DE112019004851T5

DE112019004851T5 - Vorrichtung und verfahren zur schnellen volumetrischen fluoreszenzmikroskopie unter verwendung von zeitlich multiplexierten lichtblättern

Info

Publication number: DE112019004851T5
Application number: DE112019004851.1T
Authority: DE
Inventors: Kevin Kin Man Tsia; Yuxuan Ren; Jianglai WU; Andy Kam Seng Lau; Queenie Tsz Kwan Lai
Original assignee: University of Hong Kong HKU
Current assignee: University of Hong Kong HKU
Priority date: 2018-09-28
Filing date: 2019-09-27
Publication date: 2021-07-29
Anticipated expiration: 2039-09-28
Also published as: JP7233129B2; CN112930492A; US20210325651A1; JP2022502704A; CN112930492B; WO2020063895A1; DE112019004851B4; US11656447B2

Abstract

Eine Mikroskopievorrichtung umfasst eine Laserlichtquelle mit Dauerstrich oder Impulswelle; ein Paar parallele Spiegel, die so konfiguriert sind, dass sie Licht von der Lichtquelle empfangen und ein Array inkohärenter Lichtblätter reflektieren; einen Strahlencodierer (z.B. Frequenzmodulationsretikel, Hadamard-Basis, Zufallsmodulationsmuster), um das Array inkohärenter Lichtblätter zu segmentieren und jedes Lichtblatt mit einer entsprechenden Frequenz im reziproken Raum zu codieren; eine Linse, die so konfiguriert ist, dass sie die codierten Lichtblätter auf eine biologische Probe richtet; und eine Bilderfassungsvorrichtung, die so konfiguriert ist, dass sie ein Fluoreszenzsignal von der biologischen Probe empfängt.

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die biologische Bildgebung wird seit vielen Jahren zur Abbildung physiologisch relevanter Systeme eingesetzt.
Die große Herausforderung, die belebten Prozesse komplexer biologischer Systeme in drei Dimensionen (3D) zu verstehen, liegt im Mangel an bildgebenden Modalitäten, die eine Überwachung der Dynamik bei ausreichend hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung und mit geringem Grad an Lichtschäden ermöglichen. Etablierte biologische 3D-Bildgebungstechniken, nämlich die konfokale und Multiphotonen-Mikroskopie sowie die Lichtblatt-Fluoreszenz-Mikroskopie (LSFM) ist eine biologische Bildgebungstechnik, die mit einer Entkopplung der optischen Pfade für Beleuchtung und Detektion arbeitet und verschiedene Beleuchtungstechniken verwendet, um die Photonensammeleffizienz des Systems zu optimieren. Diese lichtbasierten Bildgebungssysteme können jedoch Lichtschäden verursachen und Phototoxizität in einer biologischen Probe induzieren. Diese lichtbasierten Bildgebungssysteme beruhen überwiegend auf dem Laserscanning, das oft die Bildgebungsgeschwindigkeit beeinträchtigt, da das gesamte 3D-Sichtfeld (FOV) durch mechanische Bewegungen sequentiell gescannt werden muss, was galvanometrische Scanner oder sperrige Bildgebungsobjektive bedingt. Es wurden zwar verschiedene Techniken entwickelt, um die Scangeschwindigkeit zu skalieren, diese erfordern jedoch zwangsläufig eine höhere Systemkomplexität, einschließlich einer speziellen Strahlabtaststeuerung und Hardwaresynchronisation. In der Tat ist die auf Laserscanning basierende Bildgebung von Natur aus energieineffizient, da das räumliche Tastverhältnis immer weit unter Eins liegt (d. h. nur ein Bruchteil des gesamten Volumens wird innerhalb einer Volumenbildzeit ausgelesen). Schlimmer noch, viele Scanning-Ansätze regen wiederholt eine Fluoreszenz außerhalb des Fokus an und beschleunigen so Photobleaching und Lichtschäden.
Konventionelle lichtbasierte biologische Bildgebungssysteme verwenden ein einzelnes Lichtblatt, um eine dreidimensionale (3D) volumetrische Bildgebung durchzuführen, indem entweder die biologische Probe gescannt wird oder sowohl das Lichtblatt als auch das Detektionsobjektiv synchron gescannt werden. Die Bildgebungsgeschwindigkeit ist daher durch die Scangeschwindigkeit begrenzt, was zu Resonanzschwingungen im System führen kann. Diese Oszillation kann dazu führen, dass das System während des Scanvorgangs instabil ist.
Konventionelle Lichtgitterblatt-Mikroskopietechniken erkennen funktionelle und strukturelle Informationen der biologischen Zellen, indem sie Informationen aus korrelierten Bildkontrasten ableiten. Diese Techniken betonen ebenfalls die räumliche Auflösung, lassen aber die zeitliche Auflösung vermissen und sind darauf angewiesen, entweder den Probentisch oder sowohl den Beleuchtungsstrahl als auch das Detektionsobjektiv zu scannen. Diese Techniken haben eine beträchtlich niedrige volumetrische Bildrate und werden durch die Tischdrift, die durch das Scannen verursacht wird, negativ beeinflusst.
Um diese Herausforderungen zu bewältigen, hat sich das Konzept der parallelisierten Beleuchtung (Detektion), d. h. alle Voxel werden gleichzeitig angeregt (aufgenommen), zu einer der wichtigsten Bestrebungen in der modernen 3D-Bildgebung entwickelt. Neben der Verbesserung der Bildgebungsgeschwindigkeit ermöglicht die Parallelisierung der Beleuchtung (Detektion) die Maximierung des räumlichen Tastverhältnisses und damit des Photonenbudgets. Dies ist besonders wichtig, um die Lebensfähigkeit der biologischen Proben zu erhalten. Aktuelle Parallelisierungsmethoden sind jedoch bisher entweder auf 2D (z.B. LSFM) oder Sparse-Sampling in 3D (z.B. Multi-Fokal- oder Multi-Lichtblatt-Mikroskopie) beschränkt. Die verfügbaren Multi-Lichtblatt-Bildgebungssysteme basieren größtenteils auf Strahlinterferenz, kohärenter Wellenfronttechnik (im räumlichen oder Fourier-Bereich) oder Strahlteilung. Um jedoch Beleuchtungsartefakte zu vermeiden, die durch das Zusammenspiel von kohärentem Strahl und stark gestreutem Gewebe entstehen (z.B. Speckle-Rauschen), laufen diese Methoden typischerweise in einem Sparse-Sampling-Modus mit einer begrenzten Anzahl von Lichtblättern und erfordern immer noch sequenzielles Strahl-Scanning (oder Dithering), um eine zeitlich gemittelte inkohärente Überlagerung von Lichtblättern zu erreichen.
Eine weitere aufkommende Technik ist die Lichtfeldmikroskopie, bei der die axialen Informationen über die strukturellen Dimensionen auf einer 2D-Kamera durch ein Array aus Mikrolinsen unterschieden werden können. Das endgültige 3D-Bild wird mit Algorithmen rechnerisch rekonstruiert, die das inverse Problem lösen - was zu den Einschränkungen einer reduzierten lateralen Auflösung und einer hohen Bildberechnungskomplexität führt.
Selektive Planarbeleuchtungsmikroskopie-(SPIM)-Systeme erzeugen mehrdimensionale Bilder von Proben mit einer Merkmalsgröße von bis zu einigen Millimetern. SPIM verwendet die Lichtblattbeleuchtung und ein orthogonales Detektionssystem, um eine schnelle parallele Detektion mit einem Array-Detektor zu erreichen. Diese Systeme können Organismen wie einen Madaka-Embryo und die Embryogenese von Drosophila melanogaster abbilden. Diese Systeme haben viele Derivate, einschließlich multiView und isoView volumetrische Fluoreszenz-Bildgebungssysteme. Diese SPIM-Systeme scannen jedoch alle Proben mit mehreren Strahlen, die mehrere Freiheitsgrade haben. Dies führt zu einer schnelleren Verschlechterung der Abbildungsgeschwindigkeit. Außerdem kann die Datenverarbeitung bis zu 24 Stunden dauern, um ein einzelnes volumetrisches MultiView-Bild zu rekonstruieren.
Die digitale Scanning-Lichtblatt-Mikroskopie erzeugt eine verlängerte Beleuchtungspunktausbreitungsfunktion durch Scannen des fokussierten Strahls entlang einer Dimension. Diese Technik erzeugt eine zeitlich geteilte eindimensionale (1D) Punktausbreitungsfunktion und vermeidet eine kontinuierliche Beleuchtung der Probe, erfordert aber eine höhere Laserleistung, um dasselbe Niveau von Fluoreszenzzählungen zu erzeugen. Außerdem muss der Probentisch gescannt werden, um ein volumetrisches Bild zu erfassen, daher ist die volumetrische Bildrate gering. Infolgedessen führt eine inhärente Tischdrift zu einer Verschlechterung der Bildqualität.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ermöglicht die hierin beschriebene volumetrische Fluoreszenzmikroskopie-Technik oder codierte Lichtblatt-Array-Mikroskopie (CLAM) eine parallelisierte Lichtblattbeleuchtung und -detektion. Die Techniken basieren auf der rekonfigurierbaren Erzeugung eines inkohärenten und frequenzcodierten Lichtblatt-Arrays bzw. Lichtcheiben-Arrays. CLAM ermöglicht die gleichzeitige Erfassung aller optisch geschnittenen Bildebenen mit einer Videovolumenrate von > 10 Hz; und zwar ohne mechanisches Scannen oder eine Manipulation des aktiven Strahls. Dieses 3D-Parallelisierungsmerkmal ermöglicht eine längere Pixelverweilzeit und eine schonendere Belichtung im Vergleich zu herkömmlichen Mikroskopietechniken (z.B. konfokale Fluoreszenzmikroskopie).
Das bildgebende Verfahren verwendet ein Paar hochreflektierende Spiegel, um einen Lichtstrahl in eine Reihe von parallelen und gegenseitig inkohärenten Lichtblättern bzw. Lichtscheiben zu modifizieren und dann die Lichtblätter bzw. Lichtscheiben auf eine biologische Probe zu richten. Ein Fluoreszenzsignal von der biologischen Probe wird durch die mit entsprechenden Frequenzen zeitlich modulierten Lichtblätter angeregt. Ein Array-Detektor kann die zeitlich modulierten Blätter aufzeichnen, und das aufgezeichnete Signal kann später offline demultiplexiert werden, um die 3D-Signalinformationen der Probe zu analysieren.
Das System nimmt volumetrische Bilder ohne Scannen auf, was es widerstandsfähiger gegen mechanische und umweltbedingte Vibrationen macht. Die nicht scannende volumetrische Bildgebung wird durch zwei Merkmale ermöglicht. Erstens durch ein Paar hochreflektierender Spiegel, die das Licht der Quelle zwischen den Spiegeln mehrfach reflektieren und dann inkohärente Lichtblätter zurückreflektieren. Diese reflektierten inkohärenten Lichtblätter können als von einer Reihe von virtuellen Quellen ausgehend betrachtet werden. Eine biologische Probe kann durch die volumetrischen Lichtblätter beleuchtet werden. Zweitens wird jedes inkohärente Lichtblatt durch einen variablen Frequenz-Chopper zeitlich segmentiert und mit einer entsprechenden Frequenz moduliert. Verschiedene Ebenen der Probe können verschiedenen modulierten Frequenzen entsprechen. Das volumetrische Bild der biologischen Probe (z.B. Blutgefäße im Gewebe, Pflanzenzellen, Zebrafischembryo usw.) kann mit einer zeitlichen Demultiplexing-Einrichtung analysiert werden, die Bilder aus verschiedenen Tiefen der Probe zu einem einzigen Bild kombiniert.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nutzt das hier beschriebene Verfahren die vollständig parallelisierte Fluoreszenzbildgebung in mehreren Ebenen, die sogenannte codierte Lichtblatt-Array-Mikroskopie (CLAM). Sie beruht nicht auf dem weit verbreiteten Konzept der kohärenten Multilichtblatt-Erzeugung und umgeht somit die Notwendigkeit einer komplizierten präzisen Phasensteuerung und mechanischen Strahlabtastung/-dithering. Stattdessen erreicht CLAM eine parallelisierte 3D-Beleuchtung, indem es das Konzept des „Unendlichkeitsspiegels“ nutzt, das auf einem winkelversetzten Spiegelpaar basiert, um ein Lichtblatt-Array zu erzeugen, das sowohl in der Array-Dichte als auch in der Kohärenz rekonfigurierbar ist. Dies gewährleistet die inkohärente Überlagerung des dichten Arrays von Lichtblättern ohne Strahlendithering - was die Abbildung von tiefem und gestreutem Gewebe mit minimalen Beleuchtungsartefakten und Speckle-Rauschen begünstigt.
Hinsichtlich der parallelisierten 3D-Bilderfassung implementiert CLAM eine multiplexierte Bildebenencodierung von Fluoreszenzsignalen. Sie gewährleistet eine optische Schnittführung ohne Scan-Mechanismus und ermöglicht so eine schnelle volumetrische Bildrate. Das 100%ige räumliche Tastverhältnis bei der Detektion impliziert auch eine längere Voxel-Verweildauer. Mit anderen Worten, CLAM erfordert eine weniger intensive Beleuchtung und reduziert so weiter Lichtschäden und Photobleaching ohne Einbußen beim Signal-Rausch-Verhältnis (SNR). Das CLAM-Konzept lässt sich mit minimalen Hardware- oder Softwaremodifikationen (es wird kein komplexer iterativer Bildrekonstruktionsalgorithmus benötigt) leicht an alle bestehenden LSFM-Systeme anpassen.
CLAM könnte sich besonders gut für die langfristige dynamische volumetrische Bildgebung von lebenden Zellen, Gewebe und Organismen sowie für die volumetrische Hochdurchsatz-Visualisierung für die histopathologische 3D-Untersuchung von biologischen Archivproben eignen - beides ist für ein breites Spektrum biologischer Forschung von Bedeutung, insbesondere in den Neurowissenschaften und der Entwicklungsbiologie. Es ist bemerkenswert, dass die Technik auch für die Inspektion einer Großserienherstellung in industriellen Anwendungen zur volumetrischen Qualitätskontrolle bei hohem Durchsatz eingesetzt werden kann, wie z.B. bei Halbleiterbauelementen der Very-Large-Scale-Integration (VLSI).
Im Gegensatz zu den bestehenden Lichtblattbeleuchtungsverfahren umgeht diese Erfindung die Verwendung mechanischer Scan-Optiken zur Beleuchtung der Probe in 3D und bietet somit eine höhere und längerfristige Bildgebungsstabilität. Die parallelisierte Lichtblatt-Array-Beleuchtung ermöglicht auch eine beliebige selektive Ebenenabbildung durch Aktivierung beliebiger Teilmengen von Lichtblättern. Die vorliegende Erfindung implementiert die parallelisierte 3D-Detektion durch multiplexierte Codierung von Fluoreszenzsignalen aus allen Abbildungsebenen. Sie wird durch optische Modulation des Lichtblatt-Arrays mit einer Reihe von vordefinierten Codes realisiert, von denen jeder eindeutig eine jeweilige Bildebene repräsentiert. Diese Erfindung gewährleistet optische Sektionierung ohne jeglichen Abtastmechanismus und ermöglicht somit eine schnelle volumetrische Bildrate, die nur durch die Bildrate der Kamera begrenzt ist. Diese Erfindung maximiert das räumliche Tastverhältnis bei der Detektion und führt somit zu einer längeren Voxel-Verweildauer. Mit anderen Worten, CLAM benötigt eine weniger intensive Beleuchtung und reduziert damit weiter die Lichtschäden und das Photobleaching ohne Einbußen beim Signal-Rausch-Verhältnis (SNR), verglichen mit der verfügbaren Laser-Scanning-Konfokalmikroskopie und LSFM. Diese Erfindung kann mit Wellenfrontcodierung/-formung implementiert werden, um das FOV sowohl in axialer als auch in lateraler Dimension zu vergrößern. CLAM kann auch eine digitale strukturierte Beleuchtung entlang der axialen Richtung durchführen - wodurch die Auflösungsisotropie verbessert wird.
Figurenliste

1A ist ein Blockdiagramm einer Ausführungsform der codierten Lichtblatt-Volumenabbildungsvorrichtung.
1B ist ein Blockdiagramm einer Ausführungsform der codierten Lichtblatt-Volumenabbildungsvorrichtung.
2A ist eine schematische Darstellung einer Ausführungsform des CLAM-Aufbaus.
2B ist eine schematische Darstellung einer Ausführungsform des CLAM-Aufbaus.
2C zeigt gemessene Querprofile (entlang der x-z- und y-z-Ebenen) der Lichtblatt-Arrays (N = 10, 20, 30 & 40). Das entsprechende Intensitätslinien-Scanprofil jedes Falles ist in blau dargestellt.
2D zeigt eine experimentelle Auswertung der Lichtblatt-Array-Erzeugung in CLAM unter Verwendung einer anderen Laserquelle (Zentralwellenlänge gleich 710 nm; Lc ~ 0,5 mm) mit dem Spiegelabstand von S ~ 20 mm).
2E zeigt Bilder einer gestreuten Gelprobe, aufgenommen mit (oben) inkohärenten CLAM-Strahlen (N =40) und (unten) kohärenter Weitfeldbeleuchtung.
3 zeigt Diagramme von Implementierungen von 3D-Multiplexing des Beleuchtungsarrays in der Lichtebene.
3A zeigt einen beispielhaften Arbeitsablauf der Bildrekonstruktion von CLAM auf Basis der Frequenzteilungs-Multiplexcodierung (FDM).
3B ist eine Frequenz-Tiefen-Karte, die die lineare Beziehung zwischen Codierfrequenzen und der Tiefe zeigt (N = 40). Es wird ein minimales Übersprechen zwischen den einzelnen Lichtblättern (Frequenzkanälen) beobachtet (oberer linker Einschub). (Unterer Einschub) Das Schema des sich drehenden Retikels (d. h. Lichtblattcodierer) und die projizierten virtuellen Quellen (grüne Punkte). Die Skalenbalken stellen 50 µm dar.
4 zeigt Bilder und Schritte für eine schnelle volumetrische Bildgebungsvorrichtung. 4(a) zeigt Bilder von Simulationen einer schnellen volumetrischen Bildgebungsvorrichtung mit Punktspreizfunktion (PSF). Die Bilder zeigen verschiedene axiale Tiefen, Zp. 4(b) ist ein Diagramm der Schritte für eine schnelle volumetrische Bildgebungsvorrichtungs-Bilderzeugung mit Frequenz-Demultiplexierung.
5 zeigt volumetrische Bilder von fluoreszierenden Mikrokugeln, die in einem 2%igen Agarosegel bei verschiedenen Beleuchtungstiefen eingebettet sind. 5(a) ist ein volumetrisches Bild von fluoreszierenden Mikrokugeln, eingebettet in ein 2%iges Agarosegel bei einer Beleuchtungstiefe von 30 µm. 5(b) ist ein volumetrisches Bild von fluoreszierenden Mikrokugeln, eingebettet in ein 2%iges Agarosegel bei einer Beleuchtungstiefe von 100 µm. 5(c) ist ein volumetrisches Bild von fluoreszierenden Mikrokugeln, eingebettet in ein 2%iges Agarosegel bei einer Beleuchtungstiefe von 300 µm.
6 ist ein Diagramm zur Veranschaulichung der Verbesserung der axialen Auflösung durch digitale Strukturbeleuchtung.
7 zeigt volumetrische Bilder der fluoreszierenden Polymerkügelchen zu verschiedenen Zeiten. 7(a) zeigt ein volumetrisches Bild der fluoreszierenden Polymerkügelchen, das durch den mikrofluidischen Fluss bei 80 ms erbracht wurde. 7(b) zeigt ein volumetrisches Bild der fluoreszierenden Polymerkügelchen bei 680 ms. 7(c) zeigt ein volumetrisches Bild der fluoreszierenden Polymerkügelchen bei 1,36 s. 7(d) zeigt ein volumetrisches Bild der fluoreszierenden Polymerkügelchen bei 1,92 s.
8 zeigt volumetrische Bilder der verschiedenen Gefäßnetzwerke. 8(a) ist ein volumetrisches Bild der Netzwerkstruktur der Blutgefäße in einem Mausdarm. 8(b) zeigt Glomeruli, die an das Blutgefäßnetzwerk im optisch transparenten Nierengewebe der Maus angeschlossen sind.
9 zeigt die Einzel-Objektivlinsen-Konfiguration von CLAM. Die gleiche Objektivlinse erzeugt eine schräge Lichtblatt-Array-Beleuchtung und sammelt die Fluoreszenzsignale.
10 zeigt Implementierungen der Erfindung mit Wellenfrontcodierung/-formung, um das FOV sowohl in axialer als auch in lateraler Dimension zu manipulieren.
11 zeigt „Lichtblatt-Array-Tiling“ unter Verwendung eines räumlichen Lichtmodulators (SLM) zur Erweiterung des FOV. (Links) Eine schematische Darstellung des Aufbaus. Der SLM, der sich in der Fourier-Ebene des Bildorts befindet, erlegt dem Lichtstrahl nach dem FACED-Spiegelpaar eine binäre Linsenphasenkarte auf. (Rechts) Die Profile der Lichtblattanordnung (unten) mit und (oben) ohne die auf den SLM aufgebrachte Linsenphase. Skalenbalken: 50 µm.
12 zeigt ein Systemlayout von CLAM. M, Spiegel, f, Linsen, L, Linse, PBS, polarisierende Strahlteiler, λ/2 Halbwellenplatte, λ/4, Viertelwellenplatte, (CL1 und CL2), Zylinderlinsen, (T1, T2 und T3) Teleskope. (O1 und O2), Objektivlinsen, LP, Langpassfilter. Doppelpfeil (Punkt) im Kreis zeigt horizontale (vertikale) Polarisation. Die mit roten Sternchen gekennzeichneten Positionen sind konjugierte Ebenen der virtuellen Quellen.
13 zeigt eine Ausführungsform einer Bildrekonstruktion.
14 zeigt die volumetrische CLAM-Bildgebung von fluoreszierenden Mikrokügelchen, die in stark streuendes Agarosegel eingebettet sind.
15 zeigt die CLAM-Bildgebung von in der Mikropipette fließenden Mikropartikeln mit einer volumetrischen Bildrate von 13,2 vol/s (Volumen: 170 × 25 × 28 µm³).
16 zeigt die volumetrische Bildgebung von optisch gereinigtem Mausgewebe mit CLAM.

DETAILLIERTE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die folgende Offenbarung und die beispielhaften Ausführungsformen werden vorgestellt, um es einem Fachmann zu ermöglichen, eine schnelle volumetrische Bildgebungsvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung herzustellen und zu verwenden. Verschiedene Modifikationen der Ausführungsformen werden für den Fachmann leicht ersichtlich sein, und die allgemeinen Prinzipien hierin können auf andere Ausführungsformen angewendet werden. Daher sollen die Vorrichtungen und Verfahren im Zusammenhang mit der schnellen volumetrischen Bildgebungsvorrichtung nicht auf die gezeigten Ausführungsformen beschränkt sein, sondern es soll ihnen der größtmögliche Anwendungsbereich eingeräumt werden, der mit den hier beschriebenen Prinzipien und Merkmalen vereinbar ist.
1A zeigt ein Blockdiagramm einer Ausführungsform des codierten Lichtblatt-Array-Volumenabbildungssystems 100. Die Lichtquelle 110 kann ein Dauerstrichlaser oder ein Impulswellenlaser sein. Der von der Lichtquelle 110 erzeugte Lichtstrahl kann leistungsgesteuert werden, und ein Strahlaufweiter 120 kann den Strahl auf eine geeignete Größe aufweiten oder reduzieren. Der kollimierte Strahl kann dann entlang einer horizontalen Richtung durch eine Zylinderlinse (nicht gezeigt) in ein mit Versatz angeordnetes Spiegelpaar 130 fokussiert werden. Der Strahl kann dann mehrfach zwischen dem Spiegelpaar 130 reflektiert werden, und dann können Lichtblätter bzw. Lichtscheiben zu einem Eingangsort (nicht gezeigt) zurückreflektiert werden, wo eine Viertelwellenplatte und ein polarisierter Strahlteiler die zurückreflektierten Blätter in die nachgeschaltete Optik einkoppelt. Die zurückreflektierten Blätter vom Spiegelpaar 130 können so behandelt werden, als kämen sie aus einer Reihe von virtuellen Quellen. Die Lichtblätter bzw. Lichtscheiben können durch die Relaisoptik 140 zu einem Codierer 150 übertragen werden. Der Codierer 150 umfasst unter anderem einen Frequenzmodulator, der das Array inkohärenter Lichtblätter segmentiert und jedes Lichtblatt mit einer entsprechenden Frequenz codiert, oder einen zeitlichen Modulator, der das Array inkohärenter Lichtblätter durch eine beliebige orthogonale Codierungsbasis einschließlich einer Hadamard-Basis oder einer Zufallsmaske segmentiert. In einer Ausführungsform umfasst der Frequenzmodulator unter anderem einen Strahlencodierer, der in Form eines sich bewegenden oder rotierenden räumlichen Lichtmodulators (z.B. eines Frequenzmodulationsretikels) vorliegt, oder eine statische, räumlich gemusterte Maskenbeleuchtung durch einen scannenden Lichtstrahl. Die Lichtblätter können durch den Codierer 150 zerlegt und mit verschiedenen Frequenzen oder einer Grundschwingung codiert werden. Die codierten Blätter können dann durch die Relaisoptik 140 übertragen und von einem Beleuchtungsobjektiv 160 auf die biologische oder nicht-biologische Probe 170 fokussiert werden. Das Detektionsobjektiv 180 ist orthogonal in Bezug auf das Beleuchtungsobjektiv (nicht gezeigt) angeordnet. Eine Tubuslinse im Detektionsobjektiv 180 kann dann das Fluoreszenzsignal von der Probe 170 an eine Hochgeschwindigkeitskamera übertragen (einschließlich, aber nicht beschränkt auf einen 2D-Bildsensor oder eine Kamera 190 wie eine sCMOS-Kamera oder eine EMCCD-Kamera.
Die parallelisierte diskrete Lichtblatt-Array-Beleuchtung bietet auch einen weiteren Freiheitsgrad, um beliebige Teilmengen von Lichtblättern auszuwählen. Man könnte diese benutzerdefinierte selektive Ebenenbeleuchtung durch eine vordefinierte Maske in der Relaisoptik 140 realisieren(z.B. eine statische, räumlich gemusterte Maskenbeleuchtung durch einen scannenden Lichtstrahl oder eine aktiv steuerbare Maske unter Verwendung eines räumlichen Lichtmodulators).
1B ist ein Blockdiagramm einer weiteren Ausführungsform der mit codiertem Lichtblatt arbeitenden volumetrischen Bildgebungsvorrichtung. CLAM ist eine volumetrische Bildgebungstechnik, die eine vollständige parallelisierte 3D-Bildgebung ohne mechanische Abtastung ermöglicht. Zunächst wird eine parallelisierte 3D-Beleuchtung erreicht, indem das Konzept des „Unendlichkeitsspiegels“ basierend auf einem winkelversetzten Spiegelpaar genutzt wird, um ein Lichtblatt-Array zu erzeugen, das sowohl in der Array-Dichte als auch in der Kohärenz rekonfigurierbar ist. Hinsichtlich der parallelisierten 3D-Bilddetektion implementiert CLAM eine multiplexierte Bildebenencodierung (unter Verwendung eines Lichtblattcodierers), die eine optische Sektionierung ohne jeglichen Scan-Mechanismus gewährleistet und somit eine schnelle volumetrische Bildrate ermöglicht.
Die Erfinder machen sich diese einzigartige Eigenschaft zunutze, die den gepulsten Laserstrahl in einen ultraschnellen Linienabtaststrahl umwandelt, indem sie ein nahezu paralleles Spiegelpaar verwenden, um entweder ein gepulstes oder ein Dauerstrich-(CW)-Lichtblatt-Array zu erzeugen, bei dem die Dichte und Kohärenz der Lichtblätter durch Abstimmung der Spiegelpaar-Geometrie (z.B. Spiegelabstand S, Spiegellänge L und Versatzwinkel α) flexibel rekonfiguriert werden kann, wie in 2B gezeigt.
Wie in 1B gezeigt, passiert ein Eingangslicht zunächst den räumlichen Strahlformer 121, der jede Art von diffraktiver optischer Komponente (z.B. Beugungsgitter, räumliche Lichtmodulatoren) oder Mikrolinsenarrays oder jede Art von strahlablenkendem Element, wie z.B. eine Linse, sein kann, obwohl Ausführungsformen nicht darauf beschränkt sind. Der Eingang kann z.B. direkt von einer Lichtquelle 111 aus dem freien Raum kommen oder von Lichtleitern, wie z.B. optischen Fasern, eingekoppelt werden, wobei Ausführungsformen nicht hierauf beschränkt sind. Der geformte Lichtstrahl nach dem räumlichen Strahlformer wird durch eine Strahlkonvergenzoptik 122 mit einem Kegelwinkel (ΔΘ) linienfokussiert (d. h. eindimensional konvergiert) und tritt in ein Paar nahezu paralleler, hochreflektierender Spiegel 131 am Eingang O ein. Der Strahl wird dann in eine Sammlung von N Teilstrahlen (N = ΔΘ/α)) aufgeteilt, von denen jeder einem einzigartigen räumlich gechirpten Zick-Zack-Pfad zwischen zwei Spiegeln folgt. Basierend auf der Strahlverfolgung werden diese N diskreten Lichtpfade, die Kardinalmoden genannt werden, entlang der identischen Pfade zum Eingang O zurückreflektiert (z.B. der rote Pfad 220 in Kasten b in 2B). Andererseits können die von einem beliebigen kardinalen Strahl abweichenden Lichtpfade (z.B. der blaue Pfad 230 in Block b in 2B) immer noch zurückgeführt werden, haben aber eine winzige seitliche Verschiebung gegenüber dem kardinalen Strahl am Eingang O. In der Tat gibt es für den k-ten zurückkehrenden kardinalen Strahl einen begleitenden „Lichtfächer“, als ob er aus einer virtuellen Quelle mit einer sehr kleinen numerischen Apertur (<<0,1), die sich bei O_k befindet, austreten würde (Kasten b in 2B). Infolgedessen werden alle einfallenden Strahlen innerhalb des einfallenden fokussierenden Lichtkegels, der in das Spiegelpaar eintritt, zurückreflektiert und in ein Array aus N diskreten Teilstrahlen umgewandelt, in Analogie zu Strahlen, die aus einem Array aus N virtuellen Quellen austreten (Kasten b in 2B). Der einzige optische Verlust ist auf den Reflexionsgrad des Spiegels zurückzuführen, der bis zu > 99 % beträgt.
Die Lichtblätter können von der Relaisoptik 140 in Richtung zu einem Lichtblattcodierer 150 erzeugt werden. Der Codierer 150 umfasst unter anderem einen Frequenzmodulator, der das Array inkohärenter Lichtblätter segmentiert und jedes Lichtblatt mit einer entsprechenden Frequenz codiert, oder einen zeitlichen Modulator, der das Array inkohärenter Lichtblätter durch eine beliebige orthogonale Codierungsbasis einschließlich einer Hadamard-Basis oder einer Zufallsmaske segmentiert. In einer Ausführungsform umfasst der Frequenzmodulator unter anderem einen Strahlencodierer, der in Form eines sich bewegenden oder rotierenden räumlichen Lichtmodulators (z.B. eines Frequenzmodulationsretikels) vorliegt, oder eine statische, räumlich gemusterte Maskenbeleuchtung durch einen scannenden Lichtstrahl. Die Lichtblätter können durch den Lichtblattcodierer 150 zerlegt und mit verschiedenen Frequenzen oder einer Grundschwingung codiert werden. Die codierten Blätter können dann durch die Relaisoptik 140 übertragen werden, die die Teilmenge der Lichtblätter zu den abgebildeten Proben weiterleiten und auswählen kann. Die Blätter können weiter durch ein Wellenfrontformungsmodul 145 übertragen werden, das die Abbildungsleistung in Bezug auf die Auflösung und das Abbildungssichtfeld erhöht. Die Lichtblätter werden dann durch ein Beleuchtungsobjektiv 160 auf die biologische oder nicht-biologische Probe 170 fokussiert. Das Detektionsobjektiv 180 ist orthogonal zum Beleuchtungsobjektiv (nicht gezeigt) angeordnet. Das detektierte Licht kann durch ein PSF-(Point-Spread-Function)-Engineering-Modul 185 modifiziert werden, wodurch die Schärfentiefe der Abbildung verbessert werden kann. Eine Tubuslinse im Detektionsobjektiv 180 kann dann das Fluoreszenzsignal von der Probe 170 an einen Hochgeschwindigkeits-2D-Bildsensor oder eine Kamera 190 (einschließlich, aber nicht beschränkt auf eine sCMOS-Kamera oder eine EMCCD-Kamera) übertragen.
2A ist ein Diagramm zur Veranschaulichung der Funktionsweise der volumetrischen Lichtmikroskopie in einer Ausführungsform der Erfindung. In 2A, (a) ist ein Diagramm der codierten Lichtblatt-Volumenabbildungsvorrichtung; (b) ist ein Bild des Strahls in der Nähe der gemeinsamen Fokusebene (CFP); (c) ist ein Diagramm einer Draufsicht auf die optischen Linsen der Vorrichtung; und (d) ist ein Diagramm einer Seitenansicht der optischen Linsen der Vorrichtung.
Ein kollimierter Strahl wird durch eine Zylinderlinse CL entlang einer horizontalen Richtung fokussiert, um einen 1D-Lichtkegel zu bilden. Der Lichtkegel durchläuft einen polarisierenden Strahlteiler PBS und eine Viertelwellenplatte λ/4, bevor er durch das versetzte Parallelspiegelpaar 210 geteilt wird. Der zurückreflektierte Strahl durchläuft die Viertelwellenplatte λ/4 und wird vertikal polarisiert. Eine Linse L fokussiert den modulierten Strahl weiter und erzeugt ein lineares virtuelles Quellen-Array in der Nähe der gemeinsamen Brennebene CFP.
Die resultierenden Strahlen werden von einem kundenspezifischen Lichtblattcodierer 150 so zerlegt, dass jeder dieser Strahlen mit einer entsprechenden Modulationsfrequenz oder einer Grundbasis für jede virtuelle Quelle codiert wird. Der Lichtblattcodierer 150 umfasst unter anderem einen Frequenzmodulator, der das Array inkohärenter Lichtblätter segmentiert und jedes Lichtblatt mit einer entsprechenden Frequenz codiert, oder einen zeitlichen Modulator, der das Array inkohärenter Lichtblätter durch eine beliebige orthogonale Codierungsbasis einschließlich einer Hadamard-Basis oder einer Zufallsmaske segmentiert. In einer Ausführungsform umfasst der Frequenzmodulator unter anderem einen Strahlencodierer, der in Form eines sich bewegenden oder rotierenden räumlichen Lichtmodulators (z.B. eines frequenzmodulierten Retikels) vorliegt, oder eine statische, räumlich gemusterte Maskenbeleuchtung durch einen scannenden Lichtstrahl. Die frequenzmodulierten Strahlen werden dann von einem Mikroskopiesystem und einer Zylinderlinse CL weitergeleitet (siehe z.B. 2(c) und 2(d)). Jede virtuelle Quelle bildet ein planares Beleuchtungslichtblatt auf einer Ebene der biologischen Probe. Ein Detektionsmikroskopie-Objektiv ist orthogonal zu einem Beleuchtungsobjektiv und damit orthogonal zu jedem Beleuchtungslichtblatt montiert. Daher kann jeder beleuchtete Bereich der biologischen Probe gleichzeitig von einem schnellen Array-Detektor erfasst werden.
Im Allgemeinen können sich der Detektions- und der Beleuchtungspfad dasselbe Objektiv teilen, und die Anregungslichtblätter können in einem solchen Winkel in das Objektiv eintreten, dass der Emissionspfad noch orthogonal zu den Beleuchtungslichtblättern sein kann. Diese duale Objektivlinsen-Konfiguration ist mit dem Funktionsprinzip einer schnellen volumetrischen Bildgebungsvorrichtung kompatibel. Diese Konfiguration entkoppelt auch den Anregungspfad vom Detektionspfad und bietet so zusätzliche Freiheitsgrade zur Manipulation der Bildqualität.
2B ist ein Diagramm, das veranschaulicht, wie die volumetrische Lichtmikroskopie in einer anderen Ausführungsform der Erfindung funktioniert. Kasten a zeigt eine allgemeine schematische Darstellung des CLAM-Aufbaus. Kasten b zeigt die virtuelle Quellenerzeugung (O_k): Innerhalb des k-ten Strahlenbündels, das zwischen dem winkelversetzten Spiegelpaar hin und her geworfen wird, werden alle Lichtstrahlen 2k Reflexionen unterzogen, mit leicht unterschiedlichen Trajektorien nach dem Eingang O (z.B. rote gegenüber blauen Strahlen. Durchgezogene blaue Linie: Vorwärtspfad; gepunktete Linie: Rückwärtspfad). Kasten c zeigt das codierte Lichtblatt-Array, das eine parallelisierte Beleuchtung bereitstellt. Die Fluoreszenzsignale aus verschiedenen Tiefen entlang der z-Richtung werden mit eindeutigen zeitlichen Codes versehen, die vom Lichtblattcodierer erzeugt werden.
Die virtuellen Quellen werden durch ein Relais-Linsenmodul projiziert, um ein Array aus N Lichtblättern zu bilden (Kästen a, c in 2B). Dies ermöglicht eine parallelisierte 3D-Beleuchtung, die die Notwendigkeit der Strahl- oder Objektivabtastung beseitigt und somit eine dedizierte Synchronisation umgeht. Der Erfinder merkt an, dass die Anzahl der Lichtblätter (virtuelle Quellen) N, die von dem Spiegelpaar unterstützt werden, flexibel durch die Spiegelgeometrie (z.B. S, α, L) eingestellt werden kann, wie in 2C zu sehen ist. Die Anzahl der Lichtblätter wurde entsprechend der Abbildungsspezifikationen (z.B. Auflösung, FOV sowie das Photonenbudget) gewählt; insbesondere wurde N so gewählt, dass es im Experiment über 100 Lichtblättern liegt. Um die Gleichmäßigkeit der Intensität zu gewährleisten, werden die M Kardinalmoden höchster Ordnung (M << N) als CLAM-Beleuchtung ausgewählt.
2C zeigt gemessene Querprofile (entlang der x-z- und y-z-Ebene) der Lichtblatt-Arrays (N = 10, 20, 30 & 40). Das entsprechende Intensitätslinien-Scanprofil jedes Falles ist in blau dargestellt.
Die parallelisierte diskrete Lichtblatt-Arraybeleuchtung bietet zudem einen weiteren Freiheitsgrad, um beliebige Teilmengen von Lichtblättern frei auszuwählen. Man könnte diese benutzerdefinierte selektive Ebenenbeleuchtung durch eine vordefinierte Maske implementieren (z.B. eine statische, räumlich gemusterte Maskenbeleuchtung durch einen scannenden Lichtstrahl oder eine aktiv steuerbare Maske mithilfe eines räumlichen Lichtmodulators). Dies könnte insbesondere bei der spärlichen Abtastung der Aufzeichnung neuronaler Aktivität in bildgebenden Anwendungen des Gehirns von Interesse sein.
Darüber hinaus kann der Grad der Kohärenz zwischen den Lichtblättern flexibel eingestellt werden. Während jedes Lichtblatt selbst kohärent bleibt, kann die Inkohärenz zwischen den Lichtblättern im Array dadurch erreicht werden, dass der Spiegelabstand (S) so abgestimmt wird, dass die Pfadlängendifferenz (D) zwischen den virtuellen Quellen (d. h. D = 2S) größer ist als die Kohärenzlänge der Laserquelle L_c. Die bisherigen Arbeiten des Erfinders haben gezeigt, dass der Pfadlängenabstand (zeitliche Verzögerung) zwischen benachbarten virtuellen Quellen über mehrere Größenordnungen, d. h. Millimeter (Pikosekunden) bis Meter (Nanosekunden), rekonfiguriert werden kann. Eine solche steuerbare Inkohärenz minimiert Bildartefakte und Speckle-Erzeugung, insbesondere in gestreutem Medium.
2D zeigt eine experimentelle Auswertung der Lichtblatt-Array-Erzeugung in CLAM unter Verwendung einer anderen Laserquelle (Zentralwellenlänge gleich 710 nm; L_c ~ 0,5 mm) mit dem Spiegelabstand von S ~ 20 mm). (a) Die Lichtblatt-Array-Profile an verschiedenen Positionen entlang der Ausbreitungsachse (x-Achse) nach der Objektivlinse O1. (b) Die Änderungen der Lichtblatt-Array-Profile, wenn der versetzte Spiegelwinkel reduziert wird (von links nach rechts). Das untere Feld zeigt die in (a) und (b) angegebenen Intensitätslinienprofile (gelbe Linien). Der Maßstabsbalken repräsentiert 100 µm für (a) und (b).
In einer Ausführungsform werden eine Laserquelle (Zentralwellenlänge gleich 710 nm; L_c ~ 0,5 mm) und ein Spiegelpaarabstand von S ~ 20 mm verwendet. Diese Konfiguration zeigt ein gleichmäßiges Intensitätsprofil über das gesamte Lichtblatt-Array, wie in (a), 2D zu sehen ist. Die Dicke der einzelnen Blätter bleibt im Allgemeinen innerhalb des durch das Beleuchtungsobjektiv definierten Rayleigh-Bereichs erhalten, wie in (a), 2D zu sehen ist. Noch wichtiger ist, dass die Dichte des Lichtblatt-Arrays durch Einstellen des Spiegelversatzwinkels neu konfiguriert werden kann, wie in (b), 2D, zu sehen ist. Es ist zu beachten, dass die inkohärente Überlagerung der Lichtblätter sich deutlich als glattes Beleuchtungsprofil manifestiert, wenn die Dichte der Lichtblätter so hoch ist, dass einzelne Lichtblätter nicht mehr zu unterscheiden sind (siehe das Profil (b) ganz rechts in 2D). Dies ist konsistent mit der Tatsache, dass der virtuelle Quellenabstand (S ~ 20 mm) größer ist als die gemessene Kohärenzlänge der Lichtquelle (L_c ~ 0,5 mm, gemessen aus dem Laserspektrum).
In einer weiteren Ausführungsform wurde die Inkohärenz in der Konfiguration (L_c ~ 4,2 mm und S N50 mm) weiter validiert, die eine specklefreie Lichtblatt-Array-Beleuchtungsverteilung durch ein gestreutes Gelmedium zeigt. Dies steht in deutlichem Gegensatz zu dem Fall einer breitflächigen kohärenten Beleuchtung desselben Bereichs, die von einem einzelnen kohärenten Gauß-Laserstrahl aufgeweitet wird, was zu den stark gesprenkelten Mustern führt, wie in 2E gezeigt.
Im Gegensatz zu konventionellen LSFM-Vorrichtungen entfällt bei der schnellen volumetrischen Bildgebungsvorrichtung die Notwendigkeit von Strahl, Objektiv und Probenabtastung, und die physikalische Belastung der Proben/des Systems wird reduziert. 5 zeigt volumetrische Bilder eines gewebeähnlichen Phantoms aus Polystyrolkugeln mit einem Durchmesser von 1 µm , die mit einem Nilrot-Fluorophor beschichtet und in ein 2%iges Agarosegel mit TiO₂-Nanopartikeln eingebettet sind. Die TiO₂-Nanopartikel weisen eine Konzentration von 1,2 mg/ml auf, um den Streueffekt menschlichen Brustgewebes zu imitieren. 5(a) zeigt ein volumetrisches Bild, wenn der Beleuchtungsstrahl auf eine Eindringtiefe von 30 µm eingestellt ist. 5(b) zeigt ein volumetrisches Bild, wenn der Beleuchtungsstrahl auf eine Eindringtiefe von 100 µm eingestellt ist. 5(c) zeigt ein volumetrisches Bild, wenn der Beleuchtungsstrahl auf eine Eindringtiefe von 300 µm eingestellt ist. Die schnelle volumetrische Bildgebungsvorrichtung kann die fluoreszierenden Kügelchen bei einer Eindringtiefe von bis zu 200 µm abbilden. Wie in 5(c) zu sehen ist, sind die fluoreszierenden Kügelchen bei einer Eindringtiefe von 300 µm sichtbar, allerdings mit einer Abnahme des Signal-Rausch-Verhältnisses.
Die schnelle volumetrische Bildgebungsvorrichtung implementiert ein Paar hochreflektierende Spiegel (R>99 %), um gegenseitig inkohärente virtuelle Quellen zu schaffen, von denen jede ein Lichtblatt erzeugt. Die erzeugten Lichtstrahlen eines Lichtblatts sind untereinander inkohärent. Die gegenseitige Inkohärenz ermöglicht es, kleinste Strukturen abzubilden, auch wenn die Strukturen in Gewebe eingebettet sind, die starke Streueffekte induzieren; und das bei minimalem Übersprechen zwischen den Lichtstrahlen. Die beiden reflektierenden Spiegel teilen den Strahl in eine Reihe von virtuellen Quellen auf, die dann in ein Lichtblatt-Array umgewandelt werden. Im Gegensatz zu herkömmlichen Lichtblatt-Mikroskopie-Vorrichtungen benötigt diese Vorrichtung keine Abtastoptik zur Beleuchtung der biologischen Probe in 3D und bietet somit eine höhere und längerfristige mechanische Stabilität.
Die schnelle volumetrische Bildgebungsvorrichtung moduliert zeitlich jedes Lichtblatt, um jedes Blatt mit einer entsprechenden Frequenz zu codieren. Eine Reihe von Relaisoptiken wird verwendet, um die Lichtblätter mit einer kundenspezifischen Modulationsmaske zu verknüpfen, die eine Reihe von Modulationsfrequenzen bereitstellt. Dieser Prozess codiert jedes Lichtblatt mit einer entsprechenden modulierten Frequenz.
Das Fluoreszenzsignal der biologischen Probe kann offline demultiplexiert werden. Das Fluoreszenzsignal kann flexibel durch ein Zeitmultiplexing-, ein Frequenzmultiplexing-Schema, eine Zufallsbasis oder ein Hadamard-Transformationsschema manipuliert werden, um eine Hochgeschwindigkeits-Bildaufnahme zu ermöglichen. Diese Eigenschaft wird einzigartig durch die zeitliche Modulation genutzt, die in bestehenden kommerziellen Frequenz-Chopper-Systemen nicht zu finden ist.
Ein weiteres Merkmal der schnellen volumetrischen Bildgebungsvorrichtung ist das 3D-Multiplexing, das entweder auf FDM oder CDM basiert, wie in 3 dargestellt. Im Allgemeinen wird die k-te 2D-Bildebene Ik(x,y) über den 3D-Stapel (z-Richtung) zeitlich mit einem eindeutigen Code m_k(t) moduliert. Ein 2D-Bildsensor wird verwendet, um alle 2D-Ebenen gleichzeitig zu erfassen. Mathematisch können die erfassten 2D-Rohdaten wie folgt ausgedrückt werden: I(x,y,t) = ΣI_k(x,y) × m_k(t). Die Summe summiert sich über alle k. Bei einem FDM-basierten Verfahren ist der Code eine sinusförmige Modulation (z.B. m_k(t) = cos(2πf_kt), wobei f_k die der k-ten Ebene zugeordnete Modulationsfrequenz ist). Die frequenzcodierten Ebenen können mit einer Kurzzeit-Fourier-Transformation (STFT) demultiplexiert werden. Das gesamte 3D FOV I(x,y,z) kann dann rekonstruiert werden. Die maximale Modulationsfrequenz f_max wird durch die 2D-Bildrate f_cam der Kamera begrenzt, genauer gesagt durch die Beziehung fmax ≤ f_cam/2, gemäß dem Nyquist-Abtastkriterium. Bei FDM ist die Anzahl der auflösbaren optischen Schnittebenen N durch die Anzahl der auflösbaren Frequenzen begrenzt und sollte N ≥ 2M = f_cam/f_3D sein, wobei f_3D die 3D-Bildrate ist. Wenn N in einem Bereich von 100-120 auflösbaren Ebenen liegt, kann mit einer schnellen sCMOS-Kamera (f_cam = 2400 Hz) eine schnelle 3D-Bildrate von f_3D = 12 - 20 Hz erreicht werden. Die 3D-Abbildungsraten der schnellen volumetrischen Bildgebungsvorrichtung steigen mit den kontinuierlichen Fortschritten in der sCMOS-Kameratechnologie. Man beachte, dass die Codierungsart von Haus aus eine optische Schnittführung über einen 3D-Stapel bietet. Aufgrund des 3D-Multiplexing kann die schnelle volumetrische Bildgebungsvorrichtung im Vergleich zur Punktabtastungs-Mikroskopie oder LSFM-Techniken das Photobleaching und/oder die Phototoxizität minimieren.
Für CDM können die Codes m_k(t), die jeder 2D-Ebene zugeordnet sind, Walsh-Hadamard-Codes (WH-Codes) sein (oder fehlerkorrigierende orthogonale Codes oder Pseudo-Zufallsrauschen-(PN)-Sequenzen, die deterministische binäre Sequenzen sind, die wie Zufallsrauschen aussehen). Multiplexing, das auf beiden Arten von Codes basiert (d. h. Spreizspektrummodulation), ist resistent gegen Rauschen und günstig für hohe Signaltreue in einem Kommunikationssystem.
Die schnelle volumetrische Bildgebungsvorrichtung kann auch für die volumetrische 3D-Fluoreszenz-Lichtblattbildgebung zur Inspektion in biomedizinischen und klinischen Anwendungen (z.B. Entwicklungsbiologie, Zellbiologie, Inspektion von Großserienfertigungen, industrielle Anwendungen für die volumetrische Qualitätskontrolle mit hohem Durchsatz und VLSI-Halbleiterbauelemente (very-large scale integration)) verwendet werden.
Eine herkömmliche konfokale Mikroskopievorrichtung beleuchtet eine biologische Probe mit einem fokussierten Strahl mit einer Leistungsdichte in der Größenordnung von einigen zehn MW/cm². Die schnelle volumetrische Bildgebungsvorrichtung hat eine Leistungsdichte, die etwa 6 Größenordnungen kleiner ist als die einer herkömmlichen Vorrichtung. Die verringerte Leistungsdichte reduziert das Photobleaching und die Zytotoxizität, die mit den exogenen Fluoreszenzmarkern verbunden sind, und verringert Lichtschäden an einer biologischen Probe. Herkömmliche Mikroskopietechniken (z.B. Weitfeld- und konfokale Technik) bringen auch mehr Strahlung in die biologische Probe ein als die schnelle volumetrische Bildgebungsvorrichtung. Die Vorrichtung erzeugt weniger Strahlung, indem sie nur die Bildgebungsebene auf der biologischen Probe beleuchtet, was die Lichtschäden und die Phototoxizität minimiert.
Die schnelle volumetrische Bildgebungsvorrichtung kann aufgrund der variablen Frequenzmodulation jedes Lichtblattes eine schnelle volumetrische Bildgebung ohne Abtasten der Lichtblätter realisieren. Die zeitliche Modulation des volumetrischen Fluoreszenzsignals ermöglicht die Demultiplexierung des Signals im Frequenzbereich. Die virtuellen Lichtquellen können auf einen variablen Frequenzmodulator abgebildet werden, der von einem Lock-in-Antrieb gesteuert wird. Die zeitlich modulierten Lichtstrahlen können dann unter einem Mikroskopobjektiv in einzelne Lichtblätter umgewandelt werden, um das biologische Präparat zu beleuchten.
Die parallelisierte volumetrische Detektion in CLAM wird durch die multiplexierte Lichtblattcodierung erreicht. Dies kann durch eine Intensitätsmodulation des auf eine räumliche Modulationsmaske projizierten Lichtblatt-Arrays erfolgen, bei der es sich um ein rotierendes, gemustertes Retikel/Maske oder eine statische, gemusterte Maske mit einem Abtaststrahl; oder um eine aktiv rekonfigurierbare, gemusterte Maske, z.B. einen räumlichen Lichtmodulator (SLM) mit einem Abtastlinienstrahl handeln kann, wie in 3 zu sehen. 3 (a) zeigt, dass der Laser mit einem rotierenden Retikel moduliert wird, das in der gemeinsamen Brennebene eines 4f-Systems positioniert ist, das aus zwei Zylinderlinsen besteht. 3(b) zeigt, dass der Laser durch Scannen des fokussierten 1D-Strahls über die statische Reflexionsmaske hinweg (d. h. Flüssigkristall-SLM oder digitale Mikrospiegelvorrichtungen (DMD)) moduliert wird. Beide Ansätze können den Strahl mit verschiedenen Codes (z.B. modulierende Frequenzen bei FDM oder PN/WH-Code bei CDM) entlang einer Dimension (x-Richtung) codieren, die später auf verschiedene Lichtebenen/Lichtblätter im 3D-Stapel des Beleuchtungsarrays abgebildet werden.
Dementsprechend wird das Fluoreszenzsignal des k-ten Abschnitts I_em(x,y,z-z₀k) mit einem eindeutigen zeitlichen Code m_k(t) intensitätsmoduliert (Kasten c in 2B), wobei z₀ der Abstand der benachbarten Lichtblätter ist. Das orthogonale Detektionsobjektiv sammelte die multiplexierte Fluoreszenzemission, die auf einem 2D-Bildsensor registriert wird. Die von der Kamera aufgenommenen 2D-Rohdaten können wie folgt dargestellt werden: $I_{c a m} (x, y, t) = \sum_{k = n}^{N - 1} m_{k} (t) \cdot \int_{- \infty}^{+ \infty} I_{e m, k} (x, y, z - z_{0} k) d z$
Das Bild, mit minimalem Übersprechen zwischen den Ebenen, kann getreu wiederhergestellt werden, wenn die Orthogonalität der Codes erfüllt ist. Die Codierung kann im Frequenzmultiplexverfahren (FDM) und im Codemultiplexverfahren (CDM) erfolgen, ist aber nicht darauf beschränkt. Bei FDM wird das Signal mit einer eindeutigen Trägerfrequenz codiert, bei CDM hingegen mit einer pseudozufälligen Codefolge. Bei CDM kann der Code m_k(t), der jeder 2D-Ebene zugeordnet ist, der Walsh-Hadamard-Code (WH) sein, der ein fehlerkorrigierender orthogonaler Code ist, oder die Pseudo-Zufallsrauschen-Sequenz (PN), die eine deterministische binäre Sequenz ist, die wie ein Zufallsrauschen aussieht.
Inspiriert durch das orthogonale Frequenzmultiplexing (OFDM) in drahtlosen Kommunikationsnetzen kann eine Ausführungsform die Lichtblätter mit m_k(t)=cos(ω_kt) modulieren, wobei ω_k die tiefenabhängige Modulationsfrequenz des k-ten Lichtblatts ist. Die Frequenzträger erfüllen die Orthogonalitätseigenschaft über eine Periode T, d. h., < m_i(t), m_j(t)>= δ_ij, wobei δ_ij eine Deltafunktion ist und <*> sich auf das innere Produkt bezieht. Daher werden 2D-Schnitte in verschiedenen Tiefen mit unterscheidbaren Modulationsfrequenzen versehen und in eine einzelne 2D-Bildsequenz multiplexiert, die auf dem Bildsensor registriert wird (3A). Durch Anwendung der Kurzzeit-Fourier-Transformation auf die 2D-Bildsequenz I_cam(x,y,t) $| {\tilde{I}}_{c a m} (x, y, ω) \propto \sum_{k = 0}^{N - 1} (ω - ω_{k}) \cdot I_{e m, k} (x, y)$
wobei $\bar{| {\tilde{I}}_{c a m} (x, y, ω)}$
die zeitlichen Fourier-Transformationen von I_cam(x,y,t) bezeichnet. Im Gegensatz zu den bestehenden frequenzmultiplexierten Bildgebungsansätzen werden bei CLAM 2D-Bildstapel multiplexiert, um eine parallelisierte 3D-Bildgebung durch frequenzgechirpte Intensitätsmodulation über das Lichtblatt-Array hinweg zu ermöglichen.
3B veranschaulicht die Schritte der Bild-Multiplexierung und -Demultiplexierung, und das volumetrische Bild eines sich verzweigenden Blutgefäßes könnte aus der demultiplexierten Bildsequenz gerendert werden.
Das Designprinzip des Retikel-Musters wird im Allgemeinen von zwei Schlüsselspezifikationen geleitet, die die CLAM-Leistung entscheidend bestimmen. Erstens definiert der Modulationsfrequenzabstand zwischen benachbarten Lichtblättern (Δf) die volumetrische Abbildungsrate (f_vol), d. h. f_vol = Δf. Um die beste erreichbare axiale Auflösung zu gewährleisten, sollte Δf außerdem so gewählt werden, dass der zugehörige räumliche Abstand zwischen den codierten Frequenzkanälen (d. h. Δd=βΔf , wobei β der kalibrierte Konversionsfaktor zwischen Tiefe und Frequenz ist) gleich oder kleiner als die Dicke jedes Lichtblatts (w_LS) gehalten wird, d. h. Δd<w_LS. Zweitens bestimmt der gesamte Modulationsfrequenzbereich (BW), der für die Codierung aller Lichtblätter zulässig ist, die Anzahl der Lichtblätter (d. h. N), was sowohl durch das Nyquist-Abtastkriterium als auch durch die Kamerabildrate bestimmt wird. In Anlehnung an das Nyquist-Kriterium sollte die obere Grenze der Modulationsfrequenz (f_H) kleiner als die Hälfte der Kamerabildrate (f_cam) sein, d. h. f_H < f_cam/2. (Im schnellen Modus sollte f_H ~ 1400 Hz < f_cam/2 sein). Andererseits sollte die untere Grenze der Modulationsfrequenz (f_L) über der Hälfte der oberen Frequenzgrenze bleiben, d. h. f_L > f_H/2, um ein Übersprechen der Oberschwingungen höherer Ordnung zu vermeiden. Für eine gegebene Frequenzbandbreite, d. h. BW=f_H - f_L (festgelegt durch das Design des Retikels und die Rotationsgeschwindigkeit), ist die Anzahl der Frequenz-„Kanäle“ oder äquivalent die Anzahl der Lichtblätter (N), die zugewiesen werden können, N=BW/δf=BW/f_vol. Daher könnte CLAM getreu N~20-70 Lichtblätter erzeugen, um eine 3D-Abbildungsrate von f_vol=1~20 vol/s zu erreichen. Während eine solche Volumenrate mit den modernen scannenden LSFM-Plattformen vergleichbar ist und der Geschwindigkeit entspricht, die in vielen biologischen Bildgebungsanwendungen erforderlich ist, verbessert die Multiplexing-Natur in CLAM die Empfindlichkeit weiter, da alle Voxel im Volumen parallel ausgelesen werden (d. h. 100 % räumliches Tastverhältnis) - was die effektive Voxel-Verweilzeit um den Faktor der Multiplexing-Zahlen (N) erhöht, ohne die Volumenrate zu beeinträchtigen. Angesichts dieser Verbesserung reduziert CLAM auch die Beleuchtungsleistung und damit Photobleaching und Phototoxizität. Die Erfinder weisen darauf hin, dass diese Empfindlichkeitsverbesserung unter der Bedingung eines begrenzten Schussrauschens im Prinzip mit der Spärlichkeit der fluoreszierenden Probe skaliert wird, da das Multiplexing das Schussrauschen von Natur aus über alle 2D-Stapel verteilt.
In einer Ausführungsform, die auf dem FDM-Codierungsschema basiert, wird durch Anwendung der Kurzzeit-Fourier-Transformation auf das zeitliche Signal Pixel für Pixel eine Frequenz-Tiefenkarte vom CLAM-System erzeugt, die eine klare lineare Beziehung (R² = 0,995, eine Steigung von β = 0,23 µm/Hz) zwischen der codierten Tiefe und der Modulationsfrequenz (N = 40) zeigt, wie in 3B zu sehen ist. Dies steht im Einklang mit dem Design des Retikels, das einen linearen Frequenz-Chirp über das Strahlbündel-Array erzeugt (siehe ergänzende Informationen). Einzelne decodierte Lichtblätter, mit einer durchschnittlichen Dicke von ~1,5 µm, wie in 3B zu sehen, sind mit den markanten Mittenfrequenzen zwischen 450 Hz und 750 Hz markiert und werden durchgängig mit der endlichen Bandbreite (~3 Hz) assoziiert. Das gemittelte Signal-Rausch-Verhältnis über alle Frequenzkanäle hinweg ist > 5 dB mit minimalem Übersprechen zwischen benachbarten Kanälen, wie in der Frequenz-Tiefenkarte bestätigt wird. Der Erfinder stellt fest, dass die verbleibenden Nebenkeulen in jedem Frequenzkanal hauptsächlich auf den mechanischen Jitter und das Taumeln des sich drehenden Retikels zurückzuführen sind. Neben der Anwendung der Kurzzeit-Fourier-Transformation könnten auch andere Decodierverfahren wie die digitale Quadraturdecodierung oder das Arcustangens-Decodierverfahren implementiert werden, um das während der Modulationsphase eingeführte Rauschen zu reduzieren und die erforderliche Länge des Signals weiter zu verringern und somit die Volumenbildrate zu erhöhen.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um ein volumetrisches Bildgebungsvideo der biologischen Probe ohne mechanisches/elektrisches Scannen zu erzeugen. Im Vergleich zu bestehenden Lichtblatt-Mikroskopietechniken, die entweder das Beleuchtungslichtblatt oder den Probentisch abtasten, minimieren die hier beschriebenen Techniken den Effekt der Tischdrift und der Lichtschäden. Die nicht scannende codierte Lichtblatt-Mikroskopie der vorliegenden Vorrichtung kann ein volumetrisches Bildvideo einer fluoreszierenden Kugel im mikrofluidischen Fluss mit einer Flussrate von ca. 16 µm/s erfassen. Die erfasste volumetrische Bildrate kann bis zu 25 vol/s betragen. Die volumetrische Flussrate kann mit einer höheren Kamerageschwindigkeit weiter gesteigert werden. Damit sind die Techniken schneller als herkömmliche Scanning-Techniken oder strukturierte Lichtblatt-Mikroskopie. Die Techniken minimieren den Einsatz teurer und komplexer Strahlsteuerungsvorrichtungen, wie z.B. eines räumlichen Lichtmodulators, eines akusto-optischen Deflektors und einer Piezo-Stufe. Daher kann ein volumetrisches Bild ohne zusätzliche komplexe Steuerungsmechanismen erzeugt und so die Strahlverzerrung minimiert werden.
In einer Ausführungsform kann CLAM entweder in einem Dual-Objektivlinsen- oder Einzel-Objektivlinsen-Ansatz implementiert werden. In der Konfiguration mit Dual-Objektivlinse werden zwei separate Objektivlinsen, die orthogonal zueinander stehen, für die Beleuchtung bzw. die Fluoreszenzdetektion verwendet. Basierend auf diesem Schema kann auch eine gleichzeitige Mehrfachansicht-CLAM implementiert werden, indem das Lichtblatt-Array aus mehreren Richtungen geliefert wird - eine effektive Strategie, die nachweislich die Bildqualität bei Vorhandensein von Lichtstreuung und Auflösungsisotropie verbessert; bei einer Konfiguration mit Einzel-Objektivlinse erzeugt dieselbe Objektivlinse eine schräge Lichtblatt-Array-Beleuchtung und sammelt die Fluoreszenzsignale, wie in 9 zu sehen.
10 zeigt, dass die Erfindung mit Wellenfrontcodierung/-formung implementiert werden kann, um das FOV sowohl in axialer als auch in lateraler Dimension zu manipulieren. Bild a in 10 zeigt eine Implementierung der erweiterten Schärfentiefe (DOF) auf Basis einer induzierten sphärischen Aberration, die durch die Platzierung eines PDMS-Blocks zwischen der Probe und dem Detektionsobjektiv realisiert wird. Bild b in 10 zeigt einen Vergleich der DOF zwischen den CLAM-Bildern, die mit und ohne den PDMS-Block aufgenommen wurden. Die Skalenbalken stellen (oben) 50 µm und (unten) 20 µm dar. Bild c zeigt die gemessene volle Breite bei halbem Maximum (FWHM) (relativ zum Minimalwert) der PSF entlang der Tiefe (z) in den Fällen (rot) ohne und (blau) mit dem PDMS-Block. Die durchgezogenen Kurven sind die quadratische Anpassung. Die DOF wird bei Vorhandensein der sphärischen Aberration um ~32% erweitert.
In einer Ausführungsform kann man sich die sphärische Aberration zunutze machen, um die Tiefenschärfe (DOF) zu erweitern. Dies ist im Wesentlichen der Schritt des PSF-Engineering, durch die Wellenfrontcodierung (WFC) 145, wie in 1B gezeigt. Dies wurde durch die Einführung eines Blocks aus Material mit hohem Brechungsindex (Polydimethylsiloxan (PDMS) mit dem Brechungsindex von n = 1,42; Dicke von 5 mm) zwischen der Probe und dem Detektionsobjektiv ermöglicht (a. in 10). Bei Vorhandensein eines Mediums mit hohem Brechungsindex werden Lichtstrahlen der Fluoreszenzemission, insbesondere die peripheren Strahlen, auf verschiedene Punkte entlang der Tiefenachse fokussiert, wodurch eine beträchtliche, aber gleichmäßige sphärische Aberration entsteht. Dadurch wird die DOF effektiv erweitert, ohne dass sich die transversale Auflösung signifikant verschlechtert (b. in 10). Der Erfinder hat experimentell die FWHM der PSFs über das FOV für die beiden Fälle gemessen: d. h. mit und ohne erweiterte DOF (b. in 10). Im Vergleich dazu verbreitert sich die Punktspreizfunktion (PSF) ohne erweiterte DOF schneller entlang der axialen Richtung. Definiert man die DOF als den Bereich, in dem die FWHM innerhalb von V2 der minimal erreichbaren FWHM liegt, so hat der Erfinder beobachtet, dass die aktuelle Konfiguration eine Erweiterung der DOF um ~32% ergeben könnte (d. h. das axiale FOV wird von 31 µm auf 41 µm erweitert (c. in 10). In einer anderen Ausführungsform könnte man auch weitere PSF-Engineering-Techniken anwenden, die einen nicht-beugenden Beleuchtungsstrahl beinhalten, z.B. unter Verwendung eines Axikons, einer kubischen Phasenmaske oder einer abstimmbaren akustischen Gradientenindexlinse, um die DOF zu skalieren.
In einer anderen Ausführungsform kann das laterale FOV durch Übernahme von Wellenfrontformung erweitert werden (siehe Wellenfrontformung 145 in 1B), z.B. durch eine Remote-Fokus-Technik, die für Lichtblatt-Tiling oder Bessel-Strahlerzeugung verwendet werden könnte. Im Fall von „Lichtblatt-Array-Tiling“ kann ein räumlicher Lichtmodulator (SLM) eingesetzt werden, der dem durch die CLAM erzeugten Lichtblatt-Array ein binäres sphärisches Phasenmuster auferlegt. Somit kann das gesamte Lichtblatt-Array schnell in x-Richtung verschoben werden, wie in 11 zu sehen ist.
Ein weiteres Merkmal der schnellen volumetrischen Bildgebungsvorrichtung ist die Fähigkeit, eine digitale strukturierte Beleuchtung entlang der axialen Richtung durchzuführen (d. h. die Auflösungsisotropie zu verbessern). Unter Verwendung von FDM-Techniken kann die frequenzcodierte Beschaffenheit jeder 2D-Ebene genutzt werden, um eine Teilmenge des 3D-Stapels digital auszuwählen (unter Verwendung des Lichtblattcodierers 150 oder einer anderen vordefinierten Maske, die in der in 1A und 1B gezeigten Relaisoptik 140 enthalten ist), um ein axial moduliertes 3D-Bild zu erzeugen (z.B. jede zweite Ebene aufzunehmen und ein 3D-Bild mit einem periodischen Streifenmuster entlang der axialen Dimension zu erzeugen, wie in 6 zu sehen). Durch die Auswahl von Teilmengen, die jeweils eine entsprechende Phasenverschiebung aufweisen, kann ein hochauflösendes Bild über die axiale Dimension hinweg rekonstruiert werden. Durch Überabtastung des 3D-Stapels entlang der axialen Dimension können drei Teilmengen von 3D-Stapeln (rot, grün und blau) digital ausgewählt werden, da jede 2D-Ebene codiert ist. Jede Untergruppe ähnelt dem Bild, das unter einer periodischen strukturierten Beleuchtung aufgenommen wurde, wobei jede eine feste Phase hat (Φ1,Φ2,Φ3). Mit den drei Bildteilmengen können deren Frequenzspektren so umpositioniert werden, dass der Durchlassbereich des endgültigen Bildes erweitert ist, d. h. die Auflösung wird verbessert.
Die axiale Modulationsperiode sollte etwas kleiner oder gleich der theoretischen Auflösungsgrenze sein, um eine höhere Auflösung zu erreichen. Die mehrfach strukturierten Bilder können simultan statt sequentiell wie bei typischer SIM aufgenommen werden, da die Bildrate für eine höhere Auflösung nicht beeinträchtigt wird. Falls gewünscht, kann die schnelle volumetrische Bildgebungsvorrichtung so modifiziert werden, dass sie im SIM-Modus arbeitet, um Auflösungsisotropie zu erreichen.
6 zeigt eine digitale Strukturbeleuchtung in CLAM, die auf FDM-Codierung basiert. Durch Überabtastung des 3D-Stapels entlang der axialen Dimension konnten drei Teilmengen von 3D-Stapeln (rot, grün und blau) digital ausgewählt werden, da jede 2D-Ebene codiert ist (hier frequenzcodiert mit f₁,f₂,f₃,f₄ usw.). Jede Teilmenge ähnelt dem Bild, das unter einer periodischen strukturierten Beleuchtung aufgenommen wird, die jeweils eine feste Phase hat (Φ1,Φ2,Φ3). Wenn die drei Bildteilmengen vorliegen, werden ihre Frequenzspektren so umpositioniert, dass der Durchlassbereich des endgültigen Bildes erweitert wird, d. h. die Auflösung wird verbessert. Dies ist im Wesentlichen identisch mit der üblichen Bildverarbeitung, die in SIM verwendet wird.
Die Erfindung ist anwendbar auf die Mehrfarben-Fluoreszenz-Bildgebung, die durch die Verwendung mehrerer Laser (gepulste und Dauerstrich-(CW))-Wellenlängen erzielt werden kann, einschließlich, aber nicht beschränkt auf den Wellenlängenbereich von Ultraviolett bis zum nahen Infrarot (abhängig von den Anregungsspektren der Fluorophore) und einem oder mehreren 2D-Bildsensoren für die Bilderfassung. Das Licht mit unterschiedlichen Wellenlängen kann durch dichroitische Filter oder einen akusto-optisch abstimmbaren Filter (AOTF) kombiniert und über die gleiche Optik an das Spiegelpaar geliefert werden. CLAM ist auch für die Multiphotonen-Bildgebung geeignet, bei der das Anregungslicht ein kurz gepulster Laser ist (typischerweise Femtosekunden). Dies schließt die volumetrische Zwei-Photonen- und Drei-Photonen-Fluoreszenz-Lichtblatt-Mikroskopie ein, ist aber nicht darauf beschränkt.
CLAM kann auch eine digitale strukturierte Beleuchtung entlang der axialen Richtung durchführen und so die Auflösungsisotropie verbessern. In einer Ausführungsform, die auf FDM als Beispiel basiert, kann man die frequenzcodierte Natur jeder 2D-Ebene nutzen und eine Teilmenge des 3D-Stapels digital auswählen, um ein axial moduliertes 3D-Bild zu bilden (z.B. jede zweite Ebene aufnehmen und ein 3D-Bild mit einem periodischen Streifenmuster entlang der axialen Dimension bilden, wie in 6 gezeigt). Durch die Auswahl anderer Teilmengen des periodischen 3D-Stapels, die jeweils eine Phasenverschiebung zueinander aufweisen, kann man rechnerisch ein hochauflösendes Bild (über die axiale Dimension hinweg) auf der Grundlage dieser Teilmengen rekonstruieren - ähnlich dem Algorithmus, der in der strukturierten Beleuchtungsmikroskopie (SIM) verwendet wird. Die axiale Modulationsperiode sollte etwas kleiner oder gleich der theoretischen Auflösungsgrenze sein, um eine höhere Auflösung zu erreichen. Man beachte, dass die mehrfachen strukturierten Bilder gleichzeitig erhalten werden, anstatt sequentiell wie bei typischer SIM - d. h. die Bildrate wird für eine höhere Auflösung nicht beeinträchtigt.
Beispielhafte Ausführungsformen
Der kollimierte Strahl eines diodengepumpten Festkörperlasers (CW, Wellenlänge 532 nm, Leistung 400 mW) wurde durch eine Zylinderlinse (f_CL = 200 mm) in das winkelversetzte Spiegelpaar (Reflexionsgrad R > 99 %; Abstand S = 50 mm; Länge L = 200 mm) am Eingang O linienfokussiert. Der Strahl bricht in eine diskrete Menge von (räumlich gechirpten) Zick-Zack-Pfaden auf, die durch ihre Einfallswinkel bestimmt sind. Die Anzahl der Teilstrahlen N wurde hauptsächlich durch den Versatzwinkel, den Lichtkegelwinkel und einen variablen Spalt gesteuert (N wurde im Bereich von 30 bis 70 gewählt). Dieser Strahl wurde von einer Linse (f=200 mm) gesammelt und durch ein Teleskop T2 (2-fache Vergrößerung) auf das sich drehende Retikel (d. h. den auf OFDM basierenden Lichtblatt-Array-Codierer) weitergeleitet, gefolgt von einem weiteren Teleskop T3 (1/4 Vergrößerung), um das FOV anzupassen. Alle virtuellen Quellen werden auf den Ebenen in der Nähe der gemeinsamen Fokusebene (CFP) von L und T2 abgebildet. Diese Konfiguration stellt im Wesentlichen sicher, dass alle virtuellen Quellen innerhalb der DOF der Beleuchtungsobjektive abgebildet werden (12). Der Strahl passiert eine Beleuchtungstubuslinse TL1 (f=200 mm) und eine Zylinderlinse CL2 (f=50 mm) und wird dann von einem Beleuchtungsobjektiv O1 (20×, NA=0,45, Arbeitsabstand 8,2-6,9 mm) fokussiert, um das Lichtblatt-Array zu erzeugen. Das orthogonale Detektionsobjektiv O2 (10×,NA=0,25, Arbeitsabstand 10,6 mm) sammelt die multiplexierte Fluoreszenzemission, die auf einem 2D-Bildsensor registriert wird, der im Rolling-Shutter-Modus mit einer Bildrate von bis zu 3183 fps arbeitet. Ein Langpassfilter (Cut-Off bei 543 nm) im Detektionszweig reinigt das Anregungslicht (12). Das Frequenzretikel hat eine Transmissionsfunktion, $T (r, φ) = \frac{1}{2} + \frac{1}{2} sgn [cos (ω φ)],$
wobei ω = 2πr die radiusabhängige Modulationsfrequenz und sgn() die Vorzeichenfunktion ist (6).
Es wurde auf einer transparenten Folie (Durchmesser 20 mm) hergestellt und von einem Schrittmotor (Rotationsgeschwindigkeit = 120 - 2000 U/min) mit phasenstarrer Winkelgeschwindigkeitssteuerung gedreht. Um das Photobleaching-Verhalten zu evaluieren, ist der Aufbau so konfiguriert, dass drei Beleuchtungsszenarien erzeugt werden können, die der CLAM, dem Einzelstrahl-Lichtblatt und der konfokalen Mikroskopie entsprechen. Beim Einzelstrahl-Lichtblatt- und konfokalen Fällen umgeht die kohärente Beleuchtung das Spiegelpaar mit zusätzlichen (zylindrischen) Linsen, um das Einfallsprofil zu manipulieren.
Ohne komplexe Berechnungen basiert die Bildrekonstruktion einfach auf der Pixel-für-Pixel-Kurzzeit-Fourier-Transformation der frequenzmultiplexierten Daten, gefolgt von einer Standard-Richardson-Lucy-Entfaltung. Die 3D-Punktausbreitungsfunktion (PSF) von CLAM wurde durch die Abbildung von fluoreszierenden Kügelchen (Durchmesser = 100 nm), die auf einem gekippten Abdeck-Objektträger verteilt waren, evaluiert. Die gemessene transversale Auflösung (~1,2µm, volle Breite bei halbem Maximum (FWHM)) liegt nahe der Beugungsgrenze (NA = 0,25), während die axiale Auflösung (~2,7 µm), wie in 13 a-b zu sehen ist, durch die Lichtblattdicke, den Abstand und die optische Übertragungsfunktion des Detektionsobjektivs bestimmt wird. In 13 ist a (links) die 3D-PSF (Volumen: 90 × 40 × 25 µm³) und (rechts) sind die projizierten 2D-PSFs, gemessen von zwei Kügelchen (Kügelchen 1 und 2). Skalenbalken 2 µm, und b ist der Boxplot der gemessenen Auflösung entlang der 3 Dimensionen.
CLAM zeigt einen Eindringtiefenbereich bis zu 300 µm , innerhalb dessen die Bildqualität im Allgemeinen erhalten bleibt. Zur Überprüfung wurden fluoreszierende Mikrokügelchen (Durchmesser 1 µm), die in ein gewebeähnliches Phantom eingebettet waren, abgebildet. Die Fluoreszenzprofile der Mikrokügelchen sind bis zu einer Tiefe von 300 µm ohne starke Verzerrungen konsistent (14, a-d). Die Inspektion des transversalen und linearen Profils der einzelnen Nanosphärenbilder ermöglicht die Zerlegung der Bildqualität (14, e-h). Das Titandioxid-(TiO₂)-Nanopartikel im Phantom hat einen durchschnittlichen Durchmesser von 160 nm, charakterisiert mit dem Transmissionselektronenmikroskop. Die Mie-Streuungsberechnung deutet auf einen reduzierten Streuungskoeffizienten von µ'_s ~22 cm^-1 bei 532 nm hin, vergleichbar mit den reduzierten Streukoeffizienten des biologischen Gewebes. Dieses Verhalten deutet darauf hin, dass die parallelisierte 3D-Beleuchtung mit dem dichten, inkohärenten Lichtblatt-Array und damit die multiplexierte Lichtblatt-Codierung die Eindringtiefe in das stark gestreute Medium nicht beeinträchtigt - vergleichbar mit den modernen scannenden, konfokalen LSFM-Modalitäten (~100 µm in der Tiefe). In 14 sind die Tiefen a,e gleich 30 µm , b,f gleich 100 µm , c,g gleich 200 µm und d,h gleich 300 µm; die oberen rechten Ecken in c, d sind zum Vergleich entrauscht. Die Tiefe ist in a~d farbcodiert. e~h zeigen die Projektionen der maximalen Intensität (links) und lineare Intensitätsprofile (rechts) der in a~d markierten Kügelchen. Die Skalenbalken stellen 40 µm (a~d) und 5 µm (e~h) dar.
Die hier beschriebenen Verfahren und Prozesse können als Code und/oder Daten verkörpert werden. Der hier beschriebene Softwarecode und die Daten können auf einem oder mehreren maschinenlesbaren Medien (z.B. computerlesbaren Medien) gespeichert werden, die jede Vorrichtung oder jedes Medium umfassen können, die/das Code und/oder Daten zur Verwendung durch ein Computersystem speichern kann. Wenn ein Computersystem und/oder ein Prozessor den Code und/oder die Daten, die auf einem computerlesbaren Medium gespeichert sind, liest und ausführt, führt das Computersystem und/oder der Prozessor die Verfahren und Prozesse aus, die als Datenstrukturen und Code, die in dem computerlesbaren Speichermedium gespeichert sind, verkörpert sind.
Fachleute wissen, dass computerlesbare Medien entfernbare und nicht entfernbare Strukturen/Vorrichtungen umfassen, die zur Speicherung von Informationen verwendet werden können, wie z.B. computerlesbare Anweisungen, Datenstrukturen, Programmmodule und andere von einem Computersystem/einer Computerumgebung verwendete Daten. Zu den computerlesbaren Medien gehören unter anderem flüchtige Speicher wie Direktzugriffsspeicher (RAM, DRAM, SRAM) und nichtflüchtige Speicher wie Flash-Speicher, verschiedene Nur-Lese-Speicher (ROM, PROM, EPROM, EEPROM), magnetische und ferromagnetische/ferroelektrische Speicher (MRAM, FeRAM) sowie magnetische und optische Speichervorrichtungen (Festplatten, Magnetbänder, CDs, DVDs), Netzwerkvorrichtungen oder andere heute bekannte oder später entwickelte Medien, die computerlesbare Informationen/Daten speichern können. Computerlesbare Medien sollten nicht so ausgelegt oder interpretiert werden, dass sie irgendwelche sich ausbreitenden Signale umfassen. Ein computerlesbares Medium der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise eine Compact Disc (CD), eine digitale Videodisc (DVD), eine Flash-Speichervorrichtung, ein flüchtiger Speicher oder ein Festplattenlaufwerk (HDD) sein, wie z.B. eine externe HDD oder die HDD einer Computervorrichtung, obwohl Ausführungsformen darauf nicht beschränkt sind. Eine Computervorrichtung kann z.B. ein Laptop, ein Desktop-Computer, ein Server, ein Mobiltelefon oder ein Tablet sein, wobei die Ausführungsformen nicht darauf beschränkt sind.
Ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung und ihrer zahlreichen Vorteile kann anhand der folgenden Beispiele gewonnen werden, die zur Veranschaulichung angeführt sind. Die folgenden Beispiele veranschaulichen einige der Verfahren, Anwendungen, Ausführungsformen und Varianten der vorliegenden Erfindung. Sie sind selbstverständlich nicht als Einschränkung der Erfindung zu verstehen. Es können zahlreiche Änderungen und Modifikationen in Bezug auf die Erfindung vorgenommen werden.
BEISPIEL 1
Die schnelle volumetrische Bildgebungsvorrichtung kann ein kontinuierliches Video von dynamischen Prozessen, die in einer biologischen Probe stattfinden, aufnehmen. Um dies zu demonstrieren, wurden fluoreszierende Polymer-Kügelchen mit einem Durchmesser von 1 µm in Wasser gegeben und mittels einer Spritzenpumpe in eine quadratische Glaspipette injiziert. Ein Beleuchtungs- und ein Detektionsobjektiv wurden orthogonal zu den benachbarten Seiten der Glaspipette positioniert. Diese Konfiguration ermöglicht es dem Detektionsobjektiv, die dynamische Bewegung der fluoreszierenden Polymerkügelchen in einem mikrofluidischen Fluss zu erfassen. 7(a) zeigt ein volumetrisches Bild der fluoreszierenden Polymerkügelchen bei 80 ms. 7(b) zeigt ein volumetrisches Bild der fluoreszierenden Polymerkügelchen bei 680 ms. 7(c) zeigt ein volumetrisches Bild der fluoreszierenden Polymerkügelchen bei 1,36 s. 7(d) zeigt ein volumetrisches Bild der fluoreszierenden Polymerkügelchen bei 1,92 s. Die volumetrische Bildrate betrug -25 vol/s, und das Video wurde verwendet, um eine Geschwindigkeit von 27 µm/s für den Fluss zu schätzen.
BEISPIEL 2
Die schnelle volumetrische Bildgebungsvorrichtung wurde verwendet, um das Blutgefäßsystem im Darm einer Maus und die Glomeruli in der Niere einer Maus abzubilden. Das Darm- und Nierengewebe wurde zur besseren optischen Transparenz in einer OPTIClear-Lösung gereinigt und auf der Endothelzellmembran mit einem DiI-Farbstoff (DiIC₁₈) markiert. 8(a) ist ein volumetrisches Bild der Netzwerkstruktur der Blutgefäße im Darm. Das Bild zeigt, dass auch angiogene Sprossen deutlich sichtbar gemacht werden können. 8(b) zeigt drei Glomeruli, die sich an das Blutgefäßnetzwerk im optisch transparenten Nierengewebe der Maus anschließen. Die volumetrische Bildrate betrug 1,6 vol/s.
BEISPIEL 3
Die schnelle volumetrische Bildgebungsvorrichtung kann so konfiguriert werden, dass sie eine erweiterte Tiefenschärfe (DOF) mit Wellenfrontcodierung (WFC) enthält. Eine vordefinierte Phasenmaske kann im Erfassungspfad platziert werden, so dass sie die Punktspreizfunktion (PSF) des Systems so gestaltet, dass sie weniger tiefenvariant ist. Ein WFC-Schema, das auf einer kubischen Phasenmaske (CPM) basiert, kann während der Entfaltung verwendet werden, um eine erweiterte DOF in der schnellen volumetrischen Bildgebungsvorrichtung zu erreichen. Die CPM-Phasenfunktion kann als φ (u,v) = r (u³+v³) beschrieben werden, wobei u und v die räumlichen Frequenzkoordinaten sind und r der freie Optimierungsparameter ist. Die CPM wurde in der hinteren Brennebene der Detektions-Objektivlinse (20x, NA = 0,4) platziert. Die PSF ist über die Tiefe > 50 µm nahezu unveränderlich. Dies zeigt einen deutlichen erweiterten DOF-Effekt im Vergleich zur PSF ohne CPM (mit nur einer DOF von ~ 5 µm). Die CPM moduliert nur die Phase und daher wird kein Verlust eingeführt. Die PSF-Simulationsstudie zeigt die Tiefeninvarianz (mehr als 50 µm) der PSF, wenn die CPM hinzugefügt wird (siehe z.B. 4). Die mit der CPM erstellten PSF-Bilder wiesen eine asymmetrische Unschärfe auf, die durch Entfaltung verbessert werden kann.
Um das Verhalten der schnellen volumetrischen Bildgebungsvorrichtung zu bewerten, wurden 3 Bildebenen an verschiedenen axialen Positionen (Zp = -25, 0, & +25µm) simuliert. Jede Position wurde mit 400, 500 bzw. 600 Hz zeitlich moduliert. Die Bilder wurden mit 2kHz abgetastet und die 3D-Bildrate wurde auf 4 Hz eingestellt. Bildunschärfe und Photonenrauschen wurden ebenfalls hinzugefügt. Aus der Summe aller 3 Bildebenen zu jedem Abtastzeitpunkt ergab sich eine Sequenz von 500 multiplexierten Bildern, die die CPM enthielten. Die Demultiplexierung der 3 Bildebenen erfolgte durch eine Fourier-Transformation der Bildsequenz in die Zeit. Zur Wiederherstellung der 3 Bilder wurde eine Richardson-Lucy-Entfaltung mit einem Algorithmus der totalen Variations-(TV)-Regularisierung (100 Iterationen und TV=0,001) verwendet. Die wiederhergestellten Bilder behielten alle wichtigen ursprünglichen Merkmale bei und die Unschärfe wurde unterdrückt.
Durch die Verwendung eines der beiden in 3 gezeigten Demultiplexing-Konzepte und die Anwendung eines Entfaltungsalgorithmus konnten die wichtigsten ursprünglichen Merkmale der 3 Bilder wiederhergestellt werden. Die Bildunschärfe kann durch Entfaltung entfernt werden. Die in 3(a) und 3(b) gezeigten Ansätze können jeweils verwendet werden, um den Strahl mit verschiedenen Codes (z.B. modulierende Frequenzen in FDM oder PN/WH-Code in CDM) entlang einer Dimension (x-Richtung) zu codieren, der später auf verschiedene Lichtebenen/Lichtblätter in einem 3D-Stapel eines Beleuchtungsarrays abgebildet wird.
BEISPIEL 4
Der Erfinder hat außerdem die Abbildungsgeschwindigkeit von CLAM evaluiert, indem er die fließenden fluoreszierenden Kügelchen abbildete, die von einer mikrofluidischen Pumpe in einen Fluidikkanal (quadratische Glaspipette, innere Seitenlänge 1 mm) zugeführt wurden. Als Konzeptnachweis-Experiment ist das CLAM-System, konfiguriert im Frequenzbereich (BW) von 1100~1400 Hz und mit insgesamt N = 24 Lichtblättern, in der Lage, die Mikrokugeln im Fluss (Flussrate von ~20µm/s) mit der volumetrischen Rate f_vol von bis zu 13 vol/s zu erfassen, wie in 15 zu sehen ist. Es ist anzumerken, dass die praktische Volumenrate im aktuellen Aufbau weiter erhöht werden kann, und zwar abhängig von der Anzahl der für die Experimente benötigten Lichtblätter (N). Zum Beispiel kann die Volumenrate mit unserer aktuellen Kamera auf ~25 vol/s erhöht werden, wenn das Bildgebungs-FOV in axialer Richtung um die Hälfte reduziert wird (d. h. N = 12).
BEISPIEL 5
Bei der Gewebereinigung wird eine große biologische Probe, z.B. ein ganzer Organismus, durch Homogenisierung des Brechungsindexes durch Ersetzen, Entfernen oder Verändern eines Teils der Komponenten transparent gemacht, ohne die anatomische Struktur zu verändern. Dies ermöglicht die Analyse der Gewebestruktur unter Lichtmikroskopie mit minimaler Lichtstreuung und damit Bildverschlechterung. CLAM bietet ein fortschrittliches Werkzeug für die 3D-Visualisierung der Gewebestrukturen in Kombination mit der Gewebereinigung. Hier wird ein neueres Verfahren, OPTIClear genannt, eingesetzt, um das Gewebe transparent zu machen, da es frei von Detergenzien und Denaturierungsmitteln ist und nur minimale strukturelle und molekulare Veränderungen aufweist, und die mit OPTIClear behandelten Mäusegewebe (Ileum und Nieren), die mit einem lipophilen Carbocyanin-Farbstoff (DiI) perfundiert wurden, wurden mit CLAM abgebildet. Das Präparat wurde in das Medium eingetaucht (n = 1,47), um eine sphärisch-aberrationsgestützte erweiterte DOF zu erreichen.
Der Erfinder zeigt, dass tubuläre Epithelstrukturen, wie in 16 a zu sehen, und die Glomeruli in der Mausniere, wie in 16 b zu sehen, sowie das Blutgefäßsystem im Mausdarm, wie in 16 c zu sehen, mit einer Volumenrate von ~6,6 vol/s visualisiert werden konnten. Unter Verwendung von insgesamt bis zu 34 dicht gepackten, multiplexierten Lichtblättern erfasste CLAM alle optischen Schnittebenen gleichzeitig, ohne dass der Strahl gescannt oder das Objektiv betätigt werden musste, wie in 16 a-e zu sehen ist. Noch wichtiger ist, dass die Anwendbarkeit von CLAM in der biologischen Bildgebung durch das dank der 3D-Parallelisierung wesentlich geringere Risiko von Lichtschädigung und/oder Photobleaching untermauert wird. Dieser Vorteil wird durch den Vergleich des Photobleaching-Effekts zwischen zwei kontinuierlichen Beleuchtungsszenarien, die LSFM bzw. CLAM entsprechen, verdeutlicht (siehe Verfahren). CLAM ist der LSFM wegen des deutlich geringeren Photobleaching deutlich überlegen, wie in 16 f zu sehen ist. Die geringere Photobleaching-Rate und damit das potenziell geringere Risiko einer Lichtschädigung bzw. Phototoxizität bei CLAM ist auf den hochgradig parallelisierten Betrieb (100 % räumliches Tastverhältnis) zurückzuführen, der eine geringere Beleuchtungsintensität erfordert und eine längere Belichtungszeit genießt, ohne das SNR und die Bildgebungsgeschwindigkeit zu beeinträchtigen. Es wird angemerkt, dass die Standard-Konfokalmikroskopie die Probe mit einem fokussierten Strahl beleuchtet, dessen Leistungsdichte in der Größenordnung von einigen zehn kW/cm² liegt. Die erfindungsgemäße codierte Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie hat eine Leistungsdichte, die etwa 4 Größenordnungen kleiner ist, wodurch Photobleaching und Zytotoxizität im Zusammenhang mit den exogenen fluoreszierenden Markern und Lichtschädigung an der biologischen Probe vermieden werden. Es wird daher erwartet, dass CLAM besonders wertvoll für biologische Langzeitüberwachungsanwendungen sein könnte, insbesondere in der Entwicklungsbiologie.
In 16 zeigt a ein 3D gerendertes Bild mit drei orthogonalen Standardabweichungs-Intensitätsprojektionen (SDIP) der tubulären Epithelstrukturen in der Mausniere (N = 34) bei einer Volumenrate von 6,6 vol/s. Volumen: 230 × 73 × 65 µm³. Die SDIP von b sind die Glomeruli (siehe Pfeile) und c zeigen die Darmgefäße in der Maus entlang der 3 orthogonalen Achsen. d-e sind die Montagen der 2D-Schnitte der Bilder in b bzw. c; c ist der Vergleich des Photobleaching zweier Beleuchtungsbedingungen: Einzellichtblatt (SLS, N = 1, rot) und Lichtblatt-Array (CLAM, N = 40, blau). Die schattierten Bereiche repräsentieren ±1 Standardabweichung für jede Bedingung (20 und 30 Messungen für SLS bzw. CLAM). Die Skalenbalken stellen b, c gleich 20 µm und d, e gleich 40 µm dar.
Es sollte klar sein, dass die hier beschriebenen Beispiele und Ausführungsformen nur der Veranschaulichung dienen und für Fachleute verschiedene Modifikationen oder Änderungen offenkundig sind, die in den Umfang und den Geltungsbereich dieser Anmeldung einbezogen werden sollen.
Alle Patente, Patentanmeldungen, vorläufigen Anmeldungen und Veröffentlichungen, auf die hier Bezug genommen wird oder die hier zitiert werden, sind durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit enthalten, einschließlich aller Zahlen und Tabellen, soweit sie nicht im Widerspruch zu den ausdrücklichen Lehren dieser Beschreibung stehen.

Claims

Mikroskopievorrichtung auf Lichtblattbasis, umfassend: eine Lichtquelle; ein Paar paralleler Spiegel, die so konfiguriert sind, dass sie Licht von der Lichtquelle empfangen und ein Array inkohärenter Lichtblätter reflektieren; einen Codierer, der so konfiguriert ist, dass er das Array aus inkohärenten Lichtblättern codiert, umfassend: einen Frequenzmodulator, der so konfiguriert ist, dass er das Array inkohärenter Lichtblätter segmentiert und jedes Lichtblatt mit einer entsprechenden Frequenz codiert; oder einen zeitlichen Modulator, der so konfiguriert ist, dass er das Array inkohärenter Lichtblätter durch eine beliebige orthogonale Codierungsbasis einschließlich einer Hadamard-Basis oder einer Zufallsmaske segmentiert; eine Linse, die so konfiguriert ist, dass sie die codierten Lichtblätter auf eine biologische Probe richtet, und eine Bilderfassungsvorrichtung, die so konfiguriert ist, dass sie ein Fluoreszenzsignal von der biologischen Probe empfängt.
Mikroskopievorrichtung auf Lichtblattbasis nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Lichtquelle um mindestens einen oder eine Kombination aus mehreren Dauerstrichlasern oder Impulswellenlasern mit unterschiedlichen Wellenlängen handelt.
Mikroskopievorrichtung auf Lichtblattbasis nach Anspruch 1, wobei das Paar paralleler Spiegel jeweils einen Reflexionsgrad von mehr als 99 % aufweist.
Mikroskopievorrichtung auf Lichtblattbasis nach Anspruch 1, die ferner einen Strahlaufweiter umfasst, der so konfiguriert ist, dass er einen Lichtstrahl von der Lichtquelle aufweitet oder reduziert.
Mikroskopievorrichtung auf Lichtblattbasis nach Anspruch 1, wobei der Frequenzmodulator ein Strahlencodierer ist, der in Form eines sich bewegenden oder rotierenden, räumlichen Lichtmodulators oder einer statischen, räumlich gemusterten Maskenbeleuchtung durch einen scannenden Lichtstrahl vorliegt.
Mikroskopievorrichtung auf Lichtblattbasis nach Anspruch 1, die ferner ein Beleuchtungsobjektiv, das so konfiguriert ist, dass es Licht auf die biologische Probe überträgt, und ein orthogonal zum Beleuchtungsobjektiv angeordnetes Detektionsobjektiv umfasst.
Mikroskopievorrichtung auf Lichtblattbasis nach Anspruch 1, die ferner eine Schaltung zum Demultiplexen eines Bildsignals umfasst.
Mikroskopievorrichtung auf Lichtblattbasis nach Anspruch 1, wobei die Bilderfassungsvorrichtung ein 2D-Bildsensor oder eine Kamera ist und die Bilderfassungsvorrichtung so konfiguriert ist, dass sie ein Video erfasst, und wobei ein Objektiv der Bilderfassungsvorrichtung entweder orthogonal zu dem Beleuchtungsobjektiv angeordnet ist oder mit dem Beleuchtungsobjektiv auf einer Linie liegt.
Mikroskopievorrichtung auf Lichtblattbasis, umfassend: eine Lichtquelle; ein winkelversetztes Spiegelpaar, das so konfiguriert ist, dass es Licht von der Lichtquelle empfängt und ein Array aus Lichtblättern reflektiert, wobei eine Dichte und eine Kohärenz des Arrays aus Lichtblättern durch Abstimmen einer Geometrie des winkelversetzten Spiegelpaars rekonfigurierbar ist; einen Lichtblattcodierer, der so konfiguriert ist, dass er das Array aus Lichtblättern codiert, um eine parallelisierte Beleuchtung zu bilden; eine Linse, die so konfiguriert ist, dass sie die codierten Lichtblätter auf eine biologische Probe richtet, und eine Bilderfassungsvorrichtung, die so konfiguriert ist, dass sie ein Fluoreszenzsignal von der biologischen Probe empfängt.
Mikroskopievorrichtung auf Lichtblattbasis nach Anspruch 9, ferner einen Strahlformer umfassend, um das in das winkelversetzte Spiegelpaar eintretende Licht so zu formen, dass ein linienfokussierter Strahl mit einem Kegelwinkel entsteht.
Mikroskopievorrichtung auf Lichtblattbasis nach Anspruch 9, ferner eine Relais-Linse umfassend, die so konfiguriert ist, dass sie die projizierten codierten Lichtblätter durchlässt, um ein Array aus N Lichtblättern zu bilden.
Mikroskopievorrichtung auf Lichtblattbasis nach Anspruch 11, die ferner eine vordefinierte Maske umfasst, um eine beliebige Teilmenge des Arrays aus N Lichtblättern auszuwählen, um die biologische Probe zu beleuchten, wobei die vordefinierte Maske eine statische, räumlich gemusterte Maskenbeleuchtung durch einen scannenden Lichtstrahl oder eine aktiv steuerbare Maske unter Verwendung eines räumlichen Lichtmodulators umfasst.
Mikroskopievorrichtung auf Lichtblattbasis nach Anspruch 9, wobei ein Kohärenzgrad zwischen den Lichtblättern in dem Array durch Abstimmen eines Spiegelabstands S einstellbar ist und die Arraydichte der Lichtblätter durch Einstellen eines Spiegelversatzwinkels α konfigurierbar ist.
Mikroskopievorrichtung auf Lichtblattbasis nach Anspruch 9, ferner eine Komponente zur Wellenfrontcodierung/-formung umfassend, die so konfiguriert ist, dass sie das Sichtfeld (FOV) sowohl in der axialen als auch in der lateralen Dimension vergrößert.
Mikroskopievorrichtung auf Lichtblattbasis nach Anspruch 9, wobei der Lichtblattcodierer umfasst: einen Frequenzmodulator, der so konfiguriert ist, dass er das Array aus Lichtblättern segmentiert und jedes Lichtblatt mit einer entsprechenden Frequenz codiert; oder einen zeitlichen Modulator, der so konfiguriert ist, dass er das Array aus Lichtblättern durch eine beliebige orthogonale Codierungsbasis einschließlich einer Hadamard-Basis oder einer Zufallsmaske segmentiert.