JP2008225013A - レーザー走査型顕微鏡 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明の上記課題は、レーザー光源からの直線偏光を試料に照射して、試料から発せられた蛍光の前記直線偏光と直交した偏光成分と、前記直線偏光と平行な偏光成分とを計測するレーザー走査型顕微鏡において、前記レーザー光源と前記試料の間の光路中に、入射光の偏光成分を分離しかつ外部信号により偏光成分の配分を制御する偏光分離光学素子を備え、前記、入射光の偏光成分を分離しかつ外部信号により偏光成分の配分を制御する偏光分離光学素子から射出される互いに直交する角度の直線偏光を前記試料に交互に照射することで解決される。
【選択図】図7
Description
そこでHomo-FRETの観測は、偏光異方性を利用することで行われる。直線偏光の励起光を用いて蛍光分子を励起すると、射出される蛍光も同じ偏光異方性を持つという性質がある。しかし、励起から蛍光を射出する間にFRETが起こると偏光異方性が崩れる。したがって、直線偏光の入射に対して射出される蛍光の偏光の保存のされ方を観察することでHomo-FRETを観察することができる。
Biophysical Journal Volume 80 June 2001 3000-3008
また、本発明は従来のレーザー走査型顕微鏡の構成を大幅に変更することがなく実施できる。
最初に、Homo-FRETによって偏光異方性が崩れることに関する説明をする。
蛍光分子には吸光特性があり、光を吸収しやすい直線偏光の角度がある。さらに、励起して射出される蛍光は直線偏光の角度を継承する。図1では吸収する直線偏光の角度をθ1とし、放射される直線偏光をθ2として示している。ここで、図1の(a)は、2つのGFPが離れている為にHomo-FRETが起こらない。つまり、この状態ではθ1=θ2である。一方、図1の(b)は、2つのGFPが近接している為にHomo-FRETが起こる。この時はθ1≠θ2となる。そして、このθ1とθ2の差がHomo-FRETの観察対象となる。
図3は、従来のレーザー走査型顕微鏡の模式図である。同図における顕微鏡本体1は、対物レンズ4を使ってステージ2上の試料3を観察する。そして顕微鏡本体1にはスキャンユニット5が接続され、スキャンユニット5にはレーザーユニット6からファイバーケーブル7を通してレーザーが導入され内部でレーザー走査が行われる。また、偏光異方性を検出する構成ではファイバーケーブル7は偏波面保存ファイバーを使い、直線偏光を崩さずにスキャンユニット5へ導く。そして、スキャンユニット5やレーザーユニット6に接続されるコンピュータ端末8が備えられ、スキャンユニット5やレーザーユニット6の制御によって得られた検出された光の可視化に利用される。
図5は、従来のレーザー走査型顕微鏡におけるAOTF(Acousto-optic tunable filters)12の使用法を説明するための概略図である。AOTF12は圧電トランスドゥーサー25によって発生させた超音波によって光学素子内に回折格子と同様な機能を持たせることができる光学素子である。AOTF12は入射された光線を回折現象によって0次光と1次光に分解し、さらに圧電トランスドゥーサー25を制御することで分解の比率を変えることができる。
なおスキャニングユニット5のレーザー光合成素子28に偏光ビームスプリッターを使うことで少ない光量損失で同じもしくは極めて近い波長のレーザー光を合成することができる極めて優れたレーザー走査型顕微鏡となる。つまりHomo-FRETのみではなくさまざまなアプリケーションに対応できるレーザー走査型顕微鏡となる。例えば同じもしくは極めて近い波長のCWレーザーとパルスレーザーを組み合わせることにより、煩雑なレーザー切り替え作業や取替え作業を伴わずに一般的な顕微鏡観察とFLIM(Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy)と呼ばれる蛍光寿命のイメージングが一台のレーザー走査型顕微鏡にて可能となる。
図13は、本発明のレーザー走査型顕微鏡で試料面を走査する方法を示している概略図である。試料面の走査は、試料面を格子状に分割したピクセルを一列ごとに走査したものを結合させることによって行う。そして、本発明の実施では試料の励起光の偏光である励起偏光を切り換えながら蛍光の偏光の直交成分と平行成分を計測する。
図14は、本発明のレーザー走査型顕微鏡による励起偏光の切り換えと走査のピクセル移動の順序を表しているフローチャートを示している。
本実施例では、はじめのピクセルに対して蛍光の偏光の直交成分Iper perと平行成分Iper paraを取得する(S1)。その後、励起偏光を切り換える(S2)。この状態で取得される蛍光は直交成分Ipara perと平行成分Ipara paraである(S3)。この段階でこのピクセルでのすべての4つのデータがすべてそろったので次のピクセルへ移動する(S4)。そして励起光の偏光状態を元に戻すためにまた励起偏光の切り替えを行う(S5)。上記のフローを全てのピクセルに対して繰り返す。
2・・・ステージ
3・・・試料
4・・・対物レンズ
5・・・スキャンユニット
6・・・レーザーユニット
7・・・ファイバーケーブル
8・・・コンピュータ端末
9・・・レーザー光源
10・・・ダイクロイックミラー
11・・・ミラー
12・・・AOTF
13・・・ファイバーカップリング機構
14・・・ミラー
15・・・ダイクロイックミラー
16・・・ガルバノミラー
17・・・瞳投影レンズ
18・・・結像レンズ
19・・・ミラー
20・・・結像レンズ
21・・・共焦点ピンホール
22・・・偏光ビームスプリッター
23・・・ミラー
24・・・検出器
25・・・圧電トランスドゥーサー
26・・・0次光
27・・・1次光
28・・・レーザー光合成素子
29・・・ミラー
30・・・AOTF
31・・・シャッター
Claims (11)
- レーザー光源からの直線偏光を試料に照射して、試料から発せられた蛍光の前記直線偏光と直交した偏光成分と、前記直線偏光と平行な偏光成分とを計測するレーザー走査型顕微鏡において、
前記レーザー光源と前記試料の間の光路中に、入射光の偏光成分を分離し、かつ外部信号により偏光成分の配分を制御する偏光分離光学素子を備え、
前記偏光分離光学素子から射出される互いに直交する角度の直線偏光を前記試料に交互に照射することを特徴とするレーザー走査型顕微鏡。 - 前記偏光分離光学素子と前記試料の間の光路には第一のファイバーケーブルと第二のファイバーケーブルが備えられ、
前記互いに直交する角度の直線偏光が、互いに異なるファイバーケーブルを通過することを特徴とする請求項1に記載のレーザー走査型顕微鏡。 - 前記偏光分離光学素子と前記試料の間の光路には1本のファイバーケーブルが備えられ、
前記互いに直交する角度の直線偏光が、同一のファイバーケーブルを通過することを特徴とする請求項1に記載のレーザー走査型顕微鏡。 - 前記偏光分離光学素子は第一の偏光分離光学素子と第二の偏光分離光学素子から構成され、
前記第一の偏光分離光学素子から射出される第一の直線偏光を前記第一のファイバーケーブルに導き、
前記第一の偏光分離光学素子から射出される第二の直線偏光を前記第二の偏光分離光学素子に導き、
前記第二の偏光分離光学素子から射出される直線偏光で前記第一の直線偏光と直交する偏光を前記第二のファイバーケーブルに導くことを特徴とする請求項2に記載のレーザー走査型顕微鏡。 - 前記偏光分離光学素子は第一の偏光分離光学素子と第二の偏光分離光学素子から構成され、
前記第一の偏光分離光学素子から射出される第一の直線偏光を前記ファイバーケーブルに導き、
前記第一の偏光分離光学素子から射出される第二の直線偏光を前記第二の偏光分離光学素子に導き、
前記第二の偏光分離光学素子から射出される直線偏光で前記第一の直線偏光と直交する偏光を前記ファイバーケーブルに導くことを特徴とする請求項3に記載のレーザー走査型顕微鏡。 - レーザー光源からの直線偏光を試料に照射して、試料から発せられた蛍光の前記直線偏光と直交した偏光成分と、前記直線偏光と平行な偏光成分とを計測するレーザー走査型顕微鏡において、
互いに直交する角度の直線偏光を前記試料に交互に照射することを特徴とするレーザー走査型顕微鏡。 - 前記偏光分離光学素子は音響光学可変波長フィルターであることを特徴とする請求項1から請求項6の何れかに記載のレーザー走査型顕微鏡。
- 前記偏光分離光学素子は音響光学可変波長素子であることを特徴とする請求項1から請求項6の何れかに記載のレーザー走査型顕微鏡。
- 前記偏光分離光学素子はホログラフィック格子であることを特徴とする請求項1から請求項6の何れかに記載のレーザー走査型顕微鏡。
- レーザー光源からの直線偏光を試料に照射して、試料から発せられた蛍光の前記直線偏光と直交した偏光成分と、前記直線偏光と平行な偏光成分とを計測するレーザー走査方法おいて、
互いに直交する角度の直線偏光をピクセル毎に切り換えることを特徴とするレーザー走査方法。 - レーザー光源からの直線偏光を試料に照射して、試料から発せられた蛍光の前記直線偏光と直交した偏光成分と、前記直線偏光と平行な偏光成分とを計測するレーザー走査方法おいて、
互いに直交する角度の直線偏光をフレーム毎に切り換えることを特徴とするレーザー走査方法。
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