CN111579486B - 基于低功率受激发射损耗的超分辨成像方法及成像系统 - Google Patents

基于低功率受激发射损耗的超分辨成像方法及成像系统 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于低功率受激发射损耗的超分辨成像方法及成像系统。通过调整设置于第一光路中角反射器的位置延长损耗激光在第一光路中进行传播的光程，将低功率的高斯型损耗激光转换为环形损耗激光并与激发激光重合后聚焦照射样品，使采集到的荧光寿命数据中同时包含共聚焦信号和超分辨信号。通过数据处理从荧光信号中分离出共聚焦图像及初始超分辨图像，根据图像处理规则对共聚焦图像及初始超分辨图像进行分析处理后得到分辨率进一步提升的目标超分辨图像。通过上述方法，采用低功率的损耗激光减小了对生物样品的破坏，降低了荧光染料的光漂白效应，延长了超分辨成像的有效时间，可得到包含细微结构特征的高分辨率图像。

Description

基于低功率受激发射损耗的超分辨成像方法及成像系统
技术领域
本发明涉及超分辨光学显微成像的技术领域，尤其涉及一种基于低功率受激发射损耗的超分辨成像方法及成像系统。
背景技术
活细胞和组织成像对生物医学领域的研究至关重要，除了正确的细胞培养条件和样品制备方法，先进的成像方法及成像系统可以在保持被观测样品自身生物特性的基础上，最大程度地保障获取信息的真实性和有效性。光学显微镜具有非接触、无损伤和特异性的优点，是近代自然科学发展开端的重要标志，它可以很好地应用于活细胞和组织的成像。但是，光的衍射限制了光学显微镜的分辨率能力，使其无法清晰地辨别尺寸在200nm以下的微观生物结构。超分辨光学显微镜(Super-resolution optical microscopy,SRM)技术继承了光学显微镜的非接触和特异性优点，通过物理化学原理将光学显微镜的分辨率提升1～2个数量级，可以在分子水平了解生命的发展变化规律，揭示生物体的抗/耐药性和干预治疗作用的细胞分子机理，是本世纪光学显微成像领域最重大的突破之一。近年来，超分辨光学成像技术的快速发展让光学显微镜与生物医学等领域的联系更加紧密，但是现有的技术对样品(制备)和荧光染料有着极其严格的要求，限制了在活体生物成像中的应用。
1994年，德国科学家StefanW.Hell根据爱因斯坦辐射理论提出受激发射损耗(Stimulated emission depletion,STED)显微技术。基于荧光饱和与激发态荧光受激辐射之间的非线性关系，STED技术利用第二束波长红移的激光对激发态分子提前进行选择性耗散，通过压缩激发光斑的有效点扩展函数提高成像分辨率，理论上可以实现三维空间上纳米级的分辨率。作为第一个理论上提出和实验中实现的远场超分辨成像方法，STED技术具有快速成像和无需后期图像重构的优势。但是，为了避免再激发效应对超分辨图像质量的影响，损耗激光波长通常位于荧光染料发射光谱尾端。由于发射光谱尾端的受激辐射截面极小，STED技术需要极高的损耗能量(通常比激发光能量高三个数量级以上)实现分辨率的提升。过高的激光能量会引起光漂白和光毒性，对荧光探针和生物组织产生破坏，因此限制了该技术在活细胞和组织成像中的应用。
荧光寿命成像显微镜(Fluorescence lifetime imaging microscopy,FLIM)是一种描述荧光寿命空间分布的显微镜成像技术，可以应用于固定细胞和活细胞的成像中，揭示更多的生物信息(如细胞内微环境的变化)。基于时间相关单光子计数器(Time-correlated single photon counting,TCSPC)的FLIM技术通过将脉冲周期划分为多个等间距的时间通道，根据光子相对参考信号到达探测器的时间差，将其转换为存储器的地址，光子信号积累后得到染料的荧光衰减曲线。将STED和FLIM两种成像技术相结合，可以同时获取荧光信号的强度和寿命信息，实现双模态STED-FLIM超分辨荧光寿命成像。在共聚焦荧光寿命成像(Confocal-FLIM)中，荧光寿命曲线随时间呈单指数衰减；但是在STED超分辨荧光寿命成像(STED-FLIM)中，由于损耗激光对激发态分子的受激辐射作用，荧光寿命曲线随时间呈多指数衰减。虽然STED-FLIM可以实现超分辨率的荧光寿命成像，但是过高的激光能量改变了荧光染料自身的荧光寿命特性，因此无法真实的反映微环境变化，导致对样品进行成像时无法呈现细微结构特征，造成成像效果较差而难以获取高分辨率的图像。
发明内容
本发明实施例提供了一种基于低功率受激发射损耗的超分辨成像方法及成像系统，旨在解决受激辐射损耗超分辨成像方法对损耗激光功率需求高，以及高激光功率下超分辨图像质量差的问题。
第一方面，本发明实施例提供了一种基于低功率受激发射损耗的超分辨成像方法，其包括：
将被荧光染料染色的样品置于载物台上并调整第一光路中角反射器的位置；
发射激发激光及损耗激光，所述激发激光及所述损耗激光均为高斯型脉冲激光，其中，所述损耗激光的波长大于所述激发激光的波长；
将沿所述第一光路传播的所述损耗激光转换为环形损耗激光并与沿第二光路传播的所述激发激光重合后，聚焦照射所述样品；
同时采集所述激发激光的激发光脉冲信号以及所述样品被照射后产生的荧光信号，所述荧光信号中包含荧光光子的时间信息和空间信息；
根据所述激发光脉冲信号及预置的分割规则从所述荧光信号中分离出共聚焦图像及初始超分辨图像；
根据预置的图像处理规则对所述共聚焦图像及所述初始超分辨图像进行分析处理，以得到更高分辨率的目标超分辨图像。
第二方面，本发明实施例提供了一种基于低功率受激发射损耗的超分辨成像系统，其包括：
信号采集装置及成像处理终端；
所述信号采集装置，用于采集得到所述激发光脉冲信号作为参考信号，并采集所述样品被照射后产生的荧光信号；
所述成像处理终端，用于对所述信号采集装置所采集的所述激发光脉冲信号及所述荧光信号进行处理以得到所述目标超分辨图像。
本发明实施例提供了一种基于低功率受激发射损耗的超分辨成像方法及成像系统。通过调整设置于第一光路中角反射器的位置延长损耗激光在第一光路中进行传播的光程，将低功率的高斯型损耗激光转换为环形损耗激光并与激发激光重合后聚焦照射样品，使采集到的荧光寿命数据中同时包含共聚焦信号和超分辨信号。通过数据处理从荧光信号中分离出共聚焦图像及初始超分辨图像，根据图像处理规则对共聚焦图像及初始超分辨图像进行分析处理后得到分辨率进一步提升的目标超分辨图像。通过上述方法，采用低功率的损耗激光减小了对生物样品的破坏，降低了荧光染料的光漂白效应，延长了超分辨成像的有效时间，结合图像增强处理得到包含细微结构特征的高分辨率图像，在实际应用过程中取得了良好的技术效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的基于低功率受激发射损耗的超分辨成像方法的流程示意图；
图2为本发明实施例提供的基于低功率受激发射损耗的超分辨成像方法的子流程示意图；
图3为本发明实施例提供的基于低功率受激发射损耗的超分辨成像方法的子流程示意图；
图4为本发明实施例提供的基于低功率受激发射损耗的超分辨成像方法的子流程示意图；
图5为本发明实施例提供的基于低功率受激发射损耗的超分辨成像系统的示意图；
图6为本发明实施例提供的成像处理终端的示意性框图；
图7为本发明实施例提供的基于低功率受激发射损耗的超分辨成像方法的使用效果示意图；
图8为本发明实施例提供的基于低功率受激发射损耗的超分辨成像方法的使用效果示意图；
图9为本发明实施例提供的基于低功率受激发射损耗的超分辨成像方法的使用效果示意图；
图10为本发明实施例提供的基于低功率受激发射损耗的超分辨成像方法的使用效果示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
应当理解，当在本说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”和“包含”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。
还应当理解，在此本发明说明书中所使用的术语仅仅是出于描述特定实施例的目的而并不意在限制本发明。如在本发明说明书和所附权利要求书中所使用的那样，除非上下文清楚地指明其它情况，否则单数形式的“一”、“一个”及“该”意在包括复数形式。
还应当进一步理解，在本发明说明书和所附权利要求书中使用的术语“和/或”是指相关联列出的项中的一个或多个的任何组合以及所有可能组合，并且包括这些组合。
请参阅图1及图5，图1是为本发明实施例提供的基于低功率受激发射损耗的超分辨成像方法的流程示意图，图5为本发明实施例提供的基于低功率受激发射损耗的超分辨成像系统的示意图。该基于低功率受激发射损耗的超分辨成像方法应用于成像系统中，成像系统包括信号采集装置10及成像处理终端20，该方法通过信号采集装置10结合安装于成像处理终端20中的应用软件进行执行，成像系统即是用于执行基于低功率受激发射损耗的超分辨成像方法以实现对所述样品进行高分辨率成像的系统装置，信号采集装置10即是用于发射激发激光及损耗激光对所述样品进行探测并采集激发光脉冲信号和荧光信号的装置，成像处理终端20即是用于获取信号采集装置所采集的激发光脉冲信及荧光信号后进行成像处理得到目标超分辨图像的终端设备，例如工作站、台式电脑、笔记本电脑、平板电脑或手机等。
如图1所示，该方法包括步骤S110～S160。
S110、将被荧光染料染色的样品置于载物台上并调整第一光路中角反射器的位置。
将被荧光染料染色的样品置于载物台上并调整第一光路中角反射器的位置。首先采用荧光染料对样品进行染色，具体的，样品可以是活细胞、病毒或组织等生物材料，荧光染料即为被光照后受激并产生荧光光子的染料，调节角反射器的位置可延长损耗激光在第一光路中进行传播的光程。
图10为本发明实施例提供的基于低功率受激发射损耗的超分辨成像方法的使用效果示意图，具体的，如图10所示，未调节角反射器时角反射器位于图10中位置①处，损耗激光沿第一光路传播的光程(光沿某一路径传播一定路程所需的时间)为τ1，此时激发激光脉冲与损耗激光脉冲之间的光程间隔为Δτ1(激发激光脉冲与损耗激光脉冲作用于样品的时间差)；调节角反射器的位置至图10中位置②处，位置①与位置②的距离为S，则损耗激光沿第一光路传播的光程为τ1+2S/c，其中c为光速，则此时激发激光脉冲与损耗激光脉冲之间的光程间隔为Δτ2＝Δτ1+2S/c。
S120、发射激发激光及损耗激光，所述激发激光及所述损耗激光均为高斯型脉冲激光，其中，所述损耗激光的波长大于所述激发激光的波长。
可同时发射激发激光及损耗激光，两束激光均为脉冲型激光，且脉冲频率相同(如80MHz)，激光的频率与激光的脉冲周期呈反比，脉冲周期应至少包含一个完整的自发荧光过程(通常为纳秒及以上的时间量级)。荧光寿命越长，则激光的脉冲周期就要越大，激光的脉冲频率就越小。其中，所述激发激光的功率小于所述损耗激光的功率，具体的，此处损耗激光的功率比传统受激辐射损耗超分辨成像(～100mW)低至少一个数量级(如小于10mW)，激发激光的功率与发光材料的光谱特性有关，通常为0.1-100μW。损耗激光的功率越大，所得到的环状图像中环形光斑的中心零强度区域越小，且峰值强度越大。所述激发激光的脉宽与所述损耗激光的脉宽均为百皮秒量级，例如，激发激光的脉宽与损耗激光的脉宽的取值范围均可以是0.1-1纳秒，损耗激光的波长大于激发激光的波长，脉宽即为激发激光脉冲或损耗激光脉冲的宽度，为实现对样品进行超分辨成像，需控制激发激光的脉宽及损耗激光的脉宽均为百皮秒量级(100皮秒＝0.1纳秒)。
S130、将沿所述第一光路传播的所述损耗激光转换为环形损耗激光并与沿第二光路传播的所述激发激光重合后，聚焦照射所述样品。
具体的，可在第一光路的角反射器之后设置螺旋相位板，通过螺旋相位板将高斯型脉冲激光的损耗激光转换为环形损耗激光，环形损耗激光与沿第二光路传播的激发激光重合，两束激光的焦平面在空间上精准重合后进行聚焦并照射样品，已染色的样品被照射后荧光染料会产生荧光信号。
S140、同时采集所述激发激光的激发光脉冲信号以及所述样品被照射后产生的荧光信号，所述荧光信号中包含荧光光子的时间信息和空间信息。
同时采集得到激发激光的激发光脉冲信号，以及样品被照射后产生的荧光信号，所采集到的激发激光的激发光脉冲信号作为荧光寿命探测的起始点；荧光染料被照射后自发辐射产生荧光光子信号，所得到的荧光光子的信号即组成上述荧光信号，荧光信号中包含荧光光子的时间信息和空间信息，荧光光子的空间信息即为所辐射出的该荧光光子在二维平面上的具体位置信息，荧光分子所辐射出的荧光光子强度在单个脉冲周期内随时间逐渐减弱，荧光光子的时间信息即为采集到该荧光光子的相对参考信号到达探测器的时间信息。
S150、根据所述激发光脉冲信号及预置的分割规则从所述荧光信号中分离出共聚焦图像及初始超分辨图像。
激发光脉冲信号及荧光信号分别被传输至成像处理终端，通过该成像处理终端对激发光脉冲信号及荧光信号进行解析处理，以得到对所述样品进行高分辨率成像的超分辨图像。具体的，首先根据分割规则及激发光脉冲信号对荧光信号进行分割，得到共聚焦图像及初始超分辨图像，共聚焦图像即为通过激发激光照射样品所产生的荧光寿命成像，初始超分辨图像即为通过激发激光及环形损耗激光同时照射样品所产生的STED(受激发射损耗，Stimulated emission depletion)超分辨荧光寿命成像。
在一实施例中，如图2所示，步骤S150包括子步骤S151、S152、S153和S154。
S151、将采集到的所述激发光脉冲信号的时间点作为荧光寿命探测的起始时间，获取所述荧光光子在时间通道上的强度变化，以得到所述荧光信号的荧光衰减曲线。
将探测到激发光脉冲信号的时刻作为荧光寿命探测的起始时间，也即是作为时间通道的零点，根据该起始时间获取荧光光子在时间通道上的强度变化，也即是以时间作为横坐标，通过光子数累积获取荧光光子的强度变化，一个时间通道即为一段单位时间(例如，可设置一个时间通道为0.05纳秒)，纵坐标即为荧光光子的强度值，荧光光子的强度可通过每一时间通道内时间积累采集得到的荧光光子的数量进行体现，某一时间通道内荧光光子数量越多则荧光光子的强度越高，最后得到荧光信号的荧光衰减曲线。
图7为本发明实施例提供的基于低功率受激发射损耗的超分辨成像方法的使用效果示意图。采用直径为23nm的荧光珠样品进行试验，激发激光的波长为635nm，功率为35μW，损耗激光的波长为730nm，功率为10mW，激发激光的频率及损耗激光的频率均为80MHz，激发激光的脉宽及损耗激光的脉宽约为0.3纳秒(ns)，激发激光脉冲与损耗激光脉冲之间的光程间隔Δτ2为2纳秒，所得到的荧光信号的荧光衰减曲线如图7所示。
S152、根据所述分割规则获取所述荧光衰减曲线中强度突变的时间通道位置作为分割点。
根据分割规则获取荧光衰减曲线中强度突变的时间通道位置作为分割点。当激发激光及环形损耗激光同时照射样品时，荧光信号的信号强度会产生突变，信号强度的突变即可在所得到的荧光衰减曲线中得到体现，获取荧光衰减曲线中强度突变的时间通道位置作为分割点，即可对荧光信号进行分割。
在一实施例中，如图3所示，步骤S152包括子步骤S1521、S1522和S1523。
S1521、根据所述斜率值计算公式计算所述荧光衰减曲线中每一点的斜率值以得到对应的斜率曲线；S1522、根据所述斜率变化值计算公式计算所述斜率曲线中每一点的斜率变化值；S1523、获取数值最大的一个所述斜率变化值在所述荧光衰减曲线中对应的时间通道位置作为所述分割点。
具体的，荧光衰减曲线由多个点组成，斜率计算公式即可对荧光衰减曲线中每一点的斜率值进行计算，得到斜率曲线。例如，斜率计算公式可以是Ar＝(yr+2-yr-2)/(xr+2-xr-2)，其中Ar为计算所得到的荧光衰减曲线中第r个点的斜率值，yr+2为第r个点右侧与之间隔2个像素的点的纵坐标，yr-2为第r个点左侧与之间隔2个像素的点的纵坐标，xr+2为第r个点右侧与之间隔2个像素的点的横坐标，xr+2为第r个点左侧与之间隔2个像素的点的横坐标，在r为任意点的情况下，xr+2-xr-2恒等于5。若第r个点左侧没有点，则yr-2＝yr、xr-2＝xr；若第r个点右侧没有点，则yr+2＝yr、xr+2＝xr。斜率计算公式还可以是对荧光衰减曲线中的点进行求导的计算公式。通过斜率变化值计算公式对斜率曲线中的每一点的斜率变化值进行计算，斜率变化值的计算方法同上述的斜率值的计算方法，对所计算得到的斜率变化值取绝对值，得到与每一斜率变化值对应的一个非负数值，获取非负数值中数值最大的一个斜率变化值在荧光衰减曲线中对应的时间通道位置作为所述分割点，也即是获取数值最大的一个斜率变化值在荧光衰减曲线中对应的横坐标值作为分割点。
例如，对图7中所示的荧光衰减曲线采用上述方法得到的分割点的横坐标值为τx＝3ns，则可以3ns作为分割点对荧光信号进行分割。
S153、根据所述荧光信号中位于所述分割点之前的荧光光子的空间信息组成所述共聚焦图像。
S154、根据所述荧光信号中位于所述分割点之后的荧光光子的空间信息组成所述初始超分辨图像。
以分割点为基准，获取荧光信号中从起始时间至该分割点的荧光光子的空间信息组成一张共聚焦图像，获取荧光信号中从该分割点之后的荧光光子的空间信息组成一张初始超分辨图像。
图8为本发明实施例提供的基于低功率受激发射损耗的超分辨成像方法的使用效果示意图。例如，对所得到的荧光信号进行分割后，得到样品的一张共聚焦图像如图8(a)所示，得到对应的一张初始超分辨图像如图8(b)所示。
S160、根据预置的图像处理规则对所述共聚焦图像及所述初始超分辨图像进行分析处理，以得到高分辨率的目标超分辨图像。
通过图像处理规则对共聚焦图像及初始超分辨图像进行分析处理，可大幅提升对样品进行成像的分辨率，得到样品的目标超分辨图像。
在一实施例中，如图4所示，步骤S160包括子步骤S161、S162和S163。
S161、将所述共聚焦图像的强度值减去所述初始超分辨图像的强度值得到环状图像。
共聚焦图像、初始超分辨图像以及所得到的环状图像的视场相同(图像尺寸相同)。具体的，将共聚焦图像中一个像素的像素值减去初始超分辨图像中与该像素对应的像素值，得到该像素的像素差值，获取共聚焦图像中每一像素的像素差值进行组合即可得到对应的一张环状图像。
例如，图8中的聚焦图像命名为图像A，初始超分辨图像命名为图像B，所得到的环状图像命名为图像C，则C＝A-B，所得到的一张环状图像如图8(c)所示。
S162、将所述环状图像与所述图像处理规则中的增强系数相乘以得到增强环状图像。
具体的，将环状图像中每一像素的像素值与增强系数相乘，得到对应的增强环状图像。其中，所述增强系数为用户预设的一个系数值，增强系数的取值大于1，增强系数可以为整数或者小数。
图9为本发明实施例提供的基于低功率受激发射损耗的超分辨成像方法的使用效果示意图。例如，取增强系数为1，环状图像如图9(1)所示，此时得到的增强环状图像与环状图像C相同；取增强系数为2，此时得到的增强环状图像如图9(2)所示；取增强系数为4，此时得到的增强环状图像如图9(3)所示。
S163、将所述初始超分辨图像的强度值减去所述增强环状图像的强度值得到所述目标超分辨图像。
所得到的目标超分辨图像也与共聚焦图像的视场相同。具体的，将初始超分辨图像中一个像素的像素值减去环状图像中与该像素对应的像素值，得到该像素的像素差值，获取初始超分辨图像和环状图像中每一像素的像素差值进行组合即可得到对应的目标超分辨图像。
例如，取增强系数为1，得到的环状图像可表示为1×C，此时得到的目标超分辨图像如图9(4)所示；取增强系数为2，得到的环状图像可表示为2×C，此时得到的目标超分辨图像如图9(5)所示；取增强系数为4，得到的环状图像可表示为4×C，此时得到的目标超分辨图像如图9(6)所示。
本发明实施例所提供的基于低功率受激发射损耗的超分辨成像方法，通过调整设置于第一光路中角反射器的位置延长损耗激光在第一光路中进行传播的光程，将低功率的高斯型损耗激光转换为环形损耗激光并与激发激光重合后聚焦照射样品，使采集到的荧光寿命数据中同时包含共聚焦信号和超分辨信号。通过数据处理从荧光信号中分离出共聚焦图像及初始超分辨图像，根据图像处理规则对共聚焦图像及初始超分辨图像进行分析处理后得到分辨率进一步提升的目标超分辨图像。通过上述方法，采用低功率的损耗激光减小了对生物样品的破坏，降低了荧光染料的光漂白效应，延长了超分辨成像的有效时间，结合图像增强处理得到包含细微结构特征的高分辨率图像，在实际应用过程中取得了良好的技术效果。
本发明实施例还提供一种基于低功率受激发射损耗的超分辨成像系统，该基于低功率受激发射损耗的超分辨成像系统可用于实现前述基于低功率受激发射损耗的超分辨成像方法的任一实施例。具体地，请参阅图5-图6，图5为本发明实施例提供的基于低功率受激发射损耗的超分辨成像系统的示意图，图6为本发明实施例提供的成像处理终端的示意性框图，所述成像系统包括信号采集装置10及成像处理终端20。
所述信号采集装置10，用于采集得到所述激发光脉冲信号作为参考信号，并采集所述样品被照射后产生的荧光信号。
具体的，所述信号采集装置包括激发激光器101、损耗激光器102、分光镜103、第一双色镜104、第二双色镜105、所述角反射器106、螺旋相位板107、扫描振镜108、物镜109、所述载物台110、前置放大器111、第一探测器112、第二探测器113、时间相关单光子计数器(TCSPC)114。
其中，所述激发激光器101，用于发射高斯型脉冲的激发激光；所述损耗激光器102，用于发射高斯型脉冲的损耗激光；所述分光镜，用于对所述激发激光进行分光，以使一部分所述激发激光沿所述第二光路传播、另一部分所述激发激光射入所述第二探测器；所述角反射器106，用于对沿所述第一光路传播的所述损耗激光进行反射以使其传播至所述螺旋相位板；所述螺旋相位板107，用于将入射的所述高斯型脉冲的损耗激光转换为环形损耗激光以使其传播至所述第二双色镜；所述第一双色镜104，用于对沿所述第二光路传播的激发激光进行反射以使其传播至所述第二双色镜，并对所述样品被照射后产生的荧光信号进行透射；所述第二双色镜105，用于对所述环形损耗激光进行反射、对沿所述第二光路传播的激发激光进行透射以使两束激光重合后传播至所述扫描振镜，并对所述荧光信号进行透射；所述扫描振镜108，用于对入射的激发激光及环形损耗激光进行同步扫描，以实现对样品的面阵成像；所述物镜109，用于对入射的激光进行聚焦后照射所述样品；所述载物台110，用于放置和固定样品，并对所述样品进行三维移动；所述第一探测器112，用于探测和收集荧光染料被照射后发出的荧光光子信号；所述第二探测器113，用于对入射的激发激光进行探测以得到所述激发光脉冲信号；所述前置放大器111，用于对来自所述第一探测器的荧光光子信号进行放大和滤波；所述时间相关单光子计数器(TCSPC)114，用于信号存储和荧光寿命成像以得到所述荧光信号。
更具体的，激发激光器101与损耗激光器102之间进行电连接，激发激光器101由损耗激光器102同步触发，使两束激光脉冲保持稳定的脉冲间隔。
所述成像处理终端20，用于对所述信号采集装置所采集的所述激发光脉冲信号及所述荧光信号进行处理以得到所述目标超分辨图像。
所述成像处理终端20即是用于获取信号采集装置所采集的激发光脉冲信及荧光信号后进行成像处理得到目标超分辨图像的终端设备，例如工作站、台式电脑、笔记本电脑、平板电脑或手机等。
成像处理终端20可执行以下步骤：根据所述激发光脉冲信号及预置的分割规则从所述荧光信号中分离出共聚焦图像及初始超分辨图像；根据预置的图像处理规则对所述共聚焦图像及所述初始超分辨图像进行分析处理，以得到高分辨率的目标超分辨图像。
在一实施例中，如图6所示，所述成像处理终端20包括荧光信号分割单元210及图像处理单元220。
荧光信号分割单元210，用于根据所述激发光脉冲信号及预置的分割规则从所述荧光信号中分离出共聚焦图像及初始超分辨图像；图像处理单元220，用于根据预置的图像处理规则对所述共聚焦图像及所述初始超分辨图像进行分析处理，以得到更高分辨率的目标超分辨图像。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

Claims (8)

1.一种基于低功率受激发射损耗的超分辨成像方法，应用于成像系统，其特征在于，所述方法包括：
将被荧光染料染色的样品置于载物台上并调整第一光路中角反射器的位置；
发射激发激光及损耗激光，所述激发激光及所述损耗激光均为高斯型脉冲激光，其中，所述损耗激光的波长大于所述激发激光的波长；
将沿所述第一光路传播的所述损耗激光转换为环形损耗激光并与沿第二光路传播的所述激发激光重合后，聚焦照射所述样品；
同时采集所述激发激光的激发光脉冲信号以及所述样品被照射后产生的荧光信号，所述荧光信号中包含荧光光子的时间信息和空间信息；
根据所述激发光脉冲信号及预置的分割规则从所述荧光信号中分离出共聚焦图像及初始超分辨图像；
根据预置的图像处理规则对所述共聚焦图像及所述初始超分辨图像进行分析处理，以得到更高分辨率的目标超分辨图像；
所述根据所述激发光脉冲信号及预置的分割规则从所述荧光信号中分离出共聚焦图像及初始超分辨图像，包括：
将采集到的所述激发光脉冲信号的时间点作为荧光寿命探测的起始时间，获取所述荧光光子在时间通道上的强度变化，以得到所述荧光信号的荧光衰减曲线；
根据所述分割规则获取所述荧光衰减曲线中强度突变的时间通道位置作为分割点；
根据所述荧光信号中位于所述分割点之前的荧光光子的空间信息组成所述共聚焦图像；
根据所述荧光信号中位于所述分割点之后的荧光光子的空间信息组成所述初始超分辨图像；
所述根据预置的图像处理规则对所述共聚焦图像及所述初始超分辨图像进行分析处理，以得到高分辨率的目标超分辨图像，包括：
将所述共聚焦图像的强度值减去所述初始超分辨图像的强度值得到环状图像；
将所述环状图像与所述图像处理规则中的增强系数相乘以得到增强环状图像；
将所述初始超分辨图像的强度值减去所述增强环状图像的强度值得到所述目标超分辨图像。
2.根据权利要求1所述的基于低功率受激发射损耗的超分辨成像方法，其特征在于，所述增强系数的取值大于1。
3.根据权利要求1所述的基于低功率受激发射损耗的超分辨成像方法，其特征在于，所述分割规则包括斜率值计算公式及斜率变化值计算公式，所述根据所述分割规则获取所述荧光衰减曲线中强度突变的时间通道位置作为分割点，包括：
根据所述斜率值计算公式计算所述荧光衰减曲线中每一点的斜率值以得到对应的斜率曲线；
根据所述斜率变化值计算公式计算所述斜率曲线中每一点的斜率变化值；
获取数值最大的一个所述斜率变化值在所述荧光衰减曲线中对应的时间通道位置作为所述分割点。
4.根据权利要求1-3任一项所述的基于低功率受激发射损耗的超分辨成像方法，其特征在于，所述损耗激光的功率大于所述激发激光的功率。
5.根据权利要求4所述的基于低功率受激发射损耗的超分辨成像方法，其特征在于，所述激发激光的脉宽与所述损耗激光的脉宽均为百皮秒量级。
6.一种基于低功率受激发射损耗的超分辨成像系统，所述成像系统用于实现如权利要求1-5任一项所述的基于低功率受激发射损耗的超分辨成像方法，其特征在于，所述成像系统包括信号采集装置及成像处理终端；
所述信号采集装置，用于采集得到所述激发光脉冲信号作为参考信号，并采集所述样品被照射后产生的荧光信号；
所述成像处理终端，用于对所述信号采集装置所采集的所述激发光脉冲信号及所述荧光信号进行处理以得到所述目标超分辨图像。
7.根据权利要求6所述的基于低功率受激发射损耗的超分辨成像系统，其特征在于，所述成像处理终端包括：
荧光信号分割单元，用于根据所述激发光脉冲信号及预置的分割规则从所述荧光信号中分离出共聚焦图像及初始超分辨图像；
图像处理单元，用于根据预置的图像处理规则对所述共聚焦图像及所述初始超分辨图像进行分析处理，以得到更高分辨率的目标超分辨图像。
8.根据权利要求6所述的基于低功率受激发射损耗的超分辨成像系统，其特征在于，所述信号采集装置包括激发激光器、损耗激光器、分光镜、第一双色镜、第二双色镜、所述角反射器、螺旋相位板、扫描振镜、物镜、所述载物台、前置放大器、第一探测器、第二探测器、时间相关单光子计数器；
所述激发激光器，用于发射高斯型脉冲的激发激光；
所述损耗激光器，用于发射高斯型脉冲的损耗激光；
所述分光镜，用于对所述激发激光进行分光，以使一部分所述激发激光沿所述第二光路传播、另一部分所述激发激光射入所述第二探测器；
所述角反射器，用于对沿所述第一光路传播的所述损耗激光进行反射以使其传播至所述螺旋相位板；
所述螺旋相位板，用于将入射的所述高斯型脉冲的损耗激光转换为环形损耗激光以使其传播至所述第二双色镜；
所述第一双色镜，用于对沿所述第二光路传播的激发激光进行反射以使其传播至所述第二双色镜，并对所述样品被照射后产生的荧光信号进行透射；
所述第二双色镜，用于对所述环形损耗激光进行反射、对沿所述第二光路传播的激发激光进行透射以使两束激光重合后传播至所述扫描振镜，并对所述荧光信号进行透射；
所述扫描振镜，用于对入射的激发激光及环形损耗激光进行同步扫描，以实现对样品的面阵成像；
所述物镜，用于对入射的激光进行聚焦后照射所述样品；
所述载物台，用于放置和固定样品，并对所述样品进行三维移动；
所述第一探测器，用于探测和收集荧光染料被照射后发出的荧光光子信号；
所述第二探测器，用于对入射的激发激光进行探测以得到所述激发光脉冲信号；
所述前置放大器，用于对来自所述第一探测器的荧光光子信号进行放大和滤波；
所述时间相关单光子计数器，用于信号存储和荧光寿命成像以得到所述荧光信号，其中，所述荧光信号中包含荧光光子的时间信息和空间信息。
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