어 있으며, 명시야, 암시야, 형광, 발광 또는 인광 영상화를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 다양한 영상화 방식을 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 중앙 영역은 중앙 영역의 적어도 일부가 조명 및 영상화되도록 하는 윈도우를 포함한다. 일부 실시양태에서, 모세관은 모세관의 적어도 일부가 조명 및 영상화되도록 하는 윈도우를 포함한다. 일부 실시양태에서, 미세유체 칩은 칩 채널의 적어도 일부가 조명 및 영상화되도록 하는 윈도우를 포함한다.
일부 실시양태에서, 단일 파장 여기 및 방출 형광 영상화를 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 2중 파장 여기 및 방출(또는 다중 파장 여기 또는 방출) 형광 영상화를 수행할 수 있다. 일부 경우에서, 영상화 모듈은 비디오 화상을 획득하도록 배열된다. 영상화 방식의 선택은 모세관 또는 카트리지의 전부 또는 일부가 관심 분광 범위에 걸쳐 광학적으로 투명할 필요가 있는 플로우 셀 디바이스 또는 플로우 셀 카트리지의 설계에 영향을 미칠 수 있다. 일부 경우에서, 모세관 플로우 셀 카트리지 내의 복수의 모세관은 그 전체가 단일 화상 내에서 영상화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 모세관 플로우 셀 카트리지 또는 그의 일부 내에서 단일의 모세관 단독으로 또는 모세관의 서브세트는 단일 화상 내에서 영상화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 일련의 화상은 카트리지 내에서 1, 2개, 수개 또는 전체 복수개의 모세관의 단일의 고 해상도 화상을 생성하기 위하여 "타일링"될 수 있다. 일부 경우에서, 미세유체 칩 내의 복수의 채널은 그 전체가 단일의 화상 내에서 영상화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 미세유체 칩 또는 그의 일부 내에서 단일의 채널 단독으로 또는 채널의 서브세트가 단일의 화상 내에서 영상화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 일련의 화상은 카트리지 내에서 1, 2개, 수개 또는 전체 복수개의 모세관 또는 미세유체 채널의 단일의 고 해상도 화상을 생성하기 위하여 "타일링"될 수 있다.
분광학 또는 영상화 모듈은 예를 들면 CCD 카메라의 CMOS가 장착된 현미경을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 분광학 또는 영상화 모듈은 예를 들면 관심 특이성 분광학 또는 영상화 기술을 수행하도록 배열된 주문형 기기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 영상화 모듈과 관련된 하드웨어는 광원, 검출기 및 기타 광학 부품뿐 아니라, 프로세서 또는 컴퓨터를 포함할 수 있다.
광원: 임의의 다양한 광원은 텅스텐 램프, 텅스텐-할로겐 램프, 아크 램프, 레이저, 발광 다이오드(LED) 또는 레이저 다이오드를 포함하나 이에 제한되지 않는 영상화 또는 여기 광을 제공하는데 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 하나 이상의 광원 및 추가적인 광학 부품, 예를 들면 렌즈, 필터, 어퍼쳐, 격막, 미러 등의 조합은 조명 시스템(또는 보조 시스템)으로서 배열될 수 있다.
검출기: 영상화 목적을 위하여 광다이오드 어레이, 하전 커플링된 디바이스(CCD) 카메라 또는 상보성 금속-산화물-반도체(CMOS) 화상 센서를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 다양한 화상 센서를 사용할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "영상화 센서"는 1차원(선형) 또는 2차원 어레이 센서가 될 수 있다. 다수의 경우에서, 하나 이상의 화상 센서 및 추가적인 광학 부품, 예를 들면 렌즈, 필터, 어퍼쳐, 격막, 미러 등의 조합은 영상화 시스템(또는 보조 시스템)으로서 배열될 수 있다. 예를 들면 분광학 측정이 영상화보다는 시스템에 의하여 수행되는 일부 경우에서, 적절한 검출기는 광다이오드, 애벌런치 광다이오드 및 광전증폭관을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
기타 광학 부품: 분광학 측정 또는 영상화 모듈의 하드웨어 부품은 또한 시스템을 통한 광 빔을 조향, 성형, 필터링 또는 집속하기 위한 다양한 광학 부품을 포함할 수 있다. 적절한 광학 부품의 예는 렌즈, 미러, 프리즘, 어퍼쳐, 회절 격자, 착색 유리 필터, 롱 패스 필터, 숏 패스 필터, 밴드패스 필터, 협대역 간섭 필터, 광대역 간섭 필터, 다이크로익 반사기, 광학 섬유, 광학 도파관 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에서, 분광학 측정 또는 영상화 모듈은 조명 및/또는 검출/영상화 보조 시스템에 대한 모세관 플로우 셀 디바이스 및 카트리지의 이동을 위한 또는 그 반대를 위한 하나 이상의 전위 스테이지 또는 기타 모션 제어 메카니즘을 추가로 포함할 수 있다.
내부 전반사: 일부 경우에서, 광학 모듈 또는 보조 시스템은 여기광을 모세관 또는 채널 루멘(들)에 내부 전반사를 경유하여 전달하기 위한 도파관으로서 플로우 셀 디바이스 및 카트리지 내에서 모세관 또는 미세유체 채널의 광학적 투명 벽의 전부 또는 일부를 사용하도록 설계될 수 있다. 입사 여기 광이 임계각(모세관 또는 채널 내의 모세관 또는 채널 벽 물질 및 수성 완충제의 상대적 굴절률에 의하여 측정됨)보다 더 큰 표면에 수직에 대한 각도에서 모세관 또는 채널 루멘의 표면과 충돌시, 내부 전반사는 표면에서 발생하며, 광은 모세관 또는 채널의 길이를 따라 모세관 또는 채널 벽을 통하여 전파된다. 내부 전반사는 극히 짧은 거리의 경우 루멘 내부를 관통하며, 표면에서 형광단, 예를 들면 폴리머라제에 의하여 고상 프라이머 신장 반응을 통하여 성장 중인 올리고뉴클레오티드에 혼입된 표지된 뉴클레오티드를 선택적으로 여기시키는데 사용될 수 있는 루멘 표면에서 표면파를 발생시킨다.
영상화 프로세싱 소프트웨어: 일부 경우에서, 시스템은 화상 프로세싱 및 분석 능력을 제공하기 위한 코드를 포함하는 컴퓨터(또는 프로세서) 및 컴퓨터 판독 가능 매체를 추가로 포함할 수 있다. 소프트웨어에 의하여 제공될 수 있는 화상 프로세싱 및 분석 능력의 예는 수동, 반자동 또는 완전 자동 화상 노출 조절(예, 화이트 밸런스, 콘트라스트 조절, 신호-평균 및 기타 노이즈 감소 능력 등), 자동화된 엣지 검출 및 객체 식별(예, 모세관 플로우 셀 디바이스의 루멘 표면 상에서 형광 표지된 올리고뉴클레오티드의 클론 증폭된 클러스터를 확인하기 위함), 자동화된 통계적 분석(예, 모세관 루멘 표면의 단위 면적당 식별된 올리고뉴클레오티드의 클론 증폭된 클러스터의 개수를 측정하기 위하여 또는 핵산 시퀀싱 적용에서 자동화된 뉴클레오티드 염기 해독을 위하여) 및 수동 측정 능력(예, 클러스터 또는 기타 객체 사이의 거리 등을 측정하기 위하여)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 임의로, 기기 제어 및 화상 프로세싱/분석 소프트웨어는 별도의 소프트웨어 모듈로서 기록될 수 있다. 일부 실시양태에서, 기기 제어 및 화상 프로세싱/분석 소프트웨어는 통합된 패키지에 혼입될 수 있다.
시스템 제어 소프트웨어: 일부 경우에서, 시스템은 유저 인터페이스를 제공하기 위한 코드를 포함하는 컴퓨터(또는 프로세서) 및 컴퓨터-판독 가능 매체뿐 아니라, 모든 시스템 기능의 수동, 반자동 또는 완전 자동 제어, 예를 들면 유체공학 모듈, 온도 제어 모듈 및/또는 분광학 또는 영상화 모듈의 제어뿐 아니라, 기타 데이타 분석 및 디스플레이 선택사양을 포함할 수 있다. 시스템 컴퓨터 또는 프로세서는 시스템의 통합 부품(예, 기기 내에 매립된 마이크로프로세서 또는 마더 보드)일 수 있거나 또는 스탠드 얼론(stand-alone) 모듈, 예를 들면, 메인 프레임 컴퓨터, 퍼스널 컴퓨터 또는 랩탑 컴퓨터일 수 있다. 유체 제어 기능의 예는 부피 유체 흐름 속도, 유체 흐름 속도, 샘플 및 시약 첨가의 타이밍 및 기간, 완충제 첨가 및 헹굼 단계를 포함하나 이에 제한되지 않는 시스템 제어 소프트웨어에 의하여 제공된다. 시스템 제어 소프트웨어에 의하여 제공되는 온도 제어 기능의 예는 온도 설정점(들)의 명시 및 온도 변화에 대한 타이밍, 기간 및 변동률의 제어를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 시스템 제어 소프트웨어에 의하여 제공되는 분광학 측정 또는 영상화 제어 기능의 예는 자동 초점 능력, 조명 또는 여기 광 노출 시간 및 강도의 제어, 화상 수집 속도, 노출 시간 및 데이타 저장 옵션의 제어를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
프로세서 및 컴퓨터: 일부 경우에서, 개시된 시스템은 하나 이상의 프로세서 또는 컴퓨터를 포함할 수 있다. 프로세서는 하드웨어 프로세서, 예컨대 중앙 프로세싱 유닛(CPU), 그래픽 프로세싱 유닛(GPU), 다목적 프로세싱 유닛 또는 컴퓨팅 플랫폼일 수 있다. 프로세서는 임의의 다양한 적절한 집적 회로, 마이크로프로세서, 로직 디바이스, 필드-프로그래밍 가능한 게이트 어레이(FPGA) 등으로 이루어질 수 있다. 일부 경우에서, 프로세서는 싱글 코어 또는 멀티 코어 프로세서일 수 있거나 또는 복수의 프로세서는 병렬 프로세싱을 위하여 배열될 수 있다. 본 개시내용이 프로세서와 관련하여 기재되기는 하였으나, 기타 유형의 집적 회로 및 로직 디바이스도 또한 적용 가능하다. 프로세서는 임의의 적절한 데이타 작업 능력을 가질 수 있다. 예를 들면, 프로세서는 512 비트, 256 비트, 128 비트, 64 비트, 32 비트 또는 16 비트 데이타 작업을 수행할 수 있다.
프로세서 또는 CPU는 프로그램 또는 소프트웨어로 구체화될 수 있는 기계 판독 가능한 명령의 시퀀스를 수행할 수 있다. 명령은 메모리 위치에 저장될 수 있다. 명령은 CPU로 보낼 수 있으며, 그 후 CPU를 프로그래밍 또는 달리 배열하여 예를 들면 본 개시내용의 시스템 제어 방법을 실행할 수 있다. CPU에 의하여 실행된 작업의 예는 인출, 디코딩, 실행 및 재기록을 포함할 수 있다.
일부 프로세서는 컴퓨터 시스템의 프로세싱 유닛이다. 컴퓨터 시스템은 클라우드 기반 데이타 저장 및/또는 컴퓨팅을 가능케 할 수 있다. 일부 경우에서, 컴퓨터 시스템은 통신 인터페이스의 도움으로 컴퓨터 네트워크("네트워크")에 작동적으로 연결될 수 있다. 네트워크는 인터넷, 인트라넷 및/또는 엑스트라넷, 인터넷 또는 근거리 네트워크(LAN)과 통신하는 인트라넷 및/또는 엑스트라넷일 수 있다. 네트워크는 일부 사례에서 원격통신 및/또는 데이타 네트워크이다. 네트워크는 분산 컴퓨팅, 예컨대 클라우드 기반 컴퓨팅을 가능케 할 수 있는 하나 이상의 컴퓨터 서버를 포함할 수 있다.
컴퓨터 시스템은 또한 컴퓨터 메모리 또는 메모리 위치(예, 랜덤 액세스 메모리, 읽기 전용 메모리, 플래쉬 메모리), 전자 저장 유닛(예, 하드 디스크), 하나 이상의 기타 시스템 및 주변 디바이스, 예컨대 캐쉬, 기타 메모리 유닛, 데이타 저장 유닛 및/또는 전자 디스플레이 어댑터와 통신하기 위한 통신 인터페이스(예, 네트워크 어댑터)를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 통신 인터페이스는 컴퓨터가 하나 이상의 추가적인 디바이스와 통신하도록 할 수 있다. 컴퓨터는 분석을 위하여 커플링된 디바이스로부터의 입력 데이타를 수신할 수 있다. 메모리 유닛, 저장 유닛, 통신 인터페이스 및 주변 디바이스는 통신 버스(실선)를 통하여 프로세서 또는 CPU와 통신할 수 있으며, 예컨대 마더보드에 통합될 수 있다. 메모리 또는 저장 유닛은 데이타를 저장하기 위한 데이타 저장 유닛(또는 데이타 저장소)일 수 있다. 메모리 또는 저장 유닛은 파일, 예컨대 드라이버, 라이브러리 및 저장된 프로그램을 저장할 수 있다. 메모리 또는 저장 유닛은 유저 데이타, 예를 들면 유저 선호정보 및 유저 프로그램을 저장할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 시스템 제어, 화상 프로세싱 및/또는 데이타 분석 방법은 컴퓨터 시스템의 전자 저장 위치, 예를 들면 메모리 또는 전자 저장 유닛에 저장된 기계 실행 가능한 코드에 의하여 수행될 수 있다. 기계 실행 가능한 또는 기계 판독 가능한 코드는 소프트웨어의 형태로 제공될 수 있다. 사용 중에, 코드는 프로세서에 의하여 실행될 수 있다. 일부 사례에서, 코드는 저장 유닛으로부터 회수하고, 프로세서에 의한 즉시 접근을 위한 메모리에 저장할 수 있다. 일부 상황에서, 전자 저장 유닛은 배제될 수 있으며, 기계 실행 가능한 명령은 메모리에 저장된다.
일부 경우에서, 코드를 실행하도록 조정된 프로세서를 갖는 기계와 함께 사용하기 위하여 코드는 프리컴파일 및 배열될 수 있다. 일부 경우에서, 코드는 런타임 중에 컴파일될 수 있다. 코드는 프리컴파일 또는 컴파일된 방식으로 코드를 실행할 수 있도록 선택될 수 있는 프로그래밍 언어로 제공될 수 있다.
본원에 제공된 시스템 및 방법의 일부 측면은 소프트웨어로 구현될 수 있다. 기술의 다양한 측면은 통상적으로 기계(또는 프로세서) 실행 가능한 코드의 형태로 및/또는 기계 판독 가능한 매체의 형태로 실시 또는 구현되는 관련 데이타의 형태로 "제품" 또는 "제조 물품"으로 간주될 수 있다. 기계 실행 가능한 코드는 전자 저장 유닛, 예컨대 메모리(예, 읽기 전용 메모리, 랜덤 액세스 메모리, 플래쉬 메모리) 또는 하드 디스크에 저장될 수 있다. "저장" 유형의 매체는 소프트웨어 프로그래밍에 대하여 임의의 시간에서 비일시적 저장을 제공할 수 있는 컴퓨터, 프로세서 등 또는 그의 관련 모듈, 예컨대 다양한 반도체 메모리, 테이프 드라이브, 디스크 드라이브 등의 탠져블(tangible) 메모리의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. 소프트웨어의 전부 또는 일부는 가끔 인터넷 또는 다양한 기타 원격통신 네트워크를 통하여 통신할 수 있다. 상기 통신은 예를 들면 1개의 컴퓨터 또는 프로세서로부터 또 다른 것으로, 예를 들면 관리 서버 또는 호스트 컴퓨터로부터 애플리케이션 서버의 컴퓨터 플랫폼으로 소프트웨어를 로딩할 수 있다. 그래서, 소프트웨어 요소를 지닐 수 있는 또 다른 유형의 매체는 예컨대 유선 및 광학 지상통신선 네트워크를 통하여 및 다양한 무선 링크 상에서 로컬 디바이스 사이의 물리적 인터페이스를 통하여 사용되는 광학, 전기 및 전자기 파를 포함한다. 상기 파, 예컨대 유선 또는 무선 링크, 광학 링크 등을 지니는 물리적 요소는 또한 소프트웨어를 지니는 매체로서 간주될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 비일시적 탠져블 "저장" 매체로 제한되지 않는다면, 컴퓨터 또는 기계 "판독 가능 매체"와 같은 용어는 실행을 위하여 명령을 프로세서에 제공하는데 참여하는 임의의 매체를 지칭한다.
일부 경우에서, 본 개시내용의 시스템 제어, 화상 프로세싱 및/또는 데이타 분석 방법은 하나 이상의 알고리즘에 의하여 수행될 수 있다. 알고리즘은 중앙 프로세싱 유닛에 의하여 실행시 소프트웨어에 의하여 수행될 수 있다.
핵산 시퀀싱 적용: 핵산 시퀀싱은 개시된 플로우 셀 디바이스 및 카트리지(예, 모세관 플로우 셀 또는 미세유체 칩 플로우 셀 디바이스 및 카트리지)를 위한 애플리케이션의 비제한적인 일례를 제공한다. 다수의 "2세대" 및 "3세대" 시퀀싱 기술은 고체 지지체에 테더링된 단일 가닥 템플레이트 올리고뉴클레오티드 서열의 정확한 디코딩이 폴리머라제에 의하여 상보성 올리고뉴클레오티드 가닥에 A, G, C 및 T 뉴클레오티드의 단계별 첨가로부터 발생하는 신호의 성공적 분류에 의존하는 합성에 의한 시퀀싱(SBS)으로의 대규모 병렬 주기적 어레이 접근법을 사용한다. 상기 방법은 통상적으로 템플레이트 올리고뉴클레오티드에서의 염기의 서열을 식별하기 위하여 고정된 길이의 공지된 어댑터 서열로 변형되고, 고체 지지체(예, 개시된 모세관 또는 미세유체 칩 플로우 셀 디바이스 및 카트리지의 루멘 표면(들))에 어댑터 서열의 것에 대하여 상보성인 공지의 서열의 표면-테더링된 프로브로의 하이브리드화에 의하여 패턴형성된 어레이 또는 랜덤으로 부착된 후, 예를 들면 형광 표지된 뉴클레오티드를 사용하는 일련의 주기적 단일 염기 첨가 프라이머 신장 반응에 의하여 프로브되는 올리고뉴클레오티드 템플레이트를 필요로 한다. 그래서, 상기 과정은 시퀀싱 반응을 수행하는 플로우 셀로의 시약 투입의 타이밍 및 고가의 시약 소비를 최소로 하기 위한 작은 부피의 정확하며, 재현 가능한 제어를 제공하는 소형화된 유체공학 시스템의 사용을 필요로 한다.
기존의 상업적으로 입수 가능한 NGS 플로우 셀은 에칭되고, 랩핑되고 및/또는, 영상화, 냉각 및/또는 기타 요건에 요구되는 엄격한 치수 허용오차를 충족하는 기타 방법에 의하여 프로세싱되는 유리의 층으로부터 구성된다. 플로우 셀을 소모품으로서 사용할 경우, 그의 제조에 요구되는 고가의 제조 공정은 시퀀싱 실시당 비용을 초래하는데, 이는 비용이 많이 들어서 연구 및 임상 공간에서 과학자 및 의료 종사자가 통상적으로 접근 가능한 시퀀싱으로 할 수 없게 된다.
본 개시내용은 저렴한 유리 또는 중합체 모세관 또는 미세유체 채널, 유체공학 어댑터 및 카트리지 새시를 필요로 하는 저 비용 플로우 셀 아키텍쳐를 제공한다. 최종 단면 기하로 압출되는 유리 또는 중합체 모세관의 사용은 복수의 고 정밀 및 고가의 유리 제조 공정에 대한 필요성을 배제한다. 모세관 또는 채널의 배향을 강력하게 제한하며, 성형된 플라스틱 및/또는 엘라스토머 성분을 사용한 간편한 유체 연결을 제공하는 것은 비용을 추가로 절감시킨다. 중합체 카트리지 새시의 부품을 레이저 본딩시키는 것은 파스너 또는 접착제를 사용하지 않고 모세관 또는 미세유체 채널을 밀폐시키고, 모세관 또는 채널 및 플로우 셀 카트리지를 구조적으로 안정화시키는 신속하며 효율적인 수단을 제공한다.
플로우 셀 디바이스 및 시스템의 적용: 본원에 기재된 플로우 셀 디바이스 및 시스템은 고가의 시약의 효율적인 사용을 개선시키기 위하여 다양한 적용예, 예컨대 시퀀싱 분석에 사용될 수 있다. 예를 들면, 핵산 샘플 및 제2의 핵산 샘플의 시퀀싱 방법은 복수의 올리고뉴클레오티드를 적어도 부분적으로 투명한 챔버의 내부 표면에 전달하는 단계; 제1의 핵산 샘플을 내부 표면에 전달하는 단계; 복수의 비특이성 시약을 제1의 채널을 통하여 내부 표면에 전달하는 단계; 특이성 시약을 제2의 채널을 통하여 내부 표면에 전달하는 단계, 여기서 제2의 채널은 제1의 채널보다 더 적은 부피를 가지며; 시퀀싱 반응을 적어도 부분적으로 투명한 챔버의 내부 표면 상에서 가시화하는 단계; 및 제2의 시퀀싱 반응 이전에 적어도 부분적으로 투명한 챔버를 교체하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 적어도 부분적으로 투명한 표면의 외부 표면을 통과하여 기류를 흐르게 한다. 일부 측면에서, 상기 기재된 방법은 진핵 생물의 게놈을 시퀀싱하기 위하여 복수의 올리고뉴클레오티드를 선택하는 것을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 상기 기재된 방법은 사전제조된 튜브를 적어도 부분적으로 투명한 챔버로서 선택하는 것을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 상기 기재된 방법은 원핵 생물의 게놈을 시퀀싱시키기 위하여 복수의 올리고뉴클레오티드를 선택하는 것을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 상기 기재된 방법은 전사체를 시퀀싱하기 위하여 복수의 올리고뉴클레오티드를 선택하는 것을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 상기 기재된 방법은 모세관을 적어도 부분적으로 투명한 챔버로서 선택하는 것을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 상기 기재된 방법은 미세유체 칩을 적어도 부분적으로 투명한 챔버로서 선택하는 것을 포함할 수 있다.
상기 기재된 디바이스 및 시스템은 또한 제1의 시약을 제1의 저장소에 제공하는 단계; 제2의 시약을 제1의 제2의 저장소에 제공하는 단계로서, 제1의 저장소 및 제2의 저장소의 각각이 중앙 영역에 유체적으로 커플링되고, 중앙 영역은 시퀀싱 반응을 위한 표면을 포함하는 것인 단계; 제1의 시약 및 제2의 시약을 플로우 셀 디바이스의 중앙 영역에 순차적으로 투입하는 단계를 포함하고, 여기서 제1의 저장소로부터 중앙 영역의 주입구로 흐르는 제1의 시약의 부피는 제2의 저장소로부터 중앙 영역으로 흐르는 제2의 시약의 부피보다 적은 것인, 시퀀싱 반응에 사용되는 시약을 감소시키는 방법에 사용될 수 있다.
상기 기재된 디바이스 및 시스템의 추가적인 사용은 제1의 시약을 제1의 저장소에 제공하는 단계; 제2의 시약을 제1의 제2의 저장소에 제공하는 단계로서, 제1의 저장소 및 제2의 저장소의 각각이 중앙 영역에 유체적으로 커플링되고, 중앙 영역은 시퀀싱 반응을 위한 표면을 포함하는 것인 단계; 제1의 저장소로부터 중앙 영역의 주입구로 흐르는 제1의 시약의 부피를 제2의 저장소로부터 중앙 영역으로 흐르는 제2의 시약의 부피보다 더 적게 유지하는 단계를 포함하는, 시퀀싱 반응에서 시약의 효율적인 사용을 증가시키는 방법이다.
일반적으로, 제1의 시약은 제2의 작용제보다 더 고가이다. 일부 측면에서, 제1의 시약은 폴리머라제, 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
미세유체 칩의 제조 방법: 미세유체 칩은 마이크로제조 공정의 조합에 의하여 제조될 수 있다. 본원에 기재된 미세유체 칩의 제조 방법은 표면을 제공하는 단계; 및 적어도 1개의 채널을 표면 상에 형성하는 단계를 포함한다. 상기 제조 방법은 또한 적어도 제1의 평면인 표면을 갖는 제1의 기재를 제공하는 단계, 여기서 제1의 표면은 복수의 채널을 가지며; 적어도 제2의 평면인 표면을 갖는 제2의 기재를 제공하는 단계; 및 제1의 기재의 제1의 평면인 표면을 제2의 기재의 제2의 평면인 표면에 결합시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 제1의 표면 상의 채널은 개방된 상부측 및 폐쇄된 하부측을 가지며, 제2의 표면은 채널의 하부측을 통하여 제1의 표면에 본딩되며, 그리하여 채널의 개방된 상부측은 영향을 받지 않는다. 일부 경우에서, 본원에 기재된 방법은 제3의 평면인 표면을 갖는 제3의 기재를 제공하며, 제3의 표면을 제1의 표면에 채널의 개방된 상부측을 통하여 본딩시키는 것을 추가로 포함한다. 본딩 조건은 예를 들면 기재를 가열하거나 또는 접착제를 제1의 또는 제2의 기재의 평면인 표면 중 하나에 적용하는 것을 포함할 수 있다.
통상적으로, 디바이스는 마이크로제조되므로, 기재 물질은 공지된 마이크로제조 기술, 예를 들면 포토리토그래피, 습식 화학적 에칭, 레이저 절제, 레이저 조사, 공기 마모 기술, 사출 성형, 엠보싱 및 기타 기술과의 호환성에 기초하여 선택될 것이다. 기재 물질은 또한 일반적으로 pH, 온도, 염 농도의 극단 및, 조명 또는 전계의 인가를 포함한, 미세유체 디바이스가 노출될 수 있는 조건의 전 범위와의 호환성을 위하여 선택된다. 따라서, 일부 바람직한 측면에서, 기재 물질은 실리카계 기재, 예컨대 보로실리케이트 유리, 석영뿐 아니라, 기타 기재 물질을 포함할 수 있다.
추가적인 바람직한 측면에서, 기재 물질은 중합체 물질, 예를 들면 플라스틱, 예컨대 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리카르보네이트, 폴리테트라플루오로에틸렌(테플론(TEFLON)™), 폴리비닐클로라이드(PVC), 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리술폰 등을 포함한다. 상기 중합체 기재은 상기 기재된 바와 같이 또는 마이크로제조된 마스터로부터 잘 공지된 성형 기술, 예컨대 사출 성형, 엠보싱 또는 스탬핑을 사용하거나 또는 중합체 전구 물질을 몰드 내에서 중합시켜 이용 가능한 마이크로제조 기술을 사용하여 쉽게 제조된다(미국 특허 제5,512,131호 참조). 상기 중합체 기재 물질은 그의 제조 용이성, 저 비용 및 처분 가능성뿐 아니라, 대부분의 극한 반응 조건에 대한 그의 일반적인 불활성에 대하여 바람직하다. 다시, 상기 중합체 물질은 미세유체 시스템에서의 유용성을 향상시키며, 예를 들면 향상된 유체 방향을 제공하기 위하여 처리된 표면, 예를 들면 유도체화되거나 또는 코팅된 표면을 포함할 수 있다.
미세유체 디바이스의 채널 및/또는 챔버는 통상적으로 상기 기재된 마이크로제조 기술을 사용하여 마이크로규모의 채널(예, 그루브, 오목부)로서 제1의 기재의 상부 표면에 제조된다. 제1의 기재는 제1의 평면인 표면을 갖는 상부측 및 하부측을 포함한다. 본원에 기재된 방법에 따라 생성된 미세유체 디바이스에서, 복수의 채널(예, 그루브 및/또는 오목부)은 제1의 평면인 표면 상에 형성된다. 일부 경우에서, 제1의 평면인 표면에 형성된 채널(예, 그루브 및/또는 오목부)(제2의 기재의 첨가 전)은 상부가 개방되어 있는 하부벽 및 측벽을 갖는다. 일부 경우에서, 제1의 평면인 표면에서 채널(예, 그루브 및/또는 오목부)(제2의 기재의 첨가 전)은 상부가 폐쇄되어 있는 하부벽 및 측벽을 갖는다. 일부 경우에서, 제1의 평면인 표면에서 채널(예, 그루브 및/또는 오목부)(제2의 기재의 첨가 전)은 측벽만을 가지며, 상부면 또는 하부면은 없다.
제1의 기재의 제1의 평면인 표면이 제2의 기재의 평면인 표면과 접촉 배치되고, 본딩될 경우, 제2의 기재는 제1의 기재의 표면에서 그루브 및/또는 오목부를 커버 및/또는 밀폐시켜 디바이스의 채널 및/또는 챔버(예, 내부 부분)를 상기 2개의 부품의 계면에서 형성할 수 있다.
제1의 기재를 제2의 기재에 본딩시킨 후, 구조는 추가로 제3의 기재과 접촉 배치되고, 이에 본딩될 수 있다. 제3의 기재는 제2의 기재와 접촉하지 않는 제1의 기재의 측면과 접촉 배치될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1의 기재는 제2의 기재 및 제3의 기재 사이에 배치된다. 일부 실시양태에서, 제2의 기재 및 제3의 기재는 제1의 기재 상의 그루브, 오목부 또는 어퍼쳐를 커버 및/또는 밀폐시켜 상기 부품의 계면에서 디바이스의 채널 및/또는 챔버(예, 내부 부분)를 형성할 수 있다.
디바이스는 그루브 또는 오목부으로부터 디바이스의 내부 부분에 형성된 채널 및/또는 챔버 중 적어도 하나와 소통되도록 배향되는 개구부를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 개구부는 제1의 기재 상에 형성된다. 일부 실시양태에서, 개구부는 제1의 및 제2의 기재 상에 형성된다. 일부 실시양태에서, 개구부는 제1의, 제2의 및 제3의 기재 상에 형성된다. 일부 실시양태에서, 개구부는 디바이스의 상부측에 배치된다. 일부 실시양태에서, 개구부는 디바이스의 하부측에 배치된다. 일부 실시양태에서, 개구부는 디바이스의 제1의 및/또는 제2의 단부에 배치되며, 채널은 제1의 단부로부터 제2의 단부 방향을 따라 진행된다.
기재가 함께 본딩될 수 있는 조건은 일반적으로 널리 이해되며, 상기 기재의 본딩은 일반적으로 사용된 기재 물질의 성질에 의존하여 변경될 수 있는 임의의 다수의 방법에 의하여 실시된다. 예를 들면, 기재의 열적 본딩은 예를 들면 유리 또는 실리카계 기재뿐 아니라, 중합체계 기재를 포함한 다수의 기재 물질에 적용될 수 있다. 상기 열적 본딩은 통상적으로 고온의 조건 및 일부 사례에서 외부 압력의 인가 하에서 본딩되는 기재를 함께 교합시키는 것을 포함한다. 정확한 온도 및 압력은 일반적으로 사용된 기재 물질의 성질에 의존하여 변경된다.
예를 들면, 실리카계 기재 물질, 즉 유리(보로실리케이트 유리, 파이렉스(Pyrex)™, 소다 석회 유리 등), 석영 등의 경우, 기재의 열적 본딩은 통상적으로 예를 들면 약 500℃ 내지 약 1,400℃, 바람직하게는 약 500℃ 내지 약 1,200℃ 범위내의 온도에서 실시된다. 예를 들면 소다 석회 유리는 통상적으로 약 550℃에서 본딩되는 반면, 보로실리케이트 유리는 통상적으로 800℃에서 또는 부근에서 열적 본딩된다. 다른 한편으로 석영 기재는 통상적으로 1,200℃에서 또는 부근의 온도에서 열적 본딩된다. 상기 본딩 온도는 통상적으로 본딩되는 기재를 고온 어닐링 오븐에 배치하여 달성된다.
다른 한편으로, 열적 본딩된 중합체 기재는 통상적으로 기재의 지나친 용융 및/또는 왜곡, 예를 들면 디바이스의 내부 부분, 즉 채널 또는 챔버의 편평화를 방지하기 위하여, 실리카계 기재보다 더 낮은 온도 및/또는 압력을 사용할 것이다. 일반적으로, 중합체 기재를 본딩시키기 위한 상기 고온은 사용된 중합체 물질에 의존하여 약 80℃ 내지 약 200℃로 변경될 것이며, 약 90℃ 내지 150℃가 바람직할 것이다. 중합체 기재의 본딩에 요구되는 크게 감소된 온도로 인하여, 상기 본딩은 통상적으로 실리카계 기재의 본딩에 사용되는 바와 같이 고온 오븐을 필요로 하지 않으면서 실시될 수 있다. 이는 하기에서 상세하게 기재되는 바와 같이 단일의 통합된 본딩 시스템 내에서 열원을 투입한다.
접착제는 또한 통상적으로 본딩되는 기재 사이에 접착제 층을 적용하고, 접착제가 경화될 때까지 이들을 함께 압착시키는 것을 포함하는, 널리 공지된 방법에 따라 기재를 함께 본딩시키는데 사용될 수 있다. 다양한 접착제는 예를 들면 시판 중인 UV 경화성 접착제를 포함한 상기 방법에 따라 사용될 수 있다. 예를 들면 중합체 부품의 음향 또는 초음파 용접 및/또는 용매 용접을 포함한 대안의 방법은 또한 본 발명에 따라 기재를 함께 본딩시키는데 사용될 수 있다.
통상적으로, 다수의 기재된 미세유체 칩 또는 디바이스는 한번에 제조될 것이다. 예를 들면, 중합체 기재는 교합 및 함께 본딩될 수 있는 커다란 분리 가능한 시트에서 스탬핑 또는 성형될 수 있다. 개별적인 디바이스 또는 본딩된 기재는 더 큰 시트로부터 분리될 수 있다. 유사하게, 실리카계 기재의 경우, 개별적인 디바이스는 더 큰 기재 웨이퍼 또는 판으로부터 제조되어 제조 공정의 더 큰 처리량을 허용한다. 구체적으로, 다수의 채널 구조는 제1의 기재 웨이퍼 또는 판으로 제조된 후, 제2의 기재 웨이퍼 또는 판으로 덮고, 임의로 제3의 기재 웨이퍼 또는 판으로 추가로 덮는다. 그 후, 생성된 복수의 디바이스는 더 큰 기재로부터 공지된 방법, 예컨대 톱질, 스크리빙 및 절단 등을 사용하여 분할될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 다양한 채널 및 챔버를 밀폐시키기 위하여 상부 또는 제2의 기재는 하부 또는 제1의 기재 위에 덮는다. 본 발명의 방법에 따른 본딩 공정의 실시에서, 제1의 및 제2의 기재의 본딩은 진공을 사용하여 2개의 기재 표면이 최적의 접촉으로 유지되도록 실시된다. 특히, 하부 기재는 하부 기재의 평면인 표면을 상부 기재의 평면인 표면과 교합시키고, 상부 기재를 통하여 배치된 구멍을 통하여 진공을 인가하여 상부 기재와의 최적의 접촉으로 유지될 수 있다. 통상적으로, 상부 기재에서 진공을 구멍에 인가하는 것은 통상적으로 통합된 진공 공급원을 갖는 장착 테이블 또는 표면을 포함하는 진공 척(chuck) 상에 상부 기재를 배치하여 실시된다. 실리카계 기재의 경우, 본딩된 기재는 고온에서 처리하여 초기 결합을 생성하며, 그리하여 본딩된 기재는 서로에 대한 어떠한 이동도 없이 어닐링 오븐에 전달될 수 있다.
본원에 기재된 장치룰 사용하여 투입하기 위한 대안의 본딩 시스템은 예를 들면 접착제 층을 기재의 2개의 평면인 표면 사이에 적용하기 위한 접착제 분배 시스템을 포함한다. 이는 기재를 교합시키기 전 접착제 층을 인가하거나 또는 인접하는 기재의 하나의 가장자리에서 소정량의 접착제를 배치하고, 2개 교합된 기재의 심지 작용이 2개의 기재 사이의 공간 전체에 접착제를 인출시켜 이루어질 수 있다.
특정한 실시양태에서, 전체 본딩 시스템은 상부 및 하부 기재를 장착 표면에 배치하고, 후속 본딩을 위하여 이들을 정렬시키기 위한 자동화 시스템을 포함할 수 있다. 통상적으로, 상기 시스템은 장착 표면 또는, 상부 및 하부 기재 중 하나 이상을 서로에 대하여 이동시키기 위한 전위 시스템을 포함한다. 예를 들면, 로보트 시스템은 장착 테이블 상에서 및 정렬 구조 내에서 상부 및 하부 기재 각각을 들어올리고, 전위 및 배치시키는데 사용될 수 있다. 본딩 공정 후, 상기 시스템은 또한 본딩을 위하여 추가적인 기재를 그 위에 배치하기 전에, 최종 생성물을 장착 표면으로부터 제거하고, 상기 교합된 기재를 후속 작업, 예를 들면 분리 작업에 전달할 수 있다.
일부 경우에서, 미세유체 칩의 제조는 칩을 생성하기 위하여 기재의 2개 이상의 층을 레이어링 또는 적층시키는 것을 포함한다. 예를 들면, 미세유체 디바이스에서, 디바이스의 미세유체 요소는 통상적으로 레이저 조사, 에칭에 의하여 생성되거나 또는 달리 특징을 제1의 기재의 표면으로 제조한다. 그 후, 제2의 기재를 제1의 기재의 표면에 적층 또는 본딩시켜 상기 특징을 밀폐시키고, 디바이스의 유체 요소, 예를 들면 유체 채널을 제공한다.
실시예
본 실시예는 단지 예시를 위하여 제공하며, 본원에 제공된 청구범위의 범주를 제한하지 않는다.
실시예
1
핵산 클러스터는 모세관 내에서 설정되었으며, 형광 영상화로 처리하였다. 모세관을 갖는 플로우 디바이스를 테스트에 사용하였다. 생성된 클러스터 화상을 도 8에 제시하였다. 도 8은 본원에 개시된 바와 같은 모세관 시스템의 루멘 내의 클러스터가 신뢰성 있게 증폭되고, 가시화될 수 있다는 것을 입증한다.
실시예
2
플로우 셀 디바이스는 도 9에 도시된 바와 같은 단계 중 하나를 사용하여 유리의 1, 2 또는 3개의 층으로 구성될 수 있다. 도 9에서, 플로우 셀 디바이스는 유리의 1, 2 또는 3층으로 생성될 수 있다. 유리는 석영 또는 보로실리케이트 유리일 수 있다. 도 9a-9c는 상기 디바이스를 웨이퍼 레벨에서 예컨대 집속 펨토세컨드 레이저 조사(1 피스) 및/또는 레이저 유리 본딩(2 또는 3피스 구성)과 같은 기술을 사용하여 생성하는 방법을 도시한다.
도 9a에서, 웨이퍼의 제1의 층은 레이저(예, 펨토세컨드 레이저 조사)로 처리하여 웨이퍼 물질을 절제하고, 패턴형성된 표면을 제공한다. 패턴형성된 표면은 표면 상의 복수의 채널, 예컨대 웨이퍼당 12개의 채널일 수 있다. 웨이퍼는 210 ㎜의 직경을 갖는다. 그 후, 처리된 웨이퍼를 지지체 판에 배치하여 유체 흐름을 특정 방향을 통하여 보내는데 사용될 수 있는 채널을 형성할 수 있다.
도 9b에서, 패턴형성된 표면을 갖는 웨이퍼의 제1의 층은 웨이퍼의 제2의 층과 접촉 배치되어 본딩될 수 있다. 본딩은 레이저 유리 본딩 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 제2의 층은 패턴형성된 표면을 갖는 웨이퍼 상에서 그루브, 오목부 또는 어퍼쳐를 커버 및/또는 밀폐시켜 상기 부품의 계면에서 디바이스의 채널 및/또는 챔버(예, 내부 부분)를 형성할 수 있다. 그 후, 웨이퍼의 2개의 층과의 본딩된 구조체는 지지체 판 상에 배치될 수 있다. 패턴형성된 표면은 표면 상의 복수의 채널, 예컨대 웨이퍼당 12개의 채널일 수 있다. 웨이퍼는 210 ㎜의 직경을 가질 수 있다.
도 9c에서, 패턴형성된 표면을 갖는 웨이퍼의 제1의 층은 한쪽에서 웨이퍼의 제2의 층에 접촉 배치되어 이에 본딩될 수 있으며, 웨이퍼의 제3의 층은 다른 쪽에서 제1의 웨이퍼 층에 본딩되어 웨이퍼의 제1의 층이 웨이퍼의 제2의 및 제3의 층 사이에 배치되도록 할 수 있다. 본딩은 레이저 유리 본딩 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 웨이퍼의 제2의 층 및 제3의 층은 패턴형성된 표면을 갖는 웨이퍼 상에서 그루브, 오목부 또는 어퍼쳐를 커버 및/또는 밀폐시켜 디바이스의 채널 및/또는 챔버(예, 내부 부분)를 형성할 수 있다. 그 후, 웨이퍼의 3층과의 본딩된 구조는 지지체 판 상에 배치될 수 있다. 패턴형성된 표면은 표면 상의 복수의 채널, 예컨대 웨이퍼당 12개의 채널일 수 있다. 웨이퍼는 210 ㎜의 직경을 가질 수 있다.
실시예
3
도 10a는 1피스 유리 플로우 셀 설계를 나타낸다. 상기 설계에서, 흐름 채널 및 주입구 배출구 구멍은 집속 펨토세컨드 레이저 조사 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 플로우 셀 상에 2개의 채널/레인이 있으며, 각각의 채널은 각각의 열에서 26개의 프레임을 갖는 2개의 열을 갖는다. 채널은 약 100 ㎛의 깊이를 가질 수 있다. 채널(1)은 주입구 구멍(A1) 및 배출구 구멍(A2)을 가지며, 채널(2)는 주입구 구멍(B1) 및 배출구 구멍(B2)을 갖는다. 플로우 셀은 또한 1D 선형 및 사람 판독 가능한 코드 및 임의로 2D 매트릭스 코드를 가질 수 있다.
도 10b는 2피스 유리 플로우 셀을 나타낸다. 상기 설계에서, 흐름 채널 및 주입구 및 배출구 구멍은 집속 펨토세컨드 레이저 조사 또는 화학적 에칭 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 2피스는 레이저 유리 본딩 기술로 함께 본딩될 수 있다. 주입구 및 배출구 구멍은 구조체의 상부층 상에 배치될 수 있으며, 이들이 디바이스의 내부 부분에 형성된 채널 및/또는 챔버 중 적어도 1개와 소통하도록 하는 방식으로 배향된다. 셀에는 2개의 채널이 있으며, 각각의 채널은 각각의 열에서 26개의 프레임을 갖는 2개의 열이 존재한다. 채널은 약 100 ㎛의 깊이를 가질 수 있다. 채널(1)은 주입구 구멍(A1) 및 배출구 구멍(A2)을 가지며, 채널(2)는 주입구 구멍(B1) 및 배출구 구멍(B2)을 갖는다. 플로우 셀은 또한 1D 선형 및 사람 판독 가능한 코드 및 임의로 2D 매트릭스 코드를 가질 수 있다.
도 10c는 3피스 유리 플로우 셀을 나타낸다. 상기 설계에서, 흐름 채널 및 주입구 및 배출구 구멍은 집속 펨토세컨드 레이저 조사 또는 화학적 에칭 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 3피스는 레이저 유리 본딩 기술을 사용하여 함께 본딩될 수 있다. 패턴형성된 표면을 갖는 웨이퍼의 제1의 층은 한쪽에서 웨이퍼의 제2의 층에 본딩될 수 있으며, 웨이퍼의 제3의 층은 다른 쪽에서 제1의 웨이퍼 층에 본딩되어 웨이퍼의 제1의 층이 웨이퍼의 제2의 층 및 제3의 층 사이에 배치되도록 할 수 있다. 주입구 및 배출구 구멍은 구조체의 상부층 상에 배치되고, 이들이 디바이스의 내부 부분에 형성된 채널 및/또는 챔버 중 적어도 하나와 소통되도록 하는 방식으로 배향될 수 있다. 셀에는 2개의 채널이 존재하며, 각각의 채널은 각각의 열에서 26개의 프레임을 갖는 2개의 열을 갖는다. 채널은 약 100 ㎛의 깊이를 가질 수 있다. 채널(1)은 주입구 구멍(A1) 및 배출구 구멍(A2)을 가지며, 채널(2)는 주입구 구멍(B1) 및 배출구 구멍(B2)을 갖는다. 플로우 셀은 또한 1D 선형 및 사람 판독 가능한 코드 및 임의로 2D 매트릭스 코드를 가질 수 있다.
실시예
4
플로우 셀은 생성된 유리 채널을 KOH로 세척한 후, 에탄올로 헹구고, 30 분 동안 65℃에서 실란화시켜 코팅하였다. 채널 표면을 EDC-NHS로 30 분 동안 활성화시킨 후, 5 ㎛ 프라이머로 20 분 동안 인큐베이션에 이어서 30 ㎛ PEG-NH2를 사용한 부동태화에 의하여 프라이머를 그래프팅하였다.
다층 표면은 실시예 4의 접근법에 따라 생성되며, 여기서 PEG 부동태화를 수행하여 멀티 아암이 형성된 PEG-NHS를 PEG-NH2의 첨가로 채널을 통하여 흐른 후, 임의로 PEG-NHS를 사용한 또 다른 인큐베이션 및 임의로 멀티 아암이 형성된 PEG-NH2를 사용한 또 다른 인큐베이션을 실시하였다. 상기 표면의 경우, 프라이머를 임의의 단계에서, 특히 멀티 아암이 형성된 PEG-NH2의 최종 첨가 후 그래프팅될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태를 본원에 제시 및 기재하였으나, 해당 기술분야의 기술자에게는 상기 실시양태가 단지 예로서 제공된다는 것은 자명할 것이다. 다수의 수정예, 변경예 및 치환예는 본 발명으로부터 벗어남 없이 해당 기술분야의 기술자에게 발생될 것이다. 본원에 기재된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대체예는 본 발명을 실시하는데 있어서 임의의 조합으로 사용될 수 있는 것으로 이해하여야 한다. 하기 청구범위는 본 발명의 범주를 정의하며, 그러한 청구범위 및 그의 등가예의 범주 내의 방법 및 구조는 포함시키고자 한다.
Claims (153)
- 플로우 셀 디바이스로서,
(a) 제1의 용액을 수용하고 주입 단부 및 배출 단부를 갖는 제1의 저장소로서, 제1의 작용제가 제1의 저장소 내에서 주입 단부로부터 배출 단부로 흐르는 것인 제1의 저장소;
(b) 제2의 용액을 수용하고 주입 단부 및 배출 단부를 갖는 제2의 저장소로서, 제2의 작용제가 제2의 저장소 내에서 주입 단부로부터 배출 단부로 흐르는 것인 제2의 저장소;
(c) 제1의 저장소의 배출 단부 및 제2의 저장소의 배출 단부에 적어도 하나의 밸브를 통하여 유체적으로 커플링된 주입 단부를 갖는 중앙 영역
을 포함하고,
제1의 저장소의 배출구로부터 중앙 영역의 주입구로 흐르는 제1의 용액의 부피가 제2의 저장소의 배출구로부터 중앙 영역의 주입구로 흐르는 제2의 용액의 부피보다 적은 플로우 셀 디바이스. - 제1항에 있어서, 제1의 용액이 제2의 용액과 상이한 것인 디바이스.
- 제1항에 있어서, 제2의 용액이 중앙 영역 내에서 발생하는 복수의 반응에 공통인 적어도 하나의 시약을 포함하는 것인 디바이스.
- 제1항에 있어서, 제2의 용액이 용매, 폴리머라제 및 dNTP로 이루어진 리스트로부터 선택된 적어도 하나의 시약을 포함하는 것인 디바이스.
- 제1항에 있어서, 제2의 용액이 저 비용 시약을 포함하는 것인 디바이스.
- 제1항에 있어서, 제1의 저장소가 제1의 밸브를 통하여 중앙 영역에 유체적으로 커플링되고, 제2의 저장소가 제2의 밸브를 통하여 중앙 영역에 유체적으로 커플링되는 것인 디바이스.
- 제1항에 있어서, 밸브가 격막 밸브인 디바이스.
- 제1항에 있어서, 제1의 용액이 시약을 포함하고, 제2의 용액이 시약을 포함하며, 제1의 용액 중의 시약이 제2의 용액 중의 시약보다 더 비싼 것인 디바이스.
- 제1항에 있어서, 제1의 용액이 반응 특이성 시약을 포함하고, 제2의 용액이 중앙 영역 내에서 발생하는 모든 반응에 공통인 비특이성 시약을 포함하며, 반응 특이성 시약이 비특이성 시약보다 더 비싼 것인 디바이스.
- 제1항에 있어서, 제1의 저장소가, 제1의 용액의 전달을 위한 무용 부피(dead volume)를 감소시키기 위하여 중앙 영역의 주입구에 근접하여 배치되는 것인 디바이스.
- 제1항에 있어서, 제1의 저장소가 제2의 저장소보다 중앙 영역의 주입구에 더 가까이 배치되는 것인 디바이스.
- 제1항에 있어서, 반응 특이성 시약은, 복수의 저장소로부터 제1의 격막 밸브로의 복수의 비특이성 시약의 전달에 대한 무용 부피를 감소시키기 위하여 제2의 격막 밸브에 근접하게 구성되는 것인 디바이스.
- 제1항에 있어서, 중앙 영역이 모세관을 포함하는 것인 디바이스.
- 제13항에 있어서, 모세관이 기성 제품인 디바이스.
- 제13항에 있어서, 모세관이 디바이스로부터 제거 가능한 것인 디바이스.
- 제13항에 있어서, 모세관이, 진핵 생물의 게놈을 시퀀싱하도록 지시된 올리고뉴클레오티드 집단을 포함하는 것인 디바이스.
- 제1항에 있어서, 중앙 영역이 미세유체 칩을 포함하는 것인 디바이스.
- 제17항에 있어서, 미세유체 칩이 단일의 에칭된 층을 포함하는 것인 디바이스.
- 제17항에 있어서, 미세유체 칩이 적어도 하나의 칩 채널을 포함하는 것인 디바이스.
- 제19항에 있어서, 채널이 50 내지 300 ㎛ 범위의 평균 깊이를 갖는 것인 디바이스.
- 제19항에 있어서, 채널이 1 내지 200 ㎜ 범위의 평균 길이를 갖는 것인 디바이스.
- 제19항에 있어서, 채널이 0.1 내지 30 ㎜ 범위의 평균 폭을 갖는 것인 디바이스.
- 제19항에 있어서, 채널이 레이저 조사에 의하여 형성되는 것인 디바이스.
- 제17항에 있어서, 미세유체 칩이 하나의 에칭된 층을 포함하는 것인 디바이스.
- 제17항에 있어서, 미세유체 칩이 하나의 비에칭된 층을 포함하며, 에칭된 층이 비에칭된 층과 본딩되는 것인 디바이스.
- 제17항에 있어서, 미세유체 칩이 2개의 비에칭된 층을 포함하며, 에칭된 층이 2개의 비에칭된 층 사이에 배치되는 것인 디바이스.
- 제17항에 있어서, 미세유체 칩이 적어도 2개의 본딩된 층을 포함하는 것인 디바이스.
- 제17항에 있어서, 미세유체 칩이 석영을 포함하는 것인 디바이스.
- 제17항에 있어서, 미세유체 칩이 보로실리케이트 유리를 포함하는 것인 디바이스.
- 제19항에 있어서, 칩 채널이, 원핵 생물의 게놈을 시퀀싱하도록 지시된 올리고뉴클레오티드 집단을 포함하는 것인 디바이스.
- 제19항에 있어서, 칩 채널이, 전사체를 시퀀싱하도록 지시된 올리고뉴클레오티드 집단을 포함하는 것인 디바이스.
- 제19항에 있어서, 칩 채널이 레이저 조사에 의하여 형성되는 것인 디바이스.
- 제19항에 있어서, 칩 채널이 개방 상부를 갖는 것인 디바이스.
- 제19항에 있어서, 칩 채널이 상부층과 하부층 사이에 배치되는 것인 디바이스.
- 제19항에 있어서, 칩 채널이 상부층에 인접하게 배치되는 것인 디바이스.
- 제1항에 있어서, 중앙 영역이, 중앙 영역의 적어도 일부가 조명 및 영상화되도록 하는 윈도우를 포함하는 것인 디바이스.
- 제13항에 있어서, 모세관이, 모세관의 적어도 일부가 조명 및 영상화되도록 하는 윈도우를 포함하는 것인 디바이스.
- 제19항에 있어서, 에칭된 채널이, 칩 채널의 적어도 일부가 조명 및 영상화되도록 하는 윈도우를 포함하는 것인 디바이스.
- 제1항에 있어서, 중앙 영역이, 이에 테더링된 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드를 갖는 표면을 포함하는 것인 디바이스.
- 제39항에 있어서, 표면이 채널 또는 모세관의 내부 표면인 디바이스.
- 제39항 또는 제40항에 있어서, 표면이 국소적으로 평면인 표면인 디바이스.
- 제39항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 표면에 직접 테더링되는 것인 디바이스.
- 제39항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 중간 분자를 통하여 표면에 테더링되는 것인 디바이스.
- 제39항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가, 진핵 생물의 게놈 핵산 분절에 특이적으로 하이브리드화하는 분절을 나타내는 것인 디바이스.
- 제39항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가, 원핵 생물의 게놈 핵산 분절에 특이적으로 하이브리드화하는 분절을 나타내는 것인 디바이스.
- 제39항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가, 바이러스 핵산 분절에 특이적으로 하이브리드화하는 분절을 나타내는 것인 디바이스.
- 제39항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가, 전사체 핵산 분절에 특이적으로 하이브리드화하는 분절을 나타내는 것인 디바이스.
- 제1항에 있어서, 중앙 영역이 진핵 생물의 게놈을 시퀀싱하기에 적절한 내부 부피를 포함하는 것인 디바이스.
- 제1항에 있어서, 중앙 영역이 원핵 생물의 게놈을 시퀀싱하기에 적절한 내부 부피를 포함하는 것인 디바이스.
- 제1항에 있어서, 중앙 영역이 전사체를 시퀀싱하기에 적절한 내부 부피를 포함하는 것인 디바이스.
- 제1항에 있어서, 중앙 영역에 열적으로 커플링되는 온도 변조기를 포함하는 디바이스.
- 제1항에 있어서, 온도 변조기가 히트 블록(heat block)을 포함하는 것인 디바이스.
- 제1항에 있어서, 온도 변조기가 벤트(vent)를 포함하는 것인 디바이스.
- 제1항에 있어서, 온도 변조기가 공기 흐름에 대한 코스를 포함하는 것인 디바이스.
- 제1항에 있어서, 온도 변조기가 팬(fan)을 포함하는 것인 디바이스.
- 플로우 셀 디바이스로서,
(d) 프레임워크;
(e) 플로우 셀과 호환성을 갖는 복수의 반응에 공통인 시약을 보유하는 복수의 저장소;
(f) 반응 특이성 시약을 보유하는 단일의 저장소;
(g) 1) 복수의 저장소로부터 복수의 비특이성 시약의 유입을 게이트 제어하는 제1의 격막 밸브 및 2) 제2의 격막 밸브에 근접한 공급원 저장소로부터 단일의 시약의 유입을 게이트 제어하는 제2의 격막 밸브를 갖는 제거 가능한 모세관
을 포함하는 플로우 셀 디바이스. - 제56항에 있어서, 프레임워크가 열적 변조기를 포함하는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제57항에 있어서, 열적 변조기가 히트 블록을 포함하는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제57항에 있어서, 열적 변조기가 벤트를 포함하는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제57항에 있어서, 열적 변조기가 공기 흐름을 위한 코스를 포함하는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제57항에 있어서, 열적 변조기가 팬을 포함하는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제56항에 있어서, 프레임워크가 광 검출 엑세스 영역을 포함하는 것인 모세관 플로우 셀 디바이스.
- 제62항에 있어서, 광 검출 엑세스 영역이 여기 스펙트럼으로의 제거 가능한 모세관의 노출을 허용하는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제62항에 있어서, 광 검출 엑세스 영역이 제거 가능한 모세관으로부터 발생하는 방출 스펙트럼의 검출을 허용하는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제56항에 있어서, 복수의 반응에 공통인 시약이 용매, 폴리머라제 및 dNTP로 이루어진 리스트로부터 선택된 적어도 하나의 시약을 포함하는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제56항에 있어서, 복수의 반응에 공통인 시약이 저 비용 시약을 포함하는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제56항에 있어서, 복수의 반응에 공통인 시약이, 제2의 격막 밸브를 단일 저장소에 연결시키는 제2의 채널보다 더 긴 제1의 채널을 통하여 제1의 격막 밸브로 보내지는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제56항에 있어서, 반응 특이성 시약이 임의의 하나의 비특이성 시약보다 더 비싼 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제56항에 있어서, 반응 특이성 시약이 모든 비특이성 시약보다 더 비싼 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제56항에 있어서, 반응 특이성 시약은, 복수의 저장소로부터 제1의 격막 밸브로의 복수의 비특이성 시약의 전달에 대한 무용 부피를 감소시키기 위하여 제2의 격막 밸브에 근접하게 구성되는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제56항에 있어서, 모세관이 국소적으로 평면인 표면을 포함하는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제71항에 있어서, 국소적으로 평면인 표면이 여기 파장에 대하여 적어도 부분적으로 투명한 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제71항에 있어서, 국소적으로 평면인 표면이 방출 파장에 대하여 적어도 부분적으로 투명한 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제71항에 있어서, 국소적으로 평면인 표면이, 이에 테더링된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제74항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 표면에 직접 테더링되는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제74항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 중간 분자를 통하여 표면에 테더링되는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제74항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가, 진핵 생물의 게놈 핵산 분절에 특이적으로 하이브리드화하는 분절을 나타내는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제74항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가, 원핵 생물의 게놈 핵산 분절에 특이적으로 하이브리드화하는 분절을 나타내는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제74항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가, 바이러스 핵산 분절에 특이적으로 하이브리드화하는 분절을 나타내는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제74항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가, 전사체 핵산 분절에 특이적으로 하이브리드화하는 분절을 나타내는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제56항에 있어서, 모세관이 진핵 생물의 게놈을 시퀀싱하기에 적절한 내부 부피를 포함하는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제56항에 있어서, 모세관이 원핵 생물의 게놈을 시퀀싱하기에 적절한 내부 부피를 포함하는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제56항에 있어서, 모세관이 전사체를 시퀀싱하기에 적절한 내부 부피를 포함하는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제56항에 있어서, 모세관이 튜브를 포함하는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제84항에 있어서, 튜브가 기성 제품인 플로우 셀 디바이스.
- 제85항에 있어서, 튜브가 프레임워크의 사양에 부합하도록 제조되는 것인 모세관 플로우 셀 디바이스.
- 제85항에 있어서, 튜브가, 진핵 생물의 게놈을 시퀀싱하도록 지시된 올리고뉴클레오티드 집단을 포함하는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제56항에 있어서, 디바이스가 미세유체 칩을 포함하는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제88항에 있어서, 미세유체 칩이 단일의 에칭된 층을 포함하는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제88항에 있어서, 미세유체 칩이 적어도 하나의 칩 채널을 포함하는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제88항에 있어서, 미세유체 칩이 하나의 에칭된 층을 포함하는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제91항에 있어서, 미세유체 칩이 하나의 비에칭된 층을 포함하는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제91항에 있어서, 미세유체 칩이 2개의 비에칭된 층을 포함하는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제91항에 있어서, 미세유체 칩이 적어도 2개의 본딩된 층을 포함하는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제88항에 있어서, 미세유체 칩이 석영을 포함하는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제88항에 있어서, 미세유체 칩이 보로실리케이트 유리를 포함하는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제90항에 있어서, 칩 채널이, 원핵 생물의 게놈을 시퀀싱하도록 지시된 올리고뉴클레오티드 집단을 포함하는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제90항에 있어서, 칩 채널이, 전사체를 시퀀싱하도록 지시된 올리고뉴클레오티드 집단을 포함하는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 플로우 셀 디바이스로서,
a) 교체 가능한 하나 이상의 모세관;
b) 하나 이상의 모세관에 부착되며, 하나 이상의 모세관의 각각과, 플로우 셀 디바이스의 외부에 있는 유체 제어 시스템 사이에서 유체 연통을 제공하는 튜빙과 교합하도록 구성된 2개 이상의 유체 어댑터; 및
c) 임의로, 하나 이상의 모세관이 카트리지에 대하여 고정된 배향으로 유지되도록 하나 이상의 모세관과 교합하도록 구성된 카트리지로서, 2개 이상의 유체 어댑터가 카트리지와 통합되는 것인 카트리지
를 포함하는 플로우 셀 디바이스. - 제99항에 있어서, 하나 이상의 모세관의 적어도 일부가 광학적으로 투명한 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제99항 또는 제100항에 있어서, 하나 이상의 모세관이 유리, 용융 실리카, 아크릴, 폴리카르보네이트, 시클릭 올레핀 공중합체(COC), 시클릭 올레핀 중합체(COP) 또는 이들의 임의의 조합으로부터 제조되는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제99항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 모세관이 원형, 정사각형 또는 직사각형 단면을 갖는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제99항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 모세관 루멘의 최대 내부 단면 치수가 약 10 ㎛ 내지 약 1 ㎜인 플로우 셀 디바이스.
- 제99항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 모세관 루멘의 최대 내부 단면 치수가 약 500 ㎛ 미만인 플로우 셀 디바이스.
- 제99항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 유체 어댑터가 폴리디메틸실록산(PDMS; 엘라스토머), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리카르보네이트(PC), 폴리프로필렌(PP), 폴리에틸렌(PE), 고 밀도 폴리에틸렌(HDPE), 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리이미드, 시클릭 올레핀 중합체(COP), 시클릭 올레핀 공중합체(COC), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 에폭시 수지 또는 이들의 임의의 조합으로부터 제조되는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제99항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 카트리지가 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리카르보네이트(PC), 폴리프로필렌(PP), 폴리에틸렌(PE), 고 밀도 폴리에틸렌(HDPE), 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리이미드, 시클릭 올레핀 중합체(COP), 시클릭 올레핀 공중합체(COC), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 에폭시 수지 또는 이들의 임의의 조합으로부터 제조되는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제99항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 카트리지가 하나 이상의 미니어쳐 밸브, 미니어쳐 펌프, 온도 제어 부품 또는 이들의 임의의 조합을 더 포함하는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제99항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 모세관의 모세관 루멘이 낮은 비특이성 결합 코팅을 포함하는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제108항에 있어서, 낮은 비특이성 결합 코팅이 공유 테더링된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 더 포함하는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제109항에 있어서, 공유 테더링된 올리고뉴클레오티드가 약 1,000/㎛2의 표면 밀도로 테더링되는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제108항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 낮은 비특이성 결합 코팅의 표면 성질이, 하나 이상의 모세관 내에서 수행되는 고상 핵산 증폭 방법의 최적의 성능을 제공하도록 조절되는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제108항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 플로우 셀 디바이스가 2개 이상의 모세관을 포함하며, 2개 이상의 모세관의 낮은 비특이성 결합 코팅이 동일한 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제108항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 플로우 셀 디바이스가 2개 이상의 모세관을 포함하며, 하나 이상의 모세관의 낮은 비특이성 결합 코팅이 나머지 모세관의 것과는 상이한 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제1항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 플로우 셀 디바이스가, 부동태화된 내부 표면을 포함하는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제114항에 있어서, 내부 표면이
a) 기재;
b) 적어도 하나의 친수성 중합체 코팅층;
c) 적어도 하나의 친수성 중합체 코팅층에 부착된 복수의 올리고뉴클레오티드 분자; 및
d) 복수의 부착된 올리고뉴클레오티드 분자에 어닐링된 복수의 클론 증폭된 샘플 핵산 분자를 포함하는 표면의 적어도 하나의 불연속 영역
을 포함하며,
표면의 형광 화상이 적어도 20의 콘트라스트 대 노이즈비(CNR)를 나타내는 것인 플로우 셀 디바이스. - 제115항에 있어서, 친수성 중합체 코팅층이 50°미만의 물 접촉각을 갖는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제114항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 기재가 유리 또는 플라스틱인 플로우 셀 디바이스.
- a) 제99항 내지 제113항 중 어느 한 항의 플로우 셀 디바이스 중 하나 이상;
b) 유체 흐름 제어기; 및
c) 임의로, 온도 제어기 또는 영상화 장치
를 포함하는 시스템. - 제118항에 있어서, 유체 흐름 제어기가 하나 이상의 펌프, 밸브, 혼합 매니폴드, 시약 저장소, 폐기물 저장소 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 시스템.
- 제118항 또는 제119항에 있어서, 유체 흐름 제어기가 유체 흐름 속도, 부피 유체 흐름 속도, 시약 또는 완충제 투입 타이밍 또는 이들의 임의의 조합의 프로그래밍 가능한 제어를 제공하도록 구성되는 것인 시스템.
- 제118항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 온도 제어기가, 하나 이상의 모세관과 접촉하도록 배치된 금속판, 및 펠티어 또는 저항 가열기를 포함하는 것인 시스템.
- 제121항에 있어서, 금속판이 카트리지에 통합되는 것인 시스템.
- 제118항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 온도 제어기가, 하나 이상의 모세관과 접촉되도록 가열되거나 냉각된 공기의 스트림을 보내도록 구성된 하나 이상의 공기 전달 디바이스를 포함하는 것인 시스템.
- 제121항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 온도 제어기가 하나 이상의 온도 센서를 더 포함하는 것인 시스템.
- 제124항에 있어서, 하나 이상의 온도 센서가 카트리지에 통합되는 것인 시스템.
- 제118항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 온도 제어기가 하나 이상의 모세관의 온도를 고정된 온도에서 유지되도록 하는 것인 시스템.
- 제118항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 온도 제어기가 하나 이상의 모세관의 온도를 적어도 2개의 설정 온도 사이에서 프로그래밍 가능한 방식으로 순환되도록 하는 것인 시스템.
- 제118항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 영상화 장치가 CCD 또는 CMOS 카메라가 장착된 현미경을 포함하는 것인 시스템.
- 제118항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 영상화 장치가 하나 이상의 광원, 하나 이상의 렌즈, 하나 이상의 미러, 하나 이상의 프리즘, 하나 이상의 밴드패스 필터, 하나 이상의 롱 패스 필터, 하나 이상의 숏 패스 필터, 하나 이상의 다이크로익 반사기, 하나 이상의 어퍼쳐, 및 하나 이상의 화상 센서, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 시스템.
- 제118항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 영상화 장치가 명시야 화상, 암시야 화상, 형광 화상, 2-광자 형광 화상 또는 이들의 임의의 조합을 획득하도록 구성되는 것인 시스템.
- 제118항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 영상화 장치가 비디오 화상을 획득하도록 구성되는 것인 시스템.
- 1피스 또는 단일 플로우 셀 구성을 포함하는 플로우 셀 디바이스.
- 제132항에 있어서, 1피스 또는 단일 플로우 셀 구성이 유리 또는 중합체 모세관을 포함하는 것인 플로우 셀 디바이스.
- 제132항 또는 제133항에 있어서, 디바이스 내의 유체 채널의 표면에서 낮은 비특이성 결합 코팅을 포함하는 플로우 셀 디바이스.
- 핵산 샘플 및 제2의 핵산 샘플을 시퀀싱하는 방법으로서,
a) 복수의 올리고뉴클레오티드를 적어도 부분적으로 투명한 챔버의 내부 표면에 전달하는 단계;
b) 제1의 핵산 샘플을 내부 표면에 전달하는 단계;
c) 복수의 비특이성 시약을 제1의 채널을 통하여 내부 표면에 전달하는 단계;
d) 특이성 시약을 제2의 채널을 통하여 내부 표면에 전달하는 단계로서, 제2의 채널이 제1의 채널보다 더 낮은 부피를 갖는 것인 단계;
e) 시퀀싱 반응을 적어도 부분적으로 투명한 챔버의 내부 표면 상에서 가시화하는 단계; 및
f) 적어도 부분적으로 투명한 챔버를 제2의 시퀀싱 반응 이전에 교체하는 단계
를 포함하는, 핵산 샘플 및 제2의 핵산 샘플을 시퀀싱하는 방법. - 제135항에 있어서, 적어도 부분적으로 투명한 표면의 외부 표면을 통과하여 기류를 흐르게 하는 것을 포함하는 방법.
- 제135항에 있어서, 진핵 생물의 게놈을 시퀀싱하기 위하여 복수의 올리고뉴클레오티드를 선택하는 것을 포함하는 방법.
- 제137항에 있어서, 사전제조된 튜브를 적어도 부분적으로 투명한 챔버로서 선택하는 것을 포함하는 방법.
- 제135항에 있어서, 원핵 생물의 게놈을 시퀀싱하기 위하여 복수의 올리고뉴클레오티드를 선택하는 것을 포함하는 방법.
- 제135항에 있어서, 전사체를 시퀀싱하기 위하여 복수의 올리고뉴클레오티드를 선택하는 것을 포함하는 방법.
- 제139항에 있어서, 모세관을 적어도 부분적으로 투명한 챔버로서 선택하는 것을 포함하는 방법.
- 제140항에 있어서, 미세유체 칩을 적어도 부분적으로 투명한 챔버로서 선택하는 것을 포함하는 방법.
- 표면을 제공하는 단계; 및
표면을 에칭하여 적어도 하나의 채널을 형성하는 단계
를 포함하는, 제1항의 플로우 셀 디바이스에서 미세유체 칩의 제조 방법. - 제143항에 있어서, 에칭이 레이저 조사를 사용하여 수행되는 것인 방법.
- 제143항에 있어서, 채널이 50 내지 300 ㎛의 평균 깊이를 갖는 것인 방법.
- 제143항에 있어서, 채널이 0.1 내지 30 ㎜의 평균 폭을 갖는 것인 방법.
- 제143항에 있어서, 채널이 1 내지 200 ㎜ 범위의 평균 길이를 갖는 것인 방법.
- 제143항에 있어서, 제1의 층을 에칭된 표면에 본딩시키는 것을 더 포함하는 방법.
- 제143항에 있어서, 제2의 층을 에칭된 표면에 본딩시키는 것을 더 포함하며, 에칭된 표면이 제1의 층과 제2의 층 사이에 배치되는 것인 방법.
- 시퀀싱 반응에 사용되는 시약을 감소시키는 방법으로서,
(a) 제1의 시약을 제1의 저장소 내에 제공하는 단계;
(b) 제2의 시약을 제1의 제2의 저장소 내에 제공하는 단계로서, 제1의 저장소 및 제2의 저장소의 각각이 중앙 영역에 유체적으로 커플링되고, 중앙 영역은 시퀀싱 반응을 위한 표면을 포함하는 것인 단계; 및
(c) 제1의 시약 및 제2의 시약을 플로우 셀 디바이스의 중앙 영역에 순차적으로 투입하는 단계를 포함하고, 제1의 저장소로부터 중앙 영역의 주입구로 흐르는 제1의 시약의 부피가 제2의 저장소로부터 중앙 영역으로 흐르는 제2의 시약의 부피보다 적은 것인, 시퀀싱 반응에 사용되는 시약을 감소시키는 방법. - 시퀀싱 반응에서 시약의 효율적인 사용을 증가시키는 방법으로서,
(a) 제1의 시약을 제1의 저장소 내에 제공하는 단계;
(b) 제2의 시약을 제1의 제2의 저장소 내에 제공하는 단계로서, 제1의 저장소 및 제2의 저장소의 각각이 중앙 영역에 유체적으로 커플링되고, 중앙 영역은 시퀀싱 반응을 위한 표면을 포함하는 것인 단계; 및
(c) 제1의 저장소로부터 중앙 영역의 주입구로 흐르는 제1의 시약의 부피를 제2의 저장소로부터 중앙 영역으로 흐르는 제2의 시약의 부피보다 적게 유지하는 단계
를 포함하는, 시퀀싱 반응에서 시약의 효율적인 사용을 증가시키는 방법. - 제150항 또는 제151항에 있어서, 제1의 시약이 제2의 시약보다 더 비싼 것인 방법.
- 제150항 또는 제151항에 있어서, 제1의 시약이 폴리머라제, 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201862776827P | 2018-12-07 | 2018-12-07 | |
| US62/776,827 | 2018-12-07 | ||
| US201962892419P | 2019-08-27 | 2019-08-27 | |
| US62/892,419 | 2019-08-27 | ||
| PCT/US2019/065073 WO2020118255A1 (en) | 2018-12-07 | 2019-12-06 | Flow cell device and use thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20210108970A true KR20210108970A (ko) | 2021-09-03 |
Family
ID=70975472
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020217021167A KR20210108970A (ko) | 2018-12-07 | 2019-12-06 | 플로우 셀 디바이스 및 그의 용도 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11426732B2 (ko) |
| EP (1) | EP3890887A4 (ko) |
| JP (1) | JP7499767B2 (ko) |
| KR (1) | KR20210108970A (ko) |
| CN (2) | CN112368077B (ko) |
| AU (2) | AU2019392932B2 (ko) |
| DE (1) | DE202019005610U1 (ko) |
| GB (1) | GB2588716B (ko) |
| SG (1) | SG11202009968RA (ko) |
| WO (1) | WO2020118255A1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102626812B1 (ko) * | 2023-05-19 | 2024-01-18 | 주식회사 큐리오시스 | 외부와의 노출이 없도록 설계되는 타겟 대상물의 자동 분리 시스템 및 방법 |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112368077B (zh) | 2018-12-07 | 2023-11-24 | 元素生物科学公司 | 流动池装置及其用途 |
| JP2021039102A (ja) * | 2019-08-30 | 2021-03-11 | キヤノンメディカルシステムズ株式会社 | 検体検査装置 |
| US11287422B2 (en) | 2019-09-23 | 2022-03-29 | Element Biosciences, Inc. | Multivalent binding composition for nucleic acid analysis |
| US11060138B1 (en) | 2020-01-17 | 2021-07-13 | Element Biosciences, Inc. | Nucleic acid sequencing systems |
| US11198121B1 (en) | 2020-06-10 | 2021-12-14 | Element Biosciences, Inc. | Flow cell systems and devices |
| EP4237581A1 (en) | 2020-10-30 | 2023-09-06 | Element Biosciences, Inc. | Reagents for massively parallel nucleic acid sequencing |
| GB202407626D0 (en) * | 2021-07-21 | 2024-07-10 | Element Biosciences Inc | Optical systems for nucleic acid sequencing and methods thereof |
| WO2023082063A1 (zh) * | 2021-11-09 | 2023-05-19 | 深圳华大智造科技股份有限公司 | 液路系统、基因测序仪和试剂回收方法 |
| CN114250144B (zh) * | 2021-12-17 | 2024-08-20 | 深圳铭毅智造科技有限公司 | 一种用于基因测序的液路系统 |
| WO2023122589A2 (en) * | 2021-12-22 | 2023-06-29 | Nautilus Subsidiary, Inc. | Systems and methods for carrying out highly multiplexed bioanalyses |
| CN114958193B (zh) * | 2022-05-26 | 2023-03-24 | 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 | 一种石墨烯基温控涂层及其制备方法 |
| WO2023244463A1 (en) * | 2022-06-14 | 2023-12-21 | Illumina, Inc. | Flow cell supports and related temperature control devices, systems, and methods |
| WO2024029557A1 (ja) * | 2022-08-02 | 2024-02-08 | テルモ株式会社 | 分離装置及び分離方法 |
Family Cites Families (123)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS50109781A (ko) | 1974-02-06 | 1975-08-29 | ||
| US4222743A (en) | 1978-07-20 | 1980-09-16 | Wang Wei Kung | Method and apparatus for detecting biological particles by fluorescent stain |
| JPS57177117A (en) | 1981-04-25 | 1982-10-30 | Nippon Kogaku Kk <Nikon> | Microscope optical system |
| US5547839A (en) | 1989-06-07 | 1996-08-20 | Affymax Technologies N.V. | Sequencing of surface immobilized polymers utilizing microflourescence detection |
| US5143854A (en) | 1989-06-07 | 1992-09-01 | Affymax Technologies N.V. | Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof |
| US5491097A (en) | 1989-06-15 | 1996-02-13 | Biocircuits Corporation | Analyte detection with multilayered bioelectronic conductivity sensors |
| US6506558B1 (en) | 1990-03-07 | 2003-01-14 | Affymetrix Inc. | Very large scale immobilized polymer synthesis |
| US5455166A (en) | 1991-01-31 | 1995-10-03 | Becton, Dickinson And Company | Strand displacement amplification |
| US5184021A (en) | 1991-06-24 | 1993-02-02 | Siscan Systems, Inc. | Method and apparatus for measuring the dimensions of patterned features on a lithographic photomask |
| US5422712A (en) | 1992-04-01 | 1995-06-06 | Toa Medical Electronics Co., Ltd. | Apparatus for measuring fluorescent spectra of particles in a flow |
| US5395588A (en) * | 1992-12-14 | 1995-03-07 | Becton Dickinson And Company | Control of flow cytometer having vacuum fluidics |
| US5430541A (en) * | 1993-01-12 | 1995-07-04 | Applied Biosystems Inc. | High efficiency fluorescence flow cell for capillary liquid chromatography or capillary electrophoresis |
| EP0617278A1 (en) * | 1993-03-12 | 1994-09-28 | Orion Research, Incorporated | Connectorized capillaries for use with separation instrumentation components |
| US5395587A (en) | 1993-07-06 | 1995-03-07 | Smithkline Beecham Corporation | Surface plasmon resonance detector having collector for eluted ligate |
| US5512131A (en) | 1993-10-04 | 1996-04-30 | President And Fellows Of Harvard College | Formation of microstamped patterns on surfaces and derivative articles |
| US5840573A (en) * | 1994-02-01 | 1998-11-24 | Fields; Robert E. | Molecular analyzer and method of use |
| CA2182513A1 (en) * | 1994-02-01 | 1995-08-10 | Robert E. Fields | Molecular analyzer and method of use |
| US20030017081A1 (en) | 1994-02-10 | 2003-01-23 | Affymetrix, Inc. | Method and apparatus for imaging a sample on a device |
| US5807522A (en) | 1994-06-17 | 1998-09-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods for fabricating microarrays of biological samples |
| US5792431A (en) | 1996-05-30 | 1998-08-11 | Smithkline Beecham Corporation | Multi-reactor synthesizer and method for combinatorial chemistry |
| US6482590B1 (en) | 1996-12-20 | 2002-11-19 | Aventis Behring Gmbh | Method for polynucleotide amplification |
| US6465178B2 (en) | 1997-09-30 | 2002-10-15 | Surmodics, Inc. | Target molecule attachment to surfaces |
| KR100387245B1 (ko) | 1997-10-17 | 2003-08-19 | 일양약품주식회사 | 유산균의안정화를위한미세장용성코팅과립 |
| DE19747572C1 (de) | 1997-10-28 | 1999-04-08 | Inst Chemo Biosensorik | Vorrichtung und Verfahren zur Durchführung von Fluoreszenzimmuntests |
| US6376619B1 (en) | 1998-04-13 | 2002-04-23 | 3M Innovative Properties Company | High density, miniaturized arrays and methods of manufacturing same |
| US6387632B2 (en) | 1998-06-11 | 2002-05-14 | Hitachi, Ltd. | Polynucleotide separation method and apparatus therefor |
| JP3817389B2 (ja) | 1998-06-11 | 2006-09-06 | 株式会社日立製作所 | ポリヌクレオチド分取装置 |
| AT410718B (de) | 1998-10-28 | 2003-07-25 | Schindler Hansgeorg Dr | Vorrichtung zur visualisierung von molekülen |
| EP2045337B1 (en) | 1998-11-09 | 2011-08-24 | Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha | Process for synthesizing nucleic acid |
| US6473171B1 (en) * | 1999-01-15 | 2002-10-29 | Coors Brewing Company | Biocompatible apparatus for ultrasensitive and rapid detection of contaminants in liquids |
| US7056661B2 (en) | 1999-05-19 | 2006-06-06 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method for sequencing nucleic acid molecules |
| US6225109B1 (en) | 1999-05-27 | 2001-05-01 | Orchid Biosciences, Inc. | Genetic analysis device |
| WO2001021310A2 (en) * | 1999-09-21 | 2001-03-29 | Genome Therapeutics Corporation | Device for rapid dna sample processing with integrated liquid handling, thermocycling, and purification |
| EP1218543A2 (en) | 1999-09-29 | 2002-07-03 | Solexa Ltd. | Polynucleotide sequencing |
| DE10014204C2 (de) | 2000-03-22 | 2002-08-14 | Max Planck Gesellschaft | Mikrohybridisierungskammer |
| WO2002079762A2 (en) | 2000-10-27 | 2002-10-10 | Dumas David P | Apparatus for fluorescence detection on arrays |
| US7320775B2 (en) * | 2001-05-16 | 2008-01-22 | Guava Technologies, Inc. | Exchangeable flow cell assembly with a suspended capillary |
| JP3999479B2 (ja) | 2001-07-10 | 2007-10-31 | オリンパス株式会社 | 光学装置 |
| FR2829404B1 (fr) | 2001-09-10 | 2003-12-05 | Centre Nat Rech Scient | Appareil automatique pour la synthese de petites molecules organiques et procede de synthese mettant en oeuvre cet appareil |
| GB0129012D0 (en) | 2001-12-04 | 2002-01-23 | Solexa Ltd | Labelled nucleotides |
| US20030175163A1 (en) | 2002-03-18 | 2003-09-18 | Igor Shvets | Multiple dispenser |
| JP2006509040A (ja) | 2002-08-23 | 2006-03-16 | ソレックサ リミテッド | 修飾されたヌクレオチド |
| WO2004074503A2 (en) | 2003-02-21 | 2004-09-02 | Hoser Mark J | Nucleic acid sequencing methods, kits and reagents |
| US20040248287A1 (en) | 2003-03-28 | 2004-12-09 | Qianjin Hu | Multi-array systems and methods of use thereof |
| US7030383B2 (en) | 2003-08-04 | 2006-04-18 | Cadent Ltd. | Speckle reduction method and apparatus |
| DE10336849A1 (de) * | 2003-08-11 | 2005-03-10 | Thinxxs Gmbh | Flusszelle |
| US7169560B2 (en) | 2003-11-12 | 2007-01-30 | Helicos Biosciences Corporation | Short cycle methods for sequencing polynucleotides |
| WO2005119110A2 (en) * | 2004-05-28 | 2005-12-15 | New Objective, Inc. | Method and apparatus for connecting small diameter tubing |
| US7264934B2 (en) | 2004-06-10 | 2007-09-04 | Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. | Rapid parallel nucleic acid analysis |
| JP3116709U (ja) * | 2005-09-13 | 2005-12-15 | 有限会社メタボスクリーン | 微小流路チップ |
| US7807354B2 (en) | 2005-12-28 | 2010-10-05 | Agilent Technologies, Inc. | Low volume hybridization |
| EP2047239A2 (en) | 2006-07-20 | 2009-04-15 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Multi-color biosensor |
| US9278321B2 (en) | 2006-09-06 | 2016-03-08 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Chip and cartridge design configuration for performing micro-fluidic assays |
| US7755841B2 (en) | 2007-01-30 | 2010-07-13 | Dmetrix, Inc. | Liquid-lens variable-control optics in array microscope |
| US7960116B2 (en) | 2007-09-28 | 2011-06-14 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Nucleic acid sequencing methods and systems |
| KR20090034636A (ko) | 2007-10-04 | 2009-04-08 | 삼성전자주식회사 | 바이오 폴리머 합성 장치 및 방법, 바이오 폴리머 합성용시료의 회수 방법 |
| WO2009091535A1 (en) | 2008-01-15 | 2009-07-23 | Empire Genomics Llc | Method and device for dual array hybridization karyotype analysis |
| KR101201927B1 (ko) | 2008-02-07 | 2012-11-16 | 미쯔이 죠센 가부시키가이샤 | 형광 검출 장치 및 형광 검출 방법 |
| US8173080B2 (en) * | 2008-02-14 | 2012-05-08 | Illumina, Inc. | Flow cells and manifolds having an electroosmotic pump |
| EP2271751B1 (en) | 2008-03-31 | 2015-07-22 | Pacific Biosciences of California, Inc. | Generation of modified polymerases for improved accuracy in single molecule sequencing |
| EP2274446B1 (en) | 2008-03-31 | 2015-09-09 | Pacific Biosciences of California, Inc. | Two slow-step polymerase enzyme systems and methods |
| US8039817B2 (en) | 2008-05-05 | 2011-10-18 | Illumina, Inc. | Compensator for multiple surface imaging |
| US8753868B2 (en) * | 2008-08-04 | 2014-06-17 | General Electric Company | Method and system for selective isolation of target biological molecules in a general purpose system |
| US8404198B2 (en) | 2008-08-27 | 2013-03-26 | Life Technologies Corporation | Apparatus for and method of processing biological samples |
| WO2010027484A2 (en) | 2008-09-05 | 2010-03-11 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Engineering polymerases and reaction conditions for modified incorporation properties |
| US8481264B2 (en) | 2008-09-19 | 2013-07-09 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Immobilized nucleic acid complexes for sequence analysis |
| EP2350612B1 (en) * | 2008-11-24 | 2023-05-24 | Cytiva Sweden AB | Flow cell optical detection system |
| CN101750448A (zh) * | 2008-12-18 | 2010-06-23 | 中国科学院生态环境研究中心 | 一种毛细管和微流控芯片电泳通道中蛋白质的荧光成像表征方法 |
| WO2010118427A1 (en) | 2009-04-10 | 2010-10-14 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Fluid interface cartridge for a microfluidic chip |
| GB2473868A (en) | 2009-09-28 | 2011-03-30 | Invitrogen Dynal As | Apparatus and method of automated processing of biological samples |
| US20100298171A1 (en) | 2009-05-22 | 2010-11-25 | Affymetrix, Inc. | Apparatus for polymer synthesis |
| US8632975B2 (en) | 2009-06-05 | 2014-01-21 | Life Technologies Corporation | Nucleotide transient binding for sequencing methods |
| EP2606154B1 (en) * | 2010-08-20 | 2019-09-25 | Integenx Inc. | Integrated analysis system |
| US8715932B2 (en) | 2010-08-20 | 2014-05-06 | Intel Corporation | Nucleic acid sequencing |
| EP2613880B1 (en) * | 2010-09-09 | 2014-09-17 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der Angewandten Forschung e.V. | Microfluidic device, microfluidic dosing system and method for microfluidic dosing |
| US9387476B2 (en) | 2010-10-27 | 2016-07-12 | Illumina, Inc. | Flow cells for biological or chemical analysis |
| JP6087293B2 (ja) | 2011-01-06 | 2017-03-01 | メソ スケール テクノロジーズ エルエルシー | アッセイカートリッジ及びその使用方法 |
| US8241570B1 (en) * | 2011-02-03 | 2012-08-14 | I Shou University | Flow cell device |
| US20140149153A1 (en) * | 2011-07-01 | 2014-05-29 | Christos G. Cassandras | Method and system for dynamic parking allocation in urban settings |
| EP2774978B1 (en) | 2011-10-31 | 2019-05-15 | Hitachi High-Technologies Corporation | Nucleic acid amplification method |
| EP2776165A2 (en) | 2011-11-07 | 2014-09-17 | Illumina, Inc. | Integrated sequencing apparatuses and methods of use |
| NL2017959B1 (en) | 2016-12-08 | 2018-06-19 | Illumina Inc | Cartridge assembly |
| AU2013382089B2 (en) | 2013-03-13 | 2018-05-10 | Illumina, Inc. | Multilayer fluidic devices and methods for their fabrication |
| AU2013202778A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-02 | Gen-Probe Incorporated | Systems, methods, and apparatuses for performing automated reagent-based assays |
| WO2014191831A2 (en) * | 2013-05-31 | 2014-12-04 | Avishay Bransky | Cartridge for preparing a sample fluid containing cells for analysis |
| CA2915875C (en) | 2013-08-08 | 2018-09-18 | Illumina, Inc. | Fluidic system for reagent delivery to a flow cell |
| US9546398B2 (en) | 2013-11-14 | 2017-01-17 | Agilent Technologies, Inc. | Polymerase idling method for single molecule DNA sequencing |
| WO2015085268A1 (en) * | 2013-12-05 | 2015-06-11 | Centrillion Technology Holdings Corporation | Modified surfaces |
| AU2015267189B2 (en) | 2014-05-27 | 2019-12-05 | Illumina, Inc. | Systems and methods for biochemical analysis including a base instrument and a removable cartridge |
| DK3669985T3 (da) | 2014-06-05 | 2022-05-09 | Illumina Inc | Systemer inklusive en rotationsventil til mindst en af prøveforberedelse eller prøveanalyse |
| EP3157678B1 (en) | 2014-06-17 | 2019-07-24 | Life Technologies Corporation | Methods for preparing reagents and detecting analytes |
| US9839910B2 (en) | 2014-09-29 | 2017-12-12 | Illumina, Inc. | Fluidic cartridges, systems, and methods for conducting biochemical reactions |
| US10576471B2 (en) | 2015-03-20 | 2020-03-03 | Illumina, Inc. | Fluidics cartridge for use in the vertical or substantially vertical position |
| CN107849600A (zh) * | 2015-06-09 | 2018-03-27 | 生命技术公司 | 用于分子标记的方法、系统、组合物、试剂盒、装置和计算机可读媒体 |
| US11421264B2 (en) * | 2015-11-06 | 2022-08-23 | IsoPlexis Corporation | Thiol-containing cleave reagents and oxidative wash |
| US10377538B2 (en) | 2015-12-01 | 2019-08-13 | Illumina, Inc. | Liquid storage and delivery mechanisms and methods |
| AU2017207259B2 (en) | 2016-01-11 | 2019-06-27 | Illumina Singapore Pte Ltd | Detection apparatus having a microfluorometer, a fluidic system, and a flow cell latch clamp module |
| GB201704769D0 (en) | 2017-01-03 | 2017-05-10 | Illumina Inc | Flowcell cartridge with floating seal bracket |
| GB201704768D0 (en) | 2017-01-05 | 2017-05-10 | Illumina Inc | Flow cell liquid degassing systema and method |
| GB201704758D0 (en) | 2017-01-05 | 2017-05-10 | Illumina Inc | Reagent channel mixing systema and method |
| IL269415B2 (en) * | 2017-03-29 | 2024-03-01 | Univ Cornell | Devices, processes, and methods for determining nucleic acid sequence, expression, copy number, or methylation changes using reactions that combine nuclease, ligase, polymerase, and sequencing |
| WO2018187013A1 (en) | 2017-04-04 | 2018-10-11 | Omniome, Inc. | Fluidic apparatus and methods useful for chemical and biological reactions |
| EP3655153B1 (en) | 2017-07-18 | 2020-09-16 | Omniome, Inc. | Method of chemically modifying plastic surfaces |
| EP3668651B1 (en) | 2017-08-15 | 2024-05-01 | Pacific Biosciences of California, Inc. | Methods using a scanning apparatus for sequencing nucleic acids |
| WO2019241305A1 (en) | 2018-06-12 | 2019-12-19 | Element Biosciences, Inc. | Improved reverse transcriptase for nucleic acid sequencing |
| EP3647769A1 (en) * | 2018-10-29 | 2020-05-06 | ETH Zurich | Flow cell |
| US10768173B1 (en) | 2019-09-06 | 2020-09-08 | Element Biosciences, Inc. | Multivalent binding composition for nucleic acid analysis |
| US10876148B2 (en) | 2018-11-14 | 2020-12-29 | Element Biosciences, Inc. | De novo surface preparation and uses thereof |
| US10704094B1 (en) | 2018-11-14 | 2020-07-07 | Element Biosciences, Inc. | Multipart reagents having increased avidity for polymerase binding |
| US20200149095A1 (en) | 2018-11-14 | 2020-05-14 | Element Biosciences, Inc. | Low binding supports for improved solid-phase dna hybridization and amplification |
| WO2020102766A2 (en) | 2018-11-15 | 2020-05-22 | Element Biosciences, Inc. | Methods for generating circular nucleic acid molecules |
| CN112368077B (zh) | 2018-12-07 | 2023-11-24 | 元素生物科学公司 | 流动池装置及其用途 |
| US20200347443A1 (en) | 2019-05-01 | 2020-11-05 | Element Biosciences, Inc. | Nucleic acid hybridization methods |
| EP3947731A4 (en) | 2019-05-24 | 2022-06-29 | Element Biosciences, Inc. | Multivalent binding composition for nucleic acid analysis |
| US20200370113A1 (en) | 2019-05-24 | 2020-11-26 | Element Biosciences, Inc. | Polymerase-nucleotide conjugates for sequencing by trapping |
| WO2020242901A1 (en) | 2019-05-24 | 2020-12-03 | Element Biosciences, Inc. | Polymerase-nucleotide conjugates for sequencing by trapping |
| GB2606852A (en) | 2019-09-23 | 2022-11-23 | Element Biosciences Inc | Methods for cellularly addressable nucleic acid sequencing |
| US11287422B2 (en) | 2019-09-23 | 2022-03-29 | Element Biosciences, Inc. | Multivalent binding composition for nucleic acid analysis |
| US11060138B1 (en) | 2020-01-17 | 2021-07-13 | Element Biosciences, Inc. | Nucleic acid sequencing systems |
| US20210332430A1 (en) | 2020-01-17 | 2021-10-28 | Element Biosciences, Inc. | High performance fluorescence imaging module for genomic testing assay |
| US20230235392A1 (en) | 2020-05-20 | 2023-07-27 | Element Biosciences, Inc. | Methods for paired-end sequencing library preparation |
| US11198121B1 (en) | 2020-06-10 | 2021-12-14 | Element Biosciences, Inc. | Flow cell systems and devices |
| US11200446B1 (en) | 2020-08-31 | 2021-12-14 | Element Biosciences, Inc. | Single-pass primary analysis |
-
2019
- 2019-12-06 CN CN201980039037.6A patent/CN112368077B/zh active Active
- 2019-12-06 WO PCT/US2019/065073 patent/WO2020118255A1/en unknown
- 2019-12-06 SG SG11202009968RA patent/SG11202009968RA/en unknown
- 2019-12-06 KR KR1020217021167A patent/KR20210108970A/ko active Search and Examination
- 2019-12-06 EP EP19893558.7A patent/EP3890887A4/en active Pending
- 2019-12-06 JP JP2021532135A patent/JP7499767B2/ja active Active
- 2019-12-06 CN CN202311488519.4A patent/CN117680210A/zh active Pending
- 2019-12-06 DE DE202019005610.6U patent/DE202019005610U1/de active Active
- 2019-12-06 GB GB2016981.9A patent/GB2588716B/en active Active
- 2019-12-06 AU AU2019392932A patent/AU2019392932B2/en active Active
-
2020
- 2020-10-28 US US17/082,445 patent/US11426732B2/en active Active
-
2024
- 2024-01-19 AU AU2024200383A patent/AU2024200383A1/en active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102626812B1 (ko) * | 2023-05-19 | 2024-01-18 | 주식회사 큐리오시스 | 외부와의 노출이 없도록 설계되는 타겟 대상물의 자동 분리 시스템 및 방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US11426732B2 (en) | 2022-08-30 |
| CN112368077B (zh) | 2023-11-24 |
| GB2588716A (en) | 2021-05-05 |
| EP3890887A4 (en) | 2022-10-12 |
| CN117680210A (zh) | 2024-03-12 |
| SG11202009968RA (en) | 2020-11-27 |
| GB2588716B (en) | 2023-11-01 |
| AU2019392932A1 (en) | 2021-07-22 |
| EP3890887A1 (en) | 2021-10-13 |
| AU2024200383A1 (en) | 2024-02-08 |
| JP7499767B2 (ja) | 2024-06-14 |
| DE202019005610U1 (de) | 2021-06-10 |
| JP2022512328A (ja) | 2022-02-03 |
| CN112368077A (zh) | 2021-02-12 |
| WO2020118255A1 (en) | 2020-06-11 |
| US20210121882A1 (en) | 2021-04-29 |
| GB202016981D0 (en) | 2020-12-09 |
| AU2019392932B2 (en) | 2023-11-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7499767B2 (ja) | フローセルデバイスおよびその使用 | |
| US11339433B2 (en) | Nucleic acid sequencing systems | |
| KR102673492B1 (ko) | 세포적으로 처리가능한 핵산 서열분석 방법 | |
| US11198121B1 (en) | Flow cell systems and devices | |
| US20210223530A1 (en) | Optical system for fluorescence imaging | |
| JP2024530883A (ja) | 核酸シーケンシングのための光学システム、およびその方法 | |
| US20210223178A1 (en) | Optical system for fluorescence imaging | |
| CN217981206U (zh) | 成像系统、检测装置和核酸分子测序系统 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination |