CN110954520B - 一种扫描结构光显微成像方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种扫描结构光显微成像方法及装置，通过将激光调制成强度随时间按正弦次幂函数变化的激发光，并使用调制后的激发光对待成像样品进行扫描激发；采集待成像样品被激发光扫描激发产生的荧光信号，得到对应的强度随时间按正弦次幂函数变化的荧光结构光图像，并提取该荧光结构光图像的频率分量；根据不同方向上的荧光结构光图像的频率分量的叠加重构得到待成像样品的超分辨率图像，本实施例的方法不需要对荧光的饱和激发和高功率的附加STED光便可以实现比线性结构光双光子超分辨显微镜更高的分辨率成像，即分辨率比衍射极限提高3倍甚至更高，因此可以满足几十纳米甚至更高的荧光成像需求，提高荧光图像分辨率。

Description

一种扫描结构光显微成像方法及装置

技术领域

本发明涉及光学显微成像技术领域，尤其涉及的是一种扫描结构光显微成像方法及装置。

背景技术

荧光显微镜以其无损、非入侵、特异性标记及可以对活体细胞进行实时动态成像的优势，在生命科学研究中得到了广泛应用。但由于光学衍射极限的限制，一般成像最高分辨率仅能达到约200nm。为了突破衍射极限对荧光显微分辨率的限制，一系列新颖的超分辨显微成像方法被提出。

Hell课题组提出了STED(stimulated emission depletion,受激辐射耗尽)技术，其特点是利用套在激发光周围的高强度环形光使衍射极限范围内除中心点外的荧光分子发生受激辐射而不产生荧光，等效于将系统的点扩散函数(PSF)尺寸大幅缩小以获取超分辨图像。引入STED光后分辨率可以大幅提高到远高于衍射极限分辨率的水平(几十纳米甚至更高)。但高功率的STED光对生物样品损伤较大，特别是活细胞，因此，不适合活细胞动态成像，且必须使用特殊STED染料，限制了样品的范围。

Rust课题组提出了STORM(stochastic optical reconstruction microscopy，随机光学重建显微)技术，通过控制荧光分子稀疏发光，使得一个衍射极限范围内基本不会有两个分子同时发光而导致不可区分，通过多次成像和定位获得各个荧光分子的位置而重构出超分辨图像。该方法分辨率可达到横向高于20nm、轴向高于50nm的水平。但重构一幅超分辨图像需要采集平均数万张原始图像，成像速度受限，同时需要具有开关效应的荧光探针，对染料的要求高，限制了其适用范围。

Gustafsson课题组提出了线性SIM(structured illumination microscopy,结构光照明显微)技术，SIM基本原理是利用莫尔条纹将原本不能通过系统的高频信息平移到可观察的频率范围内来实现超分辨。具体是利用正弦条纹结构照明光激发样品产生正弦结构荧光图案,使频域上由于结构光频谱与物频谱的卷积而产生携带物体信息的多级频谱，需后期数据处理将多级频谱分开可有效获得样品的高频信息，实现超分辨成像。但是，对比衍射极限，这种线性SIM的分辨率最多提高2倍。

为了提高SIM的分辨率，Gustafsson课题组在SIM的基础上提出了饱和结构光超分辨显微(SSIM)技术，利用荧光分子的饱和激发使样品在正弦条纹图案激发光激发下发出平顶的非正弦(类似于方波)分布结构荧光，从而实现了多级频谱拓展，将分辨率提高到了几十纳米的水平。然而这种方法必须需要较高的激发光功率才能实现荧光分子的饱和激发，达到平顶条纹荧光图案效果，但高功率激光会产生严重的光损伤，这种方法并不适用于活细胞成像，无法发挥SSIM的优势，因此现有结构光超分辨技术不能满足人们对在低功率激发条件下实现几十纳米甚至更高分辨率的超分辨率成像的需求。

因此，现有技术有待于进一步的改进。

发明内容

鉴于上述现有技术中的不足之处，本发明提供了一种扫描结构光显微成像方法及装置，克服现有结构光超分辨技术无法满足在低激发光功率的条件下实现几十纳米甚至更高分辨率的超分辨率图像获取的需求的缺陷。

第一方面，本实施例公开了一种扫描结构光显微成像方法，其中，包括：

将激光调制成随时间按正弦次幂函数变化的激发光，并使用调制后的激发光对待成像样品进行扫描激发；

采集待成像样品被激发光扫描激发产生的荧光信号，得到荧光信号对应的荧光结构光图像组；其中，所述荧光结构光图像组包括：多个荧光结构光图像；各个荧光结构光图像对应的激发光图案的取向和相位不同；

提取各个所述信号结构光图像中的频率分量，对其中对应同一取向和不同相位的频率分量进行复位后叠加，根据叠加出的各个取向上的频率分量的叠加值组，重构出所述待成像样品的超分辨率图像。

可选的，所述将激光调制成强度随时间按正弦次幂函数变化的激发光的步骤包括：

通过预设调制函数将激光调制成强度随时间按正弦次幂函数变化的激发光。

可选的，所述使用调制后的激发光对待成像样品进行扫描的步骤包括：

沿所述待成像样品进行逐点扫描，直至所述待成像样品扫描完成。

可选的，所述采集待成像样品被激发光扫描激发产生的荧光信号，得到荧光信号对应的荧光结构光图像组的步骤包括：

逐点采集记录所述待成像样品被激发光扫描激发产生的荧光信号，得到荧光结构光图像组。

可选的，所述调制函数满足以下公式：

其中，I_ex(r)为待成像样品成像面上的激发光的光强，r代表待成像样品上的任意位置，ω_t为时间调制频率，

为初始相位，n为自然数，t为时间。

可选的，所述根据叠加出的各个取向上的频率分量的叠加值组，重构出所述待成像样品的超分辨率图像的步骤包括：

对叠加出的频率分量的叠加值组进行傅里叶逆变换，得到重构出的荧光信号的超分辨率图像。

第二方面，本实施例还公开了一种扫描结构光显微成像的装置，其中，包括：

激光器，用于产生激光；

强度调制器，用于将激光调制成强度随时间按正弦次幂函数变化的激发光；

扫描器，用于控制所述激发光对待成像样品进行扫描；

探测器，用于采集待成像样品在激发光扫描后产生的荧光信号，得到荧光信号对应的荧光结构光图像组；其中，所述荧光结构光图像组包括：多个荧光结构光图像；各个荧光结构光图像对应的激发光图案的取向和相位不同；

计算终端，用于提取各个所述结构光图像中的频率分量，对其中对应同一取向和不同相位的频率分量进行复位后叠加，根据叠加出的各个取向上的频率分量的叠加值组，重构出所述待成像样品的超分辨率图像。

其中，所述强度调制器、扫描器、探测器和计算终端连接。

可选的，所述强度调制器和扫描器之间设置有滤光片、分束镜、第一透镜、空间滤波器和第二透镜；

由强度调制器调制后的激发光经过所述滤光片进行激发光过滤后，入射到所述分束镜；

所述激发光经过所述分束镜透射后，入射到所述第一透镜，经所述第一透镜聚焦到所述空间滤波器；

所述空间滤波器对聚焦到其上的激发光进行过滤后，出射到所述第二透镜；

所述第二透镜对入射的激发光进行准直成平行光，发射至所述扫描器。

可选的，所述扫描器与所述探测器之间的光路中设置有扫描透镜、管镜和物镜；

所述扫描器发出的扫描光线经过扫描透镜后，入射到所述管镜，经过所述管镜发出平行光入射到所述物镜，所述物镜出射的激发光入射到待成像样品上激发出荧光信号；所述荧光信号反射到所述探测器。

可选的，所述分束镜与所述探测器之间的光路中还设置有发射滤光片和第三透镜；

所述发射滤光片接收从所述分束镜反射出的荧光信号，透射出所述荧光信号到所述第三透镜；

所述第三透镜，用于接收所述发射滤光片透射的荧光信号，并将所述荧光信号聚焦成像到所述探测器上。

与现有技术相比，本发明实施例具有以下优点：

根据本发明实施方式提供的方法，通过将激光调制成强度随时间按正弦次幂函数变化的激发光，并使用调制后的激发光对待成像样品进行扫描激发；采集待成像样品被激发光扫描激发产生的荧光信号，得到对应的光结构光图案；分别获取激发光图案处于不同取向和不同相位时的结构光图像，并将各个结构光图像中的频率分量分离，将处于同一方向上的频率分量进行复位后叠加，根据叠加出的各个方向上的叠加值组，重构出的各个方向上荧光信号的超分辨率图像。本实施例中采用调制函数间接控制荧光结构光强度分布，随着调制函数的幂指数n大小不同，荧光结构光强度分布不同，并对分离出的处于同一方向上的频率分量进行复位后叠加，根据叠加出的各个取向上的频率分量的叠加值组重构出所述待成像样品的超分辨率图像，分辨率仅与调制函数的幂指数n决定，n越大，分辨率越高。因此本实施例的方法不需要对荧光的饱和激发和高功率的STED附加光便可以实现显微超分辨成像，更重的是实现了在非饱和激发条件下利用非正弦荧光结构光使其分辨率比衍射极限提高3倍甚至更高，可以实现几十纳米甚至更高分辨率的荧光结构光成像。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例中一种扫描结构光显微成像的方法步骤流程图；

图2是本发明实施例中电光调制器调制后激发光强度随时间按正弦次幂函数变化的变化曲线图(以n＝2为例)；

图3是本实施例中激发光条纹结构光图案；

图4是本实施例中不同n值时的点扩展函数曲线；

图5是本发明实施例中所述扫描结构光显微成像装置的结构示意图；

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

发明人发现现有结构光超分辨技术不能满足人们对在低功率激发条件下实现几十纳米甚至更高分辨率的超分辨率成像的需求。

为了解决上述问题，本实施例公开了一种扫描结构光显微成像方法及装置，其可以实现分辨率不受光学衍射极限限制，达到无限小分辨能力。通过点扫描，利用强度调制器将激光调制成强度随时间按正弦次幂函数变化的激发光，激发出强度随时间按正弦次幂函数变化的荧光，与样本频谱产生多级频谱混叠。通过对混叠频谱的解频和复位，获得更高频样本信息，从而得到待成像样品的超分辨率图像。

本实施例所提供的方法及装置不仅提高了分辨率，且与受激辐射耗尽(stimulated emission depletion,STED)技术、饱和结构光照明显微(SaturatedStructured Illumination Microscopy)技术相比,可以较低的光功率实现超分辨率荧光成像，避免对活细胞的损伤。而且，该方法对染料没有特殊要求，可适用样品范围更广。再者，该方法仅需要几幅或几十幅原始图像即可重构超分辨图像，相比于需要采集上千幅原始图像的STORM，其成像速度更快。更重要的，该方法的分辨率由调制函数的幂指数n决定，n越大，分辨率越高，而且该方法可以直接移植到现有商品共焦显微镜上实现超分辨成像。

第一方面，本实施例公开了一种扫描结构光显微成像方法，如图1所示，所述方法包括：

步骤S1、将激光调制成强度随时间按正弦次幂函数变化的激发光，并使用调制后的激发光对待成像样品进行扫描激发。

本步骤中首先使用激光器发射出激光，在一种实施方式中，所述激光器可以选择使用488nm激光，该激光可以用于实现荧光物质单光子激发。

为了实现得到不同方向上不同相位上的多幅待成像样品的荧光结构光图像，所述将激光调制成强度随时间按正弦次幂函数变化的激发光的步骤包括：

按照预设调制函数将激光进行调制，将所述激光调制成强度随时间按正弦次幂函数变化的激发光，并且通过改变调制函数的相位获取同一个方向下不同相位的荧光结构光图像。

本实施例中利用强度调制器，以预设调制函数对激光进行调制，使得调制出的激发光的强度随时间按正弦次幂函数变化，所述强度调制器为光电调制器，如图2所示为调制后的激发光的光强随时间按正弦次幂函数变化的波形示意图。

在一种实施方式中，所述预设调制函数的函数表达式满足：

其中，I_ex(r)为待成像样品成像面上的激发光的光强，r代表待成像样品上的任意位置，ω_t为时间调制频率，

为初始相位，n为自然数，t为时间。

所述使用调制后的激发光对待成像样品进行扫描的步骤包括：

沿所述待成像样品纵向进行逐点扫描，当一个纵向扫描完成后，再沿所述待成像样品横向进行逐点扫描一步，重复执行上述逐点扫描的步骤，直至所述待成像样品扫描完成。

在进行扫描控制时，使用扫描器控制激发光对待成像样品进行扫描，激发出荧光信号，所述荧光信号为强度随时间按正弦次幂函数变化的结构光，并且所述扫描器控制激发光沿着待成像样品逐点扫描，直至所述待成像样品扫描完成。

步骤S2、采集待成像样品被激发光扫描激发产生的荧光信号，得到荧光信号对应的荧光结构光图像组；其中，所述荧光结构光图像组包括：多个荧光结构光图像；各个荧光结构光图像对应的激发光图案的取向和相位不同。

由于在待成像样品的内部分布有荧光物质，当激发光扫描待成像样品时，所述待成像样品内荧光物质在激发光点的作用下产生单光子荧光信号。激发光点激发待成像样品，产生单光子荧光，并且扫描器扫描完整个待成像样品后，得到整个待成像样品的荧光结构光图像。

结合图5所示，各个激发光的光束经扫描器8沿待成像样品12纵向进行逐点扫描，沿待成像样品12纵向的一行逐点扫描结束后，扫描器8沿待成像样品12横向移至下一位置进行逐点扫描，进行下一纵向位置的逐点扫描，即第二行扫描，如此循环，即可实现对整个待成像样品12的扫描，获取整个待成像样品12被激发出的荧光信息。探测器15在扫描开始时同步逐点记录荧光信号，在整个待成像样品12的扫描完成时荧光信号记录也完成，即记录一幅荧光结构光图像，并存储在计算终端16中。

上述步骤中所述计算记录出的图像为强度随时间按正弦次幂函数变化的荧光结构光图像，该强度随时间按正弦次幂函数变化的荧光结构光图像中含有频率信息，通过改变调制函数的周期和相位即可获得不同取向相位相同和取向相同但相位不同的荧光结构光图像组。所述荧光结构光图像组中含有多个荧光结构光图像，且各个荧光结构光图像可以具有相同取向，但对应的激发图案的相位不同，或者对应不同取向，但是对应的激发光图案的相位相同。

步骤S3、提取各个所述信号结构光图像中的频率分量，对其中对应同一取向和不同相位的频率分量进行复位后叠加，根据叠加出的各个取向上的频率分量的叠加值组，重构出所述待成像样品的超分辨率图像。

通过上述步骤S2获取到的不同取向、同一个取向不同相位的荧光结构光图像后，对荧光结构光图像中荧光信号的频率分量进行分离，以及对分离出的各个频率分量进行整合，得到处于同一方向上的频率分量的叠加值组，最后将频域转换到时域，实现同一个方向上的超分辨图像。

进一步的，所述根据叠加出的各个取向上的频率分量的叠加值组，重构出所述待成像样品的超分辨率图像的步骤包括：

对叠加出的频率值组所对应的荧光图像进行傅里叶逆变换，得到重构出的荧光信号的超分辨率图像。

结合图5所示，首先由激光器1发射出激光，经过强度调制器2对所述激光进行调制，将激光调制成激发光，具体的，本实施例中使用调制函数的公式为：

其中，I_ex(r)为待成像样品成像面上的激发光的光强，r代表待成像样品上的任意位置，ω_t为时间调制频率，

为初始相位，n为自然数，t为时间。

结合图2所示，当n＝2时激发光强度随时间按正弦次幂函数变化的曲线图，如图3所示，所述激发光随着调制函数的相位和周期的不同均有不同的条纹图案，为相位差为2π/5时的激发光条纹图案。

为了简化上述调制函数公式，令

则调制函数简化为调制函数为：

因此调制后的激发光强度满足：

从强度调制器2中出射的调制后的激发光入射到滤光片3，所述滤光片3对入射的光进行过滤，过滤掉除激发光以外的背景光，并将过滤后的激发光入射到分束镜4，所述分束镜4对入射的激发光进行透射，将激发光透射到第一透镜5，所述第一透镜5将入射的激发光汇聚到空间滤波器6，由所述空间滤波器6对其进行空间滤波后，入射到第二透镜7，所述第二透镜7将入射光线准直成平行光，入射到扫描器8。所述扫描器8为二维扫描器，用于控制激发光扫描实现激发光对所述待成像样品12扫描。其中，所述空间滤波器6为满足预设尺寸的针孔，其用于将焦点以外的杂散光滤掉，实现只有焦平面光信号可以通过，其他离焦信号被阻挡。

所述待成像样品12上激发出的荧光信号由物镜11收集，并先后经过由管镜10、扫描透镜9、扫描器8、第二透镜7、空间滤波器6和第一透镜5，传输到分束镜4。由分束镜4反射到发射滤光片13。发射滤光片13对入射的光进行过滤，过滤掉除荧光以外的背景光，并将过滤后的荧光信号入射到第三透镜14，所述第三透镜14将入射的荧光信号聚焦到探测器15上，由探测器15记录接收到的荧光结构光图像。

所述计算终端16获取所述探测器15中记录的荧光结构光图像，提取各个所述荧光结构光图像中的频率分量，对其中对应同一取向和不同相位的频率分量进行复位后叠加，根据叠加出的各个取向上的频率分量的叠加值组，重构出所述待成像样品12的超分辨率图像。

由于荧光强度与激发光强度存在线性关系，则荧光的光强度与激发光强相差一个常系数，对超分辨图像分辨率不影响，可以忽略，则荧光强度也写为：

其中，I_em(r)为待成像样品上激发出的荧光的光强，r代表待成像样品上的任意位置，ω_t为时间调制频率，

为初始相位，n为自然数，t为时间。

由于强度调制、光束扫描和探测同步进行，最终，对待成像样品扫描完一次，探测器逐点连续记录形成一幅荧光结构光图像，通过改变调制函数相位，改变激发光图案的相位，重复上述过程，可以获得到不同激发光图案相位下对应的荧光结构光图像。一般一种激发光图案取向下，需要获得至少在相位

m＝1,2,…,2n+1.n＝1,2,3…，时的荧光结构光图案，再利用WS重构算法重构出该取向的超分辨率图像。为了获得各个方向的超分辨率图像，理论上应该实现每个激发光图案取向下的上述超分辨率图像。实际上，通常实现三个取向(彼此相差120度)的超分辨率图像即可。因此，通过改变调制函数的周期和初始相位，即可获得不同激发光图案取向的荧光结构光图像，然后再分别获取不同激发光图案取向的上述不同相位

的荧光结构光图像，利用WS重构算法重构出对应取向的超分辨图像，最终将各方向的超分辨图像合成为一幅超分辨图像。

本实施例中采用以下算法(WS)进行超分辨率图像的重构：

假设激发的结构光为：

荧光强度为：

经过光学系统之后，被探测器逐点记录并形成的强度图像的傅立叶变化为

通过获取

m＝1,2,…,2n+1下的荧光结构光图像，就可以解出所有频率信息：

就是指各个分离的频率分量。

具体可解如下矩阵：

利用数学上频移方法，将高频成分移到正确的位置，即复位，然后将分离后的同一个取向上不同相位的的频率分量进行叠加，最后进行反傅立叶变化重构出最终的待成像样品的超分辨图像，最高分辩率比衍射极限提高约3倍甚至更高，取决于调制函数的幂指数n的大小。

改变强度调制器2的调制函数，使待成像样品上激发光图案的方向转动(也即旋转激发光图案的取向)，重复上述操作，即可提高待成像样品另一个取向上的分辨率。以此类推，即可提高该待成像样品平面内各个取向的成像分辨率。最后将各个取向的频谱线性相加并进行傅立叶逆变换重构出最终的超分辨率图像，最高分辩率比衍射极限提高约3倍甚至更高，取决于调制函数中n的大小。

结合图4所示，将本实施例所提供的图像重构算法模拟了普通荧光显微(n＝0)、线性SIM(n＝1)、一阶非线性SIM(n＝2)、二阶非线性SIM(n＝3)和三阶非线性SIM(n＝4)的点扩展函数，其分辨率分别达到210nm、112nm、74nm、53nm和43nm，理论上，调制函数的幂指数n足够大，我们的专利技术能够达到无限小分辨率能力。

值得注意的是，本发明实施例所提供的图像重构算法不仅适合于扫描结构光照明的单光子荧光结构光超分辨显微成像，也适用于宽场结构光照明的单光子荧光超分辨显微成像。

在上述方法的基础上，本实施例还公开了一种扫描结构光显微成像的装置，结合图5所示，包括：

激光器1，用于产生激光；

强度调制器2，用于将激光调制成强度随时间按正弦次幂函数变化的激发光；所述强度调制器包括电光调制器或声光调制器。

扫描器8，用于控制所述激发光对待成像样品进行扫描激发；

探测器15，用于采集待成像样品在激发光扫描激发后产生的荧光信号，得到荧光信号对应的荧光结构光图像组；其中，所述荧光结构光图像组包括：多个荧光结构光图像；各个荧光结构光图像对应的激发光图案的取向和相位不同；

计算终端16，用于提取各个所述结构光图像中的频率分量，对其中对应同一取向和不同相位的频率分量进行复位后叠加，根据叠加出的各个取向上的频率分量的叠加值组，重构出所述待成像样品的超分辨率图像；

其中，所述强度调制器2、扫描器8、探测器15和计算终端16连接。

所述强度调制器2，扫描器8、探测器15与计算终端16电连接。计算终端16控制强度调制器2改变调制函数，以将激光调制成预设强度的激发光，以及控制所述扫描器8的扫描速度和范围，所述计算终端16还用于控制所述探测器15采集荧光图像。

具体的，在所述强度调制器2和扫描器8之间设置有滤光片3、分束镜4、第一透镜5、空间滤波器6和第二透镜7；

由强度调制器2调制后的激发光经过所述滤光片3进行激发光过滤后，入射到所述分束镜4；

所述激发光经过所述分束镜4透射后，入射到所述第一透镜5，经所述第一透镜5聚焦到所述空间滤波器6；

所述空间滤波器6对聚焦到其上的激发光进行过滤后，出射到所述第二透镜7；

所述第二透镜7对入射的激发光进行准直成平行光，发射至所述扫描器8。

具体的，所述扫描器8与所述探测器15之间的光路中还设置有扫描透镜、管镜和物镜；

所述扫描器8发出的扫描光线经过扫描透镜后，入射到所述管镜10内，经过所述管镜发出平行光入射到所述物镜11，所述物镜11出射的激发光入射到待成像样品12上激发出荧光信号；所述荧光信号反射到所述探测器15中。

进一步的，所述分束镜4与所述探测器15之间的光路中还设置有发射滤光片13和第三透镜14；

所述发射滤光片13接收从所述分束镜4反射出的荧光信号，透射出所述荧光信号到所述第三透镜14；

所述第三透镜14，用于接收所述发射滤光片13透射的荧光信号，并将所述荧光信号聚焦成像到所述探测器15上。

本发明实施所提供的所述方法，根据本发明实施方式提供的方法，通过将激光调制成强度随时间按正弦次幂函数变化的激发光，并使用调制后的激发光对待成像样品进行扫描激发；采集待成像样品被激发光扫描激发产生的荧光信号，得到荧光信号对应的荧光结构光图像；分别获取激发光处于不同相位时，荧光结构光图像中荧光信号对应的频率分量，并将处于同一方向上的频率分量进行叠加，根据叠加出的各个方向上的频率值组，重构出的各个方向上荧光信号的超分辨率图像。本实施例中采用同一个方向上荧光信号的频率分量进行叠加，获取到不同方向上的荧光信号的频率分量的叠加值组，并根据各个荧光信号频率分量的叠加值组得到待成像样品的超分辨率图像，因此本实施例的方法不需要对荧光的饱和激发便可以实现单光子荧光显微超分辨成像，分辨率取决于调制函数的幂指数n的大小，n越大，分辨率越高，对比衍射极限，可达到(n+1)倍分辨率的提高，即可以实现几十纳米甚至更高分辨率的双光子荧光结构光成像。

本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的发明后，将容易想到本发明的其它实施方案。本发明旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本公开未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由权利要求指出。

应当理解的是，本发明并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本发明的范围仅由所附的权利要求来限制

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种扫描结构光显微成像方法，其特征在于，包括：

将激光调制成强度随时间按正弦次幂函数变化的激发光，并使用调制后的激发光对待成像样品进行扫描激发；

采集待成像样品被激发光扫描激发产生的荧光信号，得到荧光信号对应的荧光结构光图像组；其中，所述荧光结构光图像组包括：多个荧光结构光图像；各个荧光结构光图像对应的激发光图案的取向和相位不同；

提取各个所述荧光结构光图像中的频率分量，对其中对应同一取向和不同相位的频率分量进行复位后叠加，根据叠加出的各个取向上的频率分量的叠加值组进行傅里叶逆变换，重构出所述待成像样品的超分辨率图像；

所述将激光调制成强度随时间按正弦次幂函数变化的激发光的步骤包括：

通过预设调制函数将激光调制成强度随时间按正弦次幂函数变化的激发光；

所述预设调制函数满足以下公式：

其中，I_ex(r)为待成像样品成像面上的激发光的光强，r代表待成像样品上的任意位置， ω_t为时间调制频率，

为初始相位，n为大于等于2的自然数，t为时间；所述待成像样品的 超分辨率图像的分辨率随着所述预设调制函数的幂指数n改变而改变；

所述采集待成像样品被激发光扫描激发产生的荧光信号，得到荧光信号对应的荧光结构光图像组的步骤包括：

一种激发光图案取向下，需要获得至少在相位

，m＝1,2,…,2n+1；n＝1,2, 3…，时的荧光结构光图案，通过改变预设调制函数的周期和初始相位，获得不同取向的荧 光结构光图案，然后再分别获取不同取向的上述不同相位

的荧光结构光图案，利用WS 重构算法重构出对应取向的超分辨图像。

2.根据权利要求1所述的扫描结构光显微成像方法，其特征在于，所述使用调制后的激发光对待成像样品进行扫描激发的步骤包括：

沿所述待成像样品进行逐点扫描，直至所述待成像样品扫描完成。

3.根据权利要求1所述的扫描结构光显微成像方法，其特征在于，所述采集待成像样品被激发光扫描激发产生的荧光信号，得到荧光信号对应的荧光结构光图像组的步骤包括：

逐点采集记录所述待成像样品被激发光扫描激发产生的荧光信号，得到荧光结构光图像组。

4.一种扫描结构光显微成像装置，其特征在于，包括：

激光器，用于产生激光；

强度调制器，用于将激光调制成强度随时间按正弦次幂函数变化的激发光；

扫描器，用于控制所述激发光对待成像样品进行扫描；

探测器，用于采集待成像样品在激发光扫描后产生的荧光信号，得到荧光信号对应的荧光结构光图像组；其中，所述荧光结构光图像组包括：多个荧光结构光图像；各个荧光结构光图像对应的激发光图案的取向和相位不同；

计算终端，用于提取各个所述荧光结构光图像中的频率分量，对其中对应同一取向和不同相位的频率分量进行复位后叠加，根据叠加出的各个取向上的频率分量的叠加值组进行傅里叶逆变换，重构出所述待成像样品的超分辨率图像；

其中，所述强度调制器、扫描器、探测器分别和计算终端连接；

通过预设调制函数将激光调制成强度随时间按正弦次幂函数变化的激发光；

所述预设调制函数满足以下公式：

其中，I_ex(r)为待成像样品成像面上的激发光的光强，r代表待成像样品上的任意位置， ω_t为时间调制频率，

为初始相位，n为大于等于2的自然数，t为时间；所述待成像样品的 超分辨率图像的分辨率随着所述预设调制函数的幂指数n改变而改变；

所述用于采集待成像样品在激发光扫描后产生的荧光信号，得到荧光信号对应的荧光结构光图像组包括：

一种激发光图案取向下，需要获得至少在相位

，m＝1,2,…,2n+1；n＝1,2, 3…，时的荧光结构光图案，通过改变预设调制函数的周期和初始相位，获得不同取向的荧 光结构光图案，然后再分别获取不同取向的上述不同相位

的荧光结构光图案，利用WS 重构算法重构出对应取向的超分辨图像。

5.根据权利要求4所述的扫描结构光显微成像装置，其特征在于，所述强度调制器和扫描器之间设置有滤光片、分束镜、第一透镜、空间滤波器和第二透镜；

由强度调制器调制后的激发光经过所述滤光片进行激发光过滤后，入射到所述分束镜；

所述激发光经过所述分束镜透射后，入射到所述第一透镜，经所述第一透镜聚焦到所述空间滤波器；

所述空间滤波器对聚焦到其上的激发光进行过滤后，出射到所述第二透镜；

所述第二透镜对入射的激发光进行准直成平行光，发射至所述扫描器。

6.根据权利要求4所述的扫描结构光显微成像装置，其特征在于，所述扫描器与所述探测器之间的光路中还设置有扫描透镜、管镜和物镜；

所述扫描器发出的扫描光线经过扫描透镜后，入射到所述管镜，经过所述管镜发出平行光入射到所述物镜，所述物镜出射的激发光入射到待成像样品上激发出荧光信号；所述荧光信号反射到所述探测器。

7.根据权利要求5所述的扫描结构光显微成像装置，其特征在于，所述分束镜与所述探测器之间的光路中还设置有发射滤光片和第三透镜；

所述发射滤光片接收从所述分束镜反射的荧光信号，所述荧光信号经发射滤光片透射至所述第三透镜；

所述第三透镜，用于接收所述发射滤光片透射的荧光信号，并将所述荧光信号聚焦成像到所述探测器上。

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