CN102866137B - 一种二维超分辨显微方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种二维超分辨显微方法，包括以下步骤：1)开启第一共焦成像模式，收集待测样品发出的信号光得到I₁(x，y)；2)开启第二共焦成像模式，收集待测样品发出的信号光得到I₂(x，y)；3)开启第一负共焦成像模式，收集待测样品发出的信号光得到I₃(x，y)；4)开启第二负共焦成像模式，收集待测样品发出的信号光得到I₄(x，y)；5)根据公式计算得到有效信号光强I(x，y)，并利用I(x，y)得到超分辨图像。本发明还公开了一种二维超分辨显微装置。本发明具有成像速度快、装置简单和信噪比好的优点。

Description

一种二维超分辨显微方法和装置

技术领域

本发明涉及光学显微领域，尤其涉及一种二维超分辨显微方法和装置。

背景技术

由阿贝衍射极限理论可知，常规远场光学显微镜的极限分辨率可表示为其中λ为所用照明光的波长，NA为所用显微物镜的数值孔径。因此，在可见光波段，光学显微镜的分辨率被限制在200纳米左右。然而，随着生物医学技术的发展，研究人员们已经开始对生物组织和细胞在纳米尺度上进行分析，所以必须有一种技术可以突破常规衍射极限的限制，实现超分辨显微。

近年来，多种超分辨显微方法陆续被提出，包括：

受激发射损耗显微术（STED:Stimulated Emission DepletionMicroscopy）：利用荧光饱和与激发态荧光受激损耗的非线性关系，并通过限制受激辐射衰减的区域，减少荧光光斑大小，获得小于衍射极限的发光点来提高系统分辨率，从而突破远场光学显微术的衍射极限分辨力限制来实现无接触三维成像；

结构光照明显微术（SIM：Structured Illumination Microscopy）：将多重相互衍射的光束照射到样品上，然后从收集到的发射光模式中提取高分辨率的信息，通过衍射放大作用，得到清晰的超分辨图像；

光激活定位显微术（PALM：Photoactivated localization Microscopy）：采用光敏蛋白质标记样品，并且用超低光强的激活光使得每次只有极少数的光敏蛋白质被敏化，因此只有极少数的光敏蛋白被激发发射荧光。记录单个荧光分子所发出的光子直至漂白并通过PSF数字化计算出中心位置。反复这一过程逐个获取样品上所有荧光分子的中心位置，最后叠加重构成一幅完整的图像。

以及随机光场重建显微术（STORM：Stochastic Optical ReconstructionMicroscopy）：与PALM基本原理类似，利用荧光分子的随机逐个激发发射荧光光子，通过PSF的数字化获得其中心位置。

以上几种方法均已被实验证明可以在远场实现超衍射极限的空间分辨率，但是各自都还存在着不足。STED和SIM对系统设备的要求很高，系统的造价非常昂贵；STORM和PALM的成像速度还比较慢，无法满足实时检测的需求。

发明内容

本发明提供了一种二维超分辨显微方法和装置，可以在远场实现超衍射极限的横向分辨率。该种方法和装置具有成像速度快、装置简单、信噪比好等特点，可以很好地应用于荧光及非荧光样品的检测之中。

一种二维超分辨显微方法，包括以下步骤：

1）开启第一光源，并关闭第二光源、第三光源和第四光源，所述第一光源发出的工作光束转换为线偏振光后对待测样品进行扫描，收集扫描点发出的信号光并得到第一信号光强I₁(x,y)，其中x,y为扫描点的二维坐标；

2）开启第二光源，并关闭第一光源、第三光源和第四光源，所述第二光源发出的工作光束转换为线偏振光后对待测样品进行扫描，收集扫描点发出的信号光并得到第二信号光强I₂(x,y)，其中x,y为扫描点的二维坐标；

3）开启第三光源，并关闭第一光源、第二光源和第四光源，所述第三光源发出的工作光束转换为线偏振光后进行相位调制，并对待测样品进行扫描，收集扫描点发出的信号光并得到第三信号光强I₃(x,y)，其中x,y为扫描点的二维坐标；

4）开启第四光源，并关闭第一光源、第二光源和第三光源，所述第四光源发出的工作光束转换为线偏振光后进行相位调制，并对待测样品进行扫描，收集扫描点发出的信号光并得到第四信号光强I₄(x,y)，其中x,y为扫描点的二维坐标；

5）根据公式I_e1(x,y)＝I₁(x,y)-γI₃(x,y)计算得到第一差分光强，根据公式I_e2(x,y)＝I₂(x,y)-γI₄(x,y)计算得到第二差分光强，最终利用I(x,y)＝min{I_e1(x,y),I_e2(x,y)}计算有效信号光强I(x,y)，并利用I(x,y)得到超分辨图像，其中γ为差分系数。

当待测样品为荧光样品时，所述信号光为所述照明光斑在样品上激发出的荧光；当待测样品为非荧光样品时，所述信号光为所述照明光斑经样品表面反射的光束。

所述步骤3）中的相位调制函数为；

式中：ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与水平方向的夹角。

所述步骤4）中的相位调制函数为：

式中：ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与水平方向的夹角。

作为优选的，所述第一光源、第二光源、第三光源以及第四光源之间的切换频率为对所述样品进行点扫描频率的四倍。在这种情况下，单独开启第一光源，完成对某一扫描点的扫描并得到该点的第一信号光强后，关闭第一光源，依次单独开启第二光源、第三光源以及第四光源，重新对该点进行第二次、第三次和第四次扫描并得到该点的第二信号光强、第三信号光强和第四信号光强，之后，重新单独开启第一光源对下一扫描点进行第一次扫描。

所述第一光源、第二光源、第三光源以及第四光源之间的切换频率也可以设置为与对所述样品进行帧扫描的频率相等。此时，先在第一光源单独开启的状态下，完成对样品上所有扫描点的扫描，接着单独开启第二光源对样品上所有扫描点进行第二次扫描，然后单独开启第三光源对样品上所有扫描点进行第三次扫描，最后单独开启第四光源对样品上所有扫描点进行第四次扫描。

当有效信号光强值I(x,y)为负时，设置I(x,y)＝0，其中x,y为扫描点的二维坐标。

本发明还提供了一种二维超分辨显微装置，包括用于发出工作光束的光源、承载待测样品的样品台，所述光源分为第一光源、第二光源、第三光源和第四光源；

所述第一光源的光路上设有第一起偏器；

所述第二光源的光路上设有第二起偏器；

所述第三光源的光路上依次设有第三起偏器和第一位相调制器；

所述第四光源的光路上依次设有第四起偏器和第二位相调制器；

设有用于将所述第一光源、第二光源、第三光源和第四光源发出的工作光束投射到待测样品上的投射扫描系统；

并设有控制所述第一光源、第二光源、第三光源、第四光源和投射扫描系统的控制器以及探测所述待测样品发出的信号光光强的探测系统。

当第一光源单独开启时，系统处于第一共焦成像模式；当第二光源单独开启时，系统处于第二共焦成像模式；当第三光源单独开启时，系统处于第一负共焦成像模式；当第四光源单独开启时，系统处于第二负共焦成像模式。

所述的第一光源、第二光源、第三光源和第四光源优选为激光器，即为与所述第一光源、第二光源、第三光源和第四相对应的第一激光器、第二激光器、第三激光器和第四激光器。

所述第一激光器、第二激光器、第三激光器和第四激光器与相应的起偏器之间依次设有分别用于对工作光束进行滤波和准直的单模光纤和准直透镜。

所述第一起偏器和第三起偏器的透光轴方向均与水平方向垂直。

所述第二起偏器和第四起偏器的透光轴方向均与水平方向平行。

设有用于将所述第二位相调制器出射的光束转折90°的反射镜。

设有用于将所述第一位相调制器出射的光束转折90°的第一分束镜，所述反射镜出射的光束透过所述第一分束镜，且所述第一分束镜为偏振分光棱镜。

设有用于将所述第二起偏器出射的光束转折90°的第二分束镜，所述反射镜和第一分束镜出射的光束透过所述第二分束镜，且所述第二分束镜为中性分光棱镜。

设有用于将所述第一起偏器出射的光束转折90°的第三分束镜，所述反射镜、第一分束镜和第二分束镜出射的光束透过所述第三分束镜，且所述第三分束镜为中性分光棱镜。

所述第一位相调制器和第二位相调制器为空间光调制器或位相板。

所述第一位相调制器的调制函数为：

式中：ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与水平方向的夹角。

所述第二位相调制器的调制函数为：

式中：ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与水平方向的夹角。

所述投射扫描系统包括：

用于将所述第一光源、第二光源、第三光源和第四光源光路上的光线进行偏转的扫描振镜系统；

依次布置的分别用于对所述扫描振镜系统出射的光线进行聚焦和准直的扫描透镜和场镜；

用于将准直后的光束投射到待测样品上的显微物镜，待测样品发出的信号光被所述显微物镜收集。

所述探测系统包括：

布置在所述第三分束镜和扫描振镜系统之间的第四分束镜，所述第四分束镜用于将所述扫描振镜系统出射的信号光转折90°，所述第四分束镜在待测样品为荧光样品时应选用二色镜，当待测样品为非荧光样品时应选用中性分光棱镜；

用于滤去第四分束镜出射的信号光中的杂散光的带通滤波片，所述带通滤波片在待测样品为非荧光样品时可以省略；

用于探测信号光束的光强信号的探测器，所述探测器选用光电倍增管（PMT）或雪崩光电二极管（APD）；

用于将滤光后的信号光束聚焦到探测器上的聚焦透镜；

用于对所述信号光束进行空间滤波的空间滤波器，其位于所述聚焦透镜的焦平面处，所述空间滤波器可以采用针孔或多模光纤，若采用针孔，所用针孔的直径应小于一个艾里斑直径。

本发明的二维超分辨显微装置工作步骤如下：

（1）利用控制器控制第一激光器、第二激光器、第三激光器和第四激光器的启动和关闭，使显微系统分别工作在第一共焦成像模式、第二共焦成像模式、第一负共焦成像模式和第二负共焦成像模式；当处于第一共焦成像模式时，第一激光器开启，第二激光器、第三激光器和第四激光器关闭；当处于第二共焦成像模式时，第二激光器开启，第一激光器、第三激光器和第四激光器关闭；当处于第一负共焦成像模式时，第三激光器开启，第一激光器、第二激光器和第四激光器关闭；当处于第二负共焦成像模式时，第四激光器开启，第一激光器、第二激光器和第三激光器关闭；

（2）在第一共焦成像模式中，由第一激光器出射的第一工作光束经第一单模光纤和第一准直透镜进行滤波准直；准直后的第一工作光束经过第一起偏器作用转换为第一线偏振光，之后被第三分束镜反射；由第三分束镜反射的第一线偏振光透过第四分束镜，之后入射到扫描振镜系统之中；由扫描振镜系统出射的第一线偏振光依次经过扫描透镜聚焦和场镜准直之后，经显微物镜投射到位于样品台上的待测样品之上，形成第一照明光斑；由待测样品出射的信号光被显微物镜收集，之后依次通过场镜，扫描透镜和扫描振镜系统，最后被第四分束镜反射；经第四分束镜反射的信号光束，通过带通滤波片滤去其中的杂散光后由聚焦透镜聚焦；经聚焦透镜聚焦后的信号光束通过空间滤波器进行空间滤波，之后被探测器所收集，得到当前扫描点处的第一信号光强I₁；通过调节扫描振镜系统实现对于待测样品的二维扫描，记录各扫描点处的第一信号光强I₁(x,y)并生成相应的图像，其中x,y为扫描点的二维坐标；

（3）在第二共焦成像模式中，由第二激光器出射的第二工作光束经第二单模光纤和第二准直透镜进行滤波准直；准直后的第二工作光束经过第二起偏器作用转换为第二线偏振光，之后被第二分束镜反射；由第二分束镜反射的第二线偏振光依次透过第三分束镜和第四分束镜，之后入射到扫描振镜系统之中；由扫描振镜系统出射的第二线偏振光依次经过扫描透镜聚焦和场镜准直之后，经显微物镜投射到位于样品台上的待测样品之上，形成第二照明光斑；由待测样品出射的信号光被显微物镜收集，之后依次通过场镜，扫描透镜和扫描振镜系统，最后被第四分束镜反射；经第四分束镜反射的信号光束，通过带通滤波片滤去其中的杂散光后由聚焦透镜聚焦；经聚焦透镜聚焦后的信号光束通过空间滤波器进行空间滤波，之后被探测器所收集，得到当前扫描点处的第二信号光强I₂；通过调节扫描振镜系统实现对于待测样品的二维扫描，记录各扫描点处的第二信号光强I₂(x,y)并生成相应的图像，其中x,y为扫描点的二维坐标；

（4）在第一负共焦成像模式中，由第三激光器出射的第三工作光束经第三单模光纤和第三准直透镜进行滤波准直；准直后的第三工作光束经过第三起偏器作用转换为第三线偏振光；所述第三线偏振光经第一位相调制器调制后转换为第一调制光束，之后被第一分束镜反射；由第一分束镜反射的第一调制光束依次透过第二分束镜、第三分束镜和第四分束镜，之后入射到扫描振镜系统之中；由扫描振镜系统出射的第一调制光束依次经过扫描透镜聚焦和场镜准直之后，经显微物镜投射到位于样品台上的待测样品之上，形成第三照明光斑；由待测样品出射的信号光被显微物镜收集，之后依次通过场镜，扫描透镜和扫描振镜系统，最后被第四分束镜反射；经第四分束镜反射的信号光束，通过带通滤波片滤去其中的杂散光后由聚焦透镜聚焦；经聚焦透镜聚焦后的信号光束通过空间滤波器进行空间滤波，之后被探测器所收集，得到当前扫描点处的第三信号光强I₃；通过调节扫描振镜系统实现对于待测样品的二维扫描，记录各扫描点处的第三信号光强I₃(x,y)并生成相应的图像，其中x,y为扫描点的二维坐标；

（5）在第二负共焦成像模式中，由第四激光器出射的第四工作光束经第四单模光纤和第四准直透镜进行滤波准直；准直后的第四工作光束经过第四起偏器作用转换为第四线偏振光；所述第四线偏振光经第二位相调制器调制后转换为第二调制光束，之后被反射镜反射；由反射镜反射的第二调制光束依次透过第一分束镜、第二分束镜、第三分束镜和第四分束镜，之后入射到扫描振镜系统之中；由扫描振镜系统出射的第二调制光束依次经过扫描透镜聚焦和场镜准直之后，经显微物镜投射到位于样品台上的待测样品之上，形成第四照明光斑；由待测样品出射的信号光被显微物镜收集，之后依次通过场镜，扫描透镜和扫描振镜系统，最后被第四分束镜反射；经第四分束镜反射的信号光束，通过带通滤波片滤去其中的杂散光后由聚焦透镜聚焦；经聚焦透镜聚焦后的信号光束通过空间滤波器进行空间滤波，之后被探测器所收集，得到当前扫描点处的第四信号光强I₄；通过调节扫描振镜系统实现对于待测样品的二维扫描，记录各扫描点处的第四信号光强I₄(x,y)并生成相应的图像，其中x,y为扫描点的二维坐标；

（6）根据公式I_e1(x,y)＝I₁(x,y)-γI₃(x,y)计算得到第一差分光强，根据公式I_e2(x,y)＝I₂(x,y)-γI₄(x,y)计算得到第二差分光强，最终利用I(x,y)＝min{I_e1(x,y),I_e2(x,y)}计算有效信号光强I(x,y)，并利用I(x,y)得到超分辨图像，其中γ为差分系数。

本发明原理如下：

由于光学系统衍射的影响，平行入射的照明光束经显微物镜聚焦之后，在待测样品上所成的光斑并非一个理想的点，而是一个具有一定尺寸的衍射斑。在该衍射斑照射范围内的样品均会发出相应的信号光。其中，只有由理想聚焦点处发出的才是真正有效的信号光，而由衍射斑中其它位置所发出的光都被认为是杂散光。正是由于这一部分杂散光的存在，使得衍射斑范围内样品的细节无法被分辨，由此限制了显微系统的分辨率。因此，如何抑制这部分杂散光的影响，将成为显微系统突破衍射极限实现超衍射极限的分辨率的关键。

在本发明方法中，当显微系统工作在第一共焦成像模式时，第一线偏振光未经相位调制，直接经显微物镜投射到样品上。此时，由德拜积分计算可得，第一工作光束在样品上所成的第一照明光斑为一个椭圆形光斑，且该椭圆光斑的长轴方向与第一线偏振光的偏振方向相同。该光斑照射范围内的样品所发出的信号光均被探测器所收集，得到当前扫描点处的第一信号光强I₁。

当显微系统工作在第一负共焦成像模式时，第三线偏振光受到第一位相调制器的调制作用。第一位相调制器的相位调制函数为此时由德拜积分计算可得，调制后的第三线偏振光经显微物镜聚焦后在样品上所成的第三照明光斑被一条暗线分割成了两瓣且该暗线方向与第三线偏振光的偏振方向相同。该光斑照射范围内的样品所发出的信号光均被探测器所收集，得到当前扫描点处的第三信号光强I₃。

由于本发明方法中，第一线偏振光与第三线偏振光的偏振方向相同，因此，通过将I₁和I₃进行强度差分得到第一差分光强，可以有效地抑制I₁中由第一照明光斑长轴附近位置所发出的杂散光信号。

当显微系统工作在第二共焦成像模式时，第二线偏振光未经相位调制，直接经显微物镜投射到样品上。此时，由德拜积分计算可得，第二工作光束在样品上所成的第二照明光斑为一个椭圆形光斑，且该椭圆光斑的长轴方向与第二线偏振光的偏振方向相同。该光斑照射范围内的样品所发出的信号光均被探测器所收集，得到当前扫描点处的第二信号光强I₂。

当显微系统工作在第二负共焦成像模式时，第四线偏振光受到第二位相调制器的调制作用。第二位相调制器的相位调制函数为此时由德拜积分计算可得，调制后的第四线偏振光经显微物镜聚焦后在样品上所成的第四照明光斑被一条暗线分割成了两瓣且该暗线方向与第四线偏振光的偏振方向相同。该光斑照射范围内的样品所发出的信号光均被探测器所收集，得到当前扫描点处的第四信号光强I₄。

由于本发明方法中，第二线偏振光与第四线偏振光的偏振方向相同，因此，通过将I₂和I₄进行强度差分得到第二差分光强，可以有效地抑制I₂中由第二照明光斑长轴附近位置所发出的杂散光信号。

由于本发明方法中，第一线偏振光与第二线偏振光的偏振方向相互垂直，因此所述第一照明光斑与第二照明光斑的长轴方向相互垂直。由此，通过公式I(x,y)＝min{I_e1(x,y),I_e2(x,y)}计算得出的有效光强中同时在二维尺度上抑制了杂散光的影响。

与常规光学显微方法相比，本发明通过二维强度差分抑制了所探测到的信号光中的杂散光成分，由此提高了对于细节的分辨能力，实现了超分辨显微。

相对于现有技术，本发明具有以下有益的技术效果：

（1）具有超衍射极限的二维分辨率；

（2）成像速度快，在每一帧图像的扫描点数为512×512的情况下，帧频可达到每秒15帧以上；

（3）装置简单，操作方便。

附图说明

图1为本发明一种二维超分辨显微装置的示意图；

图2为本发明第一共焦成像模式中所成第一照明光斑沿其短轴方向的归一化光强分布曲线；

图3为本发明第一负共焦成像模式中所成第三照明光斑沿垂直于暗线方向的归一化光强分布曲线；

图4为本发明第二共焦成像模式中所成第二照明光斑沿其短轴方向的归一化光强分布曲线；

图5为本发明第二负共焦成像模式中所成第四照明光斑沿垂直于暗线方向的归一化光强分布曲线；

图6为本发明中第一差分光强所对应的点扩散函数与第一照明光斑沿各自短轴方向的归一化光强分布比较曲线；

图7为本发明中第二差分光强所对应的点扩散函数与第二照明光斑沿各自短轴方向的归一化光强分布比较曲线。

具体实施方式

下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。

如图1所示，一种二维超分辨显微装置，包括：第一激光器1，第一单模光纤2，第一准直透镜3，第一起偏器4，第二激光器5，第二单模光纤6，第二准直透镜7，第二起偏器8，第三激光器9，第三单模光纤10，第三准直透镜11，第三起偏器12，第一位相调制器13，第四激光器14，第四单模光纤15，第四准直透镜16，第四起偏器17，第二位相调制器18，反射镜19，第一分束镜20，第二分束镜21，第三分束镜22，第四分束镜23，扫描振镜系统24，扫描透镜25，场镜26，显微物镜27，样品台28，带通滤波片29，聚焦透镜30，针孔31，探测器32，控制器33。

其中，第一单模光纤2、第一准直透镜3、第一起偏器4依次位于第一激光器1出射光束的光轴之上；所述第一起偏器4的透光轴方向与水平方向垂直。

其中，第二单模光纤6、第二准直透镜7、第二起偏器8依次位于第二激光器5出射光束的光轴之上；所述第二起偏器8的透光轴方向与水平方向平行。

其中，第三单模光纤10、第三准直透镜11、第三起偏器12、第一位相调制器13依次位于第三激光器9出射光束的光轴之上；所述第三起偏器12的透光轴方向与水平方向垂直；所述第一位相调制器13的相位调制函数为其中，ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与水平方向的夹角。

其中，第四单模光纤15、第四准直透镜16、第四起偏器17、第二位相调制器18、反射镜19依次位于第四激光器14出射光束的光轴之上；所述第四起偏器17的透光轴方向与水平方向平行；所述第二位相调制器18的相位调制函数为其中，ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与水平方向的夹角。

其中，第一分束镜20、第二分束镜21、第三分束镜22、第四分束镜23、扫描振镜系统24依次位于反射镜19反射光束的光轴之上。

其中，扫描透镜25、场镜26、显微物镜27、样品台28依次位于扫描振镜系统24出射光束的光轴之上；所述样品台28位于显微物镜27的焦平面附近。

其中，带通滤波片29，聚焦透镜30，针孔31，探测器32依次位于第四分束镜23反射光束的光轴之上；所述针孔31位于聚焦透镜30的焦平面处。

其中，控制器33分别与第一激光器1、第二激光器5、第三激光器9、第四激光器14以及扫描振镜系统24相连，用于控制显微系统成像模式的切换以及扫描振镜系统24的二维扫描；显微系统成像模式的切换频率设置为扫描振镜系统的点扫描频率的四倍。

上述装置中，显微物镜27的数值孔径NA=1.4；所用针孔31的直径为0.73个艾里斑直径，探测器32为雪崩光电二极管（APD）。

采用图1所示的装置实现二维超分辨显微的方法如下：

利用控制器33启动第一激光器1，同时关闭第二激光器5、第三激光器9和第四激光器14，使显微系统工作在第一共焦成像模式。

从第一激光器1发出的第一工作光束，首先被导入第一单模光纤2，从第一单模光纤2出射的激光光束，经过第一准直透镜3完成准直。经过准直后的第一工作光束入射到第一起偏器4转换为第一线偏振光，之后被第三分束镜22反射。

由第三分束镜22反射的第一线偏振光透过第四分束镜23，入射到扫描振镜系统24上。经扫描振镜系统24出射的第一线偏振光依次被扫描透镜25聚焦、场镜26准直，之后经显微物镜27投射到位于样品台28上的待测样品之上。

所述第一线偏振光在显微物镜27的焦点附近所成的光场分布可由德拜积分确定，具体如下：

$\stackrel{\→}{E}(r_2,{\mathrm{\φ}}_2,z_2)=\mathrm{iC}{\∫\∫}_{\mathrm{\Ω}}\sin \left(\mathrm{\θ}\right)\·A_1(\mathrm{\θ},\mathrm{\φ})\·A_2(\mathrm{\θ},\mathrm{\φ})\·\left[\begin{array}{c}{p}_x\\ p_y\\ p_z\end{array}\right]\·e^{\mathrm{ikn}(z_2\cos \mathrm{\θ}+r_2\sin \mathrm{\θ}\cos (\mathrm{\φ}-{\mathrm{\φ}}_2))}\mathrm{d\θd\φ}$

式中，是以显微物镜27的焦点位置为原点的柱坐标系，代表了处的电矢量强度，i为虚数单位，C为归一化常数，θ为光束孔径角，φ为光束垂直z轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角，A₁(θ,φ)是入射光的振幅分布，A₂(θ,φ)表征了显微物镜27的结构， $\left[\begin{array}{c}{p}_x\\ p_y\\ p_z\end{array}\right]$ 则表示了入射光的偏振信息，k=2π/λ，n为介质折射率。

由上式计算可以发现，此时第一线偏振光经显微物镜27聚焦之后在待测样品上所成的第一照明光斑为一个椭圆形光斑，其沿短轴方向的归一化光强分布曲线如图2所示。

待测样品所出射的信号光被显微物镜27收集，之后依次通过场镜26、扫描透镜25、扫描振镜系统24，最后被第四分束镜23反射。经第四分束镜23反射的信号光束通过带通滤波片29滤去杂散光，之后经聚焦透镜30聚焦并通过针孔31进行空间滤波，最终被探测器32所探测。记此时探测器32探测得到的信号光强值为I₁(x,y)，将其作为在当前扫描点处的第一信号光强。

利用控制器33启动第二激光器5，同时关闭第一激光器1、第三激光器9和第四激光器14，使显微系统工作在第二共焦成像模式。

从第二激光器5发出的第二工作光束，首先被导入第二单模光纤6，从第二单模光纤6出射的激光光束，经过第二准直透镜7完成准直。经过准直后的第二工作光束入射到第二起偏器8转换为第二线偏振光，之后被第二分束镜21反射。

由第二分束镜21反射的第二线偏振光透过第三分束镜22和第四分束镜23，入射到扫描振镜系统24上。经扫描振镜系统24出射的第二线偏振光依次被扫描透镜25聚焦、场镜26准直，之后经显微物镜27投射到位于样品台28上的待测样品之上。

所述第二线偏振光在显微物镜27的焦点附近所成的光场分布同样可由德拜积分确定。通过计算可以发现，此时第二线偏振光经显微物镜27聚焦之后在待测样品上所成的第二照明光斑为一个椭圆形光斑，其沿短轴方向的归一化光强分布曲线如图4所示。

待测样品所出射的信号光被显微物镜27收集，之后依次通过场镜26、扫描透镜25、扫描振镜系统24，最后被第四分束镜23反射。经第四分束镜23反射的信号光束通过带通滤波片29滤去杂散光，之后经聚焦透镜30聚焦并通过针孔31进行空间滤波，最终被探测器32所探测。记此时探测器32探测得到的信号光强值为I₂(x,y)，将其作为在当前扫描点处的第二信号光强。

利用控制器33启动第三激光器9，同时关闭第一激光器1、第二激光器5和第四激光器14，使显微系统工作在第一负共焦成像模式。

从第三激光器9发出的第三工作光束，首先被导入第三单模光纤10，从第三单模光纤10出射的激光光束，经过第三准直透镜11完成准直。经过准直后的第三工作光束入射到第三起偏器12转换为第三线偏振光，之后入射到第一位相调制器13上进行相位调制并得到第一调制光束。

第一位相调制器13的相位调制函数为

其中，ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与水平方向的夹角。

此时，经第一位相调制器13进行相位调制之后，第一调制光束的电矢量强度可由下式表示：

其中，为入射到第一位相调制器13上的第三线偏振光在处的电矢量强度，为经过第一位相调制器13相位调制后的第一调制光束在处的电矢量强度，i为虚数单位。

由第一位相调制器13出射的第一调制光束被第一分束镜20反射，之后依次透过第二分束镜21、第三分束镜22和第四分束镜23，入射到扫描振镜系统24上。经扫描振镜系统24出射的第一调制光束依次被扫描透镜25聚焦、场镜26准直，之后通过显微物镜27投射到位于样品台28上的待测样品之上。

所述第一调制光束在显微物镜27的焦点附近所成的光场分布同样可由德拜积分确定。通过计算可以发现，此时第一调制光束经显微物镜27聚焦之后在待测样品上所成第三照明光斑被一条暗线分割成了两瓣，第三照明光斑沿垂直于暗线方向的归一化光强分布曲线如图3所示。

待测样品所出射的信号光被显微物镜27收集，之后依次通过场镜26、扫描透镜25、扫描振镜系统24，最后被第四分束镜23反射。经第四分束镜23反射的信号光束通过带通滤波片29滤去杂散光，之后经聚焦透镜30聚焦并通过针孔31进行空间滤波，最终被探测器32所探测。记此时探测器32探测得到的信号光强值为I₃(x,y)，将其作为在当前扫描点处的第三信号光强。

利用控制器33启动第四激光器14，同时关闭第一激光器1、第二激光器5和第三激光器9，使显微系统工作在第二负共焦成像模式。

从第四激光器14发出的第四工作光束，首先被导入第四单模光纤15，从第四单模光纤15出射的激光光束，经过第四准直透镜16完成准直。经过准直后的第四工作光束入射到第四起偏器17转换为第四线偏振光，之后入射到第二位相调制器18上进行相位调制并得到第二调制光束。

第二位相调制器18的相位调制函数为其中，ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与水平方向的夹角。

此时，经第二位相调制器18进行相位调制之后，第二调制光束的电矢量强度可由下式表示：

其中，为入射到第二位相调制器18上的第四线偏振光在处的电矢量强度，为经过第二位相调制器18相位调制后的第二调制光束在处的电矢量强度，i为虚数单位。

由第二位相调制器18出射的第二调制光束被反射镜19反射，之后依次透过第一分束镜20、第二分束镜21、第三分束镜22和第四分束镜23，入射到扫描振镜系统24上。经扫描振镜系统24出射的第二调制光束依次被扫描透镜25聚焦、场镜26准直，之后通过显微物镜27投射到位于样品台28上的待测样品之上。

所述第二调制光束在显微物镜27的焦点附近所成的光场分布同样可由德拜积分确定。通过计算可以发现，此时第二调制光束经显微物镜27聚焦之后在待测样品上所成第四照明光斑被一条暗线分割成了两瓣，第四照明光斑沿垂直于暗线方向的归一化光强分布曲线如图5所示。

待测样品所出射的信号光被显微物镜27收集，之后依次通过场镜26、扫描透镜25、扫描振镜系统24，最后被第四分束镜23反射。经第四分束镜23反射的信号光束通过带通滤波片29滤去杂散光，之后经聚焦透镜30聚焦并通过针孔31进行空间滤波，最终被探测器32所探测。记此时探测器32探测得到的信号光强值为I₄(x,y)，将其作为在当前扫描点处的第四信号光强。

通过控制器33调节扫描振镜系统24，并重复上述过程，实现对于待测样品的二维扫描，记录各扫描点处的第一信号光强I₁(x,y)、第二信号光强I₂(x,y)、第三信号光强I₃(x,y)和第四信号光强I₄(x,y)，其中x,y为扫描点的二维坐标。

根据公式I_e1(x,y)＝I₁(x,y)-γI₃(x,y)计算得到第一差分光强，根据公式I_e2(x,y)＝I₂(x,y)-γI₄(x,y)计算得到第二差分光强，最终利用I(x,y)＝min{I_e1(x,y),I_e2(x,y)}计算有效信号光强I(x,y)，并利用I(x,y)得到超分辨图像，其中γ为差分系数，设置为0.5。

本发明中第一差分光强所对应的点扩散函数与第一照明光斑沿各自短轴方向的归一化光强分布比较曲线如图6所示，第二差分光强所对应的点扩散函数与第二照明光斑沿各自短轴方向的归一化光强分布比较曲线如图7所示。由图6和图7可以看出，本发明中第一差分光强和第二差分光强所对应点扩散函数的沿短轴方向的尺寸（以光强分布曲线的半高全宽值来衡量）较第一照明光斑和第二照明光斑均有所减小，说明部分杂散光受到了抑制。由于本发明中第一照明光斑和第二照明光斑的短轴方向相互垂直，因此，通过公式I(x,y)＝min{I_e1(x,y),I_e2(x,y)}计算得出的有效光强将同时在二维尺度上抑制了杂散光的影响，从而实现二维超分辨显微。

Claims (6)

1.一种二维超分辨显微方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）开启第一光源，并关闭第二光源、第三光源和第四光源，所述第一光源发出的工作光束转换为线偏振光后对待测样品进行扫描，收集扫描点发出的信号光并得到第一信号光强I₁(x,y)，其中x,y为扫描点的二维坐标；

2）开启第二光源，并关闭第一光源、第三光源和第四光源，所述第二光源发出的工作光束转换为线偏振光后对待测样品进行扫描，收集扫描点发出的信号光并得到第二信号光强I₂(x,y)，其中x,y为扫描点的二维坐标；

3）开启第三光源，并关闭第一光源、第二光源和第四光源，所述第三光源发出的工作光束转换为线偏振光后进行相位调制，并对待测样品进行扫描，收集扫描点发出的信号光并得到第三信号光强I₃(x,y)，其中x,y为扫描点的二维坐标；

所述步骤3）中的相位调制函数为；

式中：ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与水平方向的夹角；

4）开启第四光源，并关闭第一光源、第二光源和第三光源，所述第四光源发出的工作光束转换为线偏振光后进行相位调制，并对待测样品进行扫描，收集扫描点发出的信号光并得到第四信号光强I₄(x,y)，其中x,y为扫描点的二维坐标；

所述步骤4）中的相位调制函数为：

式中：ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与水平方向的夹角；

5）根据公式I_e1(x,y)＝I₁(x,y)-γI₃(x,y)计算得到第一差分光强，根据公式I_e2(x,y)＝I₂(x,y)-γI₄(x,y)计算得到第二差分光强，最终利用I(x,y)＝min{I_e1(x,y),I_e2(x,y)}计算有效信号光强I(x,y)，并利用I(x,y)得到超分辨图像，其中γ为差分系数。

2.如权利要求1所述的二维超分辨显微方法，其特征在于，所述第一光源、第二光源、第三光源以及第四光源之间的切换频率为对所述样品进行点扫描频率的四倍。

3.如权利要求1所述的二维超分辨显微方法，其特征在于，所述第一光源、第二光源、第三光源以及第四光源之间的切换频率与对所述样品进行帧扫描频率相等。

4.如权利要求1所述的二维超分辨显微方法，其特征在于，当有效信号光强值I(x,y)为负时，设置I(x,y)＝0，其中x,y为扫描点的二维坐标。

5.一种二维超分辨显微装置，包括用于发出工作光束的光源、承载待测样品的样品台，其特征在于，所述光源分为第一光源、第二光源、第三光源和第四光源；

所述第一光源的光路上设有第一起偏器；

所述第二光源的光路上设有第二起偏器；

所述第三光源的光路上依次设有第三起偏器和第一位相调制器；

所述第一位相调制器的调制函数为：

式中：ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与水平方向的夹角；

所述第四光源的光路上依次设有第四起偏器和第二位相调制器；

所述第二位相调制器的调制函数为：

式中：ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与水平方向的夹角；

设有用于将所述第一光源、第二光源、第三光源和第四光源发出的工作光束投射到待测样品上的投射扫描系统；

并设有控制所述第一光源、第二光源、第三光源、第四光源和投射扫描系统的控制器以及探测所述待测样品发出的信号光光强的探测系统。

6.如权利要求5所述的二维超分辨显微装置，其特征在于，所述投射扫描系统包括：

用于将所述第一光源、第二光源、第三光源和第四光源光路上的光线进行偏转的扫描振镜系统；

依次布置的分别用于对所述扫描振镜系统出射的光线进行聚焦和准直的扫描透镜和场镜；

用于将准直后的光束投射到待测样品上的显微物镜，待测样品发出的信号光被所述显微物镜收集。