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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Anordnung zur Mikroskopie gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1, sowie auf ein Mikroskopieverfahren.
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Das Verfahren der Ultramikroskopie wurde bereits von Siedentopf, H. and Zsigmondy, R. (1902) beschrieben. Dabei wird eine Ebene des Objektes durch ein Lichtband angeleuchtet und das erzeugte Streulicht senkrecht zu dieser Ebene mittels eines Mikroskopes abgebildet. Ein Überblick über den Stand der Technik wird in dem Artikel: „Selective plane illumination microscopy techniques in evelopmental biology” von Jan Huisken und Didier Y. R. Stainer, Development 136, 1963–1975 (2009) gegeben.
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Neben dem Begriff Ultramikroskopie wird die Technik als Selective plane illumination microscopy (SPIM) bezeichnet. Dieser Begriff wurde von Stelzer (Huisken et al., 2004) geprägt.
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Die in der Veröffentlichung dargestellten Varianten der Ultramikroskopie sind dort im Einzelnen bezüglich ihrer Vor- und Nachteile beschrieben. Es handelt sich um OPFOS, HROPFOS, TLSM, SPIM, OCPI, Ultramicroscopy, DSLM, mSPIM, HILO, OPM. 1 zeigt solch eine herkömmliche Mikroskopieanordnung. In den meisten der Methoden wird aus einer Anregungslichtquelle 1 das Lichtband mittels einer Anregungsoptik 3 erzeugt, die als Zylinderoptik ausgelegt ist, mit der ein Lichtblatt im Objekt 4 in der Bildebene eines flächigen Detektors 6 erzeugt wird, so dass das Licht axial bezüglich der Achse der Detektionsoptik 5 an der Stelle der Linie auf wenige Mikrometer eingeschränkt ist. Innerhalb der Detektionsebene weitet sich das Lichtband dann zu beiden Seiten auf. Um eine dreidimensionale Darstellung des Objektes zu gewinnen, wird dieses nach dem Stand der Technik relativ zum optischen System entlang der Detektionsachse bewegt, so dass dann Ebene für Ebene aufgezeichnet wird.
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In dem Verfahren High-resolution orthogonal-plane fluorescence optical sectioning (HROPFOS, Buytaert and Dirckx, 2007) wird die Probe zusätzlich entlang der Anregungsachse bewegt und nur das Licht aufgezeichnet, welches in der Fokallinie erzeugt wird. Ein Nachteil ist, dass die Technik aufgrund der Notwendigkeit, die Probe zu bewegen und lange zu bestrahlen, die Probe stärker ausbleicht und langsam ist.
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Das Verfahren digital scanned laser light-sheet fluorescence microscopy (DSLM, Keller et al., 2008) verendet kein Lichtband, welches durch eine Zylinderoptik erzeugt ist. Es wird ein Scanner verwendet, welcher einen fokussierten Strahl, der in der Bildebene verläuft, parallel bewegt. Dadurch wird ein Lichtband geschrieben, dessen Breite durch die Scanneramplitude eingestellt werden kann. Ein solches Verfahren wird auch in der
DE 10 2008 018 476 A1 , der
DE 10 2005 027 077 A1 oder der
DE 10 2007 045 897 A1 beschrieben. Der Vorteil dieses Verfahrens ist, dass die eingestrahlte Intensität an jeder Stelle gleich ist und keine weiteren Maßnamen zur Homogenisierung des Lichtbandes eingesetzt werden müssen. Ein Nachteil des Verfahrens ist es, dass die lokale Lichtleistung wesentlich höher ist und damit die Bildrate durch Sättigungseffekte limitiert ist.
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Weitere Verfahren zur Mikroskopie mit dünnen Lichtblättern werden in der
US 2009/0174937 A1 oder der
WO 2010/014244 A2 beschrieben.
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Ein weiterer Stand der Technik ist in
US 2006/0017001 A1 angegeben, die eine Abwandlung der konfokalen Mikroskopie darstellt. Das Verfahren verwendet einen Anregungsstrahl, der koaxial durch die Detektionsoptik eingestrahlt wird und eine Linie in der Probe anregt. Der Strahl wird senkrecht zur Probe mittels eines Scanners bewegt und regt so das gesamte Probenvolumen an. Hierin unterscheidet sich das Verfahren wesentlich von den oben genannten Verfahren, bei denen im Wesentlichen nur eine Ebene angeregt wird. Das Bild der Linie wird auf eine CMOS-Kamera abgebildet, die einen Rolling-Shutter-Betrieb aufweist, mit dem es möglich ist, nur einen schmalen Zeilenbereich auf dem Detektor auszulesen und diesen Bereich synchron zur Bewegung der Linie über den Deektor laufen zu lassen.
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Eine wesentliche Limitierung der SPIM-Technik liegt in der mangelnden Eindringtiefe, die durch die Streuung und Absorption des Lichtes in der Probe hervorgerufen wird. Sowohl das Anregungslicht, als auch das Detektionslicht werden in der Probe gestreut. Dieses Problem nimmt zu, wenn größere Proben untersucht werden sollen. Streulicht verringert den Kontrast in den aufgenommenen Bildern und kann dazu führen, dass schwach leuchtende Detailstrukturen auf einem hohen Untergrund nicht mehr dargestellt werden können. Generell muss bei Aufnahmen mit hohem Streulichtuntergrund mit viel Licht gearbeitet werden, damit die Photonenstatistik so weit heruntergedrückt wird, dass die Strukturen, die von Interesse sind, auf dem Streulichtuntergrund sichtbar bleiben.
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Eine wesentliche Verbesserung konnte durch Voie erreicht werden, der die Proben vor der Messung optisch geklärt hat. Dodt et. Al (2007) hat gezeigt, dass mittels hochaperturiger Objektive in Kombination mit optischer Klärung (Clearing) 3D-Bilder zum Beispiel von ganzen Embryonen oder aus dem Gehirn mit sehr guter Auflösung gewonnen werden können. Nachteilig ist, dass das Verfahren nur auf totes Material angewendet werden kann. Eine Möglichkeit zur Verbesserung des Kontrastes liegt darin, das Lichtband periodisch zu unterbrechen und damit eine streifenartige, strukturierte Beleuchtung der Probe zu erzeugen (Breuninger et al., 2007). Eine Ebene des Objektes wird dann nicht mehr mittels eines Bildes aufgenommen, sondern man detektiert eine Serie von Bildern, bei denen das Streifenmuster schrittweise verschoben wird. Dieses Verfahren ist nur dann sinnvoll, wenn die Fluoreszenzen ausreichend stark angeregt werden, da das finale Bild den Charakter eines Differenzsignales hat. Empfindliche Proben und schwache Signale bleichen dann während der Datenaufnahme, so dass kein korrektes Bild mehr errechnet werden kann. Nachteilig an diesem Verfahren ist weiterhin, dass immer noch große Teile des gesamten Bildes beleuchtet werden und somit ein hoher Untergrund entsteht, der zum Bildrauschen beiträgt.
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Ein weiterer wesentlicher Nachteil des Verfahrens ist die Tatsache, dass ein Lichtband nur dann dünn wird, wenn die Apertur des anregenden Strahls groß ist. Damit ist aber die nutzbare Länge des Strahls beschränkt und die Auflösung senkrecht zum Lichtband von der Position im Bildfeld abhängig. Je weiter der betrachtete Punkt von der Fokuslinie des Lichbandes entfernt ist, desto geringer ist die Auflösung. Voie et. al. (1992) gibt den Zusammenhang zwischen nutzbarer Länge des Lichtbandes b und der Dicke d im Fokus mit der Formel b = nπd2/(2λ) an, wobei λ die Wellenlänge des anregenden Lichtes und n der Brechungsindex des Mediums ist. Die Dicke des Lichtbandes beträgt im Fall einer beugungsbegrenzten Optik d = λf/π, wobei f die F-Zahl der Anregungsoptik ist. Je größer also das zu betrachtende Objekt ist, desto kleiner muss die Apertur des Lichtbandes gewählt werden, um d heraufzusetzen. Die Dicke der angeregten Schicht nimmt damit zu, so dass die erreichbare Auflösung abhängig von der Objektgröße wird.
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Ein weiterer Nachteil ist durch die Probe gegeben. Falls sich in der Probe absorbierende Partikel oder Bereiche befinden, werfen diese einen Schatten, der in der Bildeben verläuft und somit als dunkler gerichteter Streifen im Bild sichtbar wird. Dieser ist insbesondere dann von Nachteil, wenn die Bilderserien (Bildstapel) zur dreidimensionalen Rekonstruktion verwendet werden sollen bzw. wenn Verfahren der Dekonvolution zur Auflösungsverbesserung herangezogen werden sollen. Die Schattenbildung ist dann besonders stark, wenn die Apertur des Beleuchtungslichtes gering ist, wie dies insbesondere der Fall ist, wenn große Proben untersucht werden. Bei großen Proben sind zudem schattenbildende Partikel wahrscheinlicher, da die zu detektierende Fläche größer ist.
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Schattenbildung kann auf verschiedene Weise reduziert beziehungsweise vermieden werden. Ein Verfahren ist es, die Probe aus unterschiedlichen Richtungen zu beleuchten (Huisken, J. and Stainier, D. Y. R. 2007), so dass Schattenbildung und Unreinheiten der Probe ebenfalls in unterschiedliche Richtungen wirken. Offenbart ist dies auch in der
DE 10 2007 015 063 A1 . Wird die Einstrahlungsrichtung geändert, indem die Probe gedreht wird, können Serien von Aufnahmen mit unterschiedlicher Orientierung der Probe aufgenommen werden. Die Schwierigkeit besteht darin, unterschiedliche Aufnahmen korrekt miteinander zu verrechnen. Dies geschieht in der Regel im Fourierraum mit anschließender Rücktransformation. Kreuzungspunkte verschiedener Schatten sind dabei schlecht zu behandeln.
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Ein weiteres Verfahren besteht darin, die Beleuchtung aus verschiedenen Richtungen nur innerhalb der Beleuchtungsebene zu realisieren und dabei die Beleuchtungsachse um die Detektionsachse innerhalb eines Winkelintervalls zu drehen. Die Probe bleibt dabei gegenüber dem Detektionssystems unverändert, so dass dass das Fluoreszenzsignal über alle Drehwinkel auf der Kamera zeitlich integriert werden kann. Schatten, die von einzelnen Partikeln ausgehen, schwenken dann innerhalb des Beleuchtungswinkelintervalls und mitteln sich weitgehend heraus. Es bleibt lediglich das Volumen des Partikels selber und ein Kernschattenbereich hinter dem Partikel stark betroffen. Die Bildqualität ist wesentlich gegenüber dem Verfahren verbessert, bei dem das beleuchtende Lichtband lediglich aus einer Richtung eingestrahlt wird. Die Drehung des Lichtbandes kann mittels eines Spiegelscanners, vornehmlich mittels eines Polygonscanners, realisiert werden, dessen Spiegel so in die Probe abgebildet wird, dass bei Drehung des Polygons eine Drehung des Lichtblattes um die optische Achse erzeugt wird. Das Problem der Erzeugung eines Lichtblattes bleibt optisch bestehen.
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Verfahren der Schattenentfernung und der Bildverbesserung mittels strukturierter Beleuchtung können nur schwer kombiniert werden, da die strukturierte Beleuchtung nur dann vernünftig funktioniert, wenn die aufgeprägte Struktur während der Belichtungszeit stabil ist und nicht durch ein Winkelscanverfahren im Kontrast verringert wird.
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Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Anordnung anzugeben, die herkömmliche Mikroskopie hinsichtlich Auflösung und Effizienz noch einmal deutlich verbessern. Günstig wäre es zudem, wenn dabei auf einfache Weise die Schattenentfernung realisiert wird, eine effiziente Nutzung der zur Verfügung stehenden Lichtleistung erfolgt, ein variable Lichtblattbreite und/oder eine verbesserte kontrastreiche Auflösung erzielt wird, die an allen Stellen der Bildebene nahezu gleich ist.
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Diese Aufgabe wird gelöst durch eine Anordnung zur Mikroskopie mit den Merkmalen des Anspruchs 1, bzw. durch ein Mikroskopieverfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 11. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.
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Grundidee eines bevorzugten Ausführungsbeispiels der Erfindung ist, dass ein Beleuchtungs- oder Anregungslichtstrahl in der Probenebene in einer oder in beide Richtungen fokussiert wird. Dabei ist es vorteilhaft, wenn die Fokussierung telezentrisch ist. Bevor das Licht in die Probe fokussiert wird, wird der Strahl über einen Scanner abgelenkt, dessen Scanachse im Wesentlichen parallel zur Detektionsachse verläuft. Damit wird erreicht, dass sich der Laserstrahl parallel durch die Probenebene bewegten lässt. Führt der Scanner eine sägezahnförmige Scanbewegung aus, so beleuchtet der fokussierte Strahl sequentiell homogen einen Streifen. Die Summe aller Streifen setzt sich zu dem Lichtblatt zusammen, das im Stand der Technik eingesetzt wird. Die Amplitude der Scanbewegung ist vorteilhaft einstellbar, so dass die Breite des „Lichtblattes” eingestellt werden kann. Die in der Probenebene erzeugte Signalstrahlung, also z. B. Fluoreszenz, Zweite Harmonische (SHG), Dritte Harmonische (THG) oder Streulicht, wird mittels einer Detektionsoptik auf einen flächigen Detektor abgebildet, der einen Random-Access-Zugriff erlaubt, d. h. einen gezielten Zugriff auf ausgewählte Bereiche. Vorteilhafterweise wird als Detektor eine Kamera mit einem Rolling-Shutter-Betrieb verwendet, bei dem der aktive Bereich des Detektors auf einen Streifen aus ein oder mehreren Bildzeilen eingeschränkt werden kann und während einer Aufnahme kontinuierlich senkrecht zu den Bildzeilen bewegt werden kann. In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird der Scanner und die Kamera so orientiert, dass die aktive Bildzeile oder die aktiven Bildzeilen (aktiver Detektorstreifen) im Wesentlichen parallel zu der momentanen auf den Detektor abgebildeten Fokuslinie verlaufen. Die Synchronisation des Scanners und der Kamera ist so gewählt, dass das Bild des von der Fokuslinie ausgelösten Lichtes zu jedem Zeitpunkt der Bildaufnahme auf dem Detektor im Wesentlichen koaxial zum aktiven Detektorstreifen liegt.
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Günstig ist es, wenn die Form, die Länge und/oder die Breite des aktiven Detektorbereichs bzw. Detektorstreifens, das ist die Anzahl und Länge der aktiven Bildzeilen, variabel eingestellt werden kann. Damit ist es möglich, dass das Licht aus einem einstellbaren Bereich um die Strahltaille des anregenden Lichtstrahls vollständig gesammelt wird und das Licht aus den Bereichen des Bildes, die weiter entfernt von der Strahltaille des Anregungslichts angeregt wird, nicht oder nur zu geringen Teil erfasst wird.
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In Kombination mit dieser Eigenschaft ist es von Vorteil, wenn die Strahltaille mit geeigneten optischen Maßnahmen entlang der Anregungsstrahlachse verschoben werden kann. Dies kann vorteilhaft erreicht werden, indem die Einheit aus Scanner und telezentrischer Fokussierung entlang der Strahlachse beweglich angeordnet wird und die Einkopplung des Lichtes in diese Einheit wiederum parallel zu der Anregungsstrahlachse in der Probe erfolgt. Damit bleibt die Synchronisation des Anregungsscanprozesses und dessen Bildes auf dem Detektor mit dem aktiven Detektorstreifen bei der Verschiebung der Scan- und Fokussiereinheit erhalten, so dass der durch die Detektionsoptik definierte scharfe Bereich entlang der Bildzeilen durch das Objekt bewegt werden kann. Vorteilhaft ist diese Bewegung auch durch eine Steuereinheit motorisiert ausführbar, so dass Bilderserien aufgenommen werden können, so dass jeder Punkt der Objektebene zumindest in einem Bild der Serie von dem Bereich, also in ausreichender Nähe von der Strahltaille, überstrichen wird. Es kann auch von Vorteil sein, wenn synchron mit der Einheit aus Scanner und telezentrischer Fokussieroptik auch der Behälter bewegt wird, in dem sich die Probe befindet. Damit kann der optische Weg, den der Anregungsstrahl im optisch dichtem Medium in der Probenkammer zurücklegt, konstant gehalten werden und damit auch die Strahlqualität. Dabei kann es vorteilhaft sein, wenn die Probe auf einer Halterung innerhalb des Behälters gehalten wird und nicht mit dem Behälter bewegt wird.
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Ein weiteres vorteilhaftes Merkmal des Verfahrens ist es, wenn aus der Bildserie mittels einer Auswerteeinheit ein Bild mit hohem Kontrast und weitgehend homogener Auflösung extrahiert wird. Dabei sind Verfahren möglich, die lokal die Information aus der Bildserie verwenden. Dabei können zu Beispiel die Bildpunkte aus der Serie verwendet werden, die lokal maximale Intensität bzw. maximalen Kontrast aufweisen. Beispielsweise kann festgelegt werden, das an jedem Ort das Bild aus den x% hellsten oder kontrastreichsten Bildern zusammengesetzt wird, wobei x variabel ist und z. B. 10, 15, 20 oder 25 betragen kann. Optional kann auch eine definierte Anzahl „n” von benachbarten Bildern in die Berechnung einbezogen werden. Die Tatsache, dass die mittels der Verschiebung aufgenommene Bildserie auf Grund der lokalen leichten Konvergenz bzw. Divergenz des Lichtes außerhalb der Strahltaille eine Serie lokal unterschiedlich ausgedehnter Anregungsprofile enthält, kann verwendet werden, um die mathematischen Methoden der weiteren Auflösungs- und Kontrasterhöhung anzuwenden. Die Bildserie stellt somit eine Art strukturierter Beleuchtung dar.
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Ein weiterer Vorteil der Aufnahme einer Bildserie ist es, dass somit das finale Bild nachträglich bezüglich der Bildhelligkeit oder Auflösung optimiert werden kann, indem mehr oder weniger Bilder der Serie in die lokale Bildgeneration einbezogen werden.
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Eine vorteilhafte Anordnung verwendet als Lichtquelle sichtbare kontinuierliche Laser unterschiedlicher Wellenlängen, die simultan oder sequentiell eingestrahlt werden. Des Weiteren kann ein Superkontinuumlaser verwendet werden, der mittels dielektrischer oder akustooptischer Filter auf einen oder mehrere Wellenlängenbereiche eingeschränkt wird. Des Weiteren kann auch ein Kurzpulslaser angewendet werden, der mittels Mehrphotonenanregung eine Linie innerhalb der Probe anregt oder innerhalb einer Linie SHG- oder THG-Licht erzeugt.
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In der Detektionsoptik wird vorteilhaft ein Filtersystem angeordnet, so dass bei Fluoreszenzdetektion das Streulicht des Anregungslichtes geblockt wird und spezifische Fluorophore (bzw. SHG oder THG) bezüglich ihrer Detektionswellenlänge selektiert werden.
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Eine weitere vorteilhafte Variante des Verfahrens verwendet zwei oder mehr (z. B. synchron zueinander laufende) Kameras, auf die das Fluoreszenzlicht spektral oder entsprechend seiner Polarisation aufgespalten gesammelt wird, so dass mehrere Farbstoffe oder Lichtsignale mittels ein oder mehrerer Anregungswellenlängen und ein oder mehrerer Detektionsfilter dargestellt werden können.
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Eine weitere vorteilhafte Erweiterung der Anordnung besteht darin, dass mindestens eine weitere im Wesentlichen identische Scan- und Beleuchtungseinheit z. B. auf der gegenüberliegenden Seite der ersten Einheit angeordnet wird und entweder zeitgleich oder sequentiell verwendet wird. Die Kameras könnten auch unter einen Winkel von 90° zueinander angeordnet sein. Damit ist eine weitere Bildverbesserung insbesondere bei großen Proben möglich, bei denen die Strahltaille des Anregungslichtes beim Durchgang durch die Probe durch Brechung, Streuung und Absorption an Qualität verliert. Hier kann dann die Beleuchtung von der gegenüberliegenden Seite oder/und unter 90° vorteilhaft sein.
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Die zusätzliche Beleuchtung von einer anderen Seite kann auch mittels eines Scanners realisiert werden, wobei das Anregungslicht nach dem Scanner mittels Optiken auf die verschiedenen Seiten des Probe gelenkt wird. Dazu sind eventuell Zwischenabbildungen vorteilhaft. Der Scanner kann auch innerhalb des maximalen Scanbereiches mehrere Intervalle ansteuern, die dann ohne zusätzliche bewegliche Teile auf verschiedene Seiten der Probe gelenkt werden. Dabei kann der Strahl innerhalb eines Intervalls (A) auf einen Spiegel treffen, der das Lichtband von einer Seite erzeugt, und innerhalb eines disjunkten Intervalls (B) auf einen anderen Spiegel fallen, der das Licht auf eine andere, vorzugsweise auf die gegenüberliegende Seite, umlenkt.
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Eine weitere vorteilhafte Variante des Verfahrens ist es, dass zusätzlich und im Wesentlichen koaxial zum Anregungslaser eine zweiter Laser eingestrahlt wird, der als STED-Laser arbeitet und mit Hilfe dessen das Anregungsvolumen auf einen sehr kleinen Durchmesser reduziert werden kann, der dann auf den aktiven Streifen (10) abgebildet wird. STED steht für „stimulated emission depletion”.
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Für den Anregungslaser und auch für einen eventuell eingesetzten STED-Laser können Strahlen eingesetzt werden, die durch Phasenmasken oder polarisationsdrehende Masken speziell geformt sind. Damit können z. B. Besselstrahlen erzeugt werden, bei denen der Anregungsstrahldurchmesser auf einer langen Strecke nahezu konstant ist. Die Verwendung der mitlaufenden Schlitzblende des Rolling-Shutters schneidet dabei die Teile des Lichtes heraus, die außerhalb der Schärfeebene der Detektionsoptik erzeugt oder gestreut werden. Zum Fokussieren des Anregungslichts kann ein Axicon verwendet werden.
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Im Falle des Einsatzes der STED-Technik ist es von Vorteil, wenn die Intensitätsverteilung des Anregungs- bzw. STED-Laserstrahls unterschiedliche Ordnungen von Besselfunktionen aufweisen, tangential polarisiert sind und/oder mit unterschiedlicher Divergenz eingestrahlt werden, damit trotz unterschiedlicher Wellenlängen der beiden Laser die Nebenmaxima weitgehend aufeinanderfallen und somit durch den STED-Laser die Anregung in den Nebenmaxima des Besselstrahls des Anregungslasers ausgelöscht wird.
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Eine Eigenschaft moderner CMOS-Kameras ist es, dass mehrere, insbesondere zwei getrennte Streifen synchron (aber relativ zueinander versetzt) oder alternierend überlappend durch das Bild laufen können. Damit ist es möglich, die Strahlen von beiden Seiten zeitgleich aber auf der Kamera getrennt voneinander zu verwenden.
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Die Kamera könnte auch so angesteuert werden, dass mehrere Bereiche gleichzeitig in disjunkte Bilder ausgelesen und gespeichert werden. Dabei kann es von Vorteil sein, wenn ein Bereich koaxial mit dem Anregungslichtstrahl und zwei weitere Bereiche parallel angrenzend ausgelesen werden, so dass der Streulichtanteil damit direkt quantifiziert und zur Korrektur des Bildes verwendet werden kann.
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Die Verwendung eines Spiegelscanners mit einem sägezahnartigen Verlauf kann optimiert werden, indem ein schneller Lichtschalter die Lichtquelle ausschaltet, wenn der Scanner zurückläuft. Dafür kann auch ein Chopperrad verwendet werden. Wird die Kamera so programmiert, dass der Rolling Shutter bidirektional über den Detektor bzw. Sensor läuft, so kann auf das Schalten der Lichtquelle verzichtet werden. Wird ein Polygonscanner verwendet, so läuft der fokussierte Strahl nur aus einer Richtung über die Detektionsfläche. Der Rolling Shutter kann dann unidirektional betrieben werden und es kann auf ein schnelles Schalten der Lichtquelle verzichtet werden.
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Die Verfahren Highly inclined and laminated optical sheet (HILO) microscopy Tokunaga et al. (2008) und Oblique plane microscopy (OPM) Dunsby (2008) erzeugen das Lichtblatt durch die Anregungsoptik selber. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch mit diesen Methoden kombiniert werden, wenn die Anregungsoptik analog zur Lichtblattoptik in diesen Verfahren eingesetzt wird. Es muss allerdings eventuell von der Telezentrizität des Anregungslichtstrahls abgewichen werden, da die Vergrößerung in diesen Verfahren über das Bildfeld nicht konstant ist. Hier muss eventuell eine trapezförmige Verzerrung berücksichtigt und korrigiert werden.
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Eine weitere Variante des Verfahrens kombiniert das Verfahren mit einer Stimulationspulslichtquelle, die für die lokale Stimulation vorteilhaft durch die Detektionsoptik oder aus einer anderen Richtung in die Probe eingestrahlt werden kann. Dabei wird die Stimulation zeitlich vorteilhaft so ausgeführt, dass der Detektionsstrahl sich in einer definierten Position relativ zum Stimulationsbereich befindet. Damit wird es möglich zu stimulieren, ohne dass die Detektion gestört ist. Gleichzeitig ist es möglich, durch Variation des Zeitablaufs zwischen Stimulation und Scanner das präzise zeitliche Verhalten der Probe als Folge der Stimulation zu untersuchen. Methoden der Stimulation können mittels Scanner, Blitzlampen mit festen oder digitalen Masken, die mittels LCD- oder DLP-Elementen variabel gestaltet werden, durchgeführt werden.
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Im Folgenden werden vorteilhafte Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand einer Zeichnung näher dargestellt. Im Einzelnen zeigen:
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1 eine Mikroskopieanordnung nach dem Stand der Technik,
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2 ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Mikroskopieanordnung,
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3 die Detektorfläche,
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4 ein zweites Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Mikroskopieanordnung und
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5 ein drittes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Mikroskopieanordnung.
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Gleiche Komponenten sind in den Figuren durchgängig mit gleichen Bezugszeichen versehen.
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1 zeigt eine herkömmliche Mikroskopieanordnung nach dem SPIM-Verfahren (SPIM: selective plane illumination microscopy). Bei dieser herkömmlichen Mikroskopieanordnung erzeugt eine Lichtquelle 1 Anregungslicht, das eine Probe zur Abgabe von Signalstrahlung (beispielsweise Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Zweite Harmonische, Dritte Harmonische oder Streulicht) anregt. Die Anregungsstrahlung wird mittels einer Fokussieroptik in das Probenvolumen 4 fokussiert, um dort ein möglichst flaches „Lichtblatt” 14 zu erzeugen. Beispielsweise umfasst die Fokussieroptik dazu eine Zylinderlinse und eine Fokussierlinse. Im Probenvolumen 4 befindet sich eine Probe, die dort beispielsweise mittels einer Halterung oder in einer Kammer gelagert ist.
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Durch eine Detektionsoptik 5 wird das Probenvolumen 4 auf einen Detektor 6 abgebildet. Die durch die Detektionsoptik 5 definierte Detektionsrichtung steht dabei senkrecht auf der Einstrahlrichtung des Anregungslichts.
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2 zeigt ein erstes Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Mikroskopieanordnung. Auch bei der erfindungsgemäßen Mikroskopieanordnung wird Anregungslicht mittels einer Lichtquelle 1 erzeugt, bei der es sich beispielsweise um einen Laser oder um eine Superlumineszenzdiode handeln kann. Das Anregungslicht läuft über eine Ablenkungseinheit 2, beispielsweise einen Scanner. Der Scanner 2 dient dazu, das Anregungslicht horizontal oder vertikal zu verlagern.
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Eine Fokussieroptik 3 erzeugt einen Linienfokus des Anregungslichts in einem Probenvolumen 4. Durch das Zusammenspiel des Scaners 2 mit der Fokussieroptik 3 kann der Linienfokus in horizontaler Richtung innerhalb des Probevolumens 4 verlagert werden, wie dies durch den Pfeil 12 angedeutet ist. Optional könnte der Liniefokus des Anregungslichts auch vertikal verlagert werden, um einen Ausschnitt in einer anderen Ebene der Probe zu beleuchten.
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Im dargestellten Ausführungsbeispiel befinden sich der Scanner 2 und die Fokussieroptik 3 auf einem gemeinsamen Verschiebetisch, auf dem sie in einer Richtung 11 verlagert werden können, d. h. auf die Probe 4 zu oder von der Probe 4 fort. Durch die Verschiebebewegung kann der Fokus des Anregungslichts entlang der Einstrahlrichtung innerhalb des Probenvolumens 4 verlagert werden.
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Über eine Detektionsoptik 5 wird das Probegebiet auf einen flächigen Detektor 6 mit einer Detektionsfläche 7 abgebildet. Die Schärfebene der Detektionsoptk 5 bestimmt, welcher Bereich der Probe scharf auf den Detektor 6 abgebildet wird. Die Detektionsoptik 5 ist optimiert zum Abbilden der Signalstrahlung, beispielsweise also der Fluoreszenz aus der Probe. Um Hintergrundlicht zu unterdrücken, kann in der Detektionsoptik 5 oder am Detektor 6 ein Filter vorgesehen sein, der im Wesentlichen nur die Signalstrahlung passieren lässt.
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Bei dem Detektor 6 handelt es ich um eine CCD- oder eine CMOS-Kamera. 3 zeigt die Detektorfläche 7 des Detektors 6. Mit 8 ist der fokussierte Verlauf des Anregungslichts bezeichnet, dessen Strahltaille über die Detektionsoptik 5 auf die Detektorfläche 7 abgebildet wird. Mit 9 sind die Ränder des Schärfebereichs des Anregungslichts innerhalb der Detektorfläche 7 bezeichnet. An diesen beiden Stellen 9 hat sich die Fläche des Anregungslichts, ausgehend von der Strahltaille, um den Faktor Wurzel aus 2 vergrößert.
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In der erfindungsgemäßen Mikroskopieanordnung ist die zum Auslesen verwendete, aktive Fläche 10 der Detektorfläche 7 beschränkbar. In 3 ist die aktive Fläche 10 auf den schraffierten Bereich der Detektorfläche 7 beschränkt. Der aktive Bereich 10 bildet damit einen Streifen, der die Abbildung des Fokus des Anregungslichts 8 umfasst. Die Breite des aktiven Bereichs kann auch kleiner als Breite der Strahltaille gewählt werden. Signalstrahlung aus den Bereichen der Probe, die außerhalb des aktiven Bereichs 10 auf die Detektorfläche 7 abgebildet werden, werden durch die Beschränkung auf die aktive Fläche 10 nicht erfasst. Auf diese Weise wird ein Hintergrundrauschen unterdrückt und die Auflösung der Mikroskopieanordnung erheblich gesteigert. Ein weiterer Vorteil liegt darin, dass jeder Bereich der Detektorfläche 7 nur eine minimale Belichtungsdauer aufweist, sodass der Dunkelstrom des Detektors 6 durch diese kurze Belichtungszeit erheblich reduziert wird.
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Die Beschränkung der aktiven Fläche 10 des Detektors 6 kann bei einer CCD- oder CMOS-Kammera dadurch erfolgen, dass diese einen sogenannten „Rolling-Shutter-Betrieb” ermöglicht. Eine (nicht dargestellte) Steuerung definiert dabei den aktiven Bereich 10 der Detektorfläche 7.
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Wird der Fokus 8 des Anregungslichts mittels der Ablenkungseinheit 2 in Richtung 12 verlagert, verlagert sich auch die Abbildung des Fokusbereichs 8 auf der Detektorfläche 7, und zwar in Richtung 13. Die aktive Fläche 10 des Detektors 6 wird dann ebenfalls verlagert, um der Verlagerung des Fokusbereichs des Anregungslichts zu folgen.
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Wird der Verschiebetisch mit dem Scanner 2 und der Fokussieroptik 3 in Richtung 11 verschoben, verlagert sich der Fokus des Anregungslichts 8 auf der Detektorfläche 7 ebenfalls in Richtung 11, d. h. entlang der Einstrahlrichtung. Die aktive Fläche kann in Richtung 11 ebenfalls beschränkt sein, beispielsweise auf den Schärfebereich 9 des Anregungslichts 8. In diesem Fall sollte die aktive Fläche 10 an die Verlagerung des Fokuses Anregungslichts in Richtung 11 angepasst werden.
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4 zeigt ein zweites Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Mikroskopieanordnung. Im Unterschied zum ersten Ausführungsbeispiel kann das Anregungslicht hier aus entgegensetzten Richtungen in das Probenvolumen 4 eingestrahlt werden. Dies ist vor allem bei größeren Proben vorteilhaft, um mittels der Wahl der Einstrahlungsrichtung die Streuung in der Probe zu vermeiden.
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In einem ersten Winkelbereich A fällt das Licht vom Scanner 2 auf einen ersten Umlenkspiegel und gelangt auf diese Weise über eine Transferoptik 15 von links in das Probenvolumen 4. In einem zweiten Winkelbereich 2 gelangt das Anregungslicht – ausgehend vom Scanner 2 – auf einen zweiten Umlenkspiegel, um von dort mittels einer Transferoptik 15 von rechts in das Probenvolumen 4 eingestrahlt zu werden. Dargestellt sind jeweils drei unterschiedliche Pfade des Anregungslichts, die sich bei unterschiedlichen Winkelstellungen des Scanners 2 ergeben, um den Fokus des Anregungslichts in horizontaler Richtung, d. h. in Richtung 12, innerhalb des Probenvolumens 4 zu verlagern. Der Scanner 2, die Transferoptik 15 und die Umlenkspiegel befindet sich auf einem strichliert gezeichneten, gemeinsamen Verschiebetisch, dessen Verlagerung in Richtung 11 den Fokus des Anregungslichts innerhalb der Probe 4 entlang der Einstrahlrichtung verlagert.
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5 zeigt ein weiters Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Mikroskopieanordnung, bei der das Anregungslicht ebenfalls aus zwei Richtungen in das Probenvolumen 4 eingestrahlt werden kann. In diesem Fall ist ein verschiebbarer Spiegel vorgesehen. Befindet er sich im Strahlengang des Anregungslichts, gelangt das Anregungslicht über einen Scanner 2 und die Fokussieroptik 3 von links in das Probenvolumen 4. Befindet sich der verschiebbare Spiegel nicht im Strahlengang, gelangt das Anregungslicht von rechts in das Probenvolumen 4. Strichliert ist wiederum ein Verschiebetisch dargestellt, der die optischen Elemente trägt und in Richtung 11 verschoben werden kann. Durch diese Bewegung wird der Fokus des Anregungslichts innerhalb des Probenvolumens 4 entlang der Einstrahlrichtung verlagert. Denkbar ist es auch, dass es sich bei dem verschiebbaren Spiegel um einen dichroitischen Spiegel handelt, der sich dauerhaft im Strahlengang befindet. Auf diese Weise kann das Probenvolumen 4 aus einer Richtung mit einer anderen Wellenlänge beleuchtet werden als aus der anderen Richtung.
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Ausgehend von dem dargestellten Ausführungsbeispielen lassen sich die erfindungemäße Mikroskopieanordnung und das erfindungsgemäße Mikroskopieverfahren auf vielfache Weise verändern.
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Beispielsweise kann statt des Rolling Shutters auch eine verfahrende, mechanische Schlitzblende verwendet werden.
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Alternativ zum Erzeugen eines Linienfokus kann die Fokussieroptik auch ein schmales Lichtblatt erzeugen, um Sättingungseffekten durch eine zu hohe Intensität der Anregungsstrahlung vorzubeugen. Die aktive Fläche des Detektors sollte dann entsprechend angepasst werden.
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Literatur
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