CN107092086A - 基于相位调制的激光扫描饱和结构光照明的显微方法及装置 - Google Patents

基于相位调制的激光扫描饱和结构光照明的显微方法及装置 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种基于相位调制的激光扫描饱和结构光照明的显微方法，包括：将准直后的照明光束转换为线偏光；在线偏光上加载第一方向的0‑π相位，并调整线偏光的偏振方向；利用偏振方向调整后的线偏光对样品进行扫描，形成激发样品产生荧光的第一激光扫描饱和结构光照明图案，并收集得到第一荧光信号；在线偏光上加载第二方向的0‑π相位，并适应调整线偏光的偏振方向；利用偏振方向调整后的线偏光对样品进行扫描，形成激发样品产生荧光的第二激光扫描饱和结构光照明图案，并收集得到第二荧光信号；对第一荧光信号和第二荧光信号进行处理，得到横向分辨率提升的超分辨图像。本发明还公开一种基于相位调制的激光扫描饱和结构光照明的显微装置。

Description

基于相位调制的激光扫描饱和结构光照明的显微方法及装置
技术领域
本发明属于共聚焦显微领域，特别涉及一种基于相位调制的激光扫描饱和结构光照明的显微方法及装置。
背景技术
共聚焦显微镜利用激光束经光学系统形成点光源对物镜焦平面处的样品进行扫描。焦平面上的被照射点在探测针孔处成像，而焦平面以外的点并不会在探测针孔处成像。被照射点的图像信息由探测针孔后的光电探测器逐点接收，迅速在计算机监视屏上形成荧光图像，这样得到的共聚焦图像就是样品内物镜焦平面的光学横切面。但是根据衍射理论，显微镜的分辨能力与波长和数值孔径有关，存在衍射极限，虽然减小波长和增大数值孔径都能提高分辨率，但都无法突破衍射极限，不能真正大幅度地提高分辨率。
近年来，一些突破衍射极限的超分辨显微方法逐渐提出。其中受激发射损耗显微镜(STED)通过分子态的饱和损耗可实现超分辨，但需使用大功率激光器提高分辨率，很容易发生荧光漂白现象；随机光学重构显微镜(STORM)则是通过牺牲时间分辨率来换取空间分辨率，不能实现对样品像的快速获取。与受激发射损耗显微镜(STED)和随机光学重构显微镜(STORM)相比，结构光照明显微镜(SIM)的照明只需要单波长光源，且不需要特殊的荧光探针。通过结构光照明，可以将样品的高频部分移到光学系统光学传递函数所限制的通带内，并随后合并频率信息。由于照明的频率亦被物镜的数值孔径所限制，传统的结构光照明显微镜仅仅能够提升两倍的分辨率。为了克服两倍分辨率提升的上限，饱和结构光照明显微镜(SSIM)利用饱和激发态所产生的非线性向照明结构光引入高次谐波，所以可以获取高于光学传递函数通带两倍的频率。但是由于产生非线性相应有极高的光功率要求，饱和结构光照明非常容易产生光致漂白现象，甚至造成固定样品的损坏，这就解释了饱和结构光照明不能广泛的应用于生物样品观测的事实。
发明内容
本发明在共聚焦显微镜的基础上，提出了一种基于相位调制的激光扫描饱和结构光照明显微方法及装置，可在提升成像分辨率的情况下同时降低所需成像光强，从而降低了实验系统对光源的要求，同时减少了光致漂白的产生。本装置通过对激光光源进行相位调制聚焦产生双峰激发点扩散函数，沿着不同方向进行扫描，将高频部分引入所获取的像，从而提高了结构光照明显微成像的横向和纵向分辨率。同时采用激光点扫描照明，相对于宽场饱和结构光照明显微成像大大降低了照明所需光强，同时亦可获取足够的高频分量。
相对于其他超分辨成像显微镜，本发明是基于共聚焦显微镜，其结构简单，便于操作，通过接收激光点扫描激发的荧光能够实现超分辨显微成像，可用于光学显微成像领域。
一种基于相位调制的激光扫描饱和结构光照明的显微方法，包括步骤：
1)将准直后的照明光束转换为线偏光；
2)在所述的线偏光上加载第一方向的0-π相位，并调整线偏光的偏振方向；
3)利用偏振方向调整后的线偏光对样品进行扫描，形成激发样品产生荧光的第一激光扫描饱和结构光照明图案，并收集得到第一荧光信号；
4)在所述的线偏光上加载第二方向的0-π相位，并适应调整线偏光的偏振方向；
5)利用偏振方向调整后的线偏光对样品进行扫描，形成激发样品产生荧光的第二激光扫描饱和结构光照明图案，并收集得到第二荧光信号；
6)对所述的第一荧光信号和第二荧光信号进行处理，得到横向分辨率提升的超分辨图像。
本发明中，可采用具有0-π相位图案的空间光调制器或者0-π位相板在线偏光上加载0-π相位。
优选的，在步骤2)中，利用具有0-π相位图案的空间光调制器在所述的线偏光上加载第一方向的0-π相位；在步骤4)中，转动所述空间光调制器上的0-π相位图案，在所述的线偏光上加载第二方向的0-π相位。
并列优选实施的，在步骤2)中，利用0-π位相板在所述的线偏光上加载第一方向的0-π相位；在步骤4)中，转动0-π位相板，在所述的线偏光上加载第二方向的0-π相位。
优选的，在所述的线偏光上加载第二方向的0-π相位时，转动的角度为60°或/和120°，此角度仅为本发明优选的实施方式之一，也可以采用其他的转动角度，转动角度只要满足转动的次数和未知数的个数相同即可解出方程，具体的角度并没有严格的要求。
本发明中，根据复原所用的级次以及对各个方向分辨率的要求选择扫描角度，依次加载不同角度方向的0-π相位，得到不同角度方向对应的第二荧光信号。
所述的第二荧光信号仅用于区别于第一荧光信号，并不用于限定荧光图像的数量，第二荧光信号表示转动某个角度后得到的荧光图像，通常需要得到多幅的扫描图像以求解频率信息。
本发明中，在改变扫描光斑的方向来获取不同的照明图案时，转动空间光调制器上的0-π相位图像或0-π位相板的角度为60°或120°。
本发明还提供了一种基于相位调制的的激光扫描饱和结构光照明的显微装置，针对荧光样品包括：
(1)激光器，用于发出激发光，实现对荧光样品的照明激发；
(2)准直透镜，用于对激光器发出的激光进行准直；
(3)起偏器，用于对准直后的激光进行起偏，使其成为线偏光；
(4)相位调制器，用于在线偏光上加载不同方向的0-π相位；
(5)半波片，用于调整线偏光的偏振方向；
(6)扫描振镜系统，包括：第一振镜，用于进行x方向上的扫描；和第二振镜，用于进行y方向上的扫描；
(7)扫描镜，用于激光扫描；
(8)场镜，用于激光扫描；
(9)二色镜，用于透过激发光，反射样品被激发后产生的荧光；
(10)显微物镜，用于聚焦激光以及收集荧光；
(11)透镜，用于聚焦激光激发产生的荧光，将荧光聚焦在光电探测器平面上；
(12)光电探测器，将探测到的光信号转换为电信号，输送至计算机；
(13)样品台，用于轴向移动样品；
(14)计算机，用于处理探测器的信号，控制快门的开关，同时控制振镜扫描形成照明图案。
本发明中，所述的相位调制器可以选用具有0-π相位图案的空间光调制器，通过转动0-π相位图案来加载不同方向的0-π相位；另外，所述的相位调制器也可采用0-π位相板，通过转动0-π位相板来加载不同方向的0-π相位。
在上述显微装置的基础上，具体操作步骤如下：
(1)激光器发出照明光束，首先经过准直透镜准直得到一束平行光，准直后的照明光束经一个起偏器后，得到线偏光；线偏光经过0-π位相板或具有0-π相位图案(图2(a))的空间光调制器调制，随后的半波片被旋转到相位调制图案的相应取向，通过空间光调制器光线再次通过半波片，得到一个具有两个峰值的激发点，其横切面如图2(b)；通过振镜扫描形成一个照明图案，如图2(c)所示；通过改变空间光调制器的位相图像，同时转动半波片到相应方向，可以得到不同取向的扫描图像。改变空间光调制器上相位图案或转动0-π位相板如图4(a)和图5(a)所示，所得到的的激发光斑形状如图4(b)和图5(b)所示，转动相位图案60°得到的激发光斑如图4(b)，转动相位图案120°得到的激发光斑如图5(b) 所示。光斑经过振镜之后通过扫描镜和场镜，透过二色镜，进入物镜聚焦，激发出荧光。
(2)所述荧光样品被激光点扫描激发，得到的荧光先被物镜收集，经二色镜反射，再经透镜聚焦被光电探测器接收；
(3)改变空间光调制器上的0-π相位图像或转动0-π位相板，同时转动半波片，从而改变扫描光斑的方向，获取不同的照明图案，不同角度下激光扫描饱和结构光照明图案如图4(c)，图5(c)所示，转动60°所得照明图案如图4(c)所示，转动120°所得照明图案如图5(c)所示。
(4)通过采集和处理不同角度下的激光扫描饱和结构光照明图案激发的荧光信号，得到横向分辨率提升的超分辨图像。
本发明原理如下：
在通用的共聚焦显微镜装置基础上，首先利用一个起偏器，将准直激光起偏为线偏光，经过一个空间光调制器之后，加载了0-π相位(如图2 (a))，然后通过了一个半波片，之后经过两个振镜，通过振镜实现x-y 平面扫描，经过场镜和扫描镜，透过二色镜，最终得到一个激光扫描照明图案(如图2(c))。激发样品产生荧光。
通过改变空间光调制器上的相位图案的方向，同时转动半波片到相应方向来改变激发光斑的空心朝向，如图4(b)和图5(b)，从而实现对激光照明图像方向的转动，如图4(c)和图5(c)。获取不同激发图案下的荧光信号。通过对不同方向照明得到的荧光信号的处理，可以最终得到横向分辨率提升的图像。
同时，本发明在纵向分辨率的提升上亦有优势。其优势在于其光学切片能力。传统的宽场照明显微成像，样品中非焦平面上的点亦会被激发，导致成像质量的下降。通过采用结构光照明，轴向上的相干区域被限制，所以非焦平面上的样品没有被照明图案调制，因此在焦平面上的被照明图案调制的样品可以被更好的观察。本发明采用激光扫描饱和结构光照明，由于激光点扫描照明中的点扩散函数在轴向受限(如图6所示)，所以进一步提升了结构光照明的光学切片能力。
本发明在实现横向的超分辨显微成像的同时提升了纵向分辨率，在一定程度上达到了三维超分辨的效果。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
(1)相对于原有的共聚焦显微镜，通过激光扫描饱和结构光照明实现了横向超分辨。
(2)通过激光扫描实现结构光照明的方法，产生轴向受限的激发点扩散函数，实现了轴向分辨率的提升。
(3)装置结构简单，数据处理方便。
附图说明
图1为一种由空间光调制器调制的基于相位调制的激光扫描饱和结构光照明显微装置示意图；
图2为空间光调制器上所加载的0-π相位图案，激发光斑示意图和得到的激光扫描饱和结构光照明图案；图2(a)为图1装置中空间光调制器上所加载的0-π相位图案；图2(b)为图1中空间光调制器上所加载的 0-π相位后得到的激发光斑示意图；图2(c)为图1中得到的激光扫描饱和结构光照明图案；
图3为一种由0-π位相板调制的基于相位调制的激光扫描饱和结构光照明显微装置示意图；
图4为转动调制相位图案60°后的空间光调制器上所加载的0-π相位图像，激发光斑示意图和得到的激光扫描饱和结构光照明图案；图4(a) 为图1中转动调制相位图案60°后的空间光调制器上所加载的0-π相位图像；图4(b)为图1中转动空间光调制器上相位图像60°后得到的方向改变的激发光斑示意图；图4(c)为图1中转动空间光调制器上相位图像60°后得到的激光扫描饱和结构光照明图案；
图5为转动调制相位图案120°后的空间光调制器上所加载的0-π相位图像，激发光斑示意图和得到的激光扫描饱和结构光照明图案；图5(a) 为图1中转动调制相位图案120°后的空间光调制器上所加载的0-π相位图像；图5(b)为图1中转动空间光调制器上相位图像120°后得到的方向改变的激发光斑示意图；图5(c)为图1中转动空间光调制器上相位图像120°后得到的激光扫描饱和结构光照明图案；
图6为轴向受限的点扩散函数示意图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不限于此。
实施例1
如图1所示，为一种由空间光调制器调制的基于相位调制的激光扫描饱和结构光照明显微装置，包括激光器1，准直透镜2，起偏器3，空间光调制器4a，半波片5，x方向扫描振镜6，y方向扫描振镜7，扫描透镜8，场镜9，二色镜10，物镜11，样品12，载物台13，透镜14，光电探测器 15，计算机16和空间光调制器控制盒17。
采用图1所示的装置实现针对荧光样品的基于相位调制的激光扫描饱和结构光照明显微方法，其过程如下：
(1)激光器1发出照明光，经过准直透镜2准直；
(2)准直后的照明光经起偏器3起偏成线偏振光；
(3)起偏后的照明光经过空间光调制器4a加载0-π相位，然后经过半波片5，经过x方向扫描振镜6，y方向扫描振镜7，通过扫描镜8，场镜9，透过二色镜10，经过物镜11聚焦在样品12上，实现对样品x-y平面上的激光扫描饱和结构光照明。激发出的荧光被物镜11收集，经二色镜10反射，被透镜14收集，由光电探测器15持续接收荧光信号，传输到计算机16中。
(4)利用空间光调制器控制盒17改变空间光调制器4a上的0-π相位相位图案的方向，同时转动半波片，得到不同方向的激发光斑继而得到不同的激光扫描饱和结构光照明图案，如图2(c)、图4(c)和图5(c)。
(5)计算机16对不同方向照明得到荧光图像进行处理，可以得到横向分辨率提升的超分辨图像。
实施例2
如图3所示，为一种由0-π位相板调制的基于相位调制的激光扫描饱和结构光照明显微装置，，包括激光器1，准直透镜2，起偏器3，0-π位相板4b，半波片5，x方向扫描振镜6，y方向扫描振镜7，扫描透镜8，场镜9，二色镜10，物镜11，样品12，载物台13，透镜14，光电探测器15和计算机16。
采用图3所示的装置实现针对荧光样品的基于相位调制的激光扫描饱和结构光照明显微方法，其过程如下：
(1)激光器1发出照明光，经过准直透镜2准直；
(2)准直后的照明光经起偏器3起偏成线偏振光；
(3)起偏后的照明光经过0-π位相板4b加载0-π相位，然后经过半波片5，经过x方向扫描振镜6，y方向扫描振镜7，通过扫描镜8，场镜 9，透过二色镜10，经过物镜11聚焦在样品12上，实现对样品x-y平面上的激光扫描饱和结构光照明。激发出的荧光被物镜11收集，经二色镜 10反射，被透镜14收集，由光电探测器15持续接收荧光信号，传输到计算机16中。
(4)转动0-π位相板4b，同时转动半波片，得到不同方向的激发光斑，得到不同的激光扫描饱和结构光照明图案，如图2(c)、图4(c)和图5(c)。
(5)计算机16对不同方向照明得到荧光图像进行处理，可以得到横向分辨率提升的超分辨图像。
以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于相位调制的激光扫描饱和结构光照明的显微方法，其特征在于，包括步骤：
1)将准直后的照明光束转换为线偏光；
2)在所述的线偏光上加载第一方向的0-π相位，并调整线偏光的偏振方向；
3)利用偏振方向调整后的线偏光对样品进行扫描，形成激发样品产生荧光的第一激光扫描饱和结构光照明图案，并收集得到第一荧光信号；
4)在所述的线偏光上加载第二方向的0-π相位，并适应调整线偏光的偏振方向；
5)利用偏振方向调整后的线偏光对样品进行扫描，形成激发样品产生荧光的第二激光扫描饱和结构光照明图案，并收集得到第二荧光信号；
6)对所述的第一荧光信号和第二荧光信号进行处理，得到横向分辨率提升的超分辨图像。
2.如权利要求1所述的显微方法，其特征在于，在步骤2)中，利用具有0-π相位图案的空间光调制器在所述的线偏光上加载第一方向的0-π相位；
在步骤4)中，转动所述空间光调制器上的0-π相位图案，在所述的线偏光上加载第二方向的0-π相位。
3.如权利要求1所述的显微方法，其特征在于，在步骤2)中，利用0-π位相板在所述的线偏光上加载第一方向的0-π相位；
在步骤4)中，转动0-π位相板，在所述的线偏光上加载第二方向的0-π相位。
4.如权利要求1～3任一项所述的显微方法，其特征在于，在步骤2)和步骤4)中，利用可旋转的半波片调整线偏光的偏振方向。
5.一种基于相位调制的激光扫描饱和结构光照明的显微装置，包括发出激发光的激光器，放置样品的样品台，探测荧光信号的光电探测器，以及用于荧光信号处理的计算机，其特征在于：
所述的激光器和样品台之间设有沿依次布置的：
准直透镜，用于对激光器发出的激光进行准直；
起偏器，用于对准直后的激光进行起偏，使其成为线偏光；
相位调制器，用于在线偏光上加载不同方向的0-π相位；
半波片，用于调整线偏光的偏振方向；
和扫描振镜系统，用于对样品进行二维扫描。
6.如权利要求5所述的显微装置，其特征在于，所述的相位调制器为具有0-π相位图案的空间光调制器，通过转动0-π相位图案来加载不同方向的0-π相位。
7.如权利要求5所述的显微装置，其特征在于，所述的相位调制器为0-π位相板，通过转动0-π位相板来加载不同方向的0-π相位。
8.如权利要求6和7所述的显微装置，其特征在于，加载不同方向的0-π相位时，转动的角度为60°或120°。
9.如权利要求5～8任一项所述的显微装置，其特征在于，通过转动所述的半波片，匹配所述在线偏光上加载的不同方向的0-π相位。
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