DE102018220779A1

DE102018220779A1 - Nachweisverfahren von induzierten Lichtsignalen in einer dreidimensionalen Region einer Probe

Info

Publication number: DE102018220779A1
Application number: DE102018220779.8A
Authority: DE
Inventors: Thomas KALKBRENNER
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2018-12-03
Filing date: 2018-12-03
Publication date: 2020-06-04
Also published as: WO2020114930A1; JP2022511009A; JP7472134B2; US20220057329A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Nachweisverfahren von optischen Signalen (12) in einer dreidimensionalen Region einer Probe (7) sowie ein Nachweisverfahren von markierten Antikörpern (10) und/oder Antigenen (9) auf einer biologischen Oberfläche. Dabei werden Signale (12) mit einer gegenüber einer ursprünglichen Schärfentiefe (DOF) erhöhten Schärfentiefe (EDOF) erfasst und ausgewertet.Die Erfindung betrifft außerdem eine Vorrichtung mit einem optischen Element (14) in einem Detektionsstrahlengang (3), durch deren Wirkung eine gegenüber einer ursprünglichen Schärfentiefe (DOF) erhöhte Schärfentiefe (EDOF) erzeugt wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Nachweisverfahren von Lichtsignalen insbesondere in einer biologischen Probe.
Aus dem Stand der Technik sind eine Reihe von hochauflösenden Verfahren bekannt, mittels derer induzierte Lichtsignale biologischer Proben erfasst und ausgewertet werden können. Dabei seien insbesondere hochauflösende Mikroskopierverfahren wie beispielsweise PALM (photoactivated localization microscopy), STORM (stochastic optical reconstruction microscopy), oder dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy) genannt.
Bei den genannten Verfahren werden einzelne, mit einem schaltbaren Fluoreszenzmarker (Fluorophore) versehene Moleküle lokalisiert, indem diese Fluoreszenzmarker (fortan auch kurz als Marker bezeichnet) sukzessive aktiviert und/oder angeregt werden. Die angeregten Marker emittieren eine Fluoreszenzstrahlung, die erfasst und die Position des betreffenden Markers lokalisiert werden kann. Das sequentielle oder sukzessive Aktivieren und/oder Anregen individueller Marker kann auch als ein Vorgang des Vereinzelns angesehen werden, bei dem Fluoreszenzsignale einzelner Moleküle erfasst werden können, selbst wenn diese unterhalb der Auflösungsgrenze zueinander vorliegen.
Das Vereinzeln und Lokalisieren beispielsweise mithilfe des PALM beziehungsweise des dSTORM-Verfahrens (=Einzelmolekül-Lokalisierungsmikrokopie), ist zum Beispiel in der US 8,988,771 B2 beschrieben. Die Verwendung photoschaltbarer Marker erlaubt dabei das sukzessive Aktivieren/Anregen und anschließende Lokalisieren von Untermengen der z. B. an Antikörper gekoppelten Marker. Damit können die Fluorophore und damit auch die Antikörper mit einer Empfindlichkeit auf der Ebene von Einzelmolekülen quantifiziert werden.
Nachteilig an den genannten Verfahren des Standes der Technik ist, dass die Proben zumeist eine 3D-Struktur aufweisen und diese 3D-Struktur im Allgemeinen bedingt, dass sie in Gänze nur durch Fokusstapel zu erfassen ist. Es muss dazu für jede Ebene des Fokusstapels eine Vielzahl von Einzelbildern aufgenommen werden, um die zu quantifizierenden Moleküle in gewünschter Genauigkeit erfassen zu können. Außerdem können die photoschaltbaren Marker nur in der Fokusebene bzw. der Schärfentiefe des Mikroskopobjektivs erfasst werden. Die Marker liegen aber in den biologischen Proben räumlich vor und werden anteilig auch ober- und unterhalb einer aktuellen Fokusebene aktiviert und/oder geblichen. Beispielsweise werden vorzeitig geblichene Marker nicht mehr erfasst, wenn die Datenerfassung in derjenigen Fokusebene erfolgt, in der der betreffende Marker tatsächlich vorliegt.
Dieser nachteilige Effekt ist in 1 verdeutlicht. In einem lediglich angedeuteten Mikroskop 1 wird entlang eines nicht näher dargestellten Beleuchtungsstrahlengangs 2 (siehe 3 bis 8) Beleuchtungsstrahlung mittels eines Objektivs 5 durch einen Probenträger 6 auf eine Probe 7 gerichtet. Die Probe 7 ist eine mit photoschaltbaren Markern 8 modifizierte Zelle. Die Marker 8 sind beispielsweise an Antigene 9 (nicht gezeigt) gebunden, die sich an der Zellmembran der Probe 7 befinden.
Die jeweils mittels des Objektivs 5 eingestellte Fokusebene weist aufgrund optischer und technischer Rahmenbedingungen eine geringe Ausdehnung in Richtung der Z-Achse auf, die auch als DOF (depht of focus) bezeichnet wird und beispielhaft durch einen Doppelpfeil veranschaulicht ist. Diese Fokusebene entspricht nominal der Schärfentiefe des Objektivs 5.
Zu einem Erfassungszeitpunkt werden mittels des Objektivs 5 die in der jeweiligen Fokalebene DOF vorhandenen angeregten und Fluoreszenzstrahlung als Detektionsstrahlung aussendenden Marker 8 mittels eines Detektors 13, beispielsweise einer Kamera als Signale 12 erfasst. Im Detektionsstrahlengang 3 können dabei weitere optische Elemente wie z. B. eine Tubuslinse 10 vorhanden sein.
Aus der schematischen 1 ist gut zu entnehmen, dass zum dargestellten Zeitpunkt lediglich die zwei innerhalb der Fokalebene DOF befindlichen Marker 8 mit dem Detektor 13 erfasst werden. Um ein Bild der gesamten Probe 7 zu erhalten, muss dieses aus einem Bilderstapel generiert werden. Der Bilderstapel wird erhalten, indem die Fokalebene DOF beispielsweise durch Verschieben des Objektivs 5 (oder des Probenträgers 6, nicht gezeigt) in der Richtung der Z-Achse Z (Z-Richtung) verschoben und in geeigneten Abständen der Fokalebenen DOF jeweils Bilder erfasst werden. Die unterschiedlichen Fokalebenen DOF und Stellungen des Objektivs 5 sind mit horizontalen Strichlinien symbolisiert. Die Punktbildverwaschungsfunktion PSF in Richtung der Z-Achse Z ist schematisch dargestellt.
Für einige Anwendungen photoschaltbarer Marker ist es von großer Bedeutung, dass keine Marker einer Erfassung entgehen. Solche falsch-negativen Ergebnisse, bei denen tatsächlich vorhandene Marker nicht nachgewiesen werden, sind beispielsweise bei der Erforschung von Antigenen auf Zellen und/oder dem Nachweis von Antikörper-Antigen-Bindungen sehr nachteilig.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Möglichkeit zur Ermittlung einer Anzahl von Fluoreszenzsignalen in einer dreidimensionalen Region einer Probe vorzuschlagen, mit der die Nachteile des Standes der Technik verringert werden.
Die Aufgabe wird mit Nachweisverfahren gemäß der Ansprüche 1 und 2 gelöst. Eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur Ausführung der Verfahren ist Gegenstand des Anspruchs 5. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung finden sich in den abhängigen Ansprüchen.
Das Nachweisverfahren von Fluoreszenzsignalen in einer dreidimensionalen Region einer Probe, beinhaltet ein Erfassen von Bilddaten der dreidimensionalen Region mittels einer optischen Vorrichtung, wobei die Bilddaten in einer zweidimensionalen Bildebene abgebildet und erfasst werden. Die Anzahl von Fluoreszenzsignalen in der Bildebene wird ermittelt, der Region der Probe zugeordnet und gespeichert. Die derart zugeordneten und gespeicherten Anzahlen werden zum Abrufen bereitgestellt.
Erfindungsgemäß werden die Fluoreszenzsignale erfasst, indem die Ausdehnung einer Fokusebene in Richtung der optischen Achse der optischen Vorrichtung, insbesondere in Richtung einer Detektionsachse der optischen Vorrichtung, vergrößert und ein Fokusbereich gebildet wird. Die mittels dieses EDOF-Ansatzes (EDOF = Extended Depth of Focus) in der dreidimensionalen Region erfassten Fluoreszenzsignale werden in die Bildebene projiziert und als zweidimensionale Abbildung erfasst.
Im Sinne dieser Beschreibung ist eine Fokusebene die nominelle Schärfentiefe eines verwendeten Objektivs. Eine erhöhte Schärfentiefe kann aus mehreren Fokusebenen oder aus mehreren Fokusbereichen zusammengesetzt sein, wobei ein Fokusbereich bereits eine gegenüber der ursprünglichen Schärfentiefe des Objektivs erhöhte Schärfentiefe darstellt.
Die Idee besteht in der 2D-Projektion aller Fluoreszenzereignisse, d.h. aller Fluoreszenzsignale, in einem gegebenen 3D-Volumen der Probe, z. B. einer Zelle, auf mindestens einen Detektor. Dazu wird das abzubildende Volumen in Z-Richtung mittels einer geeigneten EDOF-Optik erfasst. Es ist erkannt worden, dass eine erhebliche Verbesserung der quantitativen Nachweisgenauigkeit erreicht wird, wenn auf den Vorteil der dreidimensionalen Auflösung der erfassten Bilddaten und Fluoreszenzsignale verzichtet wird. Damit wird eine technische Verbesserung auf einem Gebiet, dem Zählen von Signalen, erreicht, indem auf einem anderen Gebiet, dem hochauflösenden Erfassen, Maßnahmen ergriffen werden.
Die Information über die Position eines ein Fluoreszenzsignal emittierenden Markers in Richtung der Z-Achse (Z-Richtung, Detektionsachse) wird hierbei bewusst aufgegeben. Auch die Präzision der lateralen Lokalisierung kann nachgelassen werden, da mit den erfindungsgemäßen Verfahren keine strukturelle Hochauflösung erzielt werden soll. Die Erfindung betrifft also nicht das Gewinnen struktureller Information unterhalb der Beugungsgrenze („Superresolution“), sondern ein hochempfindliches Zählen von Fluoreszenzsignalen. Eine zusätzlich anfallende superaufgelöste 2D-Ortsinformation kann natürlich dennoch genutzt werden, um beispielsweise Antikörperverteilungen an Zellmembranen genauer zu erforschen.
Die Erfassung der Fluoreszenzsignale unter Verwendung des hier beschriebenen EDOF-Ansatzes oder EDOF-Verfahrens ist von bekannten Darstellungsverfahren, beispielsweise der Maximumintensitätsprojektion (maximum intensity projection; MIP), zu unterscheiden. Mittels des EDOF-Verfahrens können sowohl positive als auch negative Bildwerte erfasst und abgebildet werden. So können bei Phasengradientverfahren negative Bildwerte (Pixelwerte) auftreten, für deren Erfassung die MIP nicht geeignet ist, aber mittels EDOF qualitativ hochwertige Bilddaten erfasst werden können (siehe dazu z. B. Giese et al. (2014): Fast volumetric phase-gradient imaging in thick samples; Optice Express 22: 1152 - 1162).
In einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens können Antigene auf biologischen Oberflächen nachgewiesen werden. Das Nachweisverfahren umfasst das Inkubieren der biologischen Oberfläche mit mindestens einem Antikörper, der an das nachzuweisende Antigen bindet und der mit einem Marker versehen ist. Der Marker ist zur Emission von Lichtsignalen, beispielsweise zur Emission angeregter Fluoreszenzstrahlung und daher von Fluoreszenzsignalen, geeignet. Alternativ wird eine mit einem solchen markierten Antikörper inkubierte biologische Oberfläche verwendet. Die vorzugsweise an einem Antigen gebundenen Antikörper werden zur Emission von Lichtsignalen, insbesondere von Fluoreszenzsignalen, angeregt. Das kann beispielsweise durch eine Anregungsstrahlung erfolgen. Mittels einer optischen Weitfeldanordnung und einer EDOF-Optik werden Bilddaten erfasst, die emittierte Lichtsignale umfassen können Der Aufbau einer vorteilhaft verwendeten Weitfeldanordnung wird unten ausführlich erläutert.
Als Antigene werden Verbindungen oder Moleküle, beispielsweise Proteine, Kohlenhydrate, Lipide, DNS-Moleküle, Saccharide und Schwermetalle verstanden, die die Antikörper spezifisch binden können. Eine spezifische Bindung erfolgt an Epitopen der Antigene, wobei ein Antigen mehrere Epitope aufweisen kann.
Die erfassten Bilddaten werden hinsichtlich des Vorhandenseins von erfassten Fluoreszenzsignalen ausgewertet und es wird eine Anzahl der erfassten Lichtsignale ermittelt, gespeichert und bereitgestellt.
Als Marker können in einer Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Verfahren photoschaltbare Moleküle verwendet werden. Während der Erfassung der Fluoreszenzsignale wird je Zeitraum eine Untermenge der Anzahl von Markern zur Emission von Lichtsignalen (Fluoreszenzsignalen) angeregt. Die emittierten Lichtsignale werden in einer Zeitserie erfasst. Mit einer derartigen Ausgestaltung des Verfahrens ist auch die Anzahl von solchen Markern erfassbar, die räumlich sehr nah beieinander liegen oder die in Richtung der Z-Achse hintereinander liegen und anderenfalls in einem gemeinsamen Punkt der Bildebene abgebildet werden würden. Die Marker werden durch die Erfassung in einer Zeitserie in Hinblick auf die Detektion vereinzelt.
Das konkrete Vorgehen beim Vereinzeln und bei einer Lokalisation des Ursprungsorts eines jeweiligen Fluoreszenzsignals wird in Abhängigkeit von dem verwendeten Marker beziehungsweise den verwendeten Markern ausgeführt. Dabei wird die durch das EDOF-Verfahren modifizierte Punktbildverwaschungsfunktion (Punktbildübertragungsfunktion; point spread function; PSF) beachtet und bei der Auswertung der Bilddaten berücksichtigt.
Die verwendeten Marker können Farbstoffe im Sinne der WO 2006/127 692 A2 (PTOL, phototransformable optical labels) sein. Beispiele hierfür sind photokonvertierbare oder photoschaltbare fluoreszierende Proteine wie Dronpa, EOS etc. sowie deren Derivate. Es können auch synthetische Farbstoffe wie Alexa 647 als Marker verwendet werden, die durch Licht und/oder (chemische) Modifikation der Umgebungsbedingungen in langlebige Dunkelzustände verbracht werden können. Außerdem ist die Verwendung von Cage-Dyes wie caged Rhodamine möglich (Grimm, Jonathan B., et al., 2013: Carbofluoresceins and carborhodamines as scaffolds for high-contrast fluorogenic probes; ACS chemical biology; 8.6: 1303 - 1310).
Das erfindungsgemäße Nachweisverfahren kann zum Nachweis mehrerer unterschiedlicher Marker beziehungsweise mehrerer mit unterschiedlichen Markern versehener Antigene verwendet werden.
In weiteren Ausgestaltungen des Verfahrens kann in Abhängigkeit der jeweiligen Probe eine Anpassung der erhöhten Schärfentiefe und/oder weiterer optischer Parameter erfolgen. In einer möglichen Ausgestaltung kann die erhöhte Schärfentiefe selbst eingestellt werden. Alternativ oder zusätzlich können mindestens zwei Fokusebenen erzeugt werden. Überschneiden sich mindestens zwei der Fokusebenen oder grenzen diese aneinander an, kann auch auf diese Weise mindestens ein Fokusbereich mit einer erhöhten Schärfentiefe erzeugt werden. Im Sinne dieser Beschreibung liegt auch eine erhöhte Schärfentiefe vor, wenn zwei oder mehr Fokusbereiche erzeugt werden, die sich in Richtung der Detektionsachse (Z-Richtung) nicht überschneiden aber in Richtung der Detektionsachse einen gegenüber der ursprünglichen Schärfentiefe insgesamt größeren Bereich scharf abbilden.
Resultierend kann eine erhöhte Schärfentiefe erzeugt werden, indem mindestens zwei Fokusebenen mit einer ursprünglichen Schärfentiefe oder mindestens zwei Fokusbereiche mit einer erhöhten Schärfentiefe oder mindestens eine Fokusebene mit einer ursprünglichen Schärfentiefe und mindestens einem Fokusbereich mit einer erhöhten Schärfentiefe erzeugt werden.
Solche auch als bifokal beziehungsweise multifokal bezeichnete Abbildungen können beispielsweise so eingestellt werden, dass mittels einer bifokalen Abbildung lediglich eine untere und eine obere Zellmembran der Probe zugleich erfasst werden. Der Vorteil liegt dabei in einer Reduzierung der Bilddaten auf die interessierenden Bereiche der Probe (region of interest; ROI). Zudem werden die Fluoreszenzphotonen effizienter genutzt. Mittels einer multifokalen Abbildung kann beispielsweise das gesamte Volumen der Probe erfasst werden. Nachträglich ist eine unabhängige Auswertung der einzelnen Fokusebenen beziehungsweise Fokusbereiche möglich.
In Verfahrensausgestaltungen, in denen unter Nutzung einer multifokalen Abbildung mit EDOF eine Überlappung aller oder wenigstens einiger der Fokusebenen /bereiche angestrebt ist, muss eine Doppelerfassung von Fluoreszenzsignalen (Signale) vermieden werden. Dies kann beispielsweise dadurch geschehen, dass die erfassten Signale auf den unterschiedlichen Bereichen des Detektors miteinander verglichen werden. Wird ein Signal eines Markers oder markierten Antikörpers auf verschiedenen Bereichen des Detektors erfasst, so wird dieses nur einmal gezählt. Solche doppelten Erfassungen desselben Signals können beispielsweise mittels eines Vergleichs und Auswertung der Ortskoordinaten in den Detektorbereichen nachgewiesen werden. Es kann auch vor einer Auswertung eine Korrelation der erfassten Signale der Bildelemente oder Pixel des Detektors ausgeführt werden.
In weiteren Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens kann Beleuchtung der Probe mit einem Lichtblatt erfolgen. Dieses kann in einer Dicke erzeugt werden, die einem EDOF-Bereich entspricht.
Obwohl mit den Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens die Information über eine Z-Position eines Ursprungsorts eines erfassten Signals völlig beziehungsweise im Falle multifokaler Abbildungen weitgehend, aufgegeben wird, kann weiterhin eine zweidimensionale Lokalisierung erfolgen. Ein solche 2D-Lokalisierung der Fluoreszenzsignale wird in Abhängigkeit von dem jeweils gewählten EDOF-Verfahren und der sich daraus ergebenden PSF vorgenommen. Möglich sind dabei beispielsweise eine Lokalisierung mittels Schwerpunktbestimmung der PSF sowie Nutzung einer theoretischen PSF oder einer experimentell bestimmten PSF. Außerdem ist eine Lokalisierung mittels Anpassen analytischer Funktionen oder Näherungen, z. B. 2D-Gaussfunktion, möglich. In einer weiteren Ausgestaltung des Verfahrens kann die EDOF-Funktion unter Verwendung eines Axikons erzeugt werden. In einem solchen Fall kann eine Besselfunktion gewählt werden, die im Ergebnis zu einer Bessel-PSF führt.
Dem Lokalisierungsschritt geht das Erkennen der Fluoreszenzsignale insbesondere in Form von „Spots“ im Detektorframe (Rohdaten) voraus. Dazu werden üblicherweise Schwellwerte des Verhältnisses von erfasster Intensität zu erfasstem Hintergrund festgelegt. Erfasste Intensitäten (Intensitäts-Peaks), die diese Schwellwerte auf mindestens einem Pixel überschreiten, werden mit einem festen Radius dem betreffenden Pixel zugeordnet. Ein solcher Radius kann beispielsweise als 2,5 * PSF-Breite der FWHM (full width at half maximum) definiert sein. Die Daten von Pixel und Radius gehen dann in den Lokalisierungsschritt ein.
Der Radius kann bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens größer gewählt werden, da die PSF, trotz EDOF, eine Abhängigkeit von der Z-Richtung aufweisen und in dieser Richtung größer werden kann. Alternativ kann der Radius auch für jeden Intensitäts-Peak angepasst werden, indem z. B. der radiale Abfall der Intensität in der Detektorebene über die benachbarten Pixel analysiert wird.
Sollte eine Vereinzelung von Markern beziehungsweise von markierten Antigenen nicht oder nicht mit hinreichender Qualität möglich sein, kann zur Lokalisierung ein Multi-Emitter-Algorithmus genutzt werden, wie er beispielsweise in Holden et al., 2011 beschrieben ist (Holden, S. J.; Uphoff, S., and Kapanidis, A. N., (2011): „DAOSTORM: an algorithm for high-density super-resolution microscopy." Nature methods 8.4: 279).
Es ist weiterhin möglich, mit den Lokalisierungsdaten eine Clusteranalyse durchzuführen, um mehrfache Lokalisierungen eines Markers beziehungsweise mehrfach markierte Antikörper einem Zielmolekül (Antigen) zuzuordnen. Ziel einer solchen Zuordnung ist letztendlich die Ermittlung der Anzahl von Antikörpern pro Zelle.
Die erfindungsgemäßen Verfahrensausgestaltungen können ergänzt werden, indem unter Verwendung eines nicht-fluoreszenten Kontrastverfahrens beispielsweise der Umfang der Zelle ermittelt wird. Parameter der Zelle wie dessen Umfang können als Referenzwert verwendet werden, bezüglich dem beispielsweise die ermittelte Anzahl von Markern beziehungsweise Antigenen angegeben wird. Beispielsweise kann neben der totalen Anzahl ermittelter Marker auch die Anzahl pro Längeneinheit Zellumfang ermittelt, gespeichert und/oder angegeben werden. Dazu können beispielsweise die Ausdehnung und/oder Kontur einer Zelle bestimmt werden. Nichtfluoreszente Kontrastverfahren sind beispielsweise DIC (differential interference contrast; Differentialinterferenzkontrast), Durchlichtkontrast, Phasenkontrast oder die Nutzung von Schräglichtbeleuchtung (angular illumination microscopy).
Um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen und um insbesondere das Vereinzeln der Marker zu unterstützen, können in vorteilhaften Ausgestaltungen die Dichten der Emitter, also der Marker beziehungsweise der markierten Antigene, unter Beachtung der gewählten Projektion und der verwendeten PSF eingestellt werden. Zur Auswertung und Lokalisierung kann eine Entfaltung anhand einer System-PSF vorgenommen werden. Mit dem Begriff System-PSF wird insbesondere eine gemessene PSF verstanden, die im Gegensatz zu einer theoretischen PSF die tatsächlichen Eigenschaften des optischen Systems (Aberrationen etc.) enthält. Die System-PSF entspricht also der EDOF-PSF des optischen Systems.
Die Aufgabe wird ferner mit einer Vorrichtung zum Nachweis von Fluoreszenzsignalen beziehungsweise induzierten Lichtsignalen in einer dreidimensionalen Region einer Probe gelöst. Die Vorrichtung weist einen Detektionsstrahlengang auf. Entlang des Detektionsstrahlengangs ist eine vorhandene Detektionsstrahlung geführt und kann mit geeigneten Mitteln wie einem Detektor erfasst werden.
In dem Detektionsstrahlengang ist zur Erfassung der Detektionsstrahlung ein Objektiv mit einer ursprünglichen Schärfentiefe in Richtung einer Detektionsachse vorhanden. Die Detektionsachse verläuft zumindest zwischen Objektiv und Probe entlang des Detektionsstrahlengangs. Als ursprüngliche Schärfentiefe wird in dieser Beschreibung die nominelle Schärfentiefe des Objektivs verstanden, so wie diese ohne den nachfolgend beschriebenen EDOF-Ansatz vorliegen und nutzbar sein würde.
Eine erfindungsgemäße Vorrichtung weist zudem ein optisches Element im Detektionsstrahlengang auf. Dieses besitzt eine solche optische Wirkung, dass mittels des optischen Elements eine gegenüber der ursprünglichen Schärfentiefe erhöhte Schärfentiefe erzeugt ist. Diese Erhöhung der Schärfentiefe wird durch eine Verlängerung des Fokus (Fokusverlängerung) in Richtung der Detektionsachse erzielt. Das optische Element ist vorzugsweise in einer Pupille des Detektionsstrahlengangs angeordnet. Mögliche vorteilhafte Ausführungen des optischen Elements werden weiter unten erläutert.
Die Vorrichtung weist einen Detektor zur Erfassung von Bilddaten einzelner Fluoreszenzereignisse/-signale auf, wobei die Erfassung der Fluoreszenzsignale (auch kurz: Signale) zweidimensional und/oder zeitlich aufgelöst erfolgt beziehungsweise erfolgen kann. Außerdem ist eine Auswerteeinheit vorhanden, in der die aus dem Detektor ausgelesenen Bilddaten ausgewertet werden und eine Anzahl der Fluoreszenzsignale ermittelt, einer Bildregion zugeordnet und abgespeichert wird.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung, die insbesondere für die Durchführung der erfindungsgemäßen Nachweisverfahren verwendet werden kann, orientiert sich im Wesentlichen an einem Mikroskopaufbau zur Fluoreszenz-Weitfeldmikroskopie mit laserbasierter Anregung, wie dies beispielsweise bei den Verfahren PALM, STORM und dSTORM bekannt ist. Die zusätzliche EDOF-Funktion ist im Detektionsstrahlengang realisiert.
Das optische Element kann in einer möglichen Ausführung eine Phasenmaske sein. Eine Phasenmaske kann statisch sein und z. B. lithographisch hergestellt werden. Sie kann in weiteren Ausführungen der Vorrichtung dynamisch sein und durch räumliche Lichtmodulatoren (spatial light modulator; SLM) realisiert werden, wobei dies entweder in Transmission oder in Reflexion möglich ist. Eine statische Phasenmaske reduziert vorteilhaft die erforderlichen Steuerungsschritte während eine dynamische Phasenmaske der Vorrichtung vorteilhaft eine höhere Flexibilität verleiht.
Als optisches Element kann in weiteren Ausführungen der Vorrichtung ein Axikon oder eine Axikon-Phasenmaske im Detektionsstrahlengang angeordnet sein. Die Detektionsstrahlung wird durch Wirkung eines solchen optischen Elements in einen Besselstrahl überführt.
Der Vorteil des Bessel-Strahls liegt für die vorliegende Problemstellung in seiner hohen Schärfentiefe, einer einfachen Erzeugung, einer definierten Bessel-PSF und einem großen EDOF-Bereich. Nachteilig ist sein ausgedehntes Ringsystem, da viel Energie bzw. viele der Fluoreszenzphotonen in dieses Ringsystem eingehen daher einer Lokalisierung nicht oder nur eingeschränkt zur Verfügung stehen. Als Phasenmaske kann beispielsweise eine Ringphasenmaske verwendet sein. Die Phasenmaske kann optional einem sogenannten Phasewrapping) unterzogen und damit zum Beispiel mit einem räumlichen Lichtmodulator realisiert sein. Unter Phasewrapping wird die Erzeugung einer Phasenverteilung verstanden, die beispielsweise mittels des räumlichen Lichtmodulators generiert werden muss, um im Ergebnis eine gewünschte Phasenverteilung zu bewirken. Da in der Regel ein räumlicher Lichtmodulator einen Phasenhub von 0 bis 2π (2Pi) realisieren kann, wird zur Erzeugung großer Phasenhübe von N*2π eine Anzahl von lokalen Phasenhüben bis 2π generiert. Infolge destruktiver und konstruktiver Überlagerungen der mittels des räumlichen Lichtmodulators modulierten Strahlen wird im Ergebnis eine gewünschte Phasenverteilung mit Phasenhüben von beispielsweise N*2π eingestellt. Auf diese Weise kann zum Beispiel ein Axikon mit einem Phasenhub von N*2π als Phasenfunktion realisiert werden.
In einer weiteren Ausführung der Vorrichtung ist als optisches Element eine kubische Phasenmaske im Detektionsstrahlengang angeordnet. Diese kann symmetrisch oder asymmetrisch ausgebildet sein.
Phasenmasken wie die erwähnte kubische Phasenmaske, das Axikon oder die nachfolgende beschriebene Ringphasenmaske sind in einer Fourier-Ebene (= Pupille) oder in deren Nähe angeordnet. Dazu kann die Phasenmaske entweder in der Objektivpupille oder in einer weiteren, durch eine Zwischenabbildung zugänglichen Pupille angeordnet sein. Letzteres hat den Vorteil, dass die Anregungsstrahlung nicht durch die Phasenmaske beeinflusst wird.
Wird das optische Element durch eine Ringphasenmaske realisiert, können als optische Effekte sogenannte Phasenringe bewirkt werden. Sind die Phasenringe binär und weisen diese einen Phasensprung von π/2 zwischen den Phasenringen auf, besitzt die resultierende Punktbildverwaschungsfunktion (point spread function; PSF) zwei Maxima. Ein solche Phasenmaske und PSF können beispielsweise für eine gezielte Erfassung von z. B. oberer und unterer Zellmembran oder anderer unterschiedlicher Bereiche der Probe eingesetzt werden.
Die Ausprägung der Maxima kann durch weitere Ringelemente beeinflusst werden. Beispielsweise können Phasenverzögerungen zwischen 0 und π/2 zu einer Reduzierung des bifokalen Charakters führen.
Das Konzept der bifokalen Abbildung und der Nutzung einer damit einhergehenden erhöhten Schärfentiefe kann in weiteren Ausführungen der Vorrichtung erreicht werden, indem als optisches Element ein doppelbrechendes Element im Detektionsstrahlengang angeordnet ist.
Die Wirkungsweise eines solchen doppelbrechenden Elements im Detektionsstrahlengang nutzt den Umstand, dass die Signale der Marker im Mittel isotrop polarisiert sind. Das doppelbrechende Element weist für orthogonale Polarisationen unterschiedliche Brechungsindizes und damit unterschiedliche optische Weglängen auf. Für die isotrop polarisierte Fluoreszenzstrahlung ergibt sich damit eine bifokale Abbildung. Die zwei Fokusbereiche können auch ineinander übergehen und so einen zusammenhängenden EDOF-Bereich bilden. In einer weitergehenden Ausführung nimmt das doppelbrechende Element nicht den gesamten Querschnitt des Strahlengangs ein. In einem solchen Fall ergibt sich beispielsweise noch eine dritte Bildebene, d. h. es wird entlang der Detektionsachse ein dritter Fokusbereich im Sinne einer dritten Schärfentiefe erzeugt.
Alternativ zu den oben vorgestellten, analytisch darstellbaren Phasenmasken können Phasenmasken auch iterativ algorithmisch ermittelt und dargestellt werden. Dazu kann beispielsweise eine Gütefunktion definiert werden, die die gewünschte EDOF-Eigenschaft der PSF beschreibt, wie z.B. Länge der PSF, Breite (x/y) an unterschiedlichen z-Positionen. Anschließend wird eine Start-Phasenfunktion vorgegeben, die iterativ verändert wird und die Änderungen nur dann übernommen werden, wenn die Gütefunktion zunimmt. So kann die Gütefunktion iterativ maximiert werden. Die iterative Veränderung kann stochastisch erfolgen („random walk“).
Ebenso kann ein sogenannter IFTA (Inverse Fourier Transform Algorithm) eingesetzt werden (Gerchberg-Saxton-Algorithmus; Gerchberg, R W and Saxton(1972): A practical algorithm for the determination of the phase from image and diffraction plane pictures; Optik 35: 237-46). Dieser muss im vorliegenden Fall auf 3D erweitert werden (z.B. Whyte, G. and Courtial, J. (2005): Experimental demonstration of holographic three-dimensional light shaping using a Gerchberg-Saxton algorithm; New Journal of Physics 7.1: 117). Auch hier wird eine Zielfunktion vorgegeben, in diesem Fall die gewünschte EDOF-PSF-Intensitätsverteilung, und diese dann iterativ durch den IFTA-Algorithmus approximiert.
Mit solchen iterativen Algorithmen kann das Ziel-EDOF-Verhalten geeignet eingestellt werden und die resultierende Phasenmaske für das vorliegende optische System dann gefertigt werden.
Sieht man für das optische System ein variables, phasenformendes Element wie einen SLM (Spatial Light Modulator) oder auch einen deformierbaren Spiegel vor, so lassen sich die o.g. iterativen Optimierungen auch zwischen einzelnen Experimenten, z. B. für unterschiedliche Probenklassen, durchführen.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann in einer weiteren Ausführung mindestens ein adaptives optisches Element im Detektionsstrahlengang aufweisen. Solche optischen Elemente sind insbesondere eine variable Linse, ein adaptiver, insbesondere deformierbarer, Spiegel oder ein Mikrolinsenarray (Microlens-Array). Die adaptiven Spiegel werden in Reflexion eingesetzt.
Wird beispielsweise eine Flüssiglinse als variable Linse für den dynamischen EDOF-Ansatz verwendet, kann diese beispielsweise im Unendlich-Raum einer Zwischenabbildung positioniert sein. Variable Linsen werden oft so konfiguriert, dass sie in einem nicht angesteuerten Zustand keine oder nur eine sehr geringe Brechkraft aufweist. Optional kann deshalb eine statische Korrekturlinse vorhanden sein.
Mittels einer solchen Ausführung mit einem adaptiven optischen Element ist ein sogenanntes dynamisches EDOF-Verfahren ausführbar. Dabei kann eine schnelle Fokusverlagerung bewirkt werden, wobei eine solche Fokusverlagerung innerhalb eines Erfassungszeitraums des Detektors, beispielsweise innerhalb einer Kamera-Belichtungszeit, erfolgt. Außerdem kann die Funktionalität des EDOF-Verfahrens flexibel an die Probe angepasst werden kann. Beispielsweise kann die erhöhte Schärfentiefe an eine mittlere Ausdehnung der zu untersuchenden Zellen in Richtung der Detektionsachse (Z-Richtung) angepasst werden.
Wenn die Morphologie der zu beobachtenden Probe bekannt ist, kann die Fokusverlagerung auch gezielt z. B. auf die obere und die untere Zellmembran erfolgen, anstelle kontinuierlich das gesamte Volumen zu durchlaufen. Die untere Zellmembran ist beispielsweise die von dem Objektiv kommend zuerst virtuell von der Detektionsachse durchstoßene Zellmembran. Entsprechend ist die obere Zellmembran die als Zweites durchstoßene Zellmembran und weiter vom Objektiv entfernt gelegen. Durch eine selektive Auswahl und Einstellung der Fokuslagen wird die Photoneneffizienz erhöht, da keine Integrationszeit des Detektors auf Probenpositionen verwendet wird, die nicht von Interesse sind.
Die jeweiligen Positionen der Zellmembranen einer Probe können in Richtung der Detektionsachse variieren. Daher ist es von Vorteil, wenn eine bifokale oder multifokale Abbildung mit einem weiteren EDOF-Verfahren kombiniert wird oder optional mit einem solchen kombinierbar ist. Auf diese Weise ist ein zweistufiger Effekt erreicht: mit der bi- oder multifokalen Abbildung der Detektionsstrahlung werden grob zwei abzubildende Bereiche der Probe vordefiniert (z. B. obere und untere Zellmembran). Mittels des zusätzlichen EDOF-Verfahrens (z. B. Verwendung einer kubischen Phasenmaske als optisches Element) werden dann alle Moleküle innerhalb des jeweiligen Grob-Bereichs erfasst. Dabei können die beiden Grob-Bereiche zweckmäßigerweise auf eigene Detektorbereiche oder Detektoren abgebildet werden.
Eine Aufteilung der aus mehreren Fokusebenen oder Fokusbereichen kommenden Detektionsstrahlung kann beispielsweise mittels einer geeigneten Bildteilereinrichtung erfolgen, durch deren Wirkung mehrere Fokusebenen beziehungsweise Fokusbereiche gleichzeitig auf entsprechend viele Teilbereiche eines Detektors und/oder auf mehrere Detektoren abgebildet werden. Beispiele für solche Bildteilereinrichtungen sind Anordnungen mit einem zweiten Detektor in einem gegenüber einem ersten Detektor leicht veränderten Abstand (z. B. Ram, Sripad, et al., 2008: High accuracy 3D quantum dot tracking with multifocal plane microscopy for the study of fast intracellular dynamics in live cells.; Biophysical Journal 95: 6025-6043), eine variable Ebeneneinstellung auf mehrere Detektorbereiche ( DE 10 2009 060 490 A1 ), ein diffraktives Element zur aberrationskorrigierten Abbildung mehrerer Fokusebenen auf mehrere Detektorbereiche ( WO 2013/106731 A1 ) oder Prismenanordnungen zur Abbildung mehrerer Fokusebenen auf Teilbereiche mehrerer Detektoren ( WO 2015/044819 A1 ).
Die Vorteile der erfindungsgemäßen Verfahren sowie der erfindungsgemäßen Vorrichtung liegen in der Möglichkeit einer verbesserten Genauigkeit bei der Ermittlung der Anzahl von Markern und/oder von markierten Antigenen. Mittels des in einer Pupille angeordnetem geeigneten EDOF-Phasenelements kann, insbesondere wenn Teileranordnung und/oder Phasenelement variabel gestaltet sind, ein Zählen von Molekülen in einer 3D-Probe ohne das Erfordernis der Erfassung eines Fokusstapels an die Ausdehnung in Z-Richtung der Probe angepasst werden. Beispielsweise können bei adhärenten Zellen bei Nutzung einer variablen multifokalen Vorrichtung die Fokusebenen so eingestellt werden, dass sie jeweils die obere und die untere Zellmembran erfassen. Um die Fokusebenen herum bewirkt dann das (zusätzliche) EDOF-Element für die entsprechende Erhöhung der Schärfentiefe und somit für entsprechende Fokusbereiche. In einer vorteilhaften Ausprägung der Erfindung bewirkt das optische Element, dass sich beide Fokusbereiche leicht überlappen. Auf diese Weise kann die gesamte Zelle erfasst werden. Wird die Erfindung auf Proben angewendet, die in z-Richtung deutlich ausgedehnter als Zellen sind, z.B. Suspensionszellen, und kann die Distanz auch mit Hilfe des optischen Elements nicht überbrückt werden, können optional auch mehr als zwei Fokusbereiche simultan erfasst werden.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann vorteilhaft zur Ermittlung einer Anzahl von Signalen, insbesondere von Fluoreszenzsignalen, einer biologischen Zelle, eines Bereichs einer biologischen Zelle oder einer biologischen Struktur verwendet werden. Sie kann außerdem in einem Verfahren zum Nachweis von fluoreszenzmarkierten biologischen Zellen, biologischen Strukturen sowie zum Nachweis von markierten Antikörpern und von Bindungen markierter Antikörper an Antigene verwendet werden.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen und Abbildungen näher erläutert. Es zeigen:

1 eine schematische Darstellung eines Nachweisverfahrens mittels einer optischen Vorrichtung und einer Fokusebene entsprechend einer ursprünglichen Schärfentiefe eines Objektivs gemäß dem Stand der Technik;
2 eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens mittels eines ersten Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen optischen Vorrichtung und eines Fokusbereichs entsprechend einer erhöhten Schärfentiefe eines Objektivs;
3 eine schematische Darstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;
4 eine schematische Darstellung eines dritten Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;
5 eine schematische Darstellung eines vierten Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;
6 eine schematische Darstellung eines fünften Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;
7 eine schematische Darstellung eines sechsten Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;
8 eine schematische Darstellung eines siebenten Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;
9 eine schematische Darstellung einer Phasenverteilung in einer Pupille eines Detektionsstrahlengangs durch Wirkung einer symmetrischen kubischen Phasenmaske jeweils als a) vereinfachte schwarz-weiße Skizze, b) als Graustufenbild sowie c) eine vereinfachte Darstellung der zugehörigen Punktbildverwaschungsfunktion (point spread function);
10 eine schematische Darstellung einer Phasenverteilung in einer Pupille eines Detektionsstrahlengangs durch Wirkung eines Axikons jeweils als a) vereinfachte schwarz-weiße Skizze, b) als Graustufenbild sowie c) eine vereinfachte Darstellung der zugehörigen Punktbildverwaschungsfunktion (point spread function);
11 eine schematische Darstellung einer Phasenverteilung in einer Pupille eines Detektionsstrahlengangs ohne Wirkung eines optischen Elements a) vereinfachte schwarz-weiße Skizze, b) als Graustufenbild sowie c) eine vereinfachte Darstellung der zugehörigen Punktbildverwaschungsfunktion (point spread function);
12 eine schematische Darstellung a) einer Phasenverteilung einer ersten Ringphasenmaske in einer Pupillenebene eines Detektionsstrahlengangs und b) eine stark vereinfachte Darstellung einer zugehörigen simulierten Punktbildverwaschungsfunktion (point spread function);
13 eine schematische Darstellung a) einer Phasenverteilung einer zweiten Ringphasenmaske in einer Pupillenebene eines Detektionsstrahlengangs und b) eine stark vereinfachte Darstellung einer zugehörigen simulierten Punktbildverwaschungsfunktion (point spread function);
14 eine schematische Darstellung a) einer Phasenverteilung einer dritten Ringphasenmaske in einer Pupillenebene eines Detektionsstrahlengangs und b) eine stark vereinfachte Darstellung einer zugehörigen simulierten Punktbildverwaschungsfunktion (point spread function); und
15 ein Ablaufschema einer Ausgestaltung eines erfindungsgemäßen Verfahrens.

Die Ausführungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung sowie mögliche Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind schematisch dargestellt. Dabei bezeichnen gleiche Bezugszeichen jeweils gleiche technische Elemente.
Das Prinzip der Erfindung ist in der 2 dargestellt und dem in 1 illustrierten Stand der Technik gegenübergestellt. Im Detektionsstrahlengang 3 einer erfindungsgemäßen optischen Vorrichtung ist ein optisches Element 14 angeordnet, durch dessen Wirkung die Schärfentiefe des Objektivs 5 erhöht wird. Die Punktbildverwaschungsfunktion PSF (auch: Punktbildübertragungsfunktion) ist in Richtung der Z-Achse Z gestreckt. Diese erhöhte Schärfentiefe EDOF (mit einem Doppelpfeil veranschaulicht) ermöglicht im Ausführungsbeispiel die Erfassung der gesamten Probe 7 in Richtung der Z-Achse Z mit nur einer einzigen Fokusstellung des Objektivs 5. Demgemäß können alle an die Probe 7 gebundenen Marker 8 durch Erfassen ihrer jeweiligen (Fluoreszenz-)signale 12 mittels des Detektors 13 zeitgleich abgebildet werden. Die Information über die Position des Ursprungsorts (Marker 8) eines jeweils erfassten Signals 12 in Richtung der Z-Achse Z geht dabei verloren. Lediglich eine Lokalisierung eines Markers 8 in der Detektionsebene entlang der Achsen X und Y ist möglich.
Ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung ist in 3 als ein Teil eines nicht näher dargestellten Mikroskops 1 gezeigt. Eine Beleuchtungsstrahlung wird in einer Laserlichtquelle 16 erzeugt und bereitgestellt. Die Beleuchtungsstrahlung gelangt entlang des Beleuchtungsstrahlungsgangs 2, in dem sich optische Linsen 17 befinden, über einen Strahlteiler 18 in Reflexion zum Objektiv 5. In oder nahe einer Fourierebene des Objektivs 5 ist ein optisches Element 14 in Form eines Phasenelements angeordnet. In einer Fourierebene wird ein Punkt in eine ebene Welle transformiert und umgekehrt eine ebene Welle in einen Punkt. Damit das jeweils vorhandene Phasenelement auf alle Objektpunkte gleich wirkt, soll dieses in der Fourierebene stehen oder möglichst nah an einer Fourierebene angeordnet sein.
Durch Wirkung des optischen Elements 14 wird eine erhöhte Schärfentiefe EDOF des Objektivs 5 erreicht. Die Beleuchtungsstrahlung bewirkt in der Probe 7 eine Detektionsstrahlung 4, die entlang des Detektionsstrahlengangs 3 auf den Strahlteiler 18 trifft. Die Detektionsstrahlung 4 weicht in ihren optischen Eigenschaften von der Beleuchtungsstrahlung ab und wird von dem Strahlteiler 18 transmittiert. Ist die Detektionsstrahlung 4 durch Strahlung mindestens zweier Wellenlängen gebildet, können diese voneinander getrennt und separat erfasst werden. Im dargestellten Ausführungsbeispiel erfolgt eine solche Trennung mittels eines weiteren Strahlteilers 18, der für eine Wellenlänge transparent und für eine andere Wellenlänge reflektierend ist. Eine derart aufgeteilte Detektionsstrahlung 4 gelangt entlang von Teilstrahlengängen zu dem Detektor 13 beziehungsweise einem weiteren Detektor 20.
Die Detektoren 13 und 20 sind mit einer Auswerteeinheit 23 verbunden, mittels der die erfassten Signale 12 als Bilddaten verarbeitet und ausgewertet werden. Außerdem ist eine Steuereinheit 24 vorhanden, mittels der Steuerbefehle zur Ansteuerung beispielsweise der Laserlichtquelle 16, des optischen Elements 14, der Tubuslinse 11 und/oder der optischen Linsen 17 erzeugt und ausgegeben werden können. Die Bilddaten sowie Informationen zu generierten Steuerbefehlen und/oder zur aktuellen Konfiguration der Vorrichtung können auf einer Anzeige 25 dargestellt werden.
Die Anordnung des optischen Elements 14 in einer zur Pupille konjugierten Ebene (Fourierebene) (4) kann gewählt sein, damit die Beleuchtungsstrahlung nicht das optische Element 14 durchläuft. Im dargestellten dritten Ausführungsbeispiel werden Beleuchtungsstrahlengang 2 und Detektionsstrahlengang 3 beziehungsweise die Beleuchtungsstrahlung und die Detektionsstrahlung 4 mittels eines Strahlteilers 18 voneinander getrennt. Die Detektionsstrahlung 4 wird mittels eines Spiegels 19 auf das optische Element 14 und den Detektor 13 gelenkt.
Ein weiteres mögliches Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung (5) ist geeignet, um eine erhöhte Schärfentiefe EDOF mittels einer schnellen Verlagerung der jeweiligen Fokusebene DOF zu erreichen. Mittels zweier beispielhaft im Detektionsstrahlengang 3 dargestellter Linsen 17.1 und 17.2 wird ein Zwischenbild nach der Tubuslinse 11 auf den Detektor 13 abgebildet. Die Linsen 17.1 beziehungsweise 17.2 können nachfolgend auch stellvertretend für komplexere abbildende Optiken stehen. Zwischen den Linsen 17.1 und 17.2 ist eine varifokale Linse 21 vorhanden, mittels der eine Verlagerung einer aktuellen Fokusebene DOF und die Erzeugung einer erhöhten Schärfentiefe EDOF ermöglicht ist. Die varifokale Linse 21 kann zusätzlich eine Kompensationslinse 21.1 aufweisen, wie dies in 5 schematisch gezeigt ist. Die varifokale Linse 21 ist mittels der Steuereinheit 24 ansteuerbar. Insbesondere kann eine Ansteuerung so schnell erfolgen, dass innerhalb eines Erfassungszeitraums des Detektors 13 wenigstens zwei aktuelle Fokusebenen DOF eingestellt werden und somit eine resultierende erhöhte Schärfentiefe EDOF erzeugt ist. Eine Erfassung der Detektionsstrahlung 4 erfolgt mit der (resultierenden) erhöhten Schärfentiefe EDOF.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist ein Axikon als optisches Element 14 im Detektionsstrahlengang 3 angeordnet (6). Das optische Element 14 ist nahe der Linse 17.1 angeordnet, die wiederum entsprechend ihrer Brennweite von einer Zwischenbildebene 22 entfernt angeordnet ist.
Eine weitere Ausführungsmöglichkeit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ermöglicht eine dynamische Erzeugung der erhöhten Schärfentiefe EDOF unter Nutzung eines adaptiven Spiegels oder eines Mikrolinsenarrays als optisches Element 14 (7). Die Linsen 17.1 und 17.2 im Detektionsstrahlengang 3 bilden ein erstes Zwischenbild auf den Detektor 13 ab. In einer Pupille 15 (Pupillenebene) ist das optische Element 14 vorhanden.
Ein Ausführungsbeispiel zur multifokalen Abbildung kombiniert mit erhöhter Schärfentiefe EDOF ist in 8 veranschaulicht. Die Linsen 17.1 und 17.2 bilden das Zwischenbild auf den Detektor 13 ab und schaffen zugleich eine weitere konjugierte Pupille 15. In dieser ist das optische Element 14 angeordnet. Durch die Linsen 17.1 und 17.2 ist eine sogenannte Relayoptik gegeben.
Die Detektionsstrahlung 4 wird mit mehreren voneinander verschiedenen Fokusebenen mit je einer Schärfentiefen DOF erfasst, wobei durch Wirkung des optischen Elements 14 um jede der Fokusebenen eine erhöhte Schärfentiefe EDOF 1 beziehungsweise EDOF2 erzeugt wird, wie dies schematisch in der vergrößerten Teildarstellung gezeigt ist. Die erhöhte Schärfentiefe EDOF 1 erlaubt dabei eine Abbildung von Signalen 12 von Markern 8, mit markierten Antikörpern 10 verbundene Antigenen 9 und/oder markierten Antikörpern 10 der oberen Zellmembran 7.1 und die erhöhte Schärfentiefe EDOF 2 eine Abbildung von Signalen 12 von Markern 8, mit markierten Antikörpern 10 verbundene Antigenen 9 und/oder markierten Antikörpern 10 der unteren Zellmembran 7.2.
In weiteren Ausführungen der Vorrichtung und/oder Ausgestaltungen des Verfahrens überlappen sich die Schärfentiefen DOF beziehungsweise die erhöhten Schärfentiefen EDOF in Richtung der z-Achse Z vorteilhaft leicht, um eine unterbrechungsfreie Abbildung des betreffenden Probenvolumens zu erlauben.
Im Detektionsstrahlengang 3 ist weiterhin eine Bildteilereinheit 26 angeordnet. Mittels dieser werden die Anteile der Detektionsstrahlung 4 der unterschiedlichen Fokusebenen DOF beziehungsweise der unterschiedlichen erhöhten Schärfentiefen EDOF1, EDOF2 auf verschiedene Detektoren 13 oder auf unterschiedliche Bereiche wenigstens eines Detektors 13 gerichtet und separat voneinander erfasst.
Die Erzeugung einer erhöhten Schärfentiefe EDOF kann unter Nutzung von Phasenmasken erfolgen. Phasenverteilungen in einer Pupille eines Detektionsstrahlengangs durch Wirkung unterschiedlicher Phasenmasken sind in den 9 bis 11 gezeigt. Dabei sind jeweils in den 9a, 10a und 11a je eine vereinfachte schwarz-weiß Skizze der in den 9b, 10b und 11b dargestellten Graustufenbilder mit entsprechenden Phasenverteilungen in einer x-y-Ebene gezeigt. In den 9c, 10c beziehungsweise 11c sind die vereinfachten Punktbildverwaschungsfunktionen PSF als Schnitt jeweils in einer x-z-Ebene illustriert.
In der 9a bis 9c sind die Skizze, das Graustufenbild und die PSF einer symmetrischen kubischen Phasenmaske gezeigt.
10a bis 10c zeigen die entsprechenden Phasenverteilungen und die PSF eines Axikons.
Phasenverteilung und PSF ohne Anordnung eines optischen Elements 14 im Detektionsstrahlengang 3 sind in den 11a bis 11c beispielhaft dargestellt.
Verschiedene Ringphasenmasken sowie deren jeweilige simulierte Punktbildverwaschungsfunktion sind in den 12 bis 14 gezeigt. Dabei ist jeweils in den 12a, 13a beziehungsweise 14a schematisch eine erzeugte Ringphasenmaske gezeigt. In den 12b bis 14b sind die zugehörigen Punktbildverwaschungsfunktionen PSF vereinfacht dargestellt.
Die 12 betrifft eine Ringphasenmaske mit einem Phasensprung von π zwischen den unterschiedlich schraffierten Bereichen. Die resultierende PSF zeigt in Richtung der Z-Achse Z zwei voneinander getrennte Maxima.
Eine Ringphasenmaske mit mehreren verschiedenen Bereichen, wiederum mit jeweils einem Phasensprung von π, ist in 13a schematisch dargestellt. Die zugehörige Punktbildverwaschungsfunktion PSF ist in Richtung der Z-Achse Z auseinandergezogen. Es treten mindestens zwei voneinander getrennte Maxima auf, wobei diese bereits deutlich erkennbare Tendenz haben, weitere Maxima zu bilden. Ringphasenmasken mit mehr als den gezeigten Bereichen und Phasensprüngen erlauben zusätzliche Maxima und damit Fokusebenen DOF und/oder erhöhte Schärfentiefen EDOF. Je nach Gestaltung der Phasenmasken kann die Punktbildverwaschungsfunktion PSF an die abzubildende Probe 7 und/oder das angestrebte Ziel der Abbildung angepasst werden.
Ausgestaltungsmöglichkeiten des erfindungsgemäßen Verfahrens werden anhand des Ablaufschemas der 15 erläutert. Zur Durchführung des Verfahrens wird insbesondere eine der oben beschriebenen Ausführungsmöglichkeiten der Vorrichtung verwendet.
Es wird eine Probe 7 bereitgestellt, von der potenziell die Emission von Fluoreszenzsignalen beziehungsweise von lichtinduzierten Lichtsignalen erwartet wird. Solche Proben 7 sind beispielsweise biologische Oberflächen mit mindestens einem Antikörper 10, der zu einem nachzuweisenden Antigen 9 kompatibel ist und der mit einem Marker 8 versehen ist, der zur Emission von Lichtsignalen geeignet ist. Es kann auch eine mit einem solchen Antikörper 10 inkubierten biologischen Oberfläche als probe 7 verwendet werden.
Es wird eine erhöhte Schärfentiefe EDOF gewählt, mit der die betreffende Probe 7 auf das Vorhandensein von Fluoreszenzsignalen 12 untersucht werden soll. Erlaubt eine aktuelle Einstellung oder Konfiguration der Vorrichtung, beispielsweise eine aktuell eingestellte Phasenrampe, den Nachweis der Signale 12 mit der gewünschten erhöhten Schärfentiefe EDOF, werden mit dieser Konfiguration die Messungen durchgeführt. Dazu wird die Probe 7 mit der Beleuchtungsstrahlung beleuchtet, wobei diese die Emission der Signale 12 ermöglicht und/oder potenziell auslösen. Fungiert die Beleuchtungsstrahlung als Anregungsstrahlung, werden in dem beleuchteten Bereich der Probe 7 vorhandene und für die Beleuchtungsstrahlung rezeptive Marker 8 zur Emission von Signalen 12 angeregt.
Die emittierten Signale 12 werden mittels der Vorrichtung und der aktuell eingestellten erhöhten Schärfentiefe EDOF auf den mindestens einen im Detektionsstrahlengang 3 angeordneten Detektor 13, 20 abgebildet und durch diesen als Bilddaten erfasst (Messung). Die Ortsauflösung des Detektors 13, 20 ermöglicht eine zweidimensionale Zuordnung (2D-Lokalisierung) des Ursprungsorts des jeweiligen Signals 12 in einer X-Y-Ebene. Eine Lokalisierung in Richtung der Z-Achse Z ist allenfalls dahingehend möglich, als dass die Herkunft des Signals 12 aus dem Bereich der erhöhten Schärfentiefe EDOF bekannt ist und somit einer Position in der X-Y-Ebene ein entsprechend grober Bereich in Richtung der Z-Achse Z zugeordnet werden kann. Die Lokalisierung unterstützt die Überprüfung möglicher Doppelerfassungen von Signalen 12 und eine eventuell erforderliche Korrektur der Nachweis- und/oder Zählergebnisse des Verfahrens.
Die erfassten Bilddaten werden, beispielsweise mittels der Auswerteeinheit 23, zu einem resultierenden Gesamtbild zusammengefügt, was auch als Bildsynthese oder Rendern bezeichnet wird.
In einem alternativen Ablauf des Verfahrens wird festgestellt, dass die gewählte erhöhte Schärfentiefe EDOF nicht mit der aktuellen Konfiguration der Vorrichtung, insbesondere mit der aktuellen Phasenrampe, erreicht werden kann. Im dargestellten Beispiel soll die erhöhte Schärfentiefe EDOF durch mehrere Fokusebenen DOF erzeugt werden, die in Richtung der Z-Achse Z hinreichend nah beieinander liegen.
Es werden daher für die gewünschte erhöhte Schärfentiefe EDOF die optimalen Abstände der Fokusebenen DOF sowie deren Überlappung eingestellt. Mittels der so eingestellten Vorrichtung erfolgen die Messung sowie die Lokalisierung des jeweils erfassten Signals 12 entweder in den jeweiligen Fokusebenen DOF und/oder in dem Bereich der erhöhten Schärfentiefe EDOF.
Die erfassten Bilddaten der einzelnen Fokusebenen DOF, und damit der erhöhten Schärfentiefe EDOF, werden anschließend zu einem Gesamtdatensatz zusammengeführt. Dabei können die bekannten Abstände und/oder Überlappungen der Fokusebenen DOF genutzt werden. Zusätzlich oder alternativ können in den Bilddaten enthaltene und erkannte Strukturen der Probe 7 genutzt werden, um ermittelte Lokalisierungsdaten durch Korrelationen der Strukturdaten zu verifizieren. Der so erhaltene und gegebenenfalls verifizierte Gesamtdatensatz wird zu dem resultierenden Gesamtbild zusammengefügt.
Zusätzlich kann ein Wert eines Ebenenabstands bereitgestellt werden und in den Verfahrensschritt des Zusammenführens zu einem Gesamtdatensatz einfließen. Dieser optionale Wert ist beispielsweise von Vorteil, wenn mehrere Objekte wie zum Beispiel Zellen übereinander vorhanden sind oder in Geweben Bilddaten erfasst werden.
Bezugszeichenliste

1: Mikroskop
2: Beleuchtungsstrahlengang
3: Detektionsstrahlengang
4: Detektionsstrahlung
5: Objektiv
6: Probenträger
7: Probe
7.1: untere Zellmembran
7.2: obere Zellmembran
8: Marker
9: Antigen
10: Antikörper
DOF: Fokusebene; ursprüngliche Schärfentiefe
EDOF: Fokusbereich; erhöhte Schärfentiefe
PSF: Punktbildverwaschungsfunktion (point spread function)
11: Tubuslinse
12: Fluoreszenzsignal
13: Detektor
14: optisches Element
15: Pupille
16: Laserlichtquelle
17: Linse
17.1: Linse
17.2: Linse
18: Strahlteiler
19: Spiegel
20: weiterer Detektor
21: varifokale Linse
21.1: Kompensationslinse
22: Zwischenbildebene
23: Auswerteeinheit
24: Steuereinheit
25: Anzeige
26: Bildteilereinheit

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

US 8988771 B2 [0004]
WO 2006/127692 A2 [0024]
DE 102009060490 A1 [0061]
WO 2013/106731 A1 [0061]
WO 2015/044819 A1 [0061]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Giese et al. (2014): Fast volumetric phase-gradient imaging in thick samples; Optice Express 22: 1152 - 1162 [0018]
Holden et al., 2011 beschrieben ist (Holden, S. J.; Uphoff, S., and Kapanidis, A. N., (2011): „DAOSTORM: an algorithm for high-density super-resolution microscopy.“ Nature methods 8.4: 279 [0034]

Claims

Nachweisverfahren von optischen Signalen (12) in einer dreidimensionalen Region einer Probe (7), umfassend die Schritte: - Erfassen von Bilddaten der dreidimensionalen Region mittels einer optischen Vorrichtung in einer zweidimensionalen Bildebene, wobei Signale (12) in Form von Fluoreszenzsignalen mit einer gegenüber einer ursprünglichen Schärfentiefe der Vorrichtung erhöhten Schärfentiefe erfasst und in eine Bildebene projiziert werden, - Ermitteln der Anzahl von Signalen (12) in der Bildebene und - Speichern der Anzahl zugeordnet zu der Bildregion sowie Bereitstellen der zugeordneten Anzahl.
Nachweisverfahren von Antigenen (9) auf biologischen Oberflächen, mit den Schritten - Inkubieren der biologischen Oberfläche mit mindestens einem Antikörper (10), der zu dem nachzuweisenden Antigen (9) kompatibel ist und der mit einem Marker (8) versehen ist, der zur induzierten Emission von Signalen (12) in Form von Fluoreszenzsignalen und/oder induzierten Lichtsignalen geeignet ist oder verwenden einer mit einem solchen Antikörper (10) inkubierten biologischen Oberfläche; - Anregen der an einem Antigen (9) gebundenen markierten Antikörper (10) zur Emission von Signalen (12); - Erfassen der emittierten Signale (12) mittels einer optischen Vorrichtung, die - einen Detektionsstrahlengang (3) aufweist, wobei entlang des Detektionsstrahlengangs (3) eine Detektionsstrahlung (4) geführt und erfasst werden kann; - ein Objektiv (5) mit einer ursprünglichen Schärfentiefe (DOF) in Richtung der Detektionsachse im Detektionsstrahlengang (3) zur Erfassung der Detektionsstrahlung (4) aufweist; - ein optisches Element (14) in einer Pupille (15) des Detektionsstrahlengangs (4) aufweist, wobei mittels des optischen Elements (14) eine gegenüber der ursprünglichen Schärfentiefe (DOF) erhöhte Schärfentiefe (EDOF) erzeugt ist; - einen Detektor (13, 20) zur zweidimensional aufgelösten Erfassung von Signalen (12) aufweist, und - eine Auswerteeinheit (23) aufweist, in der die aus dem Detektor (13, 20) ausgelesenen Bilddaten ausgewertet und eine Anzahl der Signale (12) ermittelt, einer Bildregion zugeordnet und abgespeichert werden; - Auswerten der Bilddaten hinsichtlich des Vorhandenseins von erfassten Signalen (12) und Ermitteln einer Anzahl der erfassten Signale (12) und - Speichern und Bereitstellen der Anzahl der erfassten Signale (12).
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Marker (8) photoschaltbare Moleküle verwendet werden, von denen jeweils eine Untermenge der Anzahl von Markern (8) zur Emission von Signalen (12) angeregt und die emittierten Signale (12) in einer Zeitserie erfasst werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei Fokusebenen mit einer ursprünglichen Schärfentiefe (DOF) oder mindestens zwei Fokusbereiche mit einer erhöhten Schärfentiefe (EDOF) oder mindestens eine Fokusebene mit einer ursprünglichen Schärfentiefe (DOF) und mindestens ein Fokusbereich mit einer erhöhten Schärfentiefe (EDOF) erzeugt werden und resultierend eine erhöhte Schärfentiefe (EDOF) erzeugt wird.
Vorrichtung zum Nachweis von Signalen (12) in Form von Fluoreszenzsignalen und/oder induzierten Lichtsignalen in einer dreidimensionalen Region einer Probe (7), mit - einem Detektionsstrahlengang (3), wobei entlang des Detektionsstrahlengangs (3) eine Detektionsstrahlung (4) geführt und erfasst werden kann; - einem Objektiv (5) mit einer ursprünglichen Schärfentiefe (DOF) in Richtung einer Detektionsachse im Detektionsstrahlengang (3) zur Erfassung der Detektionsstrahlung (4); - einem optischen Element (14) in einer Pupille (15) des Detektionsstrahlengangs 3, wobei mittels des optischen Elements (14) eine gegenüber der ursprünglichen Schärfentiefe (DOF) erhöhte Schärfentiefe (EDOF) erzeugt ist; - einem Detektor (13, 20) zur zweidimensional aufgelösten Erfassung von Signalen (12) als Bilddaten und - einer Auswerteeinheit (23), in der die aus dem Detektor (13, 20) ausgelesenen Bilddaten ausgewertet und eine Anzahl der Signale (12) ermittelt, einer Bildregion zugeordnet und abgespeichert werden.
Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als optisches Element (14) ein Axikon oder eine Axikon-Phasenmaske im Detektionsstrahlengang (3) angeordnet ist und die Detektionsstrahlung (4) durch Wirkung des optischen Elements (14) in einen Besselstrahl überführt wird.
Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als optisches Element (14) eine kubische Phasenmaske im Detektionsstrahlengang (3) angeordnet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als optisches Element (14) eine Ringphasenmaske im Detektionsstrahlengang (3) angeordnet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als optisches Element (14) ein doppelbrechendes Element im Detektionsstrahlengang (3) angeordnet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als optisches Element (14) mindestens eine Flüssiglinse, ein adaptiver Spiegel oder ein Mikrolinsenarray im Detektionsstrahlengang (3) angeordnet ist.