JP7472134B2 - 試料の３次元領域の蛍光信号を検出するための方法および装置 - Google Patents

Description

本発明は、特に生体試料の場合の光信号の検出方法に関する。

従来技術は、生体試料の誘起光信号をキャプチャおよび評価可能な多くの超分解能方法を開示している。この文脈において、超分解能顕微鏡法、例えばＰＡＬＭ（光活性化局在性顕微鏡法）、ＳＴＯＲＭ（確率的光学再構築顕微鏡法）またはｄＳＴＯＲＭ（直接確率的光学再構築顕微鏡法）が特に言及される。

上述した方法では、スイッチで切り替え可能な蛍光マーカ（フルオロフォア）を備えている個々の分子は、これらの蛍光マーカ（以下ではマーカとも略記される）が連続的に活性化および／または励起されることによって位置特定される。励起されたマーカは、キャプチャ可能な蛍光放射を放出し、関連したマーカの位置は特定可能である。個々のマーカの経時的または連続的な活性化および／または励起は、分離プロセスであるとみなすこともでき、個々の分子の蛍光信号は、互いに対するそれらの位置が分解能限界未満であっても、キャプチャ可能である。

ＰＡＬＭまたはｄＳＴＯＲＭ法（＝単一分子局在性顕微鏡法）を用いた分離および位置特定は、例えばＵＳ８，９８８，７７１Ｂ２に記載されている。この場合、フォトスイッチ可能なマーカの使用によって、例えば、抗体に結合されているマーカのサブセットの連続的な活性化／励起および次の位置特定が可能になる。それゆえ、フルオロフォアおよびしたがって抗体はまた、個々の分子のレベルにおける感度によって定量化可能である。

従来技術の特定された方法の不利な点は、試料がたいてい３次元構造を有するということであり、一般的に、この３次元構造の要件は、全体として焦点スタックによってのみキャプチャ可能であるということである。この目的で、定量化される分子を所望の精度でキャプチャ可能にするために、多数の個々の画像は、焦点スタックの平面ごとに記録しなければならない。さらに、フォトスイッチ可能なマーカは、顕微鏡対物レンズの焦点面または焦点深度においてのみキャプチャ可能である。しかしながら、マーカは、生体試料内に３次元で存在し、その部分は、現在の焦点面の上下においてもまた活性化および／または漂白される。例えば、一旦、関連したマーカが事実存在する焦点面においてデータキャプチャが実施されるならば、早期に漂白されたマーカはもはやキャプチャされない。

図１にはこの不利な影響が説明される。ここで単に示される顕微鏡１において、照明放射は、これ以上の詳細が示されない照明ビーム経路２（図３から図８参照）に沿って、対物レンズ５によりスライド６を通り試料７に方向付けられる。試料７は、フォトスイッチ可能なマーカ８で修正された細胞である。例えば、マーカ８は、試料７の細胞膜に位置する抗原９（図示せず）に結合される。

対物レンズ５によってそれぞれ設定される焦点面は、光学的および技術的な境界条件のためにＺ軸の方向に小さい範囲を有し、この範囲は、ＤＯＦ（焦点深度）とも呼ばれ、両矢印によって例示的な方法で説明される。名目上、この焦点面は、対物レンズ５の被写界深度に対応する。

キャプチャ時に、対物レンズ５によって、検出放射として蛍光放射を放出し、それぞれの焦点面ＤＯＦに存在する励起状態のマーカ８は、検出器１３、例えばカメラにより、信号１２としてキャプチャされる。この場合、例えばチューブレンズ１１のようなさらなる光学素子は、検出ビーム経路３に存在することができる。

焦点面ＤＯＦ内の２つのマーカ８のみが図示の時間に検出器１３によってキャプチャされることは、概略図１から明白である。試料全体７の画像を取得するために、前者は、画像スタックから生成されなければならない。画像スタックは、例えば、対物レンズ５（またはスライド６、図示せず）の変位によってＺ軸の方向（Ｚ方向）に変位する焦点面ＤＯＦによって取得され、それぞれの画像は、焦点面ＤＯＦの適切なピッチでキャプチャされる。異なる焦点面ＤＯＦおよび対物レンズ５の位置は、水平破線によって象徴される。Ｚ軸Ｚの方向の点拡がり関数ＰＳＦは概略的に示される。

検出を逃れるマーカがないことは、フォトスイッチ可能なマーカのいくつかの応用にとって非常に重要である。実際には存在するマーカが検出されないというこの種の検出漏れの結果は、例えば、細胞上の抗原を調査するときに、および／または、抗体と抗原の結合を検出するときに非常に不利である。

本発明は、従来技術の不利な点を解消し、試料の３次元領域の蛍光信号の数を確認するための可能性を提案するという目的に基づく。

目的は、請求項１および２に記載の検出方法によって達成される。方法を実行するための本発明による装置は、請求項５の主題である。本発明の有利な構成は、従属請求項に見出される。

試料の３次元領域の蛍光信号の検出方法は、３次元領域の画像データを光学装置によってキャプチャするステップを含み、画像データは、２次元画像平面においてイメージングされ、キャプチャされる。画像平面の蛍光信号の数は、確認され、試料の領域に割り当てられ、保存される。このように割り当てられ、保存された数は、検索のために提供される。

本発明によれば、焦点面が光学装置の光軸の方向に、特に光学装置の検出軸の方向に増加し、焦点領域が形成されることによって、蛍光信号がキャプチャされる。このＥＤＯＦ（拡張した焦点深度）方法によって３次元領域においてキャプチャされる蛍光信号は、画像平面に投影され、２次元画像表現としてキャプチャされる。

この明細書の意味において、焦点面は、利用された対物レンズの公称の被写界深度である。増加した被写界深度は、複数の焦点面または複数の焦点領域から成ることができ、焦点領域は、対物レンズの元の被写界深度に対して拡張された被写界深度を表現する。

概念は、試料、例えば細胞の所定の３次元ボリュームからすべての蛍光イベント、すなわちすべての蛍光信号の２次元の投影を少なくとも１つの検出器に対して実施することから成る。この目的で、イメージングされるボリュームは、適切なＥＤＯＦ光学的ユニットによってＺ方向にキャプチャされる。キャプチャ画像データおよび蛍光信号の３次元分解能の利点なしで済ます場合、定量的な検出精度の大きい改善が達成されると認識された。このようにして、一分野では信号を計数し、他分野では超分解能でキャプチャする手段によって、技術的な改善が達成される。

Ｚ軸（Ｚ方向、検出軸）に沿った蛍光信号放出マーカの位置に関する情報は、この場合故意に放棄される。本発明による方法の目的が構造的な超分解能の達成ではないので、横方向の位置特定の精度を減少することもできる。したがって、本発明は、回折限界（「超分解能」）未満の構造的な情報を取得することに関するものではなく、蛍光信号の非常に高感度な計数に関するものである。それにもかかわらず、当然、追加で生ずる超分解能の２次元空間情報を用いて、例えば細胞膜上の抗体分布をより正確に調べることができる。

ＥＤＯＦ方法または本明細書に記載されているＥＤＯＦ方法を用いた蛍光信号のキャプチャは、周知の表現方法、例えば最大値投影法（ＭＩＰ）と区別されなければならない。正および負の両方の画像値は、ＥＤＯＦ方法によってキャプチャ可能であり、イメージング可能である。したがって、負の画像値（ピクセル値）は、位相勾配法の場合、発生しうるし、ＭＩＰは、そのキャプチャには不適当であるが、ＥＤＯＦによって、高品質の画像データをキャプチャすることができる（この点で、例えば、Ｇｉｅｓｅら（２０１４）Ｆａｓｔ ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ｐｈａｓｅ－ｇｒａｄｉｅｎｔ ｉｍａｇｉｎｇ ｉｎ ｔｈｉｃｋ ｓａｍｐｌｅｓ、Ｏｐｔｉｃｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ ２２、１１５２－１１６２参照）。

本発明による方法のさらなる構成において、生体表面上の抗原を検出することができる。検出方法は、少なくとも１つの抗体を有する生体表面を培養するステップを含み、少なくとも１つの抗体は、検出される抗原に結合し、マーカを備えている。マーカは、光信号の放出、例えば励起した蛍光放射の放出、それゆえ蛍光信号の放出に適している。代替的に、この種のマークされた抗体によって培養される生体表面が用いられる。好ましくは、抗原に結合される抗体は励起され、光信号、特に蛍光信号を放出する。これは、例えば励起放射によってもたらされうる。放出光信号を備えることができる画像データは、光学的広視野装置およびＥＤＯＦ光学ユニットによってキャプチャされる。有利に用いられる広視野装置の構造は、以下に詳細に説明される。

抗原は、化合物または分子、例えば、抗体に特異的に結合することができるタンパク質、炭水化物、脂質、ＤＮＡ分子、糖類および重金属を意味するものとして理解される。特異的な結合は、抗原のエピトープで実施され、抗原は、複数のエピトープを有することができる。

キャプチャされた画像データは、キャプチャされた蛍光信号の存在に関して評価され、キャプチャされた光信号の数は、確認され、保存され、提供される。

フォトスイッチ可能な分子は、本発明による方法の１つの構成においてマーカとして使用可能である。蛍光信号のキャプチャの間、マーカの数のサブセットは、周期の間に光信号（蛍光信号）を放出するために励起される。放出光信号は、時系列でキャプチャされる。方法のこの種の構成を用いて、共に非常に空間的に近くに位置するか、または、Ｚ軸の方向に連続的に位置するマーカであって、さもなければ、画像面の共通の点でイメージングされるであろうマーカの数もまたキャプチャされる。マーカは、時系列のキャプチャによって検出に対して分離される。

分離の間、および、それぞれの蛍光信号の起点の位置特定の間、実行される特定の手順は、単数または複数の利用されるマーカに依存する。その過程で、ＥＤＯＦ方法によって修正される点拡がり関数（ＰＳＦ）は、画像データの評価の間考慮される。

利用されるマーカは、ＷＯ２００６／１２７６９２Ａ２（ＰＴＯＬ、フォト変形可能な光学的ラベル）の意味において染料とすることができる。これの例は、光変換可能またはフォトスイッチ可能な蛍光タンパク質、例えばＤｒｏｎｐａ、ＥＯＳなどおよびその誘導剤である。マーカとしてアレクサ６４７のような合成染料を使用することもでき、それは、周囲条件の光および／または（化学）修飾によって長命の暗状態にもたらされうる。さらに、ケージド・ローダミンのようなケージ染料の使用が可能である（Ｇｒｉｍｍ Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｂ．ら、２０１３、Ｃａｒｂｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｓ ａｎｄ ｃａｒｂｏｒｈｏｄａｍｉｎｅｓ ａｓ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｃｏｎｔｒａｓｔ ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｂｅｓ、ＡＣＳ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ、８．６、１３０３－１３１０）。

本発明による検出方法を用いて、複数の異なるマーカまたは異なるマーカを備えている複数の抗原を検出することができる。

方法のさらなる構成において、拡張被写界深度および／またはさらなる光学的パラメータは、それぞれの試料に基づいて適応可能である。１つの可能な構成では、拡張被写界深度自体を設定することができる。代替または追加として、少なくとも２つの焦点面を生ずることができる。焦点面の少なくとも２つが互いに交差するかまたは隣接する場合、このようにして拡張被写界深度を有する少なくとも１つの焦点範囲を生成することもできる。この明細書の意味において、検出軸の方向（Ｚ方向）に交差しないが、検出軸の方向に元の被写界深度より全体として大きな焦点の領域をイメージングする２つ以上の焦点領域が生成される場合もまた、拡張被写界深度が存在する。

その結果、元の被写界深度を有する少なくとも２つの焦点面、または、拡張被写界深度を有する少なくとも２つの焦点領域、または、元の被写界深度を有する少なくとも１つの焦点面および拡張被写界深度を有する少なくとも１つの焦点範囲が生成されることによって、拡張被写界深度を生成することができる。

二焦点または多焦点とも呼ばれるこの種のイメージングは、例えば、試料の下部および上部の細胞膜のみが二焦点イメージングによって同時にキャプチャされるように設定可能である。この場合、利点は、関心がある試料の領域（関心領域；ＲＯＩ）に対する画像データの減少にある。さらに、蛍光光子はより効率的に用いられる。例えば、試料のボリューム全体は、多焦点イメージングによってキャプチャ可能である。個々の焦点面または焦点領域の独立した評価は、後の段階で可能である。

焦点面／領域の全部または少なくとも一部の重複がＥＤＯＦを有する多焦点イメージングによって追求される方法構成において、蛍光信号（信号）が２回キャプチャされるのを回避する必要がある。例えば、これは、検出器の異なる領域でキャプチャされた信号を互いに比較することによって実施可能である。マーカまたはマークされた抗体の信号が検出器の異なる領域においてキャプチャされる場合、それは１回とだけ計数される。例えば、同じ信号のこの種の２回のキャプチャは、検出器領域の空間座標の比較および評価によって検査可能である。評価前に検出器の画素またはピクセルのキャプチャされた信号の相関を実行することもできる。

本発明による方法のさらなる構成において、試料は、光シートを用いて照明可能である。後者は、ＥＤＯＦ領域に対応する厚さによって生成可能である。

本発明による検出方法の構成を用いて、キャプチャされた信号の起点の位置のＺ位置についての情報は、完全に、または、多焦点イメージングの場合大部分が放棄されたとしても、２次元の位置特定は、実施を継続することができる。蛍光信号のこの種の２次元の位置特定は、それぞれ選択されたＥＤＯＦ方法およびそれから生ずるＰＳＦに基づいて行われる。この場合、例えば、ＰＳＦの重心を決定することにより、および、理論的なＰＳＦまたは実験的に決定されたＰＳＦを用いることにより、位置特定を実行することができる。さらに、解析関数または近似、例えば２次元のガウス関数を当てはめることによって位置特定を実行することができる。方法のさらなる構成において、ＥＤＯＦ関数は、アキシコンを用いて生成可能である。この場合、ベッセル関数を選択し、その結果ベッセルＰＳＦを生ずることができる。

位置特定ステップは、特に検出器フレームの「点」の形の蛍光信号（生データ）の認識の後に生ずる。この目的で、キャプチャされた背景に対するキャプチャされた強度の比の閾値はたいてい設定される。少なくとも１ピクセルでこれらの閾値を超えるキャプチャされた強度（強度ピーク）は、一定の半径を有する関連したピクセルに割り当てられる。例えば、この種の半径は、ＦＷＨＭ（半値全幅）の２．５×ＰＳＦ幅として定義可能である。次に、ピクセルおよび半径のデータは、位置特定ステップに組み込まれる。

本発明による方法を実行するときに、ＰＳＦは、ＥＤＯＦにかかわらず、Ｚ方向に依存しうるし、この方向により大きくなりうるので、半径はより大きく選択可能である。代替的に、例えば隣接ピクセルにわたり検出器平面の強度の放射低下を分析することによって、半径は、各強度ピークに適応可能である。

マーカまたはマークされた抗原の分離が可能でないか、または、十分な品質では可能でない場合、例えば、Ｈｏｌｄｅｎらにより２０１１年に説明されているように、マルチ・エミッタ・アルゴリズムを位置特定のために用いることができる（Ｈｏｌｄｅｎ Ｓ．Ｊ．、Ｕｐｈｏｆｆ Ｓ．およびＫａｐａｎｉｄｉｓ Ａ．Ｎ．（２０１１）「ＤＡＯＳＴＯＲＭ：ａｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｓｕｐｅｒ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ８．４、２７９）。

さらに、位置特定データによりクラスタ分析を実行し、マーカまたは複数のマークされた抗体の複数の位置特定を１つのターゲット分子（抗原）に割り当てることができる。最終的に、この種の割り当ての目的は、細胞当たりの抗体の数の確認である。

本発明による方法構成は、例えば、非蛍光性のコントラスト法を用いて、細胞の周辺を確認することによって補完可能である。その周辺のような細胞のパラメータを基準値として用いることができ、その基準値に対して、例えば、マーカまたは抗原の確認された数を特定することができる。例えば、確認されるマーカの総数に加えて、細胞周辺の単位長さ当たりのマーカの数を確認し、保存し、および／または出力することもできる。この目的で、例えば、細胞の範囲および／または輪郭を決定することができる。非蛍光性のコントラスト法は、例えば、ＤＩＣ（微分干渉コントラスト法）、透過光コントラスト法、位相コントラスト法または角度照明顕微鏡法の使用を含む。

有利な構成では、再現可能な結果を取得し、特に、マーカの分離を支援するために、エミッタ、すなわちマーカまたはマークされた抗原の密度は、選択された投影および利用されたＰＳＦを考慮して設定可能である。評価および位置特定のために、システムＰＳＦに基づいて分析を行うことができる。システムＰＳＦという用語は、特に、理論的なＰＳＦとは対照的に、光学系の実際の特性（収差など）を含む測定されたＰＳＦを意味するものと理解されたい。したがって、システムＰＳＦは、光学系のＥＤＯＦ ＰＳＦに対応する。

目的は、試料の３次元領域の蛍光信号または誘起光信号を検出するための装置を用いてさらに達成される。装置は、検出ビーム経路を有する。存在する検出放射は、検出ビーム経路に沿って導かれ、検出器のような適当な手段を用いてキャプチャ可能である。

検出軸の方向の元の被写界深度を有する対物レンズは、検出放射をキャプチャするために、検出ビーム経路に存在する。検出軸は、検出ビーム経路に沿って少なくとも対物レンズと試料との間に延在する。この明細書において、元の被写界深度は、対物レンズの公称の被写界深度であると理解され、これは、後述するＥＤＯＦ方法なしで存在し、使用可能である。

さらに、本発明による装置は、検出ビーム経路の光学素子を備える。前記光学素子は、元の被写界深度に対して拡張された被写界深度が光学素子によって生成されるような光出力を有する。被写界深度のこの拡張は、検出軸の方向に焦点を長くすること（焦点延長）によって得られる。光学素子は、好ましくは検出ビーム経路の瞳に配置される。光学素子の考えられる有利な実施形態は、以下でさらに説明される。

装置は、個々の蛍光イベント／信号の画像データをキャプチャするための検出器を備え、蛍光信号（また、略して信号）のキャプチャは、２次元の方法でおよび／または時間的に分解された方法で実施されるかまたは実施可能である。さらに、評価ユニットが存在し、評価ユニットにて、検出器から読み出された画像データは、評価され、蛍光信号の数は、確認され、画像領域に割り当てられ、保存される。

本発明による検出方法を実行するのに用いることができる本発明による装置は、例えば、ＰＡＬＭ、ＳＴＯＲＭおよびｄＳＴＯＲＭ法から知られているように、特に、レーザベースの励起を有する蛍光広視野顕微鏡法のための顕微鏡設計に実質的に適応する。追加のＥＤＯＦ機能は、検出ビーム経路において実現される。

１つの可能な構成において、光学素子は、位相マスクとすることができる。位相マスクは、静的であり、例えば、リソグラフィによって生成可能である。装置のさらなる実施形態では、それは動的であり、空間光変調器（ＳＬＭ）によって実現可能であり、これは、透過または反射において可能である。静的な位相マスクは、有利には、必要な制御ステップを減少し、一方、動的な位相マスクは、有利には、装置により大きな柔軟性を与える。

本発明の別の実施形態において、アキシコンまたはアキシコン位相マスクは、光学素子として検出ビーム経路に配置可能である。検出放射は、この種の光学素子の作用によって、ベッセルビームに変換される。

本発明の課題に関して、ベッセルビームの利点は、その大きな被写界深度、単純な生成、所定のベッセルＰＳＦおよび大きいＥＤＯＦ範囲にある。その拡張リングシステムは、不利である。なぜなら、多くのエネルギーまたは蛍光光子の多数は、このリングシステムに入り、それゆえ、位置特定に利用できないか、または、制限された範囲でしか利用できないからである。例えば、リング位相マスクは、位相マスクとして用いることができる。位相マスクは、任意に、いわゆる位相ラッピングの影響下にありうるので、例えば、空間光変調器によって実現可能である。位相ラッピングは、例えば、結果として所望の位相分布をもたらすために、空間光変調器によって生成される必要がある位相分布の生成を意味するものと理解されたい。概して、空間光変調器は、０から２π（２パイ）までの位相角偏差を実現することができるので、２πまでの多くのローカル位相角偏差が生成され、Ｎ×２πの大きい位相角偏差を生成する。空間光変調器によって変調されるビームの破壊的および建設的な重ね合せの結果として、例えばＮ×２πの位相角偏差を有する所望の位相分布が結果として設定される。このようにして、例えば、位相関数としてＮ×２πの位相角偏差を有するアキシコンを実現することができる。

装置のさらなる実施形態において、立方位相マスクは、光学素子として検出ビーム経路に配置される。前記位相マスクは、対称的にまたは非対称的に実施可能である。

上述した立方位相マスク、後述するアキシコンまたはリング位相マスクのような位相マスクは、フーリエ面（＝瞳）またはその近傍に配置される。この目的で、位相マスクは、対物レンズ瞳内、または、中間画像によりアクセス可能なさらなる瞳内に配置可能である。後者は、励起放射が位相マスクによって影響されないという点で有利である。

光学素子がリング位相マスクによって実現される場合、いわゆる位相リングは、光学的効果としてもたらされうる。位相リングがバイナリであり、これらが位相リングの間にπ／２の位相シフトを有する場合、結果として生ずる点拡がり関数（ＰＳＦ）は２つの最大を有する。例えば、この種の位相マスクおよびＰＳＦを用いて、例えば、上下の細胞膜または試料の他の異なる領域のターゲットをキャプチャすることができる。

最大の表現は、さらなるリング要素によって影響されうる。例えば、０とπ／２との間の位相角は、二焦点キャラクタの減少につながりうる。

二焦点イメージングの概念およびこのことにより伴われる拡張被写界深度の使用は、装置のさらなる実施形態において、光学素子として検出ビーム経路に配置されている複屈折素子によって達成可能である。

検出ビーム経路のこの種の複屈折素子の動作の原則は、マーカの信号が平均して等方性偏光を有する状況を利用する。複屈折素子は、異なる屈折率およびそれゆえ、直角偏光のための異なる光路長を有する。それゆえ、これは、結果として等方的に偏光した蛍光放射のための二焦点イメージングになる。２つの焦点領域はまた、互いに合併することもでき、したがって隣接するＥＤＯＦ領域を形成することもできる。さらなる実施形態において、複屈折素子は、ビーム経路の全断面を占有しない。例えば、第３の画像平面は、この場合に生じ、すなわち、第３の被写界深度の意味における第３の焦点領域は、検出軸に沿って生成される。

上述した分析的に再表現可能な位相マスクの代替として、位相マスクはまた、アルゴリズムによって反復的に確認可能であり、表現可能である。この目的で、例えばＰＳＦの長さ、異なるｚ位置の幅（ｘ／ｙ）のようなＰＳＦの所望のＥＤＯＦ特性を記述する品質関数を定義することができる。その後、開始の位相関数が特定され、後者は、反復的に変更され、品質関数が増加する場合、変更のみが採用される。このようにして、品質関数を反復的に最大にすることができる。反復的な変更は、確率的に実施可能である（「ランダムウォーク」）。

同様に、いわゆるＩＦＴＡ（逆フーリエ変換アルゴリズム）を用いることができる（Ｇｅｒｃｈｂｅｒｇ－Ｓａｘｔｏｎ－Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｕｓ、Ｇｅｒｃｈｂｅｒｇ Ｒ ＷおよびＳａｘｔｏｎ（１９７２）Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈａｓｅ ｆｒｏｍ ｉｍａｇｅ ａｎｄ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｐｌａｎｅ ｐｉｃｔｕｒｅｓ、Ｏｐｔｉｋ ３５、２３７－４６）。この場合、後者は、３次元に拡張される必要がある（例えば、Ｗｈｙｔｅ Ｇ．およびＣｏｕｒｔｉａｌ Ｊ．（２００５）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｌｏｇｒａｐｈｉｃ ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｌｉｇｈｔ ｓｈａｐｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ａ Ｇｅｒｃｈｂｅｒｇ－Ｓａｘｔｏｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ、Ｎｅｗ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃｓ ７．１、１１７）。ここでまた、ターゲット関数、この場合、所望のＥＤＯＦ－ＰＳＦ強度分布が特定され、次に、後者は、ＩＦＴＡアルゴリズムによって反復的に近似される。

この種の反復アルゴリズムを用いて、ターゲットＥＤＯＦ挙動を最適に設定することができ、次に、存在する光学系のための結果として生ずる位相マスクを製造することができる。

可変の位相整形要素、例えばＳＬＭ（空間光変調器）または他の可変ミラーが光学系のために提供される場合、上述した反復最適化はまた、個々の実験の間、例えば異なる試料クラスのために実行可能である。

さらなる実施形態では、本発明による装置は、検出ビーム経路の少なくとも１つの適応光学素子を備えることができる。この種の光学素子は、特に、可変レンズ、適応ミラー、特に可変ミラーまたはマイクロレンズアレイである。適応ミラーは、反射において用いられる。

例えば、液体レンズが動的なＥＤＯＦ方法のための可変レンズとして用いられる場合、後者は、例えば、中間画像の無限空間に位置決め可能である。可変レンズは、しばしば、非駆動状態で屈折力を有さないか、または、非常に低い屈折力しか有さないように構成される。それゆえ、静的修正レンズは、任意に存在することができる。

いわゆる動的なＥＤＯＦ方法は、適応光学素子を有するこの種の実施形態によって実施可能である。この場合、高速の焦点変位をもたらすことができ、この種の焦点変位は、検出器のキャプチャ時間間隔内で、例えばカメラ露出時間内で実施される。さらに、ＥＤＯＦ方法の機能は、試料に柔軟に適応することができる。例えば、拡張被写界深度は、検出軸の方向（Ｚ方向）に調べられる細胞の平均範囲に整合することができる。

調べられる試料の形態が公知である場合、ボリューム全体を連続的に通過する代わりに、例えば上部および下部の細胞膜に対して、ターゲットの方法で焦点変位を実施することもできる。例えば、下部の細胞膜は、対物レンズから来るとき、検出軸によって実質的に交差される第１の細胞膜である。したがって、上部の細胞膜は、２番目に交差され、対物レンズからさらに離れたところにある細胞膜である。検出器の集積時間が関心のない試料位置では用いられないので、焦点位置の選択的な選択および調整は、光子効率を増加させる。

試料の細胞膜のそれぞれの位置は、検出軸の方向に変化しうる。それゆえ、二焦点または多焦点イメージングがさらなるＥＤＯＦ方法と組み合わせられるかまたは後者にと任意に組み合わせ可能である場合、有利である。このようにして、二段階の効果が達成される。すなわち、イメージングされるべき試料の２つの領域（例えば上下の細胞膜）は、検出放射の二焦点または多焦点イメージングにより粗くあらかじめ定義される。次に、それぞれの粗い領域内のすべての分子は、追加のＥＤＯＦ方法によって（例えば光学素子として立方位相マスクを用いて）キャプチャされる。この場合、２つの粗い領域は、有利には、専用の検出器領域または検出器にイメージング可能である。

例えば、複数の焦点面または焦点領域が１つの検出器の対応する数の部分および／または複数の検出器に同時にイメージングされるという影響のため、複数の焦点面または焦点領域から来る検出放射を分割することは、適切な画像分割デバイスによって実施可能である。この種の画像分割デバイスの例は、第１の検出器に対してわずかに異なる間隔を有する第２の検出器を有する構成（例えば、Ｒａｍ Ｓｒｉｐａｄら、２００８、Ｈｉｇｈ ａｃｃｕｒａｃｙ ３Ｄ ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔ ｔｒａｃｋｉｎｇ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ ｐｌａｎｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｆａｓｔ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｉｎ ｌｉｖｅ ｃｅｌｌｓ、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ９５、６０２５－６０４３）、複数の検出器領域上の可変平面設定（ＤＥ１０２００９０６０４９０Ａ１）、複数の検出器領域上の複数の焦点面の収差修正イメージングのための回折素子（ＷＯ２０１３／１０６７３１Ａ１）、または、複数の検出器の部分上の複数の焦点面をイメージングするためのプリズム構成（ＷＯ２０１５／０４４８１９Ａ１）である。

本発明による方法および本発明による装置の利点は、マーカおよび／またはマークされた抗原の数を確認するときの改善された精度の可能性にある。瞳に配置される適切なＥＤＯＦ位相素子によって、特にスプリッタ装置および／または位相素子が可変設計を有する場合、焦点スタックをキャプチャする必要なく、試料のＺ方向の範囲に３次元試料の分子の計数を適応させることができる。例えば、可変多焦点装置が用いられるならば、接着細胞の場合、焦点面は、上部および下部の細胞膜をそれぞれキャプチャするように設定可能である。焦点面周辺では、（追加の）ＥＤＯＦ素子は、被写界深度の対応する拡張をもたらし、したがって適切な焦点領域をもたらす。本発明の有利な表現において、光学素子は、２つの焦点領域をわずかに重複させる。このようにして、細胞全体をキャプチャすることができる。本発明が細胞、例えば浮遊細胞よりｚ方向に著しく大きい範囲を有する試料に適用される場合、かつ、光学素子を用いても、距離を埋めることができない場合、任意には、２より多い焦点領域を同時にキャプチャすることもできる。

本発明による装置を用いて、有利には、生体細胞、生体細胞の領域または生体構造の信号、特に蛍光信号の数を確認することができる。さらに、装置は、蛍光でマークされた生体細胞、生体構造を検出するための方法、ならびに、マークされた抗体およびマークされた抗体と抗原との結合を検出するための方法で用いられうる。

本発明は、例示的な実施形態および図面に基づいて、以下さらに詳細に説明される。

光学装置および対物レンズの元の被写界深度に対応する焦点面による従来技術に従う検出方法の概略図を示す。 本発明による光学装置および対物レンズの拡張被写界深度に対応する焦点領域の第１の例示的な実施形態による本発明による検出方法の概略図を示す。 本発明による装置の第２の例示的な実施形態の概略図を示す。 本発明による装置の第３の例示的な実施形態の概略図を示す。 本発明による装置の第４の例示的な実施形態の概略図を示す。 本発明による装置の第５の例示的な実施形態の概略図を示す。 本発明による装置の第６の例示的な実施形態の概略図を示す。 本発明による装置の第７の例示的な実施形態の概略図を示す。 対称形の立方位相マスクの影響による検出ビーム経路の瞳における位相分布の概略図を示し、それぞれ、ａ）は簡略の白黒スケッチであり、ｂ）はグレースケール画像であり、ｃ）は関連付けられた点拡がり関数の簡略図である。 アキシコンの影響による検出ビーム経路の瞳における位相分布の概略図を示し、それぞれ、ａ）は簡略の白黒スケッチであり、ｂ）はグレースケール画像であり、ｃ）は関連付けられた点拡がり関数の簡略図である。 光学素子の影響のない検出ビーム経路の瞳における位相分布の概略図を示し、ａ）は簡略の白黒スケッチであり、ｂ）はグレースケール画像であり、ｃ）は関連付けられた点拡がり関数の簡略図である。 ａ）は検出ビーム経路の瞳面における第１のリング位相マスクの位相分布の概略図を示し、ｂ）は関連付けられたシミュレーションの点拡がり関数のより簡略化した図を示す。 ａ）は検出ビーム経路の瞳面における第２のリング位相マスクの位相分布の概略図を示し、ｂ）は関連付けられたシミュレーションの点拡がり関数のより簡略化した図を示す。 ａ）は検出ビーム経路の瞳面における第３のリング位相マスクの位相分布の概略図を示し、ｂ）は関連付けられたシミュレーションの点拡がり関数のより簡略化した図を示す。 本発明による方法の構成のフローチャートを示す。

本発明による装置の実施形態および本発明による方法の可能な構成が概略的に示される。ここで、同じ参照符号は、各場合において、同じ技術要素を意味する。

発明の原則は、図２において示され、図１において示される従来技術と比較される。光学素子１４は、本発明による光学装置の検出ビーム経路３に配置され、光学素子１４の影響により、対物レンズ５の被写界深度は拡張される。点拡がり関数ＰＳＦは、Ｚ軸Ｚの方向に拡張される。この拡張被写界深度ＥＤＯＦ（両矢印によって説明される）は、この例示的な実施形態では、対物レンズ５の単一の焦点設定のみにより、Ｚ軸Ｚの方向の試料全体７のキャプチャを容易にする。したがって、試料７に結合されるすべてのマーカ８は、検出器１３によってそれらのそれぞれの（蛍光）信号１２をキャプチャすることによって同時にイメージング可能である。Ｚ軸Ｚの方向のそれぞれキャプチャされた信号１２の起点（マーカ８）の位置に関する情報は、その過程で失われる。マーカ８は、ＸおよびＹ軸に沿った検出面でのみ位置特定が可能である。

図３において、本発明による装置の第１の例示的な実施形態が、これ以上の詳細が示されない顕微鏡１の一部として示される。照明放射は、レーザ光源１６において生成および提供される。照射ビームは、光学レンズ１７が存在する照明ビーム経路２に沿ってビームスプリッタ１８を介して反射して対物レンズ５に到達する。位相素子の形の光学素子１４は、対物レンズ５のフーリエ面内にまたはフーリエ面の近傍に配置される。フーリエ面において、点は平面波に変換され、逆に、平面波は点に変換される。それぞれ存在する位相素子がすべての対象物の点上で同じ作用を有するように、位相素子は、フーリエ面内に、または、できる限りフーリエ面の近傍に位置しなければならない。

対物レンズ５の拡張被写界深度ＥＤＯＦは、光学素子１４の作用によって達成される。試料７において、照明放射は、検出放射４を生じさせ、検出放射４は、検出ビーム経路３に沿ってビームスプリッタ１８に当たる。検出放射４は、その光学特性に関して照明放射から逸脱し、ビームスプリッタ１８によって送信される。検出放射４が少なくとも２つの波長の放射によって形成される場合、これらは、互いから分離可能であり、別々にキャプチャ可能である。図示の例示的な実施形態では、この種の分離は、１つの波長を透過し、他の波長を反射するさらなるビームスプリッタ１８によってもたらされる。このようにして分割された検出放射４は、部分ビーム経路に沿って検出器１３またはさらなる検出器２０に到達する。

検出器１３および２０は、評価ユニット２３に接続され、評価ユニット２３によって、キャプチャされた信号１２は、画像データとして処理および評価される。さらに、制御ユニット２４が存在し、制御ユニット２４によって、例えば、レーザ光源１６、光学素子１４、チューブレンズ１１および／または光学レンズ１７を制御するための制御コマンドは、生成可能であり、出力可能である。生成された制御コマンドおよび／または装置の現在の構成に関する画像データおよび情報は、ディスプレイ２５上に表示可能である。

照明放射が光学素子１４を通過しないように、瞳－共役面（フーリエ面）における光学素子１４の配置を選択することができる（図４）。図示の第３の例示的実施形態では、照明ビーム経路２および検出ビーム経路３、または、照明放射および検出放射４は、ビームスプリッタ１８によって互いから分割される。検出放射４は、ミラー１９によって光学素子１４および検出器１３に向けられる。

本発明による装置のさらに可能な例示的な実施形態（図５）は、それぞれの焦点面ＤＯＦの高速変位によって拡張被写界深度ＥＤＯＦを達成するのに適している。チューブレンズ１１の下流の中間画像は、例示的な方法で検出ビーム経路３に示した２つのレンズ１７．１および１７．２により検出器１３上にイメージングされる。以下、レンズ１７．１および１７．２は、より複雑な結像光学ユニットを表現することもできる。現在の焦点面ＤＯＦの変位および拡張被写界深度ＥＤＯＦの生成を容易にする可変焦点レンズ２１は、レンズ１７．１と１７．２との間に存在する。図５に概略的に示すように、可変焦点レンズ２１は、加えて補償レンズ２１．１を有することができる。可変焦点レンズ２１は、制御ユニット２４によって制御可能である。特に、少なくとも２つの現在の焦点面ＤＯＦが検出器１３のキャプチャ時間間隔内で設定され、したがって、結果として生ずる拡張被写界深度ＥＤＯＦが生成されるほど高速に制御を実施することができる。検出放射４は、（結果として生ずる）拡張被写界深度ＥＤＯＦによってキャプチャされる。

アキシコンは、本発明による装置のさらに例示的な実施形態（図６）の光学素子１４として、検出ビーム経路３に配置される。光学素子１４は、レンズ１７．１の近傍に配置され、後者は、次に、その焦点距離に従って中間像面２２からある距離をおいて配置される。

本発明による装置のさらなる実施形態の可能性は、光学素子１４として適応ミラーまたはマイクロレンズアレイを用いて、拡張被写界深度ＥＤＯＦを動的に生成するのを容易にする（図７）。検出ビーム経路３のレンズ１７．１および１７．２は、第１の中間画像を検出器１３上にイメージングする。光学素子１４は、瞳１５（瞳面）に存在する。

図８には、拡張被写界深度ＥＤＯＦと組み合わせた多焦点イメージングのための１つの例示的な実施形態が説明される。レンズ１７．１および１７．２は、中間画像を検出器１３上にイメージングし、同時にさらなる共役瞳１５を作成する。光学素子１４は、後者に配置される。レンズ１７．１および１７．２は、いわゆるリレー光学ユニットを提供する。

検出放射４は、複数の相互に異なる焦点面を有するそれぞれの被写界深度ＤＯＦでキャプチャされ、光学素子１４の影響は、拡大された部分図に概略的に示すように、焦点面の各々の周りに拡張被写界深度ＥＤＯＦ１またはＥＤＯＦ２を生成する。この場合、拡張被写界深度ＥＤＯＦ１は、マーカ８、マークされた抗体１０に接続されている抗原９および／または上部の細胞膜７．１のマークされた抗体１０の信号１２のイメージングを可能にし、拡張被写界深度ＥＤＯＦ２は、マーカ８、マークされた抗体１０に接続されている抗原９および／または下部の細胞膜７．２のマークされた抗体１０の信号１２のイメージングを可能にする。

装置および／または方法の構成のさらなる実施形態において、被写界深度ＤＯＦまたは拡張被写界深度ＥＤＯＦは、有利には、ｚ軸Ｚの方向にわずかに重複し、関連した試料ボリュームの中断のないイメージングを可能にする。

さらに、画像分割ユニット２６は、検出ビーム経路３に配置される。後者によって、異なる焦点面ＤＯＦまたは異なる拡張被写界深度ＥＤＯＦ１、ＥＤＯＦ２からの検出放射４の成分は、異なる検出器１３または少なくとも１つの検出器１３の異なる領域に方向付けられ、互いに別々にキャプチャされる。

拡張被写界深度ＥＤＯＦは、位相マスクを用いて生成可能である。図９から図１１には、異なる位相マスクの影響の結果としての検出ビーム経路の瞳における位相分布が示される。この場合、部分的な図９ａ、図１０ａおよび図１１ａは、それぞれ、図９ｂ、図１０ｂおよび図１１ｂに示されるグレースケール画像の簡略の白黒のスケッチを、ｘｙ平面の対応する位相分布とともに示す。図９ｃ、図１０ｃおよび図１１ｃは、それぞれ各場合において、ｘｚ平面の断面として簡略の点拡がり関数ＰＳＦを示す。

図９ａから図９ｃは、対称形の立方位相マスクのスケッチ、グレースケール画像およびＰＳＦを示す。

図１０ａから図１０ｃは、対応する位相分布およびアキシコンのＰＳＦを示す。

図１１ａから図１１ｃには、検出ビーム経路３の光学素子１４の配置のない位相分布およびＰＳＦが例示的な方法で示される。

図１２から図１４には、さまざまなリング位相マスクおよびそれらのそれぞれのシミュレーションされた点拡がり関数が示される。この場合、図１２ａ、図１３ａおよび図１４ａは、それぞれ、生成されたリング位相マスクを概略的に示す。図１２ｂから図１４ｂは、関連付けられた点拡がり関数ＰＳＦを簡略化された方法で示す。

図１２は、異なってハッチングされた領域の間でπの位相シフトを有するリング位相マスクに関する。結果として生ずるＰＳＦは、Ｚ軸Ｚの方向に２つの別々の最大を示す。

図１３ａには、複数の異なる領域を有し、各場合において再びπの位相シフトを有するリング位相マスクが概略的に示される。関連付けられた点拡がり関数ＰＳＦは、Ｚ軸Ｚの方向に引き離される。少なくとも２つの別々の最大が生成され、これらにはさらなる最大を形成する明らかに識別可能な傾向がある。示された領域および位相シフトより多くのリング位相マスクは、追加の最大およびそれゆえ追加の焦点面ＤＯＦおよび／または拡張被写界深度ＥＤＯＦを可能にする。位相マスクの設計に応じて、点拡がり関数ＰＳＦは、イメージングされる試料７および／またはイメージングの求められている対象物に整合することができる。

図１５のフローチャートに基づいて、本発明による方法の構成の可能性が説明される。特に、装置の上述した実施形態の可能性の１つを用いて方法を実行する。

蛍光信号または光誘起光信号を潜在的に放出すると思われる試料７が提供される。例えば、この種の試料７は、少なくとも１つの抗体１０を有する生体表面であり、抗体１０は、検出される抗原９と互換性を持ち、光信号を放出するのに適しているマーカ８を備えている。しかしながら、この種の抗体１０によって培養される生体表面を試料７として用いることもできる。

拡張被写界深度ＥＤＯＦが選択され、関連した試料７は、蛍光信号１２の存在が調べられなければならない。装置の現在の設定または構成、例えば現在設定された位相ランプが所望の拡張被写界深度ＥＤＯＦを有する信号１２の検出を可能にする場合、測定はこの構成で実行される。この目的で、試料７は、照明放射によって照明され、後者は、信号１２の放出を容易にするおよび／または潜在的に誘発する。照明放射が励起放射として作用する場合、試料７の照明領域に存在し、照明放射を受け入れるマーカ８は、励起され、信号１２を放出する。

放出信号１２は、装置および検出ビーム経路３に配置される少なくとも１つの検出器１３、２０上の現在設定された拡張被写界深度ＥＤＯＦによってイメージングされ、前記検出器によって画像データ（測定値）としてキャプチャされる。検出器１３、２０の空間分解能は、ＸＹ平面のそれぞれの信号１２の起点の位置の２次元の割り当て（２次元の位置特定）を容易にする。Ｚ軸Ｚの方向の位置特定が可能なのは、せいぜい、信号１２の起点が、拡張被写界深度ＥＤＯＦの領域から来るものとして知られており、それゆえ、Ｚ軸Ｚの方向の、対応して粗い領域が、ＸＹ平面の位置に割り当て可能な場合である。位置特定は、信号１２の可能な２回のキャプチャのためのチェックならびにおそらく必要な検出の修正および／または方法の計数結果を支援する。

キャプチャされた画像データは合併され、例えば評価ユニット２３によって、結果として生ずる全体画像を形成し、これは、画像合成またはレンダリングとも呼ばれる。

方法の代替のフローでは、選択された拡張被写界深度ＥＤＯＦが、特に現在の位相ランプを有する装置の現在の構成によって達成できないと決定される。図示例では、拡張被写界深度ＥＤＯＦは、Ｚ軸Ｚの方向に互いに十分近くに位置する複数の焦点面ＤＯＦによって生成されなければならない。

それゆえ、焦点面ＤＯＦの最適間隔およびその重複は、所望の拡張被写界深度ＥＤＯＦのために設定される。このように設定される装置によって、それぞれキャプチャされた信号１２の測定および位置特定は、それぞれの焦点面ＤＯＦにおいておよび／または拡張被写界深度ＥＤＯＦの領域において実施される。

個々の焦点面ＤＯＦおよびそれゆえ拡張被写界深度ＥＤＯＦのキャプチャされた画像データは、その後結合され、全体のデータ記録を形成する。その過程で、焦点面ＤＯＦの既知の間隔および／または重複を使用することができる。追加または代替として、画像データ内に含まれて識別された試料７の構造を用いて、構造データの相関により確認された位置特定データを検査することができる。このように取得された全体のデータ記録は、必要な場合検査されてもよく、合併され、結果として生ずる全体画像を形成する。

加えて、面間隔の値は、提供可能であり、組み合わせの方法ステップに含まれて、全体のデータ記録を形成することができる。例えば、複数の対象物、例えば細胞が互いに重なって存在する場合、または、画像データが組織内にキャプチャされる場合、この任意の値は有利である。

１ 顕微鏡（Mikroskop）
２ 照明ビーム経路（Beleuchtungsstrahlengang）
３ 検出ビーム経路（Detektionsstrahlengang）
４ 検出放射（Detektionsstrahlung）
５ 対物レンズ（Objektiv）
６ スライド（Probentraeger）
７ 試料（Probe）
７．１ 下部の細胞膜（untere Zellmembran）
７．２ 上部の細胞膜（obere Zellmembran）
８ マーカ（Marker）
９ 抗原（Antigen）
１０ 抗体（Antikoerper）
ＤＯＦ 焦点面；元の被写界深度（Fokusebene；urspruengliche Schaerfentiefe）
ＥＤＯＦ 焦点領域；拡張被写界深度（Fokusbereich；erhoehte Schaerfentiefe）
ＰＳＦ 点拡がり関数（Punktbildverwaschungsfunktion（point spread function））
１１ チューブレンズ（Tubuslinse）
１２ 蛍光信号（Fluoreszenzsignal）
１３ 検出器（Detektor）
１４ 光学素子（optisches Element）
１５ 瞳（Pupille）
１６ レーザ光源（Laserlichtquelle）
１７ レンズ（Linse）
１７．１ レンズ（Linse）
１７．２ レンズ（Linse）
１８ ビームスプリッタ（Strahlteiler）
１９ ミラー（Spiegel）
２０ さらなる検出器（weiterer Detektor）
２１ 可変焦点レンズ（varifokale Linse）
２１．１ 補償レンズ（Kompensationslinse）
２２ 中間像面（Zwischenbildebene）
２３ 評価ユニット（Auswerteeinheit）
２４ 制御ユニット（Steuereinheit）
２５ ディスプレイ（Anzeige）
２６ 画像分割ユニット（Bildteilereinheit）

Claims (13)

1. 試料の３次元領域の光信号を検出するための方法であって、前記方法は、
   －前記３次元領域の画像データを光学装置によって２次元画像平面にキャプチャするステップであって、蛍光信号の形の信号は、前記光学装置の元の被写界深度に対して拡張された被写界深度でキャプチャされ、画像平面に投影され、前記蛍光信号は励起放射を適用することによって励起されるマーカから放出され、フォトスイッチ可能な分子は前記マーカとして用いられ、前記マーカのサブセットは各場合において信号を放出するために励起される、ステップと、
   －前記放出された信号を時系列で２次元的に分解してキャプチャするステップであって、共に非常に空間的に近くに位置するか、または、Ｚ軸の方向に連続的に位置するマーカをキャプチャできるようにし、時系列のキャプチャによって分離する、ステップと、
   －前記画像平面の信号の数を確認するステップと、
   －画像領域に割り当てられた前記数を保存し、前記割り当てられた数を提供するステップと、を含み、
   －前記光学装置は、検出ビーム経路を有し、検出放射は、前記検出ビーム経路に沿って導かれ、キャプチャ可能であり、
   －前記光学装置は、前記検出放射をキャプチャするための、前記検出ビーム経路の検出軸の方向の元の被写界深度（ＤＯＦ）を有する対物レンズを有し、
   －前記光学装置は、前記検出ビーム経路の瞳における光学素子を有し、前記元の被写界深度（ＤＯＦ）に対して拡張された被写界深度（ＥＤＯＦ）は、前記光学素子によって生成され、
   －前記光学装置は、２次元的に分解された信号のキャプチャのための検出器であって、前記ＥＤＯＦによって３次元領域においてキャプチャされる前記信号は、２次元画像としてキャプチャされる、検出器を有し、
   －前記光学装置は、評価ユニットを有し、前記評価ユニットにて、前記検出器から読み出された画像データは、ＥＤＯＦによって変更された点広がり関数（ＰＳＦ）を考慮して評価され、前記信号の数は、確認され、画像領域に割り当てられ、保存される、
   方法。
2. 生体表面上の抗原を検出するための方法であって、前記方法は、
   －少なくとも１つの抗体を有する前記生体表面を培養するステップであって、前記少なくとも１つの抗体は、検出される前記抗原と互換性を持ち、蛍光信号および／または誘起光信号の形の信号の誘起放出に適したマーカを備えているか、または、前記少なくとも１つの抗体によって培養される生体表面を用いるステップであって、フォトスイッチ可能な分子は前記マーカとして用いられる、ステップと、
   －抗原に結合されたマークされた抗体を励起し、信号を放出するステップであって、前記マーカのうちのサブセットは各場合において信号を放出するために励起される、ステップと、
   －光学装置によって前記放出された信号をキャプチャするステップと、
   を含み、
   －前記光学装置は、検出ビーム経路を有し、検出放射は、前記検出ビーム経路に沿って導かれ、キャプチャ可能であり、
   －前記光学装置は、前記検出放射をキャプチャするための、前記検出ビーム経路の検出軸の方向の元の被写界深度（ＤＯＦ）を有する対物レンズを有し、
   －前記光学装置は、前記検出ビーム経路の瞳における光学素子を有し、前記元の被写界深度（ＤＯＦ）に対して拡張された被写界深度（ＥＤＯＦ）は、前記光学素子によって生成され、
   －前記光学装置は、２次元的に分解された信号のキャプチャのための検出器であって、前記ＥＤＯＦによって３次元領域においてキャプチャされる前記信号は、２次元画像としてキャプチャされる、検出器を有し、
   －前記光学装置は、評価ユニットを有し、前記評価ユニットにて、前記検出器から読み出された画像データは、ＥＤＯＦによって変更された点広がり関数（ＰＳＦ）を考慮して評価され、前記信号の数は、確認され、画像領域に割り当てられ、保存され、
   前記方法は、
   －キャプチャされた信号の存在に関して前記画像データを評価し、前記キャプチャされた信号の数を確認するステップと、
   －前記キャプチャされた信号の前記数を保存し、提供するステップと、
   を含む方法。
3. ２次元的に蛍光信号の位置特定は、選択されたＥＤＯＦ方法及び点広がり関数に基づいて行われる、
   請求項１または２に記載の方法。
4. 前記位置特定は、検出器上でキャプチャされた蛍光信号の点の強度値に基づいて実行され、
   －背景強度に閾値を設定するステップと、
   －点の少なくとも１ピクセルで前記閾値を超えるキャプチャされた強度を一定の半径を有する関連したピクセルに割り当てるステップと、
   －関連するピクセルおよび半径のデータを位置特定ステップに組み込むステップと、
   を含む請求項３記載の方法。
5. 前記位置特定は、点分布関数の重心を決定することにより実行される、
   請求項３記載の方法。
6. 前記位置特定は、関連するピクセルおよび半径に２次元のガウス関数を当てはめることによって実行される、
   請求項３記載の方法。
7. 元の被写界深度（ＤＯＦ）を有する少なくとも２つの焦点面、または、拡張被写界深度（ＥＤＯＦ）を有する少なくとも２つの焦点領域、または、元の被写界深度（ＤＯＦ）を有する少なくとも１つの焦点面および拡張被写界深度（ＥＤＯＦ）を有する少なくとも１つの焦点領域が生成され、その結果、拡張被写界深度（ＥＤＯＦ）が生成される、
   請求項１から６のいずれかに記載の方法。
8. 試料の３次元領域の蛍光信号および／または誘起光信号の形の信号を検出するための装置であって、
   －前記装置は、検出ビーム経路を備え、検出放射は、前記検出ビーム経路に沿って導かれ、キャプチャ可能であり、
   －前記装置は、前記検出放射をキャプチャするための、前記検出ビーム経路の検出軸の方向の元の被写界深度（ＤＯＦ）を有する対物レンズを備え、
   －前記装置は、前記検出ビーム経路の瞳における光学素子を備え、前記元の被写界深度（ＤＯＦ）に対して拡張された被写界深度（ＥＤＯＦ）は、前記光学素子によって生成され、
   －前記装置は、２次元的に分解された信号のキャプチャのための検出器であって、前記ＥＤＯＦによって３次元領域においてキャプチャされる前記信号は、２次元画像としてキャプチャされる、検出器を備え、
   －前記装置は、評価ユニットを備え、前記評価ユニットにて、前記検出器から読み出された画像データは、ＥＤＯＦによって変更された点広がり関数（ＰＳＦ）を考慮して評価され、前記信号の数は、確認され、画像領域に割り当てられ、保存される、
   装置。
9. アキシコンまたはアキシコン位相マスクは、光学素子として前記検出ビーム経路に配置され、前記検出放射は、前記光学素子の作用によってベッセルビームに変換される、
   請求項８に記載の装置。
10. 立方位相マスクは、光学素子として前記検出ビーム経路に配置される、
    請求項８に記載の装置。
11. リング位相マスクは、光学素子として前記検出ビーム経路に配置される、
    請求項８に記載の装置。
12. 複屈折素子は、光学素子として前記検出ビーム経路に配置される、
    請求項８に記載の装置。
13. 少なくとも１つの液体レンズ、適応ミラーまたはマイクロレンズアレイは、光学素子として前記検出ビーム経路に配置される、
    請求項８に記載の装置。
    

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