CN110907415B - 一种基于并行探测的三维亚十纳米定位方法及装置 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种基于并行探测的三维亚十纳米定位方法，用同一光源发出的被调制为两种光束，其中一束光调制后在样品上聚焦形成横向空心光斑，另一束光调制为轴向空心斑，合束后形成三维空心光斑；再基于探测器阵列和正负离焦的两个单点探测器对空间不同位置点进行荧光光子数采样计数，根据统计分布规律以及极大似然概率估计的数学模型，对荧光分子进行三维空间定位。本发明较之传统方法可以在三维空间下进行亚十纳米精度定位，并且基于并行差分探测的原理，可以仅一次照明实现对单分子的定位，大大提高了定位速度，从而更满足生物医学研究领域的实际需要。与上述方法对应的是，本发明还公开一种基于并行探测的三维亚十纳米定位装置。

Description

一种基于并行探测的三维亚十纳米定位方法及装置
技术领域
本发明属于超分辨领域，尤其涉及一种基于并行探测的三维亚十纳米定位方法及装置。
背景技术
现有技术中，诺贝尔化学奖得主Stefan Hell在Science杂志上发表论文[Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules withminimal photon fluxes.Science 355(6325),606-612(2017)]，创新性的结合了随机坐标定位和确定坐标分辨两种技术的优点，提出了一种新型的纳米分辨技术，称为最小光通量显微术(MINFLUX)。
与随机坐标定位技术通过高斯中心拟合定位，以及确定坐标分辨技术使用空心光束进行荧光损耗不同，在单分子定位过程中，MINFLUX只使用空心光束激发荧光并进行确定坐标的暗斑中心定位。相比高斯中心定位，MINFLUX采用的暗斑中心定位具有很强的光敏感性，其空间分辨能力可以达到亚十纳米。
MINFLUX定位单个荧光分子所需的光子数极低，大大降低荧光染料漂白的风险，可以长时间对荧光分子进行定位。因此该技术是一种长时程、高精度、高分辨的定位手段。
尽管MINFLUX实现了低光通量条件下的亚十纳米精确定位并进行了实验验证，但仍然存在以下不足：
(1)在进行单分子定位时，需要移动平台进行四次照明才能得到一个荧光分子的位置；
(2)作为一种分时定位技术，定位速度受到一定的限制；
(3)只探究了二维平面的应用，而并没有推至三维情形。
发明内容
本发明提供了一种基于并行探测的三维亚十纳米定位方法，利用将一束激光分成两束线偏振光，分别在横向和轴向上进行相位调制，再合束为一束点扩展函数表现为三维空心斑的光束。随后采用探测器阵列收集焦面荧光信号，用两个单探测器分别收集正离焦与负离焦荧光信号，结合后期数学模型，重构出荧光分子的三维精确位置信息。
一种基于并行探测的三维亚十纳米定位方法，包括以下步骤：
1)激光光束分成两束线偏振光，分别为P光和S光；
2)对所述的P光进行横向相位调制，对S光进行轴向相位调制；
3)所述的P光和S光合束后对样品进行扫描，并收集信号光；
4)利用探测器分别接收焦面位置的信号光和离焦的信号光；
5)根据焦面位置的信号光计算荧光分子的横向位置信息，根据离焦的信号光计算荧光分子的轴向位置信息；
6)根据所述的横向位置信息和轴向位置信息，重构出荧光分子的三维空间信息。
优选的，利用0～2π涡旋位相板对P光进行横向相位调制，利用0/π相位板对S光进行轴向相位调制。
本申请中，P光通过0-2π相位板调制后在样品上聚焦形成横向空心光斑，S光被0/π相位板调制为轴向空心斑，合束后形成三维空心光斑。
优选的，利用包含多个单体探测器的探测器阵列收集焦面位置的信号光；所述的离焦的信号光由两个单探测器分别收集的正离焦的信号光和负离焦的信号光。
本申请中，探测器阵列包括七个单体探测器，一次照明即可获得七个光子数分布，相当于间接实现了照明光斑位置对于荧光分子的相对移动，理论上可以比传统所使用的二维暗斑定位方法在速度上提高4倍。
本发明原理如下：
在XY平面上，传统的光子接收只采用一个单光子探测计数器，定位一个荧光分子，需要精准扫描光斑四次，使得暗斑中心分别位于探测圆的圆心位置以及圆周上的三等分点位置。荧光分子受激发后在四个位置产生的光子分布满足多项式分布。但这种定位技术，一是需要纳米尺度上精准扫描光斑，二是实现一次定位的速度较慢，效率较低。本发明将单个探测器换成七个探测器，一次照明即可获得七个光子数分布，相当于间接实现了照明光斑位置对于荧光分子的相对移动，理论上可以比传统所使用的二维暗斑定位方法在速度上提高4倍。
要加上Z方向的信息，我们需要将原来二维平面的暗斑替换为一个三维的空间暗斑，并在正离焦和负离焦的位置使用单点探测器收集光子数，起到相当于并行Z轴探测光子信息的作用。
对探测器阵列所接收到的光信号，本发明采用极大似然概率估计函数，并进行反解，即可以获得较为精准的荧光分子定位。在添加噪声的情况下，定位精度仍然可以达到亚十纳米，并且相较于现有方法有所提高。极大似然函数估计公式如下：
Figure BDA0002257917180000031
其中，ni代表在第i个探测器上接收到的光子数，pi代表在其共轭平面上不同探测器相对照射强度的占比，即：
Figure BDA0002257917180000032
对于Z轴方向的定位，正离焦和负离焦，以及焦平面三者相当于针孔的位置在Z轴上有所区别，因此使用探测器探测到的PSF也会有所不同，根据离焦量和实际空间Z方向共轭等价的关系，可以推得相应的Z轴定位信息。
其中，针孔信息在Z轴有所偏离，从而导致不同位置探测器接收到的光照强度分布有所偏移，即Ii有所不同，之后的计算方法与XY平面相同，相当于在XZ平面上再次进行定位。
与上述方法相对应的是，本发明还提供一种基于并行探测的三维亚十纳米定位装置，包括光源，承载待测样品的样品台，以及用于接收信号光的探测系统；
所述光源与样品台之间依次设有：
用于改变所述光源发出光束的偏振特性的第一1/2波片；
用于将偏振特性改变后的光束分成两束线偏振光的第一偏振分束器，所述的两束线偏振光分别为P光和S光；
用于对所述P光进行横向相位调制的0～2π涡旋位相板；
用于对所述S光进行轴向相位调制的0/π相位板；
所述的P光和S光合束后对样品进行扫描，并激发信号光；
所述的探测系统包括：
第一探测器阵列，用于接收焦面位置的信号光；
第二探测器阵列，用于接收离焦的信号光。
本申请中，所述光源与1/2波片之间依次设有用于对所述激光光束进行滤波的单模光纤和准直的准直透镜。
优选的，所述0～2π涡旋位相板，其横向相位调制原理在于调制函数
Figure BDA0002257917180000041
其中，ρ为光束上某点与光轴的距离，
Figure BDA0002257917180000042
为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角；
优选的，所述0/π相位板，其轴向相位调制原理在于相位阶跃函数
Figure BDA0002257917180000043
其中r为光束上某点与光轴的距离，R为0到1之间的设定值。
所述的P光和S光经第一偏振分束器后，并通过依次设置在光路上的第二1/2波片、1/4波片、扫描振镜系统、扫描透镜、场镜和显微物镜对样品进行扫描，并激发信号光。
优选的，样品发出的信号光由第一分光镜等分为两束，分别由第一探测器阵列和第二探测器阵列收集。
优选的，所述的第一探测器阵列包含多个单体探测器；所述的第二探测器阵列包括两个单探测器，两个单探测器分别收集的正离焦的信号光和负离焦的信号光。
本申请的装置中，还应当包括用于信号处理的计算机，用于根据焦面位置的信号光计算荧光分子的横向位置信息，根据离焦的信号光计算荧光分子的轴向位置信息；并利用所述的横向位置信息和轴向位置信息，重构出荧光分子的三维空间信息。
因此，与现有MINFLUX方法相比，本发明具有以下有益的技术效果：
(1)首次提出了基于探测器阵列的三维亚十纳米定位方法；
(2)装置简单，操作方便。
附图说明
图1为本实施例的超分辨显微装置的结构示意图；
图2为本实施例的三维激发空心光斑的归一化横向光强分布曲线；
图3为本实施例的三维激发空心光斑的归一化轴向光强分布曲线；
图4为本实施例的并行探测共轭平面位置分布示意图；
图5为本实施例的轴向定位示意图。
具体实施方式
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开的具体实施例的限制。
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
如图1所示，本实施例的超分辨显微装置，包括：激光器1，单模光纤2，准直透镜3，第一偏振分束器5和第一偏振分束器10，0～2π涡旋位相板6，0/π相位板9，第一1/2波片4和第二1/2波片11，1/4波片12，第一反射镜7、第二反射镜8、第三反射镜13、第四反射镜17和第五反射镜33，二色镜14，消色差1/4波片15，扫描振镜16，扫描透镜18，场镜19，显微物镜20，样品台21，带通滤波片23，微透镜阵列24，针孔阵列25，光纤束26，探测器阵列27，第一分光镜22和第二分光镜28，第一收集透镜29和第二收集透镜34，第一针孔30和第二针孔35，第一多模光纤31和第二多模光纤36，第一单探测器32和第二单探测器37。
单模光纤2、准直透镜3、0～2π涡旋位相板6、第一1/2波片4和11、第一偏振分束器5和第二偏振分束器10、1/4波片12依次位于激光器1出射光束的光轴之上。
第一偏振分束器10位于经0～2π涡旋位相板6和经0/π相位板9调制后光束的光轴之上。
二色镜14、消色差1/4波片15依次位于第二偏振分束器10的出射光经反射镜偏折之后的光轴之上；扫描振镜16位于经二色镜14出射后光束的光轴之上。
扫描透镜18、场镜19、显微物镜20、样品台21依次位于扫描振镜16出射光束的光轴之上。
带通滤波片23、第一分光镜22、微透镜阵列24、针孔阵列25、光纤束26和探测器阵列27依次位于经二色镜14后反射镜反射光束的光轴之上；所述针孔阵列25位于微透镜阵列24的焦平面处。
上述装置中，显微物镜20的数值孔径NA＝1.4；所用针孔25的直径为0.2个艾里斑直径，探测器阵列27为雪崩二极管阵列(APD)。
第一收集透镜29、针孔30、第一多模光纤31和第一单探测器32依次位于经第二分光镜28反射光束的光轴之上；第一针孔30位于第一收集透镜29的负离焦平面处。第一单探测器32为雪崩二极管阵列(APD)。
第二收集透镜34、针孔35、第二多模光纤36和第二单探测器37依次位于经反射镜33反射光束的光轴之上；第二针孔35位于第二收集透镜34的正离焦平面处。第二单探测器37为雪崩二极管阵列(APD)。
本实施例中，第一分光镜22和第二分光镜28均为50/50分光镜，用于将荧光信号等分反射和透射。
采用图1所示的装置进行超分辨显微的方法如下：
从激光器1发出的激光光束，首先被导入单模光纤2，经过准直透镜3完成准直。经过准直后的光束入射到0～2π涡旋位相板6和0/π相位板9受到调制，经第二偏振分束器10后合束产生三维空心光斑。
分别由0～2π涡旋位相板4和0/π相位板9出射的两束光，通过第二1/2波片11变为线偏振光，再经1/4波片12变为圆偏光。再通过消色差1/4波片15，补偿因二色镜引起的偏振态改变，使其重新变为圆偏光。
调制后的光入射到扫描振镜16上，经扫描振镜16出射的光束依次被扫描透镜18聚焦、场镜19准直，之后经显微物镜20投射到位于样品台21上的待测样品之上。
入射光在显微物镜20的焦点附近所成的光场分布可由德拜积分确定，具体如下：
Figure BDA0002257917180000071
式中，
Figure BDA0002257917180000072
是以显微物镜20的焦点位置为原点的柱坐标系下的坐标，
Figure BDA0002257917180000073
代表了
Figure BDA0002257917180000074
处的电矢量强度，i为虚数单位，C为归一化常数，θ为光束孔径角，φ为光束垂直Z轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角，A1(θ,φ)是入射光的振幅分布，A2(θ,φ)表征了显微物镜20的结构，
Figure BDA0002257917180000075
则表示了入射光的偏振信息，k＝2π/λ，n为介质折射率。
由上式计算可以发现，此时入射的圆偏光经显微物镜20聚焦之后在待测样品上所成光斑为一个面包圈型空心光斑，其横向和轴向光场分布归一化曲线分别如图2和3所示。
待测样品所出射的信号光被显微物镜20收集，之后依次通过场镜19、扫描透镜18、扫描振镜16，通过二色镜14，最后被反射。信号光束通过带通滤波片23滤去杂散光，之后经第一分光镜22分光，一半的荧光被反射入微透镜阵列24，并被聚焦，随后通过针孔阵列25进行空间滤波，最终被探测器阵列27接收；一半的荧光透射通过第二分光镜22。透射的荧光有一半被第二分光镜28反射入第一收集透镜29，并被聚焦，随后通过第一针孔30，最终被第一单探测器32接收；透射的荧光另有一半透射通过第二分光镜28，经第五反射镜33反射后进入第二收集透镜34，并被聚焦，随后通过第二针孔35，最终被第二单探测器37接收。
通过控制器调节扫描振镜16，实现对于待测样品的二维扫描。
通过探测器阵列，七个探测器在一次照明下可获得七个光子数分布。采用极大似然概率估计函数，并进行反解，即可以获得较为精准的荧光分子定位，如图4是七个探测器在一次照明情况下在共轭平面上的等效光照分布。在添加噪声的情况下，定位精度仍然可以达到亚十纳米。如图5是第一单探测器32和第二单探测器37结合焦平面上的总光子数解析出的荧光分子轴向位置信息。
以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于并行探测的三维亚十纳米定位方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)激光光束分成两束线偏振光，分别为P光和S光；
2)对所述的P光进行横向相位调制，对S光进行轴向相位调制；
3)所述的P光和S光合束后形成三维空心光斑对样品进行扫描，并激发信号光；
4)利用探测器分别接收焦面位置的信号光和离焦的信号光；
5)根据焦面位置的信号光计算荧光分子的横向位置信息，根据离焦的信号光计算荧光分子的轴向位置信息；
6)根据所述的横向位置信息和轴向位置信息，重构出荧光分子的三维空间信息。
2.如权利要求1所述的基于并行探测的三维亚十纳米定位方法，其特征在于，利用0～2π涡旋位相板对P光进行横向相位调制，利用0/π相位板对S光进行轴向相位调制。
3.如权利要求1所述的基于并行探测的三维亚十纳米定位方法，其特征在于，利用包含多个单体探测器的探测器阵列收集焦面位置的信号光；
所述的离焦的信号光由两个单探测器分别收集的正离焦的信号光和负离焦的信号光。
4.一种基于并行探测的三维亚十纳米定位装置，包括光源，承载待测样品的样品台，以及用于接收信号光的探测系统；其特征在于：
所述光源与样品台之间依次设有：
用于改变所述光源发出光束的偏振特性的第一1/2波片；
用于将偏振特性改变后的光束分成两束线偏振光的第一偏振分束器，所述的两束线偏振光分别为P光和S光；
用于对所述P光进行横向相位调制的0～2π涡旋位相板；
用于对所述S光进行轴向相位调制的0/π相位板；
所述的P光和S光合束后形成三维空心光斑对样品进行扫描，并激发信号光；
所述的探测系统包括：
第一探测器阵列，用于接收焦面位置的信号光；
第二探测器阵列，用于接收离焦的信号光。
5.如权利要求4所述的基于并行探测的三维亚十纳米定位装置，其特征在于，所述光源与1/2波片之间依次设有用于对所述激光光束进行滤波的单模光纤和准直的准直透镜。
6.如权利要求4所述的基于并行探测的三维亚十纳米定位装置，其特征在于，所述0～2π涡旋位相板，其横向相位调制原理在于调制函数
Figure FDA0002808553940000021
其中，ρ为光束上某点与光轴的距离，
Figure FDA0002808553940000022
为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角；
所述0/π相位板，其轴向相位调制原理在于相位阶跃函数
Figure FDA0002808553940000023
其中r为光束上某点与光轴的距离，R为0到1之间的设定值。
7.如权利要求4所述的基于并行探测的三维亚十纳米定位装置，其特征在于，经第一偏振分束器出射的P光和S光，并通过依次设置在光路上的第二1/2波片、1/4波片、扫描振镜系统、扫描透镜、场镜和显微物镜对样品进行扫描，并激发信号光。
8.如权利要求4所述的基于并行探测的三维亚十纳米定位装置，其特征在于，样品发出的信号光由第一分光镜等分为两束，分别由第一探测器阵列和第二探测器阵列收集。
9.如权利要求8所述的基于并行探测的三维亚十纳米定位装置，其特征在于，所述的第一探测器阵列包含多个单体探测器；所述的第二探测器阵列包括两个单探测器，两个单探测器分别收集的正离焦的信号光和负离焦的信号光。
10.如权利要求4所述的基于并行探测的三维亚十纳米定位装置，其特征在于，还包括用于信号处理的计算机，用于根据焦面位置的信号光计算荧光分子的横向位置信息，根据离焦的信号光计算荧光分子的轴向位置信息；并利用所述的横向位置信息和轴向位置信息，重构出荧光分子的三维空间信息。
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