CN108254340B - 基于线偏振调制的扫描显微镜 - Google Patents

基于线偏振调制的扫描显微镜 Download PDF

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Abstract

本发明提供的基于线偏振调制的扫描显微镜，通过所述线偏振调制机构对所述激光光束进行调制后形成偏振状态为X方向线偏光照明，并生成IX‑ill的共聚焦扫描图像；再对所述激光光束进行调制形成与所述X方向线偏光照明相垂直的Y方向线偏光照明，生成IY‑ill的共聚焦扫描图像，所述计算机根据所述IX‑ill的共聚焦扫描图像及所述IY‑ill的共聚焦扫描图像计算所述最终的共聚焦扫描图像，本发明提供的扫描显微镜，采用基于垂直线偏振光照明的中空点扩散函数生成技术，由于中空点扩散函数与传统圆偏振照明的实心共聚焦点扩散函数的外围基本无差异，通过该中空点扩散函数可消去圆偏振照明的实心共聚焦点扩散函数的外围而不会使成像产生图像畸变，并能提高图像的分辨率。

Description

基于线偏振调制的扫描显微镜
技术领域
本发明涉及一种光学显微成像技术，尤其涉及一种基于线偏振调制的扫描显微镜。
背景技术
激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)可以用来对样本进行高信噪比的三维成像。由于其无损光学成像能力，尤其适用于活体成像，目前CLSM已经成为在生命科学领域中研究生物样本的必备研究工具。但是受制于衍射极限，通常的CLSM的横向分辨率在200nm左右。近几十年来，涌现出了很多种超越衍射极限的远场超分辨光学显微镜，比如说PALM、STORM、SIM、STED等，它们将光学显微镜的分辨率提高到100nm或者更高。但是这些超分辨技术或成本较高，或光学系统极为复杂，或成像及数据处理时间超长，或受制于依赖于特殊的荧光染料和特殊的样本制备，这些因素都制约了超分辨技术的推广，所以更加通用且成本较低的超分辨技术仍是目前的研究热点。
通过点扩散函数相减是一种有效的提高共聚焦显微系统分辨率的方法，并且这种方法光学系统比较简单，数据处理速度也很快。点扩散函数相减的方法主要是一个实心的点扩散函数减去一个空心点扩散函数，通过中空点扩散消去实心点扩散函数的外围以获得半高全宽更小的有效点扩散函数。目前有多种方式生成中空点扩散函数，包括：(1)通过圆偏振光在物镜光瞳上进行相位调制的方式实现了中空光斑的生成；(2)利用角向偏振光生成中空点扩散函数。在点扩散函数相减的过程中，一个显著的问题是如果减项过大，在有效点扩散函数中将出现负值，一般的处理方式是将负值部分设为零，但是，这种处理方式将使图像畸变，出现这种问题的原因是中通过偏振调制产生的中空点扩散函数与实心点扩散函数的外围存在区别。
发明内容
有鉴如此，有必要提供一种基于线偏振调制的扫描显微镜，旨在解决现有技术中提供的共聚焦显微系统在提高其图像分辨率的同时而使得其但是其图像畸变的缺陷。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案:
一方面，本发明提供的基于线偏振调制的扫描显微镜，包括
包括：激光器、光束整形透镜、线偏振调制机构、分光模块、X-Y扫描振镜、扫描透镜、筒镜、物镜、探测透镜、探测器及计算机，所述计算机电性连接所述探测器及所述线偏振调制机构；
所述激光器出射的激光光束依次经所述光束整形透镜、所述线偏振调制机构、所述分光模块、所述X-Y扫描振镜、所述扫描透镜、所述筒镜及所述物镜后聚焦于样品处，并激发样品产生荧光；所述荧光再依次经所述物镜、所述筒镜、所述扫描透镜、所述X-Y扫描振镜、所述分光模块、所述探测透镜后被所述探测器探测，所述探测器将探测的光信号转换为电信号并将所述电信号传输至所述计算机，所述计算机根据所述电信号生成最终的共聚焦扫描图像；其中：
所述计算机控制所述线偏振调制机构，使所述激光光束经所述线偏振调制机构调制后形成偏振状态为X方向线偏光照明，生成IX-ill的共聚焦扫描图像；
所述计算机控制所述线偏振调制机构，使所述激光光束经所述线偏振调制机构调制后形成与所述X方向线偏光照明相垂直的Y方向线偏光照明，生成IY-ill的共聚焦扫描图像；
所述计算机根据所述IX-ill的共聚焦扫描图像及所述IY-ill的共聚焦扫描图像计算所述最终的共聚焦扫描图像，所述最终的共聚焦图像为
Figure BDA0001530351740000021
其中：
Figure BDA0001530351740000022
等价于采用圆偏振光照明时获得的共聚焦扫描成像，其点扩散函数为一个实心光斑；
Figure BDA0001530351740000031
的点扩散函数为中空光斑，γ为一个第二项中空成像的参数。
在一些较佳的实施例中，所述计算机还电性连接于所述X-Y扫描振镜，所述计算机用于控制所述X-Y扫描振镜的转动。
本发明采用上述技术方案，能够实现下述有益效果：
本发明提供的基于线偏振调制的扫描显微镜，通过所述线偏振调制机构对所述激光光束进行调制后形成偏振状态为X方向线偏光照明，并生成IX-ill的共聚焦扫描图像；再对所述激光光束进行调制形成与所述X方向线偏光照明相垂直的Y方向线偏光照明，生成IY-ill的共聚焦扫描图像，所述计算机根据所述IX-ill的共聚焦扫描图像及所述IY-ill的共聚焦扫描图像计算所述最终的共聚焦扫描图像，所述最终的共聚焦图像为
Figure BDA0001530351740000032
其中：
Figure BDA0001530351740000033
等价于采用圆偏振光照明时获得的共聚焦扫描成像，其点扩散函数为一个实心光斑；
Figure BDA0001530351740000034
的点扩散函数为中空光斑，γ为一个第二项中空成像的参数，本发明提供的基于线偏振调制的扫描显微镜，采用基于垂直线偏振光照明的中空点扩散函数生成技术，由于中空点扩散函数与传统圆偏振照明的实心共聚焦点扩散函数的外围基本无差异，通过该中空点扩散函数可消去圆偏振照明的实心共聚焦点扩散函数的外围而不会使成像产生图像畸变，并能提高图像的分辨率。
附图说明
图1为本实施例提供的基于线偏振调制的扫描显微镜的结构示意图。
图2中(a)、(b)及(c)表示为X线偏光照明的点扩散函数。
图2中(d)、(e)及(f)表示为Y线偏光照明的点扩散函数。
图2中(g)、(h)及(i)表示为右旋圆偏光的照明点扩散函数。
图3中(a)表示为1对垂直分量线偏光计算所得
Figure BDA0001530351740000041
图3中(b)表示为2对垂直分量线偏光计算所得
Figure BDA0001530351740000042
图3中(c)表示为19对垂直分量线偏光计算所得
Figure BDA0001530351740000043
图4为3种中空点扩散函数与圆偏光Ez分量X轴方向剖面比较图。
图5中(a)表示为垂直线偏振光点扩散函数的算数平均的获得的点扩散函数。
图5中(b)表示为圆偏光照明的照明点扩散函数。
图5中(c)为(a)和(b)两个点扩散函数相减。
图6表示为在λ＝0.5时不同波长照明情况下分辨率提高率。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
请参阅图1，为本发明实施例提供的基于线偏振调制的扫描显微镜10，包括激光器110、光束整形透镜120、线偏振调制机构130、分光模块140、X-Y扫描振镜150、扫描透镜160、筒镜170、物镜180、探测透镜190、探测器210及计算机220，所述计算机220电性连接所述探测器210及所述线偏振调制机构130。
本发明实施例提供的基于线偏振调制的扫描显微镜10，其工作方式如下：
所述激光器110出射的激光光束依次经所述光束整形透镜120、所述线偏振调制机构130、所述分光模块140、所述X-Y扫描振镜150、所述扫描透镜160、所述筒镜170及所述物镜180后聚焦于样品处，并激发样品产生荧光；所述荧光再依次经所述物镜180、所述筒镜170、所述扫描透镜160、所述X-Y扫描振镜150、所述分光模块140、所述探测透镜190后被所述探测器210探测，所述探测器210将探测的光信号转换为电信号并将所述电信号传输至所述计算机220，所述计算机220根据所述电信号生成最终的共聚焦扫描图像。
具体地，所述计算机220控制所述线偏振调制机构130，使所述激光光束经所述线偏振调制机构130调制后形成偏振状态为X方向线偏光照明，生成IX-ill的共聚焦扫描图像。
进一步地，所述计算机220控制所述线偏振调制机构130，使所述激光光束经所述线偏振调制机构130调制后形成与所述X方向线偏光照明相垂直的Y方向线偏光照明，生成IY-ill的共聚焦扫描图像。
更近一步地，所述计算机220根据所述IX-ill的共聚焦扫描图像及所述IY-ill的共聚焦扫描图像计算所述最终的共聚焦扫描图像，所述最终的共聚焦图像为
Figure BDA0001530351740000051
其中：
Figure BDA0001530351740000052
等价于采用圆偏振光照明时获得的共聚焦扫描成像，其点扩散函数为一个实心光斑；
Figure BDA0001530351740000053
的点扩散函数为中空光斑，γ为一个第二项中空成像的参数。
以下详细说明本发明提供的基于线偏振调制的扫描显微镜10的基本原理。
请参阅图2及图3，其中图2中(a)、(b)及(c)表示为X线偏光照明的点扩散函数；图2中(d)、(e)及(f)表示为Y线偏光照明的点扩散函数；图2中(g)、(h)及(i)表示为右旋圆偏光的照明点扩散函数；图3(a)表示为1对垂直分量线偏光计算所得
Figure BDA0001530351740000054
图3(b)表示为2对垂直分量线偏光计算所得
Figure BDA0001530351740000055
图3(c)表示为19对垂直分量线偏光计算所得
Figure BDA0001530351740000056
本发明提供的基于线偏振调制的扫描显微镜10，采用垂直线性偏振光得照明点扩散函数相减的方式获得圆偏光Ez分量的近似：
Figure BDA0001530351740000057
其中，Hhollow为由垂直线偏振光运算所得到的中空点扩散函数，
Figure BDA0001530351740000058
为X线性偏振光的照明点扩散函数，
Figure BDA0001530351740000061
为Y线性偏振光的照明点扩散函数，||为取绝对值运算。
由图2可知，
Figure BDA0001530351740000062
和
Figure BDA0001530351740000063
的电场横向分量相同,得到的Hhollow得到的中空点扩散函数是由
Figure BDA0001530351740000064
和
Figure BDA0001530351740000065
的电场纵向分量运算得到。从中2(c)和(f)可以看出，
Figure BDA0001530351740000066
和
Figure BDA0001530351740000067
的电场纵向分量基本独立，仅有少量部分重叠，这部分重叠造成
Figure BDA0001530351740000068
和
Figure BDA0001530351740000069
相减时某些方向的Hhollow值为零(如3(a))，可以通过旋转垂直线偏振的方向，并通过将这些方向所得的Hhollow值线性组合的方式获得各方向都一致的Hhollow(如图3(b)、(c))。
请参阅图4，为3种中空点扩散函数与圆偏光Ez分量X轴方向剖面比较图，其中：(1)表示为圆偏光的Ez分量形成的点扩散函数；(2)表示为垂直线性偏振光点扩散函数相减；(3)表示为左旋圆偏光经过0-2π相位调制后得到的点扩散函数；(4)表示为角向偏振光的点扩散函数。
从图4中，可以看出，本发明提供的垂直线性偏振光点扩散函数相减方法所获得的点扩散函数与圆偏光Ez分量的点扩散函数最为接近。因此，采用垂直照明的偏振光的点扩散函数的绝对值来近似圆偏光的Ez分量。
请参阅图5(a)表示为垂直线偏振光点扩散函数的算数平均的获得的点扩散函数；图5(b)表示为圆偏光照明的照明点扩散函数；图5(c)为(a)和(b)两个点扩散函数相减。
可以理解，因为垂直线偏振光点扩散函数的算数平均
Figure BDA00015303517400000610
等价于采用圆偏光照明的
Figure BDA00015303517400000611
在图5的仿真中两个点扩散函数最大差值为1.6431×10-14。
因此照明点扩散函数为
Figure BDA00015303517400000612
对应的图像计算方法为
Figure BDA00015303517400000613
其中，Ix-ill和Iy-ill为一组互相垂直的线偏光照明情况下所得到的共聚焦成像。
请参阅表1，γ为调整相减项在最终获得图像中作用的一个参数，下表表示为γ取不同值时候
Figure BDA0001530351740000071
的改进情况和与之同时存在的
Figure BDA0001530351740000072
中出现负值的情况。随着γ的增大，点扩散函数
Figure BDA0001530351740000073
的半高宽不断变小；当γ≤0.5时，在
Figure BDA0001530351740000074
不会出现负值的情况，γ>0.5，在
Figure BDA0001530351740000075
会出现负值的情况。大的γ值会使
Figure BDA0001530351740000076
中引入负值，传统的处理方式是当图像中像素点值为负时，将其设为0。但是将负值的
Figure BDA0001530351740000077
设为0将会使图像中出现畸变。
在γ＝0.5，重建图像不会出现畸变的情况下，系统成像分辨率相对传统共聚焦显微镜有16.9％的提高，并且这个提高比例不会随照明光波长的变化而变化(如图6，表示为在λ＝0.5时不同波长照明情况下分辨率提高率)。
表1γ与点扩散函数半高宽及
Figure BDA0001530351740000078
最小值
Figure BDA0001530351740000079
本发明提供的基于线偏振调制的扫描显微镜，通过所述线偏振调制机构对所述激光光束进行调制后形成偏振状态为X方向线偏光照明，并生成IX-ill的共聚焦扫描图像；再对所述激光光束进行调制形成与所述X方向线偏光照明相垂直的Y方向线偏光照明，生成IY-ill的共聚焦扫描图像，所述计算机根据所述IX-ill的共聚焦扫描图像及所述IY-ill的共聚焦扫描图像计算所述最终的共聚焦扫描图像，所述最终的共聚焦图像为
Figure BDA0001530351740000081
其中：
Figure BDA0001530351740000082
等价于采用圆偏振光照明时获得的共聚焦扫描成像，其点扩散函数为一个实心光斑；
Figure BDA0001530351740000083
的点扩散函数为中空光斑，γ为一个第二项中空成像的参数，本发明提供的基于线偏振调制的扫描显微镜，采用基于垂直线偏振光照明的中空点扩散函数生成技术，由于中空点扩散函数与传统圆偏振照明的实心共聚焦点扩散函数的外围基本无差异，通过该中空点扩散函数可消去圆偏振照明的实心共聚焦点扩散函数的外围而不会使成像产生图像畸变，并能提高图像的分辨率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种基于线偏振调制的扫描显微镜，其特征在于，包括：激光器、光束整形透镜、线偏振调制机构、分光模块、X-Y扫描振镜、扫描透镜、筒镜、物镜、探测透镜、探测器及计算机，所述计算机电性连接所述探测器及所述线偏振调制机构；
所述激光器出射的激光光束依次经所述光束整形透镜、所述线偏振调制机构、所述分光模块、所述X-Y扫描振镜、所述扫描透镜、所述筒镜及所述物镜后聚焦于样品处，并激发样品产生荧光；所述荧光再依次经所述物镜、所述筒镜、所述扫描透镜、所述X-Y扫描振镜、所述分光模块、所述探测透镜后被所述探测器探测，所述探测器将探测的光信号转换为电信号并将所述电信号传输至所述计算机，所述计算机根据所述电信号生成最终的共聚焦扫描图像；其中：
所述计算机控制所述线偏振调制机构，使所述激光光束经所述线偏振调制机构调制后形成偏振状态为X方向线偏光照明，生成IX-ill的共聚焦扫描图像；
所述计算机控制所述线偏振调制机构，使所述激光光束经所述线偏振调制机构调制后形成与所述X方向线偏光照明相垂直的Y方向线偏光照明，生成IY-ill的共聚焦扫描图像；
所述计算机根据所述IX-ill的共聚焦扫描图像及所述IY-ill的共聚焦扫描图像计算所述最终的共聚焦扫描图像，所述最终的共聚焦图像为
Figure FDA0003258757870000011
其中：
Figure FDA0003258757870000012
等价于采用圆偏振光照明时获得的共聚焦扫描成像，其点扩散函数为一个实心光斑；
Figure FDA0003258757870000013
的点扩散函数为中空光斑，γ为一个第二项中空成像的参数，其中γ≤0.5。
2.根据权利要求1所述的基于线偏振调制的扫描显微镜，其特征在于，所述计算机还电性连接于所述X-Y扫描振镜，所述计算机用于控制所述X-Y扫描振镜的转动。
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