CN105487214B - 一种快速三维超分辨率显微方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速三维超分辨率显微方法，包括：激光光束在准直后转换为线偏振光，对线偏振光进行相位调制并转换为圆偏振光投射到待测样品上，以及收集待测样品各扫描点发出的信号光；对样品进行三维扫描，所述的相位调制包括一次相位调制和二次相位调制；一次相位调制采用对线偏振光s光分量进行相位调制的空间光调制器，二次相位调制采用对线偏振光p光分量进行相位调制的空间光调制器，最后根据有效信号光强得到三维超分辨图像。本发明还公开了一种快速三维超分辨率显微装置。本发明使用较低的光功率，减弱光漂白效应，快速的三维成像，装置简单，无需分光。

Description

一种快速三维超分辨率显微方法和装置

技术领域

本发明属于超分辨领域，尤其涉及一种能在远场快速实现三维超衍射极限分辨率的方法和装置。

背景技术

光学显微成像是一种常用的、有效的观测亚微米级微观结构的手段，然而光学衍射极限的存在极大限制了光学显微成像的分辨率。根据阿贝衍射极限原理，理想点光源经过显微物镜聚焦后不是成一个理想像点，而是一个衍射光斑，其尺寸用衍射斑强度分布曲线的半高全宽来衡量，式中λ为显微镜所使用的照明光波长，NA为所使用显微物镜的数值孔径，由于NA＝n sinα，式中n是被观察物体与物镜之间介质的折射率，α是物镜孔径角(物镜光轴上的物点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度)的一半，NA值约为1，因此衍射斑尺寸最小约为工作波长的一半，这也是常规光学显微成像的极限分辨率。对于更加精细、微小的微观结构，常规光学显微成像的方法就有所受限。

1990年共聚焦显微镜的提出，是光学显微领域的一次革命。共聚焦显微镜利用一个小孔进行空间滤波，能够将分辨率提高2倍，且能提高显微图像的信噪比和对比度，另外，共聚焦显微镜还有光学切片能力，使高精度三维成像变为可能。虽然共聚焦显微镜仍受到光学衍射极限的限制，但它是后来提出的很多超越衍射极限的光学显微方法的基础。

在共聚焦显微镜提出后二十年里，有多种超分辨光学显微方法被提出，比如结构光照明荧光显微术(SIM：Structured Illumination Microscopy)、光活化定位显微术(PALM:Photo-activated Localization Microscopy)、随机光场重建显微术(STORM:Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)、受激发射损耗显微术(STED:Stimulated Emission Depletion Microscopy)、荧光受激微分显微术(FED:FluorescenceEmission Difference Microscopy)等。其中荧光受激微分显微术(FED)是最近提出的一种新颖的超分辨成像手段，它在共聚焦显微镜的基础上，利用两种不同模式的激发光激发产生荧光图像的强度差异实现超分辨，是一种差值成像法。差值成像法是在数十年前被提出的，通过相同激发光下不同尺寸小孔收集的共焦信号差异，可以提高一定程度的分辨率，但此种方法的信噪比比较低。为了克服此缺陷，科研工作者提出了荧光受激微分显微术和激光模式切换显微术(SLAM：Switching Laser Mode Microscopy)，通过利用相同尺寸小孔、不同模式的激发光下收集到的荧光信号差异实现超分辨。荧光受激微分显微术采用横向不同强度分布的两种模式的激发光交替照明荧光样品，一种是实心光斑，另一种是面包圈状的中空光斑，其中心是一个尺寸小于衍射极限的暗斑，通过差值消除边缘激发的信号光，提取中心小于衍射极限区域激发的信号光，继而达到超越衍射极限的分辨率。

例如，现有公开号为CN 102735617 A的专利文献公开了一种超分辨显微方法，包括：将激光器发出的激光光束准直后转换为线偏振光；线偏振光经第一次相位调制后进行光路偏转；偏转后的光束经聚焦和准直后转换为圆偏振光投射到待测样品上，收集待测样品各扫描点发出的信号光，得到第一信号光强；切换调制函数，对线偏振光进行第二次相位调制后投射到待测样品上，收集待测样品各扫描点发出的信号光，得到第二信号光强；计算有效信号光强，并得到超分辨图像；该显微方法仅可实现二维成像。

荧光受激显微术具有低功耗、弱漂白、成快像、光路简单等优点，但当其应用于三维超分辨率显微成像时，需要将激发光分为三路分别调制，再将调制完毕的三路光进行合束，这无疑大大增大了光学显微系统的空间复杂度。另外，还需要设计三路快门开关控制激发光模式的切换，也大大增大了显微系统的时间复杂度。

发明内容

本发明提供了一种快速三维超分辨显微方法和装置，可以在远场快速实现三维的超越衍射极限的分辨率；该种方法和装置具有成像速度快、三维成像、装置简易、分辨率高等特点，可以很好的应用于荧光样品的检测之中。

本发明的具体技术方案如下：

一种快速三维超分辨率显微方法，包括以下步骤：

1)将激光器发出的激光光束准直后转换为线偏振光；

2)对所述线偏振光进行相位调制，调制函数为其中ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角；

3)将所述相位调制后的线偏振光进行光路偏转；

4)偏转后的光束转换为圆偏振光经准直和聚焦后投射到待测样品上，以实现对待测样品的二维扫描，沿z轴方向移动待测样品，以实现对待测样品的三维扫描；

5)在三维扫描过程中收集所述待测样品各扫描点发出的信号光，滤去杂散光得到第一信号光强I₁(x,y,z)，其中x,y,z为扫描点的三维坐标；

6)对步骤2)中所述线偏振光的s光分量进行相位调制，调制函数为其中ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角；

7)对步骤2)中所述线偏振光的p光分量进行相位调制，调制函数为其中ρ为光束上某点与光轴的距离，ρ₀为光束半径，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角；

8)重复步骤3)和步骤4)，对步骤5)中的各扫描点进行第二次扫描，收集得到的第二信号光强I₂(x,y,z)，其中x,y,z为扫描点的三维坐标；

9)根据公式I(x,y,z)＝I₁(x,y,z)-γI₂(x,y,z)计算有效信号光强I(x,y,z)，并利用I(x,y,z)得到超分辨图像，其中， 为第一信号光强I₁(x,y,z)中的最大值，为第二信号光强I₂(x,y,z)中的最大值。

本发明中，待测样品上的x,y,z轴方向由三维扫描方向决定。

其中，所述有效信号光强I(x,y,z)为负值时，将其设为零值。

本发明提供一种快速三维超分辨显微装置，包括光源、承载待测样品平台和将光线投射到所述样品平台的显微物镜等，所述光源与显微物镜之间依次设有：

用于将所述激光光束滤波和准直的单模光纤和准直透镜；

用于将所述滤波和准时后的激光光束转变为线偏振光的起偏器；

用于调节所述线偏振光s光和p光分量比例的1/2波片；

用于对所述线偏振光s光分量进行相位调制的空间光调制器；

用于对所述线偏振光p光分量进行相位调制的空间光调制器；

用于对所述相位调制后的光束进行光路偏转的扫描振镜系统；

用于对所述扫描振镜系统的出射光束进行聚焦和准直的扫描透镜和场镜；

用于将准直之后的光束转换为圆偏振光的1/4波片；

所述圆偏振光通过所述显微物镜投射到所述待测样品上。

所述待测样品固定在纳米位移平台上，用于对所述待测样品进行轴向扫描。

并设有用于控制所述空间光调制器、扫描振镜系统和纳米位移平台的控制器及收集所述待测样品发出的信号光的探测系统。

探测系统包括：

布置在空间光调制器和扫描振镜系统之间的二色镜；

用于滤去通过二色镜信号光中的杂散光的带通滤波片；

用于探测信号光束光强信号的探测器，所述探测器选用雪崩二极管(APD)；

用于将所述滤光过的信号光束聚焦到探测器上的会聚透镜；

用于对所述信号光束进行空间滤波的空间滤波器，其位于所述聚焦透镜的焦平面处，所述空间滤波器可以采用针孔或多模光纤，若采用针孔，所用针孔的直径应小于一个艾里斑的直径；

所述两个空间光调制器分别具有可切换的第一调制函数和第二调制函数其中ρ为光束上某点与光轴的距离，ρ₀为光束半径，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角。

本发明中，所述两个空间光调制器的调制函数的切换频率与扫描振镜系统的帧扫描频率相同，从而实现扫描振镜系统每扫描一帧图像，两个空间光调制器的调制函数均切换一次。

优选的，所述显微物镜的数值孔径选择NA＝1.4。

本发明的原理如下：

根据阿贝衍射理论，传统光学显微镜受限于光学衍射极限，分辨能力无法突破照明光波长的一半。平行的照明光束经过物镜聚焦后，在焦平面附近形成一个具有一定体积的椭球状光斑，而不是理想的一个像点，在焦平面上形成一个具有一定面积的弥散的光斑。在横向方向，被弥散光斑照亮的荧光样品区域均会受激发射出荧光，荧光被显微物镜收集并通过和所述扫描振镜系统，经探测系统收集，此过程同样受光学衍射极限的限制。弥散光斑的横向尺寸(用半高全宽来衡量)一般为一个艾里斑大小，根据瑞利判据，弥散斑照亮的荧光样品区域内的细节无法被分辨，因此限制了光学显微镜的横向分辨能力。在纵向方向，椭球状光斑的纵向尺寸约为其横向尺寸的2.5倍，因此光学显微镜的纵向分辨率更差，约为横向分辨率的2.5倍。

在本发明中，我们把荧光受激微分显微术应用于三维显微成像，来同时提高显微系统的横向和纵向分辨率，实现快速三维超分辨率显微成像。当两个空间光调制器加载的相位调制函数均为时，s光分量和p光分量均未被调制，通过1/4波片转换为圆偏振光后经显微物镜聚焦，在样品上形成一个三维实心光斑，该实心光斑照亮的样品区域所激发出的荧光被探测器所收集，得到当前扫描点处的第一信号光强I₁。当两个空间光调制器分别加载0-2π涡旋位相板和0-π位相板时，s光分量和p光分量分别被两个空间光调制器调制，通过1/4波片转换为圆偏振光后经显微物镜聚焦，分别在样品上形成一个横向方向的二维空心光斑和一个纵向方向的z轴暗斑，两者叠加后形成一个三维空心光斑，该空心光斑照亮的样品区域所激发出的荧光被探测器所收集，得到当前扫描点处的第二信号光强I₂。对于同一扫描点探测得到的I₁和I₂，利用公式I(x,y,z)＝I₁(x,y,z)-γI₂(x,y,z)，计算得到I(x,y,z)。实心光斑减去空心光斑，只保留了中心区域的信号光，相当于缩小了实心光斑的尺寸，因此I(x,y,z)所对应的扫描点处的有效信号光发光面积将小于I₁(x,y,z)所对应的各扫描点处的第一信号光发光面积。

相对于现有的技术，本发明具有以下有益的技术效果：

(1)使用较低的光功率，减弱光漂白效应；

(2)快速的三维成像；

(3)装置简单，无需分光。

附图说明

图1为本发明中快速三维超分辨率显微装置的示意图。

具体实施方式

如图1所示，一种快速三维超分辨率显微装置，包括：激光器1，单模光纤2，准直透镜3，起偏器4，1/2波片5，空间光调制器6，空间光调制器7，反射镜8，分束镜9，扫描振镜系统10，扫描透镜11，场镜12，1/4波片13，显微物镜14，纳米位移平台15，带通滤波片16，聚焦透镜17，针孔18，探测器19和控制器20。

其中，单模光纤2、准直透镜3、起偏器4、1/2波片5和空间光调制器6依次位于激光器1出射光束的光轴之上。

其中，空间光调制器7、反射镜8依次位于经空间光调制器6调制后光束的光轴之上。

其中，分束镜9、扫描振镜系统10依次位于经反射镜8反射后的调制光束的光轴之上。

其中，扫描透镜11、场镜12、1/4波片13、显微物镜14、纳米位移平台15依次位于扫描振镜系统10出射光束的光轴之上；样品置于纳米位移平台15之上，样品位于显微物镜14的焦平面附近。

其中，带通滤波片16、聚焦透镜17、针孔18、探测器19依次位于分束镜9反射光束的光轴之上；针孔18位于聚焦透镜17的焦平面处。

其中，控制器20分别与空间光调制器6、空间光调制器7、扫描振镜系统10和纳米位移平台15相连，用于控制空间光调制器6、空间光调制器7的调制函数切换，以及扫描振镜系统10的扫描和纳米位移平台15的扫描。空间光调制器6和空间光调制器7在控制器20的控制下按照一定的切换频率分别在以下两种调制函数之间切换：和 和其中ρ为光束上某点与光轴的距离，ρ₀为光束半径，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角；空间光调制器6和空间光调制器7的切换频率相同，也与扫描振镜系统10的帧扫描频率相同，从而实现扫描振镜系统10每扫描一帧图像，空间光调制器6和空间光调制器7的调制函数切换一次。纳米位移平台15的步进频率是扫描振镜系统10帧扫描频率的一半，从而扫描振镜系统10每扫描两帧图像，纳米位移平台15步进一次。

上述装置中，显微物镜14的数值孔径为1.4；所用针孔18的直径为0.73个艾里斑直径，探测器19为雪崩二极管APD。

采用图1所示的装置进行快速三维超分辨率显微的方法如下：

激光器1发出的激光光束首先耦合入单模光纤2，然后从单模光纤2中出射后经准直透镜3准直。起偏器4将准直后的光束转换为线偏振光，线偏振光经过1/2波片5调节s光分量和p光分量的比例，之后入射到空间光调制器6和空间光调制器7上进行相位调制。

利用控制器20对空间光调制器6和空间光调制器7进行控制，使两者的相位调制函数切换为：

其中，ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角。

由空间光调制器7出射的光束经反射镜8反射，透过分束镜9，之后入射到扫描振镜系统10上。经扫描振镜系统10出射的光束依次被扫描透镜11聚焦、场镜12准直之后，通过1/4波片13转换为圆偏振光，圆偏振光经显微物镜14投射到位于纳米位移平台15上的待测样品之上。

入射圆偏振光在显微物镜14的焦点附近所成的光场分布可由德拜积分确定，具体如下：

式中，是以显微物镜14的焦点位置为原点的柱坐标系，代表了(r₂,φ₂,z₂)处的电矢量强度，i为虚数单位，C为归一化常数，θ为光束孔径角，为光束垂直Z轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角，A₁(θ,φ)是入射光的振幅分布，A₂(θ,φ)表征了显微物镜14的结构，则表示了入射光的偏振信息，k＝2π/λ，n为介质折射率。

由上式计算可以发现，此时入射的圆偏振光经显微物镜14聚焦之后在待测样品上所成光斑为一个实心光斑。

待测样品激发的荧光被显微物镜14收集，之后依次通过1/4波片13、场镜12、扫描透镜11、扫描振镜系统10，最后被分束镜9反射。经分束镜9反射的荧光通过带通滤波片16滤去杂散光，之后经聚焦透镜17聚焦并通过针孔18进行空间滤波，最终被探测器19所探测。记此时探测器19探测得到的信号光强值为I₁，将其作为在当前扫描点处的第一信号光强。

通过控制器20调节扫描振镜系统10，实现对于待测样品的二维扫描，通过控制器20调节纳米位移平台15，实现对于待测样品的纵向扫描，记录各扫描点处的第一信号光强I₁(x,y,z)，其中x,y,z为扫描点的三维坐标。

利用控制器20对空间光调制器6进行控制，使相位调制函数切换为

其中，ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角。

利用控制器20对空间光调制器7进行控制，使相位调制函数切换为

其中ρ为光束上某点与光轴的距离，ρ₀为光束半径，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角。

由空间光调制器7出射的光束经反射镜8反射，透过分束镜9，之后入射到扫描振镜系统10上。经扫描振镜系统10出射的光束依次被扫描透镜11聚焦、场镜12准直之后，通过1/4波片13转换为圆偏振光，圆偏振光经显微物镜14投射到位于纳米位移平台15上的待测样品之上。

入射圆偏振光在显微物镜14的焦点附近所成的光场分布同样可由德拜积分确定。通过计算可以发现，此时入射的圆偏振光经显微物镜14聚焦之后在横向方向上所成光斑为一个面包圈型空心光斑，在纵向方向也为一个空心光斑。

待测样品激发的荧光被显微物镜14收集，之后依次通过1/4波片13、场镜12、扫描透镜11、扫描振镜系统10，最后被分束镜9反射。经分束镜9反射的荧光通过带通滤波片16滤去杂散光，之后经聚焦透镜17聚焦并通过针孔18进行空间滤波，最终被探测器19所探测。记此时探测器19探测得到的信号光强值为I₂，将其作为在当前扫描点处的第二信号光强。

通过控制器20调节扫描振镜系统10，实现对于待测样品的二维扫描，通过控制器20调节纳米位移平台15，实现对于待测样品的纵向扫描，记录各扫描点处的第二信号光强I₂(x,y,z)，其中x,y,z为扫描点的三维坐标。

利用公式I(x,y,z)＝I₁(x,y,z)-γI₂(x,y,z)计算各扫描点处的有效信号光强I(x,y,z),并最终得到超分辨显微图像。

以上仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种快速三维超分辨率显微方法，包括：激光光束在准直后转换为线偏振光，对线偏振光进行相位调制并转换为圆偏振光投射到待测样品上，以及收集待测样品各扫描点发出的信号光；其特征在于：对样品进行三维扫描，所述的相位调制包括一次相位调制和二次相位调制；

所述的一次相位调制和二次相位调制的调制函数均为时，收集所述的信号光得到第一信号光强I₁(x,y,z)，x,y,z为扫描点的三维坐标；

所述的一次相位调制的调制函数为且所述的二次相位调制的调制函数为时，收集所述的信号光得到第二信号光强I₂(x,y,z)，x,y,z为扫描点的三维坐标；

其中：ρ为光束上某点与光轴的距离，ρ₀为光束半径，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角；

根据I₁(x,y,z)和I₂(x,y,z)计算有效信号光强I(x,y,z)，并利用I(x,y,z)得到三维超分辨率显微图像；

根据下式计算I(x,y,z)：

I(x,y,z)＝I₁(x,y,z)-γI₂(x,y,z)

其中， 为第一信号光强I₁(x,y,z)中的最大值，为第二信号光强I₂(x,y,z)中的最大值。

2.如权利要求1所述的快速三维超分辨率显微方法，其特征在于，所述的有效信号光强I(x,y,z)为负值时，将其设为零值。

3.一种快速三维超分辨率显微装置，包括沿光路依次布置的光源、起偏器、空间光调制器、1/4波片和显微物镜，以及收集待测样品发出的信号光的探测系统；其特征在于，对样品进行三维扫描，所述的空间光调制器包括第一空间光调制器和第二空间光调制器；

所述第一空间光调制器的调制函数在和之间切换；所述第二空间光调制器的调制函数在和之间切换；其中：ρ为光束上某点与光轴的距离，ρ₀为光束半径，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角。

4.如权利要求3所述的快速三维超分辨率显微装置，其特征在于，所述的光路中还设有用于样品扫描的扫描振镜系统，所述扫描振镜系统的扫描频率与第一空间光调制器和第二空间光调制器的函数切换频率相同。

5.如权利要求4所述的快速三维超分辨率显微装置，其特征在于，所述样品放置在纳米位移平台，用于对样品进行轴向扫描。

6.如权利要求5所述的快速三维超分辨率显微装置，其特征在于，所述纳米位移平台的步进频率是扫描振镜系统帧扫描频率的一半。

7.如权利要求6所述的快速三维超分辨率显微装置，其特征在于，所述显微物镜的数值孔径选择NA＝1.4。