JP5175536B2 - エバネッセント波発生装置及びそれを用いた観察装置 - Google Patents

Description

本発明は、エバネッセント波を発生させるエバネッセント波発生装置及びそれを用いた観察装置に関するものである。

近年組織工学では、細胞培養を基本とした組織再生の研究が注目を集め、医療の質までもかえると言われている。その中でも、培養した細胞を医療デバイスに付与することで移植時に生体との適合性をあげる技術（例えば、骨基材の上に培養細胞をのせる技術）や、各機能を有する細胞へ培養する技術（例えば、間葉系幹細胞から心筋、血管、皮膚などの細胞へ分化する技術）などが再生医療の発展により急速に進歩して来ている。このような細胞培養技術においては、培養された細胞の状態を評価した上で、医療目的で用いる必要があり、そのための装置や技術も組織工学の進歩と共に発展しつつある。

特に、エバネッセント波を用いた全反射顕微鏡（観察装置）は、全反射面から細胞の一部（全反射面から上方約１００ｎｍ）だけを観察することができ、バックグラウンドを抑えた鮮明な観察図を得ることが可能であるため、培養容器に接触し増殖する細胞の状態を、より明確に観察することができるものとして注目されつつある。

具体的には、例えば、観察する細胞の乗ったサンプル容器の底面（屈折率境界面であり、全反射面となる）にプリズムなどを利用し、所定角度で励起光を照射して、サンプル容器の底面（屈折率境界面、且つ、全反射面）で反射させ、そのとき全反射面の上に発生するエバネッセント波により全反射面から上方約１００ｎｍの間にある測定（観察）サンプル（細胞）を励起させるものである。

このように、光（エバネッセント波）が到達する領域を約１００ｎｍに限定して、その領域にある測定サンプル（細胞）から発生した散乱光や蛍光を検出することで、測定サンプルの状況をより明確に検出することが可能となり、バックグラウンドのノイズを抑えることができるようになり、より鮮明な蛍光観察が可能になった（例えば、特許文献１参照）。

また、このようなエバネッセント波を用いた観察装置として、表面プラズモン共鳴現象の原理を利用した観察装置もある。この装置は、プリズムの上面に形成された金属薄膜表面に測定サンプル（細胞）を配置し、この測定サンプルを配置した金属薄膜のプリズム側の面にプリズムを介して光（レーザー）を入射させると、金属薄膜と測定サンプルとの境界面に電子の粗密波ＳＰ（表面プラズモン）との共鳴が発生する。このとき、光（レーザー）の入射角度を変化させて金属薄膜のプリズム側の面で全反射させると、ある特定の入射角度で反射光が減衰する現象、即ち、表面プラズモン共鳴が生じる。この表面プラズモン共鳴が生じる光の入射角度（共鳴角）は、測定サンプルの誘電率に依存するので、この共鳴角を測定することで、金属薄膜表面における測定サンプルを観察することができるというものである。即ち、光の入射角度を調整して、共鳴角の変化を測定することで、金属薄膜表面で測定サンプルのプロセス（例えば、抗体と抗原の相互作用）をリアルタイムで定量分析できるようになった（例えば、特許文献２参照）。
特開平９−６１３４６号公報 特許第２７５８９０４号公報

ところで、従来の全反射顕微鏡では、照明と観察を一つのレンズで可能にするために、口径の大きい高倍率の対物レンズを使用していたため、短時間で多くの観察対象を処理することが困難であり、且つ、装置のコストを高騰させていた。また、最近の再生医療の現場では、細胞の培養が頻繁に行われており、できる限り短時間で培養された測定サンプル（細胞）を評価したいとの要望がある。そして、再生医療が普及し、より医療現場での応用が進むと、培養された測定サンプルを全体的に判断する必要が生じてくる。そのため、多くのサンプルが一括して処理できるマイクロプレートで培養されたサンプルを瞬時或いは同時に観察判断したいとの要望があるが、従来の装置では、瞬時若しくは同時に複数の観察対象を観察することができなかった。

また、このような装置では、観察対象に照射する励起光を全反射が生じる角度である、臨界角以上の入射角度で全反射のポイントに入射させる必要がある。この全反射を起こすための臨界角（全反射のポイントの面に対して垂直な線と励起光とが成す角度）は、測定サンプルによって異なるため、測定サンプルに応じて適切な入射角度となるように調整しなければならなかった。また、臨界角以上の入射角でも臨界角に近いほどエバネッセント波が到達する領域は全反射面からの距離が遠くなり、反面、臨界角から離れるとエバネッセント波の到達する領域は全反射面からの距離が短くなることから、入射角を変えることで、照明領域が変わる（エバネッセント波到達領域を１００ｎｍから変更することができる）ことになり、観察の幅を広げるためにも入射角の調整が必要であった。従来では、励起光の角度を変更することにより入射角度を調整していた。しかしながら、励起光の角度を変更すると、全反射のポイントが変わってしまうため、当該全反射のポイントが対象の測定サンプルに合うように励起光照射手段の位置も移動させなければならず、特に複数の測定サンプルのそれぞれを照明して同時に観察しようとする場合には、著しく作業性が煩雑化する問題がある。

本発明は、従来の技術的課題を解決するために成されたものであり、複数の測定サンプルを同時に観察することができ、且つ、ノイズの発生も低減したエバネッセント波発生装置とこの発生装置を用いた観察装置を提供することを目的とする。

請求項１の発明のエバネッセント波発生装置は、プリズム内に導入された光によりエバネッセント波を発生させるものであって、光軸に平行な光が入射した場合に、入射位置にかかわらず、当該光を一点に集中させる屈折機能を有した複数の導入用レンズが並設されて成るレンズアレイと、複数条の平行光を発生する光入射手段と、各導入用レンズにおいて発生し、隣接する他の導入用レンズに入る反射光を遮断する反射光遮断手段とを備え、光入射手段からレンズアレイの各導入用レンズに光をそれぞれ入射し、各導入用レンズをそれぞれ通過した複数条の光をプリズム内に導入すると共に、反射光遮断手段は、各導入用レンズのプリズム側の端部から光入射手段側に向けて所定距離延在していることを特徴とする。

請求項２の発明のエバネッセント波発生装置は、上記において反射光遮断手段は、隣接する各導入用レンズ間にそれぞれ設けられた隔壁であることを特徴とする。

請求項３の発明のエバネッセント波発生装置は、請求項１の発明において反射光遮断手段は、それぞれ導入用レンズが収納された複数の筒体であることを特徴とする。

請求項４の発明のエバネッセント波発生装置は、請求項１の発明において反射光遮断手段は、各導入用レンズに入射する光を相互に隔離する通路であることを特徴とする。

請求項５の発明のエバネッセント波発生装置は、上記各発明において光入射手段は、各導入用レンズの光軸に対して同時に平行に入射させる移動手段を有し、各導入用レンズの直径よりも狭い幅の光を各導入用レンズにそれぞれ入射させることを特徴とする。

請求項６の発明のエバネッセント波発生装置は、上記において光入射手段は、入射位置の変更方向に対して所定の幅を有し、且つ、各導入用レンズの光軸に平行な光を発生させる平行光発生手段と、この平行光発生手段からの光の一部が通過する複数の窓孔を有した遮蔽部材とを備え、この遮蔽部材を移動させて各導入用レンズへの光の入射位置を同時に変更することを特徴とする。

請求項７の発明のエバネッセント波発生装置は、上記において平行光発生手段は、点光源と、この点光源からの拡散光を各導入用レンズの光軸に平行な光に屈折させる光源用レンズとを有することを特徴とする。

請求項８の発明のエバネッセント波発生装置は、請求項６又は請求項７の発明において平行光発生手段からの光を、波長に応じて選択的に通過させるフィルタを備えたことを特徴とする。

請求項９の発明のエバネッセント波発生装置は、請求項５の発明において光入射手段は、レーザー光を発生する複数のレーザー光源を有し、各レーザー光源からのレーザー光を各導入用レンズにそれぞれ入射させると共に、各レーザー光源を同時に移動させて各導入用レンズへのレーザー光の入射位置を同時に変更することを特徴とする。

請求項１０の発明のエバネッセント波発生装置は、上記各発明において導入用レンズは、一つのレンズのうちの必要箇所のみを残して切除して成るレンズ断片であることを特徴とする。

請求項１１の発明の観察装置は、請求項１乃至請求項１０の何れかに記載のエバネッセント波発生装置の各エバネッセント波発生面において発生するエバネッセント波により、複数の測定サンプルの散乱光、及び／又は、蛍光を検出する手段を備えたことを特徴とする。

請求項１２の発明の観察装置は、請求項１乃至請求項１０何れかに記載のエバネッセント波発生装置の各エバネッセント波を用いた表面プラズモン共鳴による複数の反射光強度の変化を検出する手段を備えたことを特徴とする。

本発明によれば、プリズム内に導入された光によりエバネッセント波を発生させるエバネッセント波発生装置において、光軸に平行な光が入射した場合に、入射位置にかかわらず、当該光を一点に集中させる屈折機能を有した複数の導入用レンズが並設されて成るレンズアレイと、複数条の平行光を発生する光入射手段とを備え、この光入射手段からレンズアレイの各導入用レンズにそれぞれ入射し、各導入用レンズをそれぞれ通過した複数条の光をプリズム内に導入するようにしているので、複数の測定ポイントにおいてそれぞれエバネッセント波を発生させることができるようになる。これにより、例えばマイクロプレートの各ウエルにそれぞれ収容された複数の測定サンプルを同時に照明して同時或いは瞬時に観察することができるようになり、観察効率を著しく向上させることができるようになる。

ここで、複数の導入用レンズを用いてレンズアレイを構成した場合、レンズの数が多くなる分、各レンズ面での反射光も増加する。そのため、この反射光が隣接する他の導入用レンズに入り、ノイズの発生など、観察に悪影響を及ぼすことになるが、本発明では各導入用レンズにおいて発生し、隣接する他の導入用レンズに入る反射光を遮断する反射光遮断手段を設け、この反射光遮断手段が、各導入用レンズのプリズム側の端部から光入射手段側に向けて所定距離延在するようにしたので、各導入用レンズにおいて発生した反射光を遮断し、当該反射光が隣接する他の導入用レンズに入る不都合を防止若しくは抑制することが可能となる。これにより、ノイズの発生など、反射光が観察に及ぼす悪影響を低減することができるようになるものである。

また、請求項２の発明の如く上記反射光遮断手段を、隣接する各導入用レンズ間にそれぞれ設けられた隔壁で構成すれば、比較的簡単な構成で隣接する導入用レンズからの反射光を排除できるものである。

また、請求項３の発明の如く前記反射光遮断手段を、それぞれ導入用レンズが収納された複数の筒体で構成するようにすれば、それぞれ導入用レンズを収納した筒体を複数用意して並設することにより、極めて容易に反射光遮断手段を構成することができるようになる。また、導入用レンズの周囲が必ず遮蔽されることになるので、隣接する導入用レンズからの反射光を極めて効果的に排除できるようになるものである。

また、請求項４の発明の如く反射光遮断手段を、各導入用レンズに入射する光を相互に隔離する通路で構成すれば、光入射手段からの光以外の光が導入用レンズに入射することを遮ることができるので、これによっても各導入用レンズにおいて発生する反射光が隣接する他の導入用レンズに入る不都合を防止若しくは抑制することが可能となる。これにより、ノイズの発生など、反射光が観察に及ぼす悪影響を低減することができるようになるものである。

また、請求項５の発明によれば、上記各発明において光入射手段は、各導入用レンズの光軸に対して同時に平行に入射させる移動手段を有し、各導入用レンズの直径よりも狭い幅の光を各導入用レンズにそれぞれ入射させるので、各々の全反射のポイントが変わることなく、複数条の光の入射角度のみを同時に変更することが可能となる。

ここで、観察対象に照射する励起光は全反射が生じる角度である、臨界角以上の入射角度で全反射のポイントに入射させる必要がある。この全反射を起こすための臨界角は、測定サンプルによって異なるため、測定サンプルに応じて適切な入射角度となるように調整しなければならない。また、臨界角以上の入射角でも臨界角に近いほどエバネッセント波が到達する領域は全反射面からの距離が遠くなり、反面、臨界角から離れるとエバネッセント波の到達する領域は全反射面からの距離が短くなることから、入射角を変えることで、照明領域が変わる（エバネッセント波到達領域を１００ｎｍから変更することができる）ことになり、観察の幅を広げるためにも入射角の調整が必要である。従来では、励起光の角度を変更することにより入射角度を調整しており、その場合は励起光の角度を変更することにより、全反射のポイントも変わってしまうため、当該全反射のポイントが対象の測定サンプルに合うように励起光照射手段の位置も移動させなければならず、作業性の煩雑化を招いていたが、この発明によれば、複数の測定ポイントに対する入射角度の調整に伴う作業を著しく簡便に行うことが可能となる。

また、直径が大きい単一の導入用レンズに複数条の光を導入する場合は、導入用レンズの焦点に複数条の光が集約して多点観測できなくなるが、本発明では複数の導入用レンズを並設してレンズアレイを構成し、各導入用レンズにそれぞれ光を入射させるようにしているので、各導入用レンズへの光の入射位置を変化させることで、各測定ポイントに対する光の入射角度を顕著に変化させることができるようになる。

請求項６の発明によれば、上記発明において光入射手段は、入射位置の変更方向に対して所定の幅を有し、且つ、各導入用レンズの光軸に平行な光を発生させる平行光発生手段と、この平行光発生手段からの光の一部が通過する複数の窓孔を有した遮蔽部材とを備え、この遮蔽部材を移動させて各導入用レンズへの光の入射位置を同時に変更するので、遮蔽部材により必要な部分の光のみを各導入用レンズに入射させることができるようになる。また、遮蔽部材を移動させることで、各々の全反射の位置を変えることなく、入射角度のみを変えることができるようになる。これにより、各導入用レンズの光軸に平行な光を発生可能な光入射手段であれば、どのようなものであっても光源として用いることが可能となる。

請求項７の発明では、上記発明において平行光発生手段は、点光源と、この点光源からの拡散光を各導入用レンズの光軸に平行な光に屈折させる光源用レンズとを有するので、点光源（例えばランプ）の性能により、多くの波長成分を含んだ光を得ることができるようになる。

請求項８の発明では、請求項６又は請求項７に記載の発明において平行光発生手段からの光を、波長に応じて選択的に通過させるフィルタを備えたので、フィルタにより任意の波長の光を自在に抽出することができるようになる。

請求項９の発明によれば、上記請求項５の発明において光入射手段は、レーザー光を発生する複数のレーザー光源を有し、各レーザー光源からのレーザー光を各導入用レンズにそれぞれ入射させると共に、各レーザー光源を同時に移動させて各導入用レンズへのレーザー光の入射位置を同時に変更することで、簡単に全反射角を変えることができるようになる。また、単位面積当たりの出力が強い複数のレーザー光源を使うことで、より強い複数のエバネッセント波を得ることができるようになる。

更に、請求項１０の発明の如く導入用レンズを、一つのレンズのうちの必要箇所のみを残して切除して成るレンズ断片とすれば、導入用レンズを必要最小限の大きさとすることができるので、レンズアレイの小型化を図ることができる。

請求項１１の発明の観察装置によれば、請求項１乃至請求項１０の何れかに記載のエバネッセント波発生装置の各エバネッセント波発生面において発生するエバネッセント波により、複数の測定サンプルの散乱光、及び／又は、蛍光を検出する手段を備えたので、細胞などの観察対象となる複数の測定サンプルの散乱光や蛍光を検出することができるようになる。この場合、前述した如く各導入用レンズにおいて発生する反射光が隣接する他の導入用レンズに入る不都合を防止若しくは抑制しているので、観察時のノイズを効果的に防止若しくは低減できることになる。

また、請求項１２の発明の観察装置によれば、請求項１乃至請求項１０の何れかに記載のエバネッセント波発生装置において発生するエバネッセント波を用いた表面プラズモン共鳴による複数の反射光強度の変化を検出する手段を備えたので、測定サンプルのプロセスをリアルタイムで定量分析することができるようになる。この場合も、前述した如く各導入用レンズにおいて発生する反射光が隣接する他の導入用レンズに入る不都合を防止若しくは抑制しているので、観察時のノイズを効果的に防止若しくは低減できることになる。

以下、図面に基づき本発明の実施形態を詳述する。

図１は本発明の一実施例のエバネッセント波発生装置１を備えた観察装置Ｓの構成図、図２は図１の一部拡大図をそれぞれ示している。この観察装置Ｓは、後述するエバネッセント波発生装置１と、光検出手段２０とを備えている。具体的に、本実施例の観察装置Ｓは、エバネッセント波発生装置１により発せられたエバネッセント波を細胞等の観察対象物質となる測定サンプル（本実施例では測定対象を励起光の照射により蛍光を発する細胞とする）が収容されたサンプル容器４０の下面から照射することにより、サンプル容器４０の底壁４０Ｂの上面４０Ｃでエバネッセント波を発生させて、このエバネッセント波の発生面である上記サンプル容器４０の底壁４０Ｂの上面４０から所定の範囲内にある細胞を励起させ、散乱光や蛍光を発生させて、この散乱光や蛍光をサンプル容器４０の一方（図１では上方）に配置された光検出手段２０にて検出する構成とされている。

実施例のサンプル容器４０はガラス製のマイクロプレートであり、図２に示すような複数のウエル４０Ａを備え、各ウエル４０Ａ内にそれぞれ測定サンプルが収容されている。そして、各ウエル４０Ａの底壁（当該ウエル４０Ａに対応するマイクロプレートの底壁）４０Ｂの上面４０Ｃでエバネッセント波を発生させ、所定の範囲内にある細胞を励起させ、散乱光や蛍光を発生させて観察するものである。

上記光検出手段２０は、エバネッセント波発生装置１からの励起光により各ウエル４０Ａ内の細胞から発せられた散乱光や蛍光を同時に、又は、瞬時に検出するための手段である。本実施例の光検出手段２０は、細胞からの散乱光や蛍光を集光するためのレンズ又は対物レンズ４５と、散乱光や蛍光から特定の波長を除去する光フィルタ（蛍光フィルタ）４６と、この光フィルタ４６を通過した散乱光や蛍光を結像する図示しない結像レンズと、結像レンズからの光像を二次元的に検出し撮像するＣＣＤカメラ４８とから構成されている。尚、散乱光や蛍光を検出する手段は、本実施例の光検出手段に限らず、散乱光や蛍光を検出できるものであればどのような検出手段であっても差し支えない。例えば、実施例ではＣＣＤカメラを用いるものとしたが、フォトダイオード等の受光素子を用いても構わない。

更に、光検出手段として、エバネッセント波を用いた表面プラズモン共鳴による反射光強度の変化を検出する手段を用いるものとしても有効である。具体的に、その場合の観察装置は、この表面プラズモン共鳴現象の原理を利用した観察装置である。当該装置は、プリズムの上面に形成された金属（例えば金）薄膜表面に測定サンプル（細胞）を配置し、この測定サンプルを配置した金属薄膜のプリズム５側の面にプリズム５を介して光（レーザー）を入射させると、金属薄膜と測定サンプルとの境界面に電子の粗密波ＳＰ（表面プラズモン）との共鳴が発生する。

このとき、光（レーザー）の入射角度を変化させて金属薄膜のプリズム５側の面で全反射させると、ある特定の入射角度で反射光が減衰する現象、即ち、表面プラズモン共鳴が生じる。この表面プラズモン共鳴が生じる光の入射角度（共鳴角）は、測定サンプルの誘電率に依存するので、この共鳴角を測定、即ち、エバネッセント波を用いた表面プラズモン共鳴による反射光強度の変化を検出することで、金属薄膜表面における測定サンプルを測定することができる。従って、光の入射角度を調整して、共鳴角の変化を測定することで、金属薄膜表面で測定サンプルのプロセス（例えば、抗体と抗原の相互作用）をリアルタイムで定性、定量分析することができる。

次に、前述した本発明のエバネッセント波発生装置について説明する。本発明のエバネッセント波発生装置は、プリズム内に複数条の光を導入し、複数のエバネッセント波発生面においてそれぞれ全反射させるものである。具体的に、本実施例のエバネッセント波発生装置１は、プリズム５と、レンズアレイ３０と、光入射手段１０とを備え、プリズム５内に複数条の光を導入し、複数のエバネッセント波発生面（本実施例では、エバネッセント波発生面は、サンプル容器４０の底面４０Ｂの上面４０Ｃ）においてそれぞれ全反射させるものである。

実施例のプリズム５は、ＢＫ７（ＳＣＨＯＴＴ ＧＬＡＳＳ社製）から成るもので、この屈折率は、１．５２である。このプリズム５の一面（図１では左側面）は、後述する光入射手段１０からの励起光をプリズム５内に入射するための光入射部とされている。

一方、前述したレンズアレイ３０は、図２に示すように円形の複数の導入用レンズ６を並設してなるものである。各導入用レンズ６は、当該導入用レンズ６の光軸Ｌに平行な光が入射した場合に、入射位置に拘わらず、それぞれ光を一点に集中させる屈折機能を有したレンズである。また、各導入用レンズ６は全て光軸Ｌを平行として並べられている。本実施例では、導入用レンズ６としてアクロマートレンズを用いるものとする。このアクロマートレンズは、光の波長で生じる色収差を補正したレンズである。具体的に、屈折率と色分散の異なる２枚のレンズ（凸レンズと凹レンズ）を貼り合わせて２色（通常は赤と青）の焦点位置のずれを補正したものである。尚、実施例では導入用レンズ６として、アクロマートレンズを用いるものとするが、３枚以上のレンズを組み合わせて、球面収差とコマを修正し、且つ、アクロマートレンズより色収差を小さくしたアポクロマートレンズを導入用レンズ６として用いるものとしても本発明は有効である。

また、この実施例の場合レンズアレイ３０は、各導入用レンズ６間及び両端の導入用レンズ６の外側に、それぞれ隔壁（反射光遮断手段）６１を備えている。各隔壁６１は光が透過せず、且つ、反射も防止若しくは最小限に抑えられる部材（例えば黒色艶消し素材の板材）にて構成されており、各導入用レンズ６のプリズム５側の端部から光入射手段１０（後述する遮蔽部材５５）側に向けて所定距離延在している。但し、光入射手段１０には至らず、光入射手段１０の動作には干渉しない。

また、各隔壁６１は少なくとも各導入用レンズ６間に介在し、それらの間における光の入射を遮断する。即ち、各隔壁６１は、導入用レンズ６のレンズ面において発生した反射光が、隣接する他の導入用レンズ６に入ることを遮るものである。また、各隔壁６１は各導入用レンズ６の光軸Ｌに平行に設けられている。

一方、前述した光入射手段１０は、複数条の平行光を発生し、各平行光をレンズアレイ３０の各導入用レンズ６にそれぞれ入射させるための手段であり、前記プリズム５内に光を導入、即ち、本実施例ではレンズアレイ３０の各導入用レンズ６へそれぞれ入射させ、各導入用ンズ６をそれぞれ通過した複数条の光をプリズム５内に導入するための励起光源と、導入用レンズ６の光軸Ｌに対して平行に光を入射させながら、光入射手段１０をエバネッセント波が発生する面に対する各光の入射角度が変化する方向に同時に移動させる移動手段とを有する。そして、この光入射手段１０は、各導入用レンズ６の直径（本実施例では図１に示すＤ）よりも狭い幅の光を、各隔壁６１間を通して各導入用レンズ６に同時にそれぞれ入射させるよう構成されている。

具体的には、この実施例の光入射手段１０は、入射位置の変更方向（レンズアレイ３０を構成する各導入用レンズ６の直径方向）におけるレンズアレイ３０の寸法に対応可能な所定の幅を有し、且つ、各導入用レンズ６の光軸Ｌに平行な光を発生させる平行光発生手段１０Ａと、遮蔽部材５５とを備える。この遮蔽部材５５は、平行光発生手段１０Ａからの一部の光を各導入用レンズ６にそれぞれ入射させるための部材であり、平行光発生手段１０Ａからの光の一部を通過させるため、導入用レンズ６の数と同数（複数）の窓孔５６（スリット）を有している。各窓孔５６は各導入用レンズ６の直径よりも狭い幅を有し、この遮蔽部材５５は平行光発生手段１０Ａとレンズアレイ３０の隔壁６１との間に配置されている。

そして、この場合はモータ及びラックアンドピニオンギアなどにより構成された移動手段により、実施例では各導入用レンズ６の光軸Ｌに対して直交する方向に遮蔽部材５５を移動させて各導入用レンズ６への光の入射位置をそれぞれ変更する。尚、図１の破線で示す方向に遮蔽部材５５を移動させてもよい。これにより、この遮蔽部材５５の各窓孔５６を通過した光入射手段１０（平行光発生手段１０Ａ）からの一部の光のみが隔壁６１間を通して各導入用レンズ６にそれぞれ入射される。従って、この実施例では光源である平行光発生手段１０Ａを移動させることなく、遮蔽部材５５を移動させることで、入射角度を変更することが可能となる。具体的に、遮蔽部材５５を移動させて、遮蔽部材５５により必要な部分の光のみが各導入用レンズ６に入射されるように調整することで、各ウエル４０Ａにおける全反射のポイントを変えることなく、容易に光の入射角度を各ウエル４０Ａで同時に変えることができるようになる。

上記レンズアレイ３０は、光入射手段１０とプリズム５との間に配置され、図２に示すようにレンズアレイ３０の各導入用レンズ６にそれぞれ入射され、各導入用レンズ６をそれぞれ通過した複数条の光をプリズム５内に導入するよう構成されている。

上述したように、光の一部が通過可能な窓孔５６を有した遮蔽部材５５を設けて、当該遮蔽部材５５を移動することで、各導入用レンズ６への光の入射位置を同時に変更することができるので、各ウエル４０Ａにおける全反射の位置を変えることなく、入射角度を同時に変えることが可能となる。これにより、各導入用レンズ６の光軸Ｌに平行な光を発生可能な平行光発生手段であれば、どのようなものであっても光源として用いることが可能となる。

そして、光入射手段１０からの複数条の励起光が各導入用レンズ６の何れかの部分に各導入用レンズ６の光軸Ｌに対して平行に入射されると、各導入用レンズ６を通過した光は各導入用レンズ６への入射位置や波長に拘わらず、屈折してそれぞれある一点に集中することとなる。そこで、当該光が集中する一点にそれぞれのウエル４０Ａ内の測定サンプルを配置すると共に、この測定サンプルに照射される各励起光を全反射が生じる角度である臨界角以上の入射角度で入射させて、それぞれ各測定サンプルの臨界面で全反射させ、そのとき、全反射面の上側に発生するエバネッセント波により全反射面から上方の所定範囲内にある各測定サンプルを励起させる。

このように、入射位置や波長にかかわらず、光入射手段１０からの複数条の光をそれぞれ一点に集中させる屈折機能を有した複数の導入用レンズ６を並設して成るレンズアレイ３０を設けて、光入射手段１０から導入用レンズ６の直径Ｄよりも狭い幅の各光を各導入用レンズ６へ入射し、各導入用レンズ６を通過した光をそれぞれプリズム５内に導入することで、各導入用レンズ６を通過したそれぞれの光は、各導入用レンズ６への入射位置や波長にかかわらず、それぞれ一点に集中することとなる。即ち、光入射手段１０からの複数条の光を、如何なる位置で各導入用レンズ６に入射させたとしても、各導入用レンズ６を経た光は、それぞれ必ず一点に集中するので、光入射手段１０の位置が変わった場合であっても、それぞれの全反射のポイントは変わらず、各ポイントに入射するそれぞれの光の入射角度のみが同時に変わることとなる。

このように、本発明では光入射手段１０からの複数条の光をプリズム５内に導入し、複数のエバネッセント発生面においてそれぞれ全反射させるので、複数のポイント（各ウエル４０Ａの底壁４Ｂの上面４０Ｃ）においてぞれぞれエバネッセント波を発生させることができる。これにより、各ウエル４０Ａのエバネッセント波の発生面にそれぞれ測定サンプルを配置すれば、各測定サンプルを同時に照明して同時或いは瞬時に観察することができるようになり、観察効率を著しく向上させることができるようになる。

また、光軸Ｌに平行な光が入射した場合に、入射位置にかかわらず、当該光を一点に集中させる屈折機能を有した複数の導入用レンズ６が並設されて成るレンズアレイ３０と、複数条の平行光を発生する光入射手段１０とを設け、この光入射手段１０からレンズアレイ３０の各導入用レンズ６へそれぞれ入射し、各導入用レンズ６をそれぞれ通過した複数条の光をプリズム５内に導入すると共に、各導入用レンズ６の光軸Ｌに対して同時に平行に入射させながら、図１の実施例におけるエバネッセント波が発生する面であるサンプル容器４０の底壁４０Ｂの上面４０Ｃに対する光の入射角度を変更する方向に移動させる移動手段を有し、各導入用レンズ６の直径よりも狭い幅の光を各導入用レンズ６に入射させるようにしているので、各々の全反射のポイントが変わることなく、複数条の光の入射角度のみを同時に変更することが可能となる。

これにより、複数の測定ポイントに対する入射角度の調整に伴う作業を著しく簡便に行うことが可能となる。ここで、直径が大きい単一の導入用レンズに複数条の光を導入する場合は、導入用レンズの焦点に複数条の光が集約して多点観測できなくなるが、この発明の如く複数の導入用レンズ６を並設してレンズアレイ３０を構成し、各導入用レンズ６にそれぞれ光を入射させるようにしているので、各導入用レンズ６への光の入射位置を変化させることで、各測定ポイント（各ウエル４０Ａの底壁４０Ｂの上面４０Ｃ）に対する光の入射角度を顕著に変化させることができるようになる。

特に、レンズアレイ３０に、隣接する各導入用レンズ６間に設けられた隔壁６１を設けているので、各導入用レンズ６において発生した反射光を隔壁６１によって遮断し、当該反射光が隣接する他の導入用レンズ６に入る不都合を防止若しくは抑制することが可能となる。これにより、ノイズの発生など、反射光が観察装置Ｓによる測定サンプルの観察に及ぼす悪影響を低減することができるようになる。

次に、本発明の他の実施例について図３を用いて説明する。尚、図３において図１、図２と同一の符号が付されているものは、同様、或いは、類似の効果を奏するものとして説明を省略する。図３に示す本実施例の光入射手段６０の平行光発生手段６５は、点光源６７（例えば、キセノンランプ、水銀ランプ等）と、光源用レンズ６８とを有する。この光源用レンズ６８は、点光源６７からの拡散光を各導入用レンズ６の光軸Ｌに平行な光に屈曲させるためのレンズであり、点光源６７と遮蔽部材５５との間に配設されている。遮蔽部材５５は、図１、図２に示す前記実施例１と同様であるため説明を省略する。

この場合、点光源６７の光は、点光源（例えばランプ）の性能により、多くの波長成分を含んだ光であり、且つ、拡散光であるが、光源用レンズ６８を通過させることで、当該拡散光を屈折させて、各導入用レンズ６の光軸Ｌに平行な光とすることができる。即ち、点光源６７からの拡散光は、光源用レンズ６８を通過する過程で各導入用レンズ６の光軸Ｌと平行な光とされた後、遮蔽部材５５により必要な部分の光のみが隔壁６１間を通って各導入用レンズ６にそれぞれ入射されるように調整される。これにより、各導入用レンズ６に当該導入用レンズ６の光軸Ｌと平行な必要な部分の光を入射させることが可能となる。また、各導入用レンズ６を通過した光は前記実施例で詳述したようにそれぞれ一点に集中される。これにより、点光源を用いた場合であっても、上記で詳述した本実施例の如き構成とすることで、各ウエル４０Ａにおける全反射のポイントを変えることなく、容易に光の入射角度を変更することができるようになる。

尚、本実施例、或いは、前記実施例１において、例えば、本実施例の構成において、図４に示すように平行光発生手段６５と各導入用レンズ６との間に平行光発生手段６５からの光を波長に応じて選択的に通過させるフィルタ７０（例えば、バンドパスフィルタ等）を設置するものとすれば、複数の波長を含む光を光源として用いた場合であっても、当該フィルタ７０により必要とされる特定の波長以外の光をカットし、当該特定の波長の光（予め設定された波長の光）のみを通過させることができる。このようにフィルタ７０を設けることで、複数波長の光を含む光源からの光から任意の波長の光を自在に選択することができるようになる。

尚、上記各実施例では、光入射手段１０、６０を平行光発生手段１０Ａ、６５と遮蔽部材５５とで構成したが、本発明の請求項１の発明に記載の光入射手段は、これに限定されるものではない。図５及び図６は、この場合の一実施例を説明する図である。尚、図６は図５の光入射手段５０及びレンズアレイ３０の拡大図であり、この図及び図５において図１乃至図４と同一の符号が付されたものは、同様、若しくは、類似の効果、或いは、作用を奏するものとして、説明を省略する。

本実施例の光入射手段５０は、前述した励起光源として、レーザー光を発生するレーザー光源（例えば、固体レーザーなど）を用いる。即ち、この実施例の光入射手段５０は、それぞれ平行なレーザー光（導入用レンズ６の直径よりも狭い幅のレーザー光）を発生する複数のレーザー光源５２を有し、各レーザー光源５２からのレーザー光を、隔壁６１間を通して導入用レンズ６にそれぞれ同時に入射させると共に、各レーザー光源５２を同時に移動させて各導入用レンズ６へのレーザー光の入射位置を同時に変更可能に構成されている。

具体的に、上記移動手段は例えばモータとラックアンドピニオンギアなどから構成されており、レンズアレイ３０の各導入用レンズ６の光軸Ｌに対して平行に光を入射させながら、エバネッセント波が発生する面であるサンプル容器４０の各ウエル４０Ａの底壁４０Ｂの上面４０Ｃに対する複数条の光の入射角度を変更する方向に、レーザー光源５２を同時に移動させるものであり、本実施例では、図５に実線矢印で示すように各導入用レンズ６の光軸Ｌに対して直交する方向に各レーザー光源５２を移動可能に構成されている。尚、本実施例の移動手段は、各導入用レンズ６の光軸Ｌに対して直交する方向に同時に複数条の光を移動させるものであれば良く、例えば、図１に破線矢印で示したような方向に移動するものであっても有効である。

そして、光入射手段５０の各レーザー光源５２からの複数条の励起光（レーザー光）を各導入用レンズ６の何れかの部分に各導入用レンズ６の光軸Ｌに対して平行に入射させると、各導入用レンズ６を通過した光は各導入用レンズ６への入射位置や波長に拘わらず、屈折してそれぞれある一点に集中する。そこで、当該光が集中する一点にそれぞれのウエル４０Ａ内の測定サンプルを配置すると共に、この測定サンプルに照射される各励起光を全反射が生じる角度である臨界角以上の入射角度で入射させて、それぞれ各測定サンプルの臨界面で全反射させ、そのとき、全反射面の上側に発生するエバネッセント波により全反射面から上方の所定範囲内にある各測定サンプルを励起させる。

このように、この場合も入射位置や波長にかかわらず、光入射手段５０からの複数条のレーザー光をそれぞれ一点に集中させる屈折機能を有した複数の導入用レンズ６を並設して成るレンズアレイ３０を設けて、光入射手段５０から導入用レンズ６の直径Ｄよりも狭い幅の各光を各導入用レンズ６へ入射し、各導入用レンズ６を通過した光をそれぞれプリズム５内に導入することで、各導入用レンズ６を通過したそれぞれのレーザー光は、各導入用レンズ６への入射位置や波長にかかわらず、それぞれ一点に集中することとなる。即ち、光入射手段５０からの複数条のレーザー光を、如何なる位置で各導入用レンズ６に入射させたとしても、各導入用レンズ６を経たレーザー光は、それぞれ必ず一点に集中するので、光入射手段５０の位置が変わった場合であっても、それぞれの全反射のポイントは変わらず、各ポイントに入射するそれぞれのレーザー光の入射角度のみが同時に変わることとなる。

特に、この場合は励起光としてレーザー光を用いているので、単一面積当たりの出力が強い複数のレーザー光により、複数の強いエバネッセント波を得ることができるようになる。

この場合もレンズアレイ３０に、隣接する各導入用レンズ６間に設けられた隔壁６１を設けているので、各導入用レンズ６において発生した反射光（レーザー光）を隔壁６１によって遮断し、当該反射光が隣接する他の導入用レンズ６に入る不都合を防止若しくは抑制することが可能となる。これにより、ノイズの発生など、反射光が観察装置Ｓによる測定サンプルの観察に及ぼす悪影響を低減することができるようになる。

次に、図７及び図８は前記各実施例のレンズアレイ３０の他の実施例を示している。この場合、導入用レンズ６は、前述した隔壁６１と同様の素材にて構成された筒体６２内に収納されており、係る導入用レンズ６が収納された筒体６２（反射光遮断手段）を複数並設して構成されている。即ち、この場合は筒体６２の周側壁が前述した隔壁を構成することになる。

そして、光入射手段５０（光入射手段１０、光入射手段６０でも同様）からの複数条の平行光を各筒体６２にそれぞれ入射させる。これにより、それぞれ導入用レンズ６を収納した筒体６２を複数用意して並設することにより、極めて容易にレンズアレイ３０を構成することができるようになる。また、この場合は導入用レンズ６の周囲が必ず遮蔽されることになるので、隣接する導入用レンズ６からの反射光を極めて効果的に排除できるようになる。

次に、図９は前記各実施例の光入射手段１０、光入射手段６０の他の実施例を示している。この場合、遮蔽部材５５は励起光の進行方向（導入用レンズ６の光軸Ｌ方向）に所定の厚さ寸法を備えたブロック体（反射光遮断手段となる）により構成されており、窓孔５６（導入用レンズ６の光軸Ｌに平行）は複数条の励起光を、導入用レンズ６に入るまでの間、相互に隔離するための所定の距離（遮蔽部材５５の厚さ分）を有した通路にて構成されている。そして、遮蔽部材５５はレンズアレイ３０を構成する導入用レンズ６に可能な限り近接して設けられる（移動可能な状態は維持される）。

このような構成としたことで、光入射手段１０から発せられた複数条の励起光は、相互に隔離された状態で各導入用レンズ６にそれぞれ入射することになる。これにより、励起光源からの平行光以外の光の入射が遮断されるので、同様に各導入用レンズ６において発生した反射光が隣接する他の導入用レンズ６に入る不都合を防止若しくは抑制することが可能となり、ノイズの発生など、反射光が観察に及ぼす悪影響を低減することができるようになる。

また、このような構成とすることで、レンズアレイ３０に前述したような隔壁６１や筒体６２を設ける必要は無くなる。尚、光入射手段５０に適用する場合には、レーザー光源５２の移動と共に遮蔽部材５５も移動することになる。

次に、図１０は前記各実施例のレンズアレイ３０を構成する各導入用レンズ６の他の実施例を示している（図ではレーザー光源と筒体の例で説明している）。この場合、各導入用レンズ６は、一つの円形のレンズを全て使用するのでは無く、導入用レンズ６の光軸Ｌに平行な面で、実施例では半分に切断された断片を用いる。即ち、この場合の各導入用レンズ６は、エバネッセント波発生ポイントに入射する励起光の入射角度を変更するために必要な箇所（実施例では中心から半分）のみを残して切除されたものを用いている。

そして、この場合の励起光はこのように切断された半分の寸法の導入用レンズ６の半径よりも幅の狭いものとされる。

このように各導入用レンズ６を、一つのレンズのうちの必要箇所のみを残して切除して成るレンズ断片とすれば、各導入用レンズ６を必要最小限の大きさとすることができるので、当該導入用レンズ６を複数並設した場合に、レンズアレイ３０の小型化を図ることができるようになる。

尚、上記各実施例ではサンプル容器としてガラス製のマイクロプレートを使用したが、材質はそれに限らず、また、区画されていない容器の複数箇所にそれぞれ測定サンプルを配置してもよく、更に、複数の容器を使用し、それぞれに測定サンプルを収容する場合や、容器を用いずにプリズム上に直接複数の測定サンプルを配置する場合にも本発明は有効である。

本発明の一実施例のエバネッセント波発生装置を備えた観察装置の構成図である。（実施例１） 図１のエバネッセント波発生装置の一部拡大図である。 図１の観察装置の他の実施例のエバネッセント波発生装置の説明図である（実施例２）。 図１の観察装置のもう一つの他のエバネッセント波発生装置を説明する図である。 図１の観察装置の更にもう一つの他のエバネッセント波発生装置を説明する図である（実施例３）。 図５のエバネッセント波発生装置の一部拡大図である。 図１の観察装置の更にもう一つの他のエバネッセント波発生装置を説明する図である（実施例４）。 図７のエバネッセント波発生装置の一部拡大図である。 図１の観察装置の更にもう一つの他のエバネッセント波発生装置を説明する図である（実施例５）。 図１の観察装置の更にもう一つの他のエバネッセント波発生装置を説明する図である（実施例６）。

Ｓ 観察装置
１ エバネッセント波発生装置
５ プリズム
６ 導入用レンズ
１０、５０、６０ 光入射手段
２０ 光検出手段
４０ サンプル容器
４０Ａ ウエル
４０Ｂ 底壁
４５ 対物レンズ
４８ ＣＣＤカメラ
６１ 隔壁
６２ 筒体

Claims (12)

1. プリズム内に導入された光によりエバネッセント波を発生させるエバネッセント波発生装置において、
   光軸に平行な光が入射した場合に、入射位置にかかわらず、当該光を一点に集中させる屈折機能を有した複数の導入用レンズが並設されて成るレンズアレイと、
   複数条の平行光を発生する光入射手段と、
   前記各導入用レンズにおいて発生し、隣接する他の導入用レンズに入る反射光を遮断する反射光遮断手段とを備え、
   前記光入射手段から前記レンズアレイの前記各導入用レンズに光をそれぞれ入射し、各導入用レンズをそれぞれ通過した複数条の光を前記プリズム内に導入すると共に、
   前記反射光遮断手段は、前記各導入用レンズの前記プリズム側の端部から前記光入射手段側に向けて所定距離延在していることを特徴とするエバネッセント波発生装置。
2. 前記反射光遮断手段は、隣接する前記各導入用レンズ間にそれぞれ設けられた隔壁であることを特徴とする請求項１に記載のエバネッセント波発生装置。
3. 前記反射光遮断手段は、それぞれ前記導入用レンズが収納された複数の筒体であることを特徴とする請求項１に記載のエバネッセント発生装置。
4. 前記反射光遮断手段は、前記各導入用レンズに入射する光を相互に隔離する通路であることを特徴とする請求項１に記載のエバネッセント波発生装置。
5. 前記光入射手段は、前記各導入用レンズの光軸に対して同時に平行に入射させる移動手段を有し、各導入用レンズの直径よりも狭い幅の光を各導入用レンズにそれぞれ入射させることを特徴とする請求項１乃至請求項４の何れかに記載のエバネッセント波発生装置。
6. 前記光入射手段は、前記入射位置の変更方向に対して所定の幅を有し、且つ、前記各導入用レンズの光軸に平行な光を発生させる平行光発生手段と、該平行光発生手段からの光の一部が通過する複数の窓孔を有した遮蔽部材とを備え、該遮蔽部材を移動させて前記各導入用レンズへの光の入射位置を同時に変更することを特徴とする請求項５に記載のエバネッセント波発生装置。
7. 前記平行光発生手段は、点光源と、該点光源からの拡散光を前記各導入用レンズの光軸に平行な光に屈折させる光源用レンズとを有することを特徴とする請求項６に記載のエバネッセント波発生装置。
8. 前記平行光発生手段からの光を、波長に応じて選択的に通過させるフィルタを備えたことを特徴とする請求項６又は請求項７に記載のエバネッセント波発生装置。
9. 前記光入射手段は、レーザー光を発生する複数のレーザー光源を有し、各レーザー光源からのレーザー光を前記各導入用レンズにそれぞれ入射させると共に、前記各レーザー光源を同時に移動させて前記各導入用レンズへのレーザー光の入射位置を同時に変更することを特徴とする請求項５に記載のエバネッセント波発生装置。
10. 前記導入用レンズは、一つのレンズのうちの必要箇所のみを残して切除して成るレンズ断片であることを特徴とする請求項１乃至請求項９の何れかに記載のエバネッセント波発生装置。
11. 前記各エバネッセント波発生面において発生するエバネッセント波により、複数の測定サンプルの散乱光、及び／又は、蛍光を検出する手段を備えたことを特徴とする請求項１乃至請求項１０の何れかに記載のエバネッセント波発生装置を用いた観察装置。
12. 前記各エバネッセント波を用いた表面プラズモン共鳴による複数の反射光強度の変化を検出する手段を備えたことを特徴とする請求項１乃至請求項１０の何れかに記載のエバネッセント波発生装置を用いた観察装置。

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