CN103025859A - 用于检测生物学和化学分析中的颗粒的位置自由度的方法和装置以及在免疫诊断学中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于检测生物学、生物化学、物理学、生物物理学和化学分析中使用的颗粒的位置自由度的方法和装置。特别是，本发明涉及能够根据所检测到的颗粒/细胞的群体的迁移率来检测和表征颗粒/细胞的群体的方法和装置。在根据本发明的一个实施方式中，某些细胞的检测基于在结合至基底的细胞群体和显示出较弱的结合力的那些细胞群体中所检测到的差异。首先，使细胞沉降在所述基底上，并且在重力、自然热动力学压力波动和其他随机或施加的力存在的情况下，一些颗粒可以显示出平移移动。根据本发明的方法和装置，检测颗粒移动并计算测量结果，以确定特异性分析物的结合。

Description

用于检测生物学和化学分析中的颗粒的位置自由度的方法和装置以及在免疫诊断学中的应用
相关申请的交叉引用
本发明要求于2010年5月25日提交的美国临时专利申请No.61/348,072和于2010年5月25日提交的美国临时专利申请No.61/347,946的优先权，在此通过参引的方式将它们两者的全部内容引入本文。
技术领域
本发明涉及用于检测在生物学、生物化学、生物物理学、物理学和化学分析中使用的颗粒的位置自由度的方法和装置。本发明的主要用途包括免疫诊断，例如血液分型和传染性疾病筛查。
背景技术
诸如微孔板和生物芯片形式的阵列分子的使用允许检索数量不断增长的与自然界有关的信息。尽管已知有很多变体，但是这种阵列的使用典型地包括将探针或者分析物固定在基底上并且使用各种技术测量被固定的分子与其它液相分子之间的相互作用。这些阵列技术的具体实例包括在微孔板中进行的免疫测定法(例如，酶联免疫吸附测定法(ELISA))、商业核酸芯片和蛋白微阵列或生物芯片。生物芯片最经常使用的是玻璃质基底，而用于ELISA的微孔板经常由经γ射线辐射的聚苯乙烯构成。尽管从固定分子的斑块相对于彼此或者相对于基准功能部件被放在限定位置的意义上来说，阵列典型地为“有序的”，但是所谓的“溶液相阵列”也已经商业化。溶液相阵列技术测量分析物与珠子的悬浮体的结合。悬浮体通过以不同比例将以结合探针共标记(co-label)的成批颗粒与两种荧光鉴定子分子(identifier molecule)的相应混合物混合而形成。流式细胞仪检测结合的荧光标记的分析物以及鉴定子比率。
除了检测个体分子之外，也已经使用阵列技术来分析颗粒(包括生物学细胞)。例如，现有技术中已知通过ELISA或流式细胞仪来检测细胞表面抗原。授予Oberhardt的美国专利No.6,251,615公开了使用显微镜检测细胞，以检测结合至带有偶联抗体受体的多个捕获表面区域中的一个的细胞。
然而，常规阵列的最大局限在于常常需要长时间的温育以达到充分接近平衡的结合程度以获得希望的灵敏度。这可能需要允许样品或试剂在ELISA微孔板或者生物芯片中温育很多小时，并且在一些情况中，长于8小时的典型工作日。这种迟延可能导致费用的增加，阻碍在紧急情况中的使用，并且因试剂降解而降低了数据质量和在被延长的温育时间期间增加了非特异性(背景)信号。常规方法的其它局限包括需要分析物标记步骤和严苛的洗涤步骤，这引入了额外的劳动力和装备成本，并且可能影响数据的质量。另外，基于微孔板的方法使用体积相对较大的检测样品和试剂。
常规阵列的一种用途是免疫诊断，例如以确定血型。血液分型需要确定人红细胞(RBC)表面上关键表面抗原的存在或者不存在和/或需要确定对RBC表面抗原具有特异性的临床相关抗体的存在或者不存在。常规阵列通过检测红细胞(RBC)在添加相应抗体时的凝集来进行血液分型(参见例如授予Hillyard美国专利No.4,894,347)。血液样品的凝集指示对受检抗原呈阳性结果。因此，血液分型方法以大批进行以确定凝集/粘附，并且间接测量RBC的结合。用于血液分型的一些方法(称为“固相”方法)包括将某些蛋白或者表达某些蛋白的细胞固定在表面上。这些方法常常以批量形式进行。例如，照相机可以通过拍摄单个低分辨率图像以查看红颜色是否位于孔室的中央底部或者位于边缘，检测大部分红细胞是否在孔室的壁部或者在孔室的底部。对于强信号或者接近平衡的系统，可以发现大部分细胞处于类似的状态(大部分在底部，后者大部分在壁部)，对于充分的信号强度和温育时间，产生可靠的结果。
确保血液分型得以正确进行是非常重要的，因为来自不同个体的RBC可以在它们的表面上具有不同的抗原，并且将来自具有某些RBC抗原的供体的全部血液或者某些血液组分输注到缺乏那些抗原的患者可能在患者中导致不利的输注反应。如果患者对特定抗原具有天然的免疫反应的话(这可能发生于非匹配ABO血型)，或者如果患者已经通过前期暴露而针对血液抗原进行免疫(例如Kell或Duffy型抗原)，这是常常发生的。因此，假性结果的可能情况会由于抗因测量灵敏度的限制或者因免疫患者的血液中的抗体浓度(滴度)随时间减少而变得不可检测的血细胞抗原的可能免疫反应而发生，也可能因抗体滴度和人与人之间的反应性的可能变化或者试剂特异性的潜在可变性而发生。
用于确定血液类型的现有技术受限于它们的灵敏度、速度和针对大量分析物来检测样品的能力。例如，常规血液分型方法要求凝集或者大量表面结合的事实(其中大部分RBC必须结合(并且在很多情况中必须通过形成多价连接而强烈结合))限制了检测的速度和灵敏度。另外，目前的技术需要数量相对较大的血液(例如约3mL)以供检测。在利用更小体积的同时进行血液分型的能力将是非常有用的，特别是在应对婴儿的时候。可靠地测量水平较低的结合(其具有较少的结合细胞并且对于每个结合细胞具有较少的连接，)的能力将能够提高灵敏度(即以高信度检测较低的滴度)，使检测时间显著变短或者兼具两者的益处。
随着灵敏度的增加，患者和供体血液能够信度更高地匹配。速度增加，急需血液的患者可以快得多地安全输注经匹配的血液。检测大量分析物的能力的增加，可以减少检测成本，可以采用额外的检测，并且通过针对来自多个个体的多重相关抗体或者试剂细胞进行检测来减少特异性问题。扩大检测名目(test panel)以包括针对抗原变体或者抗这些变体的抗体的更多检测可能是有价值的，这是因为可变性由于遗传变异或其它常见于例如具有不同种族背景(并因此具有不同的基因构成)的群体的比较中的其它变体的缘故而非常普遍。如果可以实现这些优点，益处可以延至血液分型之外的很多其它用途，包括干细胞、血小板和癌细胞的表面抗原表征。
发明内容
本发明涉及用于检测生物学、生物化学、生物物理学、物理学和化学分析中使用的颗粒的位置自由度的方法和装置。本发明所述的方法和装置能够根据所检测到的颗粒/细胞的群体的迁移率来检测和表征颗粒/细胞的群体。在根据本发明的一个实施方式中，细胞群体的分析性表征基于在结合至基底的细胞群体和显示出较弱的结合力的那些细胞群体中所检测到的差异。首先，使细胞沉降在所述基底上，并且在重力、布朗力和其他随机或施加的力存在的情况下，一些颗粒可以显示出平移移动。检测颗粒的移动并计算测量结果，以确定特异性分析物的存在和/或浓度。
本发明的一些例示性实施方式公开了用于生物学、化学或生物化学分析的方法(即，测定法)，所述方法基于如下发现：颗粒与其所暴露的表面关联的移动准确地度量了分析物在颗粒、表面上或者溶液周围的存在或者不存在。
特别是，颗粒的称为“位置自由度”的这种移动以及根据本发明的所述方法和装置对这种移动的显微测量表征了颗粒(例如细胞、病毒、小的聚合物或者无机物(例如具有各种形状和组成的微球或微珠))—显示出与结合表面(例如基底)或者另一种颗粒相关的移动的程度。特别是，位置自由度反映在结合至结合表面或者与结合表面关联的颗粒的位置波动的测量结果中。
在本发明的一个实施方式中，使用显微装置来实施本发明，并且所述显微装置可以采用明视场或者暗视场显微镜、相衬显微镜、微分干涉对比(DIC)成像或者诺玛斯基(Normaski)显微镜、荧光显微镜、全息显微镜或者本领域已知的其它显微镜技术。
在一个实施方式中，使用设计用于测量颗粒(例如细胞)的迁移率以推断表面相互作用(即，特异性表面-颗粒相互作用的存在或者不存在)和/或颗粒分散体的集体扩散/粘弹性(例如有效粘度)的联机显微装置。在另一个实施方式中，照相机或者计算机被包括在显微装置中，以对样品的不同区域进行成像和以帮助量化和分析所获得的结果，从而确定颗粒与上面放置所述颗粒的基底上的捕获表面区域的结合反应。因此，本发明的测定方法可以作为计算机程序产品实现以供计算机系统使用。
在根据本发明的另一个实施方式中，所述显微装置包括相干光源(例如激光器、超发光二极管)，其中，所述相干光线由准直器准直，并且它的激光束照射样品。在该实施方式中，显微装置根据已知全息显微技术进行操作。
在根据本发明的另一个实施方式中，透明、半透明或部分镜面反射颗粒样品和其中放置有所述颗粒的样品室(带有反射层)可以以反射模式进行测量，包括激光照射(或者可选的照射源)以从收集侧照射样品，图像形成由从样品反射的光发生，所述样品随后在计算机系统的监视器上成像。这种成像方法还可以称为反射光成像或者落射照射显微术(epi-illuminatedmicroscopy)。
在一个实施方式中，实施本发明的方法中使用的颗粒可以具有不同的物理和化学属性，并且可以基于尺寸、形状和材料具有不同的类型，从而获得了可区别的图像。
在根据本发明的一个实施方式中，所用的颗粒样品可以通过在测量之前、测量过程中或者测量之后在样品保持器上引导试剂或者非反应性溶液而被进一步改性。所述表面可以以各种设备和不同方式提供–即，以不同透明度和反射度和以不同的水平度或者使用生物分子处理等的方式提供。
在一个实施方式中，所述颗粒样品可以以很多种方式提供，或者可以根据标记加以区别。
在一个实施方式中，当颗粒被包被或者具有嵌合荧光或发光分子或纳米颗粒(这通过根据荧光或者发光发射光谱利用颗粒类型加以区别)时，显微装置应该装配有荧光、发光激励源、适当滤波器和二色镜元件以及颜色检测能力(例如彩色照相机和/或发射滤波器选择)。
在根据本发明的一个实施方式中，所述样品保持器包括由玻璃或者塑料制得的单显微镜载玻片，所述颗粒被放置在或者沉降在其透明表面上。
在根据本发明的又一个实施方式中，透明样品保持器是孔板(标准微滴定板或者常规孔板)或者单无源微流体盒。盖玻片玻璃使用用于希望的特定用途的适当化学品处理。
在根据本发明的又一个实施方式中，微滴定板可以具有或者可以不具有定制的构造，包括光学透明盖、样品输送区、样品观察区等。例如，微滴定板可以是开孔式一次性的，带有盖件(cap)或者盖子(lid)，所述盖件被布置在孔室中以在温育和测量步骤的过程中提供顶部表面。
在根据本发明的另一个实施方式中，单微流体样品盒包括用于引导一种或更多种溶液的入口和用于将空气和溶液排出系统的出口，如特定测定法所需的那样。
在根据本发明的另一个实施方式中，微流体样品盒包括例如在盖玻片玻璃上或者基底上的三个区域，这些区域被功能化以用于结合实验(即，具有三个捕获表面区域)。
在一个实施方式中，所述微流体盒可以是自动化流体设备，并且所述孔板可以使微滴定板设备，每个设备与数据采集和分析兼容(即，显微装置)，如本文所述。本文概述的仪器可以与机器人微滴定板操作机床一体形成以用于自动地(并且可并行地)将流体从样品容器输送至每个孔室、用于混合样品和用于温育功能以及并行微滴定板测量功能，其可以是可程序化并且是自动化的。因此，测定可以设计为以并行方式对一个样品或者众多样品进行多重检测。
根据本发明的一个实施方式的芯片设计包括用于免疫诊断的一次性盒，例如，在所述一次性盒上，可以进行ABO/Rh血液分型、抗体筛查和血浆过滤，另外，进行弱的D抗原、扩展表型分型、直接抗球蛋白检验(DAT)和抗体鉴定。
其中插入过滤或者其他血浆分离一次性制品、ABO/Rh一次性制品和抗体筛查(AbS)一次性制品以供检测的仪器完全自动化并且接受全血管子和瓶子并且不需要像常规检验那样人工读取结果。另外，本发明的一次性制品不需要经离心的血液作为输入物(并且因此没有外部离心，因为它在一次性制品上从全血分离出血浆)，并且在所述一次性制品本身中具有试剂和对照。
有若干个根据本发明的实施方式提供用于将力施加至物理样品保持器或者施加至样品中的流体以确定结合相互作用发生的程度的激励方法。特别是，物理力施加单元包括使用外部单元如由压电/液压压力振荡器、压电液压致动器、压电台式振荡器、压电或液压阀调/摄动设备、热致动器、音频辐射设备和孔盖激励设备等引起的平移平台、流体或样品保持器的不连贯的或者连续的周期性移动。
这些激励方法的优点包括：1)结合颗粒和未结合颗粒之间的更强烈(因而更牢固和可靠)地分离；2)更牢固性地抗照射强度变化、振动、稍微偏离焦点的颗粒，样品扁平度缺陷、平台或样品校平缺陷和将噪音引入测量的其他问题；3)通过NSB和特异性结合之间的差异化潜在地积极地克服非特异性结合(NSB)，其中NSB可以具有比激励方法的驱动力低的结合强度；和4)促进构造在颗粒和基底之间更快的探索，允许快速结合—从而加快检验测量。因此，这些激励方法可以用来加快相互租用和结合过程，以使结合差异化，并且在测量步骤期间增强每次结合测量的辨别力和可信度。激励的强度可以是均一的、可变的或间歇性的，并且可以在不同时间调节以最优化地增强希望的效果。
在进行本发明的方法之前，可以进行显微装备的聚焦以实现最佳结果。与传统显微技术不同，使用相干光源来照射颗粒允许对样品的单焦点外图像进行数值处理来以快速的方式确定颗粒的正确焦点平面。
在上述装置上进行本发明的方法包括将微观颗粒群体引导至样品室并使颗粒在表面上沉降以测量任意的结合相互作用。本发明可以采用各种系统使颗粒在基底上沉降。它们包括重力系统、离心系统、基于流动的系统、基于扩散的系统、基于磁性的系统以及基于全息钳镊的系统。
在本发明的方法中，将含有颗粒的溶液放在载玻片上，或者将其流动通过孔板或者微流体设备的样品室且流过基底，并且颗粒因重力、离心力等而沉降在所述表面上。检查颗粒以鉴定颗粒是否结合至基底上的捕获表面区域(或者结合至其他颗粒上)。
在一个实施方式中，基底上的捕获表面区域包括结合探针，所述结合探针使得基底能够特异性地与特定分析物或者其他化学实体发生相互作用。分析物可以在基底的表面上、在颗粒的表面上、或者在溶液中。在本发明中，玻璃质载玻片、盖玻片、塑料或者二氧化硅基底可以具有带特异性探针的多个捕获表面区域以形成诸如DNA阵列、蛋白阵列或者其他微阵列等传感阵列。
在一个实施方式中，使颗粒与基底上的捕获表面区域接触。接触可以通过利用重力使颗粒沉降而被动发生，也可以通过主动方式(例如通过上述的激励方法、离心法、电泳法)使接触发生、或者通过光学施力使接触发生，或者使用光学陷阱技术使颗粒移动至所述基底等等而发生。在至少一个颗粒与所述基底的相应捕获表面区域接触后，如果在所述至少一个颗粒的表面上存在特异性的化学实体，所述至少可一个颗粒与所述基底的相应捕获表面区域之间可以发生特异性结合相互作用。在该情况中，所述颗粒和所述表面之间的结合形成“表面关联的”颗粒，从而在所述颗粒和所述捕获表面区域之间形成多个“系链(tether)”。换言之，所述特异性结合相互作用显示出特征性亲和力(即，因类似于多价抗体的亲和力的多重化学/生物化学相互作用引起的协同性或者累积性亲和性)。
在本发明的一个实施方式中，一旦结合，颗粒没有破坏其与所述捕获表面区域等的键，颗粒展示出的位置自由度的程度反而可以被用来确定分析物的存在、不存在或者数量。
在本发明的一个实施方式中，颗粒波动包括颗粒运动的多重的、连贯的变化。例如，颗粒移动可能因为热动力学波动(如产生完全自由颗粒的布朗运动)或者因根据上述激励方法循环施加的力而改变方向。这种平移移动或者位置波动可以源自于热动力学波动或者其他的影响，例如振荡流、对流、声波、或者其他力(即，激励方法)。
在一个实施方式中，通过上述激励方法使颗粒运动的量增加，以增强移动的程度，同时颗粒仍然保持与所述捕获表面区域的结合。
当针对指定的温度范围将捕获表面区域的结合势适当地调节至与颗粒的特定亲和性，颗粒的位置自由度的测量揭示了所述捕获表面区域与颗粒之间的特异性结合相互作用的存在与位置自由度的降低的量关联。
使用本发明的显微装置照射颗粒，而且可以使用明视场、暗视场、相衬显微镜、微分干涉对比(DIC、全息成像以及其它光学显微方法。通过照相机收集颗粒的图像并且使用计算机进行分析。利用照相机采集在观察区域中的颗粒的时间序列图像(至少N=2图像，但是更多数量的图像可以提供更高的精确度)。根据颗粒的类型和成像方法以及是否选用致动方法，可以选择的重要参数包括图像之间的时间间隔和观察颗粒的总时间。
待在图像中分析的颗粒可以根据它们的尺寸、形状、取向、外观、与其他颗粒的接近性、它们在图像中的位置等进行选择，并且可以基于一个图像或者若干个图像。
位置波动的量度是表面关联颗粒对刺激物的反应的数量型量度，由此推断特定表面关联颗粒的位置自由度。可以观察和量化颗粒如何响应于小的力(例如随机热力(即那些在适当的环境中对未结合颗粒产生的布朗运动)而移动、由所施加的压力(即，来自位于入口位置处的阀调或其他控制压力，或者通过利用诸如可移动膜等位移)如何导致悬浮流体的整体运动、如何被基底/样品容器的运动、声学振动和来自上述的激励方法的其他力所诱导。
位置波动的量度可以是归类性(categorical)或者定性测量(例如二进制值)。或者，位置波动的量度可以是数量值。位置自由度的量度可以是描述颗粒在指定邻域的时间依赖性位置演化的统计学量度，并且可以表示为方差、标准偏差、均方根(RMS)行程或者与时间系列观察关联的颗粒位置的自动关联函数。
于是，如果粘附至捕获表面区域的颗粒在经过一定时间量或者一定数量的观察之后移动不能快于一定的程度，则该颗粒被确定为具有在其表面上存在的(或者存在并且可以用以使颗粒与表面区域结合)捕获表面区域的特异性标靶。
位置波动的量度可以来自于所记录的所述基底的表面的平面中的颗粒的位置的时间系列测量，如果使用笛卡尔坐标系统，其可以表示为x,y。可以将一些或所有的观测结果贮存在有形的计算机存储器或者数据库中以备后期对位置自由度进行处理以及对相关值(例如结合亲和性)进行确定。或者，可以通过计算机程序对观测结果进行连续处理。
在z轴(即，与基底的表面限定的平面正交的方向)上的位置自由度的变化还可以通过偶联运动影响测自x,y位置数据的位置波动。或者，z轴上的运动可以直接通过计算机程序进行测量并用于确定位置波动。也可以是使用极坐标。时间系列的位置数据可以与第一表面区域的、样品保持器或显微镜台的、或者其他颗粒或者微观物体的参照标记(例如第一表面或者显微镜光学器件的参照标记)相关地测量。任选的是，可以根据下述颗粒追踪方法追踪颗粒的轨迹并将与轨迹有关的数据保存在有形计算机介质中。
可以针对每个颗粒单独地确定颗粒的位置波动的量度(包括通过并行处理多个颗粒的图像)，或者可以以没有要求鉴定个体颗粒的方式对多个颗粒的图像进行数学处理或者计算处理。例如，可以使用算法计算图像系列内的移动总程度。或者，一种算法可以检测移动发生的区域，并且这可以结合与图像中颗粒的数量相关的信息使用或者独立于与图形中颗粒的数量相关的信息使用。
位置波动的测量可以通过裸眼实现，或通过使用显微装置来实现。在另一个实施方式中，使用包括相干照射的显微技术(全息波动显微术)测量位置波动。例如，全息显微术使得可以采集高分辨率的三维位置数据。因此，可以更快速地获得分析物存在或数量的可靠确定，或者可以针对特定数据采集时间实现更高的可信度或者灵敏度。
分析的方法包括找到颗粒的位置自由度的值以确定结合的程度。这种位置自由度的程度可以通过测量颗粒的来自所采集的图像序列的波动移动的程度来推断。这可以通过各种不同的方法(包括颗粒的识别和追踪、计算多个图像的平均值、计算连贯图像帧的平均差异和计算全部时间序列图像的强度的像素级变化)来进行。典型地，以采用移动量度表征每个颗粒的方式进行计算。
在一个实施方式中，首先针对一个、两个或者多个样品获得校准数据。对于具有两个可能结果的简单检验，可以测量两个对照样品(或者两组对照样品，其中每组具有类似的性质)以获得校准数据。对于具有多于两个可能结果的检验，例如可能需要连续变化量度的测量(例如测量温度、pH、分析物浓度等)，可以使用多个校准样品。
在一个实施方式中，测量两个校准样品并且获得位置自由度测量的单个(校准)阈值。将检验样品中的颗粒的位置自由度的测量结果与阈值比较，并且如果它们落在该阈值内，则推断有结合相互作用。如果颗粒具有高于阈值的测量结果，则推断没有结合相互作用。因此，一定数量的检验样品的测量获得了被推断具有更强结合的颗粒的数量的计数以及那些结合强度较弱的颗粒的计数，或者这可以表示为强结合颗粒的百分比。对于特定试验而言，通过将这些计数或者这种百分比与一个或者多个基准值比较，最终的测量结果可以称为“阳性”、“阴性”或者“兼性(inclusive)”。
在另一个实施方式中，颗粒的位置自由度测量组包括位置自由度分布。可以针对基准样品(例如由对照样品上很多校准回合确定)以及针对目标检验样品获得位置自由度分布。可以将检验分布与基准值分布比较以确定哪个是与检验样品相似性最接近的对照样品。这可以通过众多方法以数值方式进行，所述方法包括投影法(projeciton)、关联法、点乘法、最小化差异法、曲线积分区域法或者其他方法。这种方法可以获得二进制结果(例如“阳性”或者“阴性”)或者非二进制结果(例如0(阴性)、1(极弱)、1+、2、2+、3、3+、4、4+或5(极强))。因此，可以将波动测量结果集与来自具有已知特性的基准样品的波动测量结果集进行比较。
本发明在至少免疫诊断学(其包括血液分型)领域中具有实用性，并且除了该领域之外，还在包括药学活细胞测定(即，用于研究过去筛查(pastscreening)和诊断性检测)以及过敏检验(例如IgE抗体检验)在内的其他诊断学中具有具有实用性。特别是，用途包括正向分型、反向分组、抗体筛查(IgM和IgG类抗体)。
在根据本发明的另外一些实施方式中，本文公开的方法和装置适合用于传染性疾病筛查(例如人类免疫缺陷病毒(HIV)、肝炎B型病毒(HBV)、梅毒(syphilis)、人类T淋巴细胞病毒(HTLV)、肝炎C型病毒(HCV)、梅毒(syphillis)等)，其通过针对抗这些传染性媒介物的抗体进行检验，或者在一些情况中，针对媒介物本身进行检验。另外，依赖于希望的分析，具有不同探针类型和特异性的混合物还可以用来检测带有互补性抗原的独特组合的细胞(例如某些癌细胞或者干细胞)的存在。
在其他一些例示性实施方式中，本发明的方法可以包括化学和技术变体，包括：生物学惰性部分，其用于在对细胞和捕获表面区域之间的非特异性结合相互作用具有最小影响或者负影响的情况下降低探针浓度；直接测定法，其中分析物偶联至基底；间接测定法，其中有探针复合物；竞争测定法，包括检测与分析物或者报告分子或者其他分子的位移或者阻断关联的事件；分析物特异性，其中捕获表面区域对不同分析物具有特异性；共价系链，其中核酸寡聚物延伸和连接测定可以用来共价地连接特异性形成的系链；分子文库的筛查；因位置自由度以及所获得的阳性和阴性颗粒的可测量的位置波动的变化造成的洗涤步骤的取消；传感阵列鉴定的使用；对照捕获表面区域的使用；用以加强位置自由度的分析的颗粒的定径；系链长度的控制或者与参照基准的关联以及基准值的使用，使得如果颗粒在预定的某些量的时间之后或者在预定的某个观测数量之后移动没有大于预定的某个距离则确定颗粒对在其表面上存在捕获表面区域的特异性结合标靶具有特异性。
本发明的又一些实施方式基于这样的发现，即，对于至少一些探针类型，沉降的颗粒以不同于特异性结合的速度发生非特异性结合。结果发现，根据颗粒沉降后早期的时间点可以测量位置波动信号。追踪位置自由度测量结果随时间的演化可以允许改进非特异性结合与特异性结合的辨别。或者，系统可以设想为具有多种效应，所述多种效应在具有不同时间演化(例如不同的特征性时间量程(timescale)或者行进速度)的情况下发生，并且通过追踪随时间的演化，可以确定每种影响的水平。例如，在发现非特异性结合与特异性结合相比较快速地发生的一个简单情况中，可以从基于后期时间点的位置波动减去早期位置波动。换言之，位置波动的计算可以包括计算机程序操作以计算与颗粒位置的时间演化相关的量度并且可选地针对非特异性结合(其发生时具有大于非特异性结合的时间常数的动力学时间常数)进行校正的步骤。如上所述，这可以通过曲线拟合或者在动力学或者分子测定技术领域已知的其他算法进行。
至此，已经概述了根据本发明的一些特征，目的可以更好地理解本发明随后的具体实施方式，并且更好地认识到本发明对现有技术的贡献。当然，本发明还有将在下文中描述并且形成所附权利要求的主题的其他特征。
在该方面，在详细说明本发明的至少一个实施方式之前应当理解的是，本发明的用途不限于在以下具体实施方式中给出或在附图中展示的部件/组分的布置/配制和结构的细节。根据本发明的方法和装置可以包括其他实施方式并且能够以各种不同方式实践或实现。还应当理解的是，本文使用的措辞和术语以及说明书摘要仅出于描述目的因而不应当理解为用于限制目的。
因此，本领域的技术人员应当认识到，本公开内容所根据的构想可以容易被用作设计用于实现本发明的若干目的的其他结构、方法和系统的基础。因此重要的是，这些权利要求应当被看作包括这些范围内的等同结构，只要它们没有偏离本发明的方法和装置的实质和范围。
附图说明
通过参考以下具体实施方式部分并参考附图可以更容易地理解本发明的前述特征。
图1A是显示根据本发明的显微装置的第一实施方式的示意图，其中所述显微装置为其最简单的形式。
图1B是显示根据本发明的显微装置的第二实施方式的示意图，其中所述显微装置包括照相机和计算机。
图1C是显示根据本发明的显微装置的第三实施方式的示意图，其中所述显微装置包括激光器照射以及照相机和计算机。
图1D是显示根据本发明的另一个实施方式的示意图，其中可以采用反射模式测量带有发射涂层的样品室和颗粒样品。
图1E是样品保持器表面的受差异化处理的表面区域的俯视图的示意图，每个所述表面区域具有异源性颗粒混合物，其中每种类型的颗粒获得了与所述表面的不同相互作用，如根据通过对颗粒的异源性群体的迁移率量度所观测到的那样。
图1F显示了根据本发明的一个实施方式的例示性微流体盒的示意图，所述微流体盒具有立体图A、截面图B、俯视图C以及传感阵列的俯视图D。
图1G显示了根据本发明的一个实施方式的例示性开孔样品盒的示意图，其具有立体图A、截面图B和俯视图C。
图1H显示了根据本发明的一个实施方式的带有盖件的孔板的示意图，所述盖件限定了位于平面表面之间的指定缝隙。
图2A显示了根据本发明的一个实施方式的微流体设备的示意图，所述微流体设备连接至用于振荡发生流体压力(因而发生流体流)的例示性系统。
图2B显示了根据本发明的一个实施方式的微流体设备的示意图，所述微流体设备带有例示性的压电-液压致动器。
图2C显示了根据本发明的一个实施方式的微流体设备的示意图，所述微流体设备带有例示性的压电平台振荡器。
图2D显示了根据本发明的一个实施方式的微流体设备的示意图，所述微流体设备一体形成有压电-驱动(或者液压驱动)系统以用于振荡发生动水压力和物流。
图2E显示了根据本发明的一个实施方式的微流体设备的示意图，所述微流体设备连接至例示性的热致动器。
图2F显示了根据本发明的一个实施方式的微流体设备的示意图，所述微流体设备连接至声源。
图2G显示了根据本发明的一个实施方式的在带有孔室的盒中使用的盖件的示意图，其具有显示盖件就位的孔室的图A、显示以线性螺线管致动器使盖件振荡以进行激励的使用的图B、和显示驱动盖移动以进行激励颗粒移动的压电致动器。
图3显示了根据本发明的一个实施方式的微流体设备的样品保持器或基地的示意图，包括传感阵列，颗粒放置在多个捕获表面区域上。
图4是根据本发明的一个实施方式的截面图形式的示意图，其显示具有表面抗原的红细胞，所述表面抗原将通过传感阵列检测以确定患者的血型(正向分型)。
图5是根据本发明的一个实施方式的截面形式的示意图，其显示了图4的在沉降并且与探针联合后的红细胞，并且显示了特异性结合反应。
图6显示了根据本发明的一个实施方式的正向分型的实验，所得的图显示观测到的B组红细胞的作为针对分散在两种不同斑块(一种斑块具有固定在表面上的抗-A抗体，而另一种斑块具有固定在表面上的抗-B)上的细胞的测量时间间隔的函数的均方位移(mean-square displacement)。B组细胞在抗-B抗体斑块上具有比在抗-A抗体斑块低的位置波动，揭示了B组细胞与抗-B斑块发生结合以及在没有激励的情况下识别结合是否发生所需的时间量程(timescale)。
图7显示了根据本发明的一个实施方式的正向分型实验的图，其中使用算法计算红细胞的归一化标准偏差(NSD)的概率分布。
图8以截面图形式示出了根据本发明的一个实施方式的传感阵列或者基底，其中传感阵列在反向分组试验中用于鉴定血浆样品是否在其中具有例如抗-A和/或抗-B抗体。
图9是根据本发明的一个实施方式的截面图形式的传感阵列，其中针对某些IgG类血型抗体的抗体筛查检验。
图10展示了根据本发明的一个实施方式的相干照射“L1归一化”法的校准曲线，所述校准曲线用于计算优势地定位在某个z平面的样品的最佳焦点的平面外z位置。
图11展示了根据本发明的一个实施方式的使用图10的校准曲线在针对一定范围的初始起点位置进行三个聚焦迭代时的聚焦性能。
图12显示了根据本发明的一个实施方式的归一化标准偏差柱状图的图，其测量了在抗-A包被表面上测量的两个不同红细胞样品(对A抗原呈阳性的细胞和对A抗原呈阴性的细胞)的位置自由度。
图13显示了根据本发明的一个实施方式的在抗-B包被基底表面上测量的两种不同红细胞样品(一种样品对B抗原呈阳性，另一种样品对B抗原呈阴性)的NSD柱状图的图。
图14显示了根据本发明的一个实施方式的在抗-D包被基底表面测量的两种不同红细胞样品(一种样品是其中血细胞对D抗原呈阴性的样品，另一种样品是其中D抗原存在于细胞上的样品)的NSD柱状图的图。
图15A显示了根据本发明的一个实施方式的在抗-A存在的情况下分散在制备成带有B抗原的表面上的红细胞样品的系列NSD柱状图。
图15B显示了根据本发明的一个实施方式的在与图15A类似的条件下(不同的是表面上具有类型-A抗原)的时间系列柱状图。
图16A和16B是根据本发明的一个实施方式的在与图15A和15B中测量的类似条件下(不同的是使用低得多的抗体浓度)的柱状图。
图17是显示根据本发明的一个实施方式的在同时包括探针和生物学惰性部分的基底上的捕获表面区域的截面图。
图18A是显示了根据本发明的一个实施方式的直接测定法的截面图，其中分析物抗原结合至(或者被捕获至)捕获表面区域并且带有被固定的抗体探针的颗粒与所述捕获表面区域接触并且结合至捕获表面区域，而图18B显示了抗体没有识别非结合抗原(即没有发生结合)的情况。
图19A是根据本发明的一个实施方式的显示结合至第一探针以形成复合物(例如生物分子复合物)的第二探针的间接测定法，所述复合物将同源(cognate)结合伴侣分子呈递至读出颗粒，而图19B显示了没有特异性结合反应。
图20A显示了根据本发明的一个实施方式的竞争测定法的截面图，其显示了在基底的捕获表面区域位置处形成的三元夹心式结构，而图20B显示了其中分析物分子使位置标示符分子位移特定的适当时间以接近平衡，或者如果分析物分子在位置标示符分子之前被导入则可以阻断结合。
图21是显示了根据本发明的一个实施方式的针对竞争测定法的反应方案的截面图，在所述竞争测定法中，位置标示符分子对探针具有低于分析物分子的亲和性。
图22是显示了根据本发明的一个实施方式的夹心式测定法的沿着图21的线路的截面图，其中捕获表面区域对不同分析物具有特异性。
图23是显示了根据本发明的一个实施方式的结合和未结合颗粒的分布的图，其显示同时使用热激励以及使用以如图2A所述的仪器进行的激励以明视场测量的归一化标准偏差测量结果的分布。
图24显示了根据本发明的一个实施方式的用于进行免疫诊断检验的一次性制品的示意性图解的俯视图。
图25是显示了在进行血液类型检验中涉及的程序步骤的流程图。
图26是显示了根据本发明的一个实施方式的仪器的立体图，其中插入图24的一次性制品。
图27显示了根据本发明的一个实施方式的在显微镜下并且颗粒(即红细胞)在分别以1g和400g(重力)离心的情况下的两个载玻片。
图28是显示了根据本发明的一个实施方式的在以0至400G离心5分钟的情况下代表对颗粒(即，红细胞)/单位面积进行计数的不同方式的高、中、低数据点的图。
具体实施方式
本发明涉及用于检测生物学、生物化学、物理学、生物物理学和化学分析中使用的颗粒的位置自由度的方法和装置。特别是，本发明涉及能够根据所检测到的颗粒/细胞的群体的迁移率来检测和表征颗粒/细胞的群体的方法和装置。在根据本发明的一个实施方式中，某些细胞的检测基于在结合至基底的细胞群体和显示出较弱的结合力的那些细胞群体中所检测到的差异。首先，使细胞沉降在所述基底上，并且在重力、自然热动力学压力波动和其他随机或施加的力存在的情况下，一些颗粒可以显示出平移移动。根据本发明的方法和装置，检测颗粒移动并计算测量结果，以确定特异性分析物的结合。
本发明的一些例示性实施方式公开了用于生物学、化学或生物化学分析的方法(即，测定法)并且涉及如下发现：颗粒与其所暴露的表面关联的移动准确地度量了分析物在颗粒上、表面上或者溶液周围的存在、不存在或者数量。另外，这些测量结果可以用于揭示诸如温度、pH或者其他环境参数等环境性质。
特别是，颗粒的称为“位置自由度”的这种移动以及根据本发明的所述方法和装置对这种移动的显微测量表征了颗粒(例如细胞、病毒、小的聚合物或者无机物(例如具有各种形状和组成的微球或微珠))—显示出与结合表面(例如基底)或者另一种颗粒相关地移动的程度。特别是，位置自由度反映在结合至结合表面或者与结合表面联合的颗粒的位置波动的测量结果中。
特别是，结合表面是表面的能够结合分析物或者颗粒的部分。结合表面(即，基底或者另一个颗粒的表面)可以具有称为“捕获表面区域”的区域，其中相互作用在颗粒和结合表面之间发生，以准确地度量分析物在颗粒上、捕获表面区域上或者周围溶液中的存在、不存在或者数量，或者度量结合程度敏感的环境或者系统条件。因此，“表面联合颗粒”是对捕获表面区域具有足够近的接近性使得如果存在特异性结合伴侣分子的话可以在适当的结合条件下发生颗粒和捕获表面区域之间特异性结合相互作用的颗粒。
装置
以下装置可以使用以完成本发明的目标。然而，本领域的技术人员应当认识到的是，所述装置的各种变化或者其他类型的装置可以实现所希望的方法。
显微装置
在本发明的一些实施方式中，显微装置被用来实现本发明，并且可以采用明视场或者暗视场显微镜、相位显微镜、微分干涉对比度(DIC)成像或者诺玛斯基显微镜、荧光显微镜、全息显微镜或者本领域已知的任何其他显微技术。
实施方式1
在本发明的具有最简单形式并且是例示性的一个实施方式中，图1A显示了一个示意图，该示意图显示一个联机显微装置10，所述显微装置10被设计用于测量颗粒(即，细胞)的迁移率以推断表面相互作用(即特异性表面-颗粒相互作用的存在或者不存在)和/或颗粒分散体的集体扩散/粘弹性(例如有效粘度)。
在图1A的例示性实施方式中，显微装置10A能够进行明视场显微术，其包括照射源100A(例如LED，白炽灯、弧光灯)，所述照射源100A照射显微镜106的透明样品保持器105(即显微镜载玻片)。透明样品保持器105具有经过处理或者未经过处理的表面109，在所述表面109上放置带有颗粒108(即，细胞)的样品107。显微装置10包括包含照射源100的支持结构或者底座(未示出)，并且可以包括准直透镜或者其他光学器件、物镜142和镜筒透镜141(它们一起形成样品107的图像)、目镜140(或者双目镜)、将光线引导通过样品107的聚光镜144和允许所述样品保持器105进行机械移动的平移平台114。调节旋钮(未示出)和聚焦机构148执行焦距调节。视场光阑145调节样品区域105的照射光线指向的部分。另外，聚光器144不仅可以包括透镜而且还可以包括可变光阑，例如孔径光阑146，以控制照射光线接进(approach)样品107的角度范围(例如数值孔径)。另外，聚光器144可以包括相环147，所述相环147还可以用于限制光线接进样品107的角度。当与适当的物镜142一起使用时，相环147可以用于相衬成像。
另外，相环147或者适当的聚光器144结构可以用于暗视场显微术，其中来自聚光器144的照射光线可以以没有被成像光学器件收集的角度到达样品107，形成这样的情况，其中成像光学器件仅接受被反射、衍射、散射的光线或者具有其被样品107改变的轨道角度的光线。在该实施方式中，装置10可以包括相环147或者光阑以照射样品107，其中较高的角度(较高的数值孔径(NA)放射光线由于物镜142或者整个成像系统的较低的NA设置而不能到达图像平面。或者，可以采用适当的滤光器进行荧光成像或者落射荧光成像。并且照射在本领域中是已知的(未示出)。
最后，油浸物镜142和专用浸渍用油可以放在样品107上的玻璃质盖玻片上以改善被观测样品107的分辨率。或者，适当地选择物镜142，可以使用不同的浸渍流体，例如水或者甘油。通常，较高数值孔径物镜的益处在于提供更高的分辨率。制衡这样的益处的是使用最高NA物镜所需的液态浸渍流体的额外努力以及具有可以用来降低放大倍数的大视场和NA物镜的益处。简言之，可以选择空气物镜(air objective lens)142。
实施方式2
在根据本发明的另一个实施方式中，照相机112和计算机113被包括在显微装置10中，如图1B例示性所示。细胞/颗粒108可以通过显微镜物镜141成像，其利用镜筒透镜141在与用于图像处理等的计算机113连接的CCD或CMOS照相机112上形成细胞/颗粒108的放大图像。照相机112可以包括自动变焦硬件和控制机构。可以使用平移平台114(例如机动显微镜平移平台)通过平移样品107来对样品107的不同区域进行成像，这在本领域中是已知的。可以采用各种激励方法(本文将进一步讨论)。
样品保持器105还可以允许控制部分或者所有被测量区域的温度，从而允许例如温育在对于生物分子相互作用发生而言最佳的温度进行。另外，被显微镜106成像的样品平面可以通过使用焦距控制调节旋钮(其也可以由马达驱动)进行调节。本领域的技术人员应当发现，在此基础上的其他加强或者其他显微装置10可以被用来获得希望的结果。
应当注意的是，尽管本发明可以利用裸眼或者图1A中的目镜140观察结合反应来实现，但是也可以使用照相机112和计算机系统113来量化和分析所获得的结果，以确定颗粒108和表面109的结合反应。
对于计算机系统113，所述系统113包括显示单元(即监视器，屏幕等)、输入单元(即，键盘、声音激励等)并且可以具有本领域已知的处理和贮存功能。计算机系统113可以处在客户端环境和/或服务端环境，或者处在分布式环境。
本发明的测定方法可以作为供计算机系统113使用的计算机程序产品来实现。这样的实现方式可以包括一系列的计算机指令，所述计算机指令固化在有形介质(例如计算机可读取介质(例如软盘、CD-ROM、ROM或者硬盘)上，或者经由调制解调器或者其他接口设备(例如通过媒介与网络连接的通信适配器)可以传输至计算机系统。所述介质可以是有形介质(例如光学或者模拟通信线路)或者以无线技术(例如微波、红外或者其他传输技术)实现的介质。系列计算机指令实现所有或者部分本文先前针对所述系统描述的功能。本领域的技术人员应当认识的是，这些计算机指令可以以很多程序语言编写以供很多计算机体系结构或者操作系统使用。
可以预料的是，这种计算机程序产品可以作为附随有打印文档或电子文档(例如压缩打包软件)的可移动介质进行分配，或者与计算机系统预加载(例如在系统ROM或硬盘上)，或者在网络(例如互联网或万维网)上由服务器或电子公告板发配。当然，本发明的一些实施方式可以作为软件(例如计算机程序产品)和硬件这两者的组合实现。另外，本发明的其他一些实施方式可以全部作为硬件或者全部作为软件(例如计算机程序产品)实现。
实施方式3
在本发明的另一个实施方式中，图1C显示了例示性联机显微装置10的示意图，所述显微装置10还被设计为用于测量额颗粒的迁移率以推断表面相互作用。
在如图1C所示的实施方式中，用于是实现本发明的显微装置10包括相干光源100B(例如激光器、超发光二极管)，其中所述相干光线被准直器101准直，并且它的激光束104照射显微镜106的透明样品保持器105(例如显微镜载玻片)。来自所述相干光源100的激光器光线104可以作为“自由空间束”或者通过光纤(例如光纤插接线102)行进至准直器101。任选的是，针孔或可变光阑/光圈103可以放置在准直器101和样品保持器105之间以降低被照射的视场和关联的散射光以防止照射过大的区域，从而起到视场光阑的作用。
在该实施方式中，所使用的相干激光器源100具有短的相干波长(小于400μm)并且在660nm工作。本实施方式可以采用已知的全息显微技术。
和如图1A和1B所示的两个在前实施方式一样，细胞/颗粒108可以通过显微镜目镜142和镜筒透镜141成像，这允许在CCD或CMOS照相机112上形成细胞/颗粒108的放大图像，所述照相机112被连接至用于图像处理等的计算机113。照相机112可以包括自动变焦硬件和控制机构。如上所述，可以使用平移平台114(例如机动显微镜平移平台)通过平移样品107来对样品107的不同区域进行成像，这在本领域中是已知的。移动平移平台114的方法和装置还可以包括将在下文进一步描述的激励方法。此外，如上所述，样品保持器105还可以允许控制部分或者所有被测量区域的温度，从而允许例如温育在对于生物分子相互作用的发生而言最佳的温度进行。另外，被显微镜106成像的样品平面可以通过使用焦距控制器148(其也可以由马达驱动)进行调节。
如上所述，计算机系统113可以具有软件和硬件必需装备以及本领域已知的处理和贮存功能，并且可以处在客户端环境和/或服务端环境，或者处在分布式环境。
本发明的测定方法可以作为供计算机系统113使用的计算机程序产品来实现。如上所述，这样的实现方式可以包括一系列的计算机指令，所述计算机指令固化在有形介质(例如计算机可读取介质(例如软盘、CD-ROM、ROM或者硬盘)上，或者经由调制解调器或者其他接口设备(例如通过媒介与网络连接的通信适配器)可以传输至计算机系统。如上所述，所述介质可以是有形介质(例如光学或者模拟通信线路)或者以无线技术(例如微波、红外或者其他传输技术)实现的介质。系列计算机指令实现所有或者部分本文先前针对所述系统描述的功能。本领域的技术人员应当认识的是，这些计算机指令可以以很多程序语言编写以供很多计算机体系结构或者操作系统使用。
如上所述，可以预料的是，这种计算机程序产品可以作为附随有打印文档或电子文档(例如压缩打包软件)的可移动介质进行发配，或者与计算机系统预加载(例如在系统ROM或硬盘上)，或者在网络(例如互联网或万维网)上由服务器或电子公告板发配。如上所述，本发明的一些实施方式可以作为软件(例如计算机程序产品)和硬件这两者的组合实现。本发明的还有其他一些实施方式也可以全部作为硬件或者全部作为软件(例如计算机程序产品)实现。
反射模式
在根据本发明的另一个实施方式中，透明、半透明或部分镜面反射颗粒样品108和样品室118(带有反射涂层或者带有部分反射涂层120)(参见图1D)可以以反射模式进行测量，包括激光器照射100B(或者可选的照射源)(参见图1C)以从收集侧照射样品107，图像形成由从样品107反射的光发生，所述样品随后在计算机系统113的监视器上成像。可选的是，可以使用非相干照射，例如明视场、暗视场、荧光、或者其他成像方法。如此进行时，在使用偏振滤波器来降低光滑界面(例如光学器件和样品室的表面)的镜面反射光线时获得一般情况下得到改善的结果，如本领域已知的那样。
颗粒
用于实现本发明的方法的颗粒108可以具有各种不同的物理和化学属性，并且可以基于尺寸、形状和材料而属于不同的类型，从而获得可区分的图像。例如，颗粒108可以是具有一些对称性的规则形状(例如球形、长椭圆形、扁椭圆形)的珠子或是形状不规则的珠子。颗粒108可以由一种类型的材料制成，或者由多种类型的材料制成。颗粒108可以是实心的、多孔性的或者具有空洞核心的。颗粒108可以全部或者部分地被其他材料(一种或者多种)所包被。颗粒108可以是金属的或者部分金属的。颗粒108可以是非金属的或者部分非金属的。颗粒的表面可以经过处理以施加有纹理。颗粒108可以是表面上带有接头分子的二氧化硅珠子，或者表面上连接有生物分子或合成分子的二氧化硅珠子。颗粒108还可以是表面上带有与所述接头分子连接的生物分子或合成分子的二氧化硅珠子。颗粒108可以是由与颗粒108共价或非共价连接或者与颗粒108一体形成的荧光或发光标记分子(一种或多种)包被或嵌合的珠子，这样的珠子还可以基于荧光或发光发射光谱来区分颗粒的类型。颗粒108可以是由与颗粒108共价或非共价连接或者与颗粒108一体形成的不同荧光或发光标记分子(一种或多种)的组合包被或嵌合的珠子，这样的珠子还可以基于荧光或发光发射光谱来区分颗粒的类型。颗粒108可以是带有共价或非共价地与颗粒108连接或者与颗粒108一体形成的纳米颗粒(一种或多种)、磁性纳米颗粒(一种或多种)或者荧光纳米颗粒(一种或多种)的珠子。
在又一个实施例中，颗粒108可以是生物细胞。颗粒108可以是经过遗传工程改造的生物细胞或者经过遗传工程改造的生物细胞的派生物(descendant)。颗粒108可以是经过生物分子和/或合成分子处理的细胞。颗粒108可以是经过接头分子处理的细胞。颗粒108可以是这样的细胞，该细胞受到连接至接头分子的生物分子和/或合成分子的处理。颗粒108可以是带有共价或非共价地与颗粒108连接或者与颗粒108一体形成的荧光或发光标记分子(一种或多种)的细胞。颗粒108可以是带有与颗粒108共价或非共价连接或者与颗粒108一体形成的不同荧光或发光标记分子(一种或多种)的组合的细胞。颗粒108可以是带有共价或非共价地与颗粒108连接或者与颗粒108一体形成的纳米颗粒(一种或多种)的细胞。颗粒108可以是带有共价或非共价地与颗粒108连接或者与颗粒108一体形成的磁性纳米颗粒(一种或多种)的细胞。颗粒108可以是带有共价或非共价地与颗粒108连接或者与颗粒108一体形成的荧光纳米颗粒(一种或多种)的细胞。颗粒108可以是自然表达荧光蛋白(一种或多种)或者经过遗传改造而表达荧光蛋白(一种或多种)的细胞。颗粒108可以是被抗体、蛋白或者其他分子或者材料包被的细胞。
基底表面制备
在根据本发明的一个实施方式中，具有颗粒108的样品107可以进一步通过在测量之前、测量测量期间或者测量之后在样品保持器105上引入试剂或者非反应性溶液来进行改性。例如，如图1A至1C所示，对于细胞/颗粒108的表面相互作用的测量，样品保持器105的上面沉降有细胞/颗粒108的透明表面109(例如盖玻片)可以提供有特殊的处理。因此，放置在样品保持器105上的样品107可以包括放置在经过处理或者未经过处理的透明表面109(即，盖玻片)上的颗粒108(即，细胞)的分散体。具有细胞/颗粒108的样品107可以通过手动引导至样品保持器105或者通过自动化流体设备116(后文讨论)引导至样品保持器105，所述自动化流体设备116的结构和操作在本领域中是已知的。
可以108可以沉降在表面109上以检验颗粒-表面相互作用。在一个实施方式中，颗粒108可以利用重力而沉降在表面109上。在另一个实施方式中，颗粒108可以通过离心机施加于样品室118而引起的离心力而沉降在表面109上(例如参见图1F)。另外，在另一个实施方式中，颗粒108可以因施加于颗粒108的其他力而沉降在表面109上(本文将进一步讨论)。
在根据本发明的一个实施方式中，离心机可以被用来将颗粒108(即，红细胞)离心在基底200的表面109上，从而形成更加致密的涂层。图27显示了根据本发明的一个实施方式的在显微镜下并且颗粒(即红细胞)在分别以1g和400g(重力)离心的情况下沉积的两个载玻片的屏幕截图。
图28是显示了根据本发明的一个实施方式的在以0至400G离心5分钟的情况下代表对颗粒(即，抗体筛查中的红细胞)/单位面积进行计数的不同方式的高、中、低数据点的图。从该图可以看出，无论计数方法如何，趋势基本上是相同的。该实施方式对固相血液分型具有用处。
可以以各种不同方式提供表面109。在一个实施方式中，表面109可以是平整的并且是透明的。另外，表面109可以是平整的并且是部分透明的。还有，表面109可以是平整的并且是完全反射的或者部分反射的。表面109还可以是具有纹理的平整表面。表面109可以使用生物分子或者合成分子处理。表面109可以使用接头分子处理。表面109可以使用连接至接头分子的生物分子或合成分子处理。表面109可以使用不同的分子进行差异化处理。表面109可以使用不同的接头分子进行差异化处理。表面109可以使用分子混合物进行处理。表面109可以是微流体设备116的一部分(例如参见图1F)。表面109可以是具有一个或者多个孔室或者样品室的微滴定板或者其他设备的一部分。表面109可以是透明的或者部分透明的样品室118的一部分(例如参见图1F)。表面109可以是反射性或部分反射性样品室118的一部分(即，反射性或者部分反射性表面)。表面109可以在微观上是充分光滑的以允许对颗粒108进行成像。在传感阵列200中的捕获表面区域的通常为平面的陈列还可以简化光学检测。
在一个实施例中，图1E显示了盖玻片的经过差异化处理的表面区域(A、B、C和D)的俯视图，每个表面区域具有颗粒108的异源性混合物，其中每种类型的颗粒108是可区分的(例如利用荧光标记或者全息图像特性)。注意的是，每个表面109在颗粒108的异源性群体的迁移率量度上获得了不同的相互作用(即，不同类型的颗粒108在每个区域中显示出较高的迁移率)。图1E展示了根据本发明如何可以在表面109区域被差异处理或者未被差异化处理的情况下使用可区分的颗粒108同时探测很多种类型的相互作用(即多重测量)。
样品
在一个实施方式中，可以同时测量颗粒108的异源性群体，每种类型的颗粒以类似的数量检验不同的数量或者状态(regime)(例如多重测量)。所有或者一些类型的颗粒108可以基于标记(例如荧光、纳米颗粒)、颗粒图像(因不同的吸收、散射、荧光、发光特性、荧光或者发光发射光谱、荧光或者发光衰变寿命、和/或颗粒位置等(假定颗粒类型的沉积受控))进行区分。所有或者一些类型的颗粒108可以通过每个颗粒108的数据的多模式收集进行区分。颗粒108的同源性群体可以同时进行测量。
在一个实施方式中，包括被生物分子A包被的颗粒108的样品107与被生物分子B包被的表面(即，固相)接触。样品107溶液可以含有生物分子A并且可以含有或者不含有其他类型的生物分子(例如生物分子C、D、E等)。这种方法的样品测量在存在用于研究、工业和/或临床目的的溶液的存在下通过分析颗粒响应于受控力或者热力的迁移率而获得了颗粒108与表面109之间的生物分子相互作用的信息。
在根据本发明的一个实施方式中，关于血液分型用途，颗粒10是带有表面抗原的颗粒108，所述表面抗原可以结合至溶液中存在的扩散部分。另外，该部分可以能够同时结合至经过适当处理的表面(固相)。采用这种方式，可以通过测量在经过适当处理的表面109(固相)上的经过适当处理的颗粒108的迁移率来测量所述部分在溶液中的存在或者数量。所述扩散物种的存在可以以浓度依赖性方式影响结合细胞/颗粒108的迁移率。这种类型的测量可以被用来确定用作颗粒的捕获试剂的自由扩散标靶的存在、不存在和/或浓度。
在血液分型例示性实施方式中，如果探查细胞/颗粒表面上的特定抗原，对透明表面109进行的适当的表面处理可以包括使用适合的接头分子对表面109进行化学改性以能够将适当的抗体连接至表面109，从而允许呈递标靶抗原的细胞/颗粒108与透明表面109上的表面抗体发生特异性结合。在这种情况中，在细胞/颗粒108的表面108a上没有标靶抗原的细胞/颗粒108没有特异性地结合至透明表面109的表面上。在测量细胞/颗粒108的扩散性能(例如有效扩散系数、有效粘度或者粘弹性)的情况中，可以使用例如惰性表面109(后文讨论)。
在一个实施方式中，当颗粒108被包被或者具有嵌合荧光或者发光分子或纳米颗粒(其通过根据荧光或者发光发射光谱进行区分)时，显微装置10应当装配有荧光、发光激发源，适当的滤波器和二色性元件以及颜色检测功能(例如彩色照相机112和/或发生滤波器选择)。引入每种类型经过独特包被的不同类型颗粒108可以允许进行多重测量(即，同时测量多种类型的相互作用)。不像很多传统的荧光多重测量那样，不需要单独的洗涤步骤，这是因为标记阳性结合的不是标记阳性结合相互作用的特定颗粒108的存在，而是颗粒的指示阳性结合的迁移率测量结果。
样品保持器和流体设备
下面以及先前描述的仪器是用于测定样品中的颗粒的迁移率的单元。
实施方式1
在根据本发明的一个实施方式中，样品保持器105包括由玻璃或者塑料制得的简单显微镜载玻片，颗粒108被放置或者沉降在其透明表面109上(参见图1A至1C)。通常，盖玻片放在样品上。
实施方式2
在根据本发明的另一个实施方式中，透明的样品保持器105包括简单的无源微流体盒116(参见图1F)。在该实施方式中，封闭的样品微流体盒116包括两个开口(即，入口401和出口402)和之间的样品室118(参见图A)。传感阵列200在下方与捕获表面区域210、211、212结合，并且使用适当的化学品处理以用于希望的特定用途。具有颗粒108的样品溶液107被导入入口401并且颗粒沉降在表面109上以及传感阵列200的捕获表面区域210、211、212上(参见图B至D)。结合相互作用可以使用显微装置10来观测。
实施方式3
在根据本发明的又一个实施方式中，透明的样品保持器105包括孔板(标准微滴定板或者常规孔板或者其他带有孔室的盒)。在该实施方式中，开孔样品盒161包括透明的样品保持器105，样品保持器105在中央带有用于样品室118的开口(参见图1G的图A)。玻璃盖片162结合于下方。玻璃盖片162将使用适当的化学品处理以用于希望的特定用途。盖件(例如像图1H中的盖件417)可以放置在样品室118的开口上。具有颗粒108的样品溶液107放置在样品室118中并且沉降在包括表面109，包括捕获表面区域210、211、212上(参见图1G的图B至C)，并且可以使用显微装置10观测结合相互作用。
实施方式4
在根据本发明的另一个实施方式中，实施例3的微滴定板或者带有孔室的适当备选装置可以具有或者不具有常规的构造，包括光学透明盖，样品输送区、样品观察区等。例如，微滴定板或者带有孔室的备选盒可以是带有盖件(cap)或者盖子(lid)的开孔一次性制品。特别是，盖件417可以用于微流体孔板416(参见图1H)以允许供执行本发明之用。盖件417被放置在孔室418中以在某些温育和/或测量步骤中提供顶部表面。任选的是，衬垫450可以用来形成盖件417和孔板或者带有孔室416的其他盒之间的密封。还可以在例如位置451或者其他位置形成密封以例如使盖件417保持就位。并且溢流槽452允许过量的溶液在被从开孔室118排代时有地方流走。
颗粒108(例如探针红细胞)被放置在孔室416的底部。孔室418中的盖件417限定了位于捕获表面区域210等和盖件417的底部表面(其形成了开孔室418的顶板)之间的固定空间(例如约100微米)。将盖件417放置在孔室418中的益处在于流体高度非常短并且由此：1)允许颗粒/RBC108的沉降非常快速地发生；2)抑制可能干扰沉淀、结合或者测量的三维流动；3)消除能够发生蒸发以及振动可以诱导表面波和大量对流的自由表面或者使该表面最小化；4)抑制流体在微流体板的手动移动或者机器人移动过程中的意外流动；以及其他重要益处。
实施方式5
在根据本发明的另一个实施方式中，简单的微流体样品盒115包括出口402和用于一种或者多种溶液的入口401(例如参见图1F的图A)。微流体盒116通过切割两个塑料薄片制得，其中顶层具有用于所述入口401和出口402的两个开口和用于样品室的中央开口118。第二层在上面具有图案，通道进入中央室118。将所述两层结合在一起并且在下面结合上面带有适当的化学品的玻璃盖片200。溶液被添加至入口开口40并且流动通过所述通道到达中间样品室118，溶液在样品室118中与带有捕获表面区域210至212玻璃盖片200接触，并且排出通道和开口402。如果引入适量的流体，溶液自己流动并且在到达样品室118的内部或者到达出口402位置时停止。或者，流体可以被主动泵送通过该设备。
实施方式6
在根据本发明的另一个实施方式中，微流体样品盒116包括位于玻璃盖片或者基底200上的三个区域210、211、212，所述三个区域被功能化以用于结合实验(即，具有三个捕获表面区域210、211、212)(例如参见图3)。这是用于本文进一步讨论的血液分型实验的实例。
额外的实施方式
微流体盒可以是自动化流体设备或者孔室式设备，每种都与数据采集和分析兼容(即，显微装置10)，如本文所述。使颗粒108流动进入微流体设备的样品室118中，或者通过机器人吸移装置引导到孔室设备中，所述机器人吸移装置将一定量的样品107(颗粒108，带有溶液)引入不同的孔室。在该孔室设备中，每个孔室具有由位置标引的独特的表面化学性(由位置标引)，从而允许进行多个检验(例如独立结合测定法)，从而最终允许利用多个表面109对单个样品107(或者多个样品107)进行检验。
在此概述的仪器可以与用于将流体从样品容器自动(并且是可并行地)输送至每个小室、用于样品混合和温育功能以及并行测量功能的机器人机床一体形成，其可以是可程序化的和自动化的。于是，测定可以设计为以并行方式对一个或很多个样品107进行多重检验。另外，可以使用适当并行的光学对准(train)和检测装置(setup)以并行方式测量多个微流体设备或者开孔设备。机器人装置可以将微滴定设备或者开孔设备馈送至检测区以以自动方式进行测量，从而允许在无需使用者干预的情况下测量很多样品。
可以在添加溶液、颗粒或者混合物之后、或者更换溶液、颗粒或者混合物之后和/或在不同温度温育之后，重复给定样品室、微流体样品室或者开孔设备中的测量。
可以通过将额外的分析物引入给定的样品室、微流体样品室(一个或者多个)或者盒式孔室(一个或者多个)溶液中而在所述室/孔室中进行滴定测量。
另外，可以在给定的样品室、微流体样品室(一个或者多个)或者盒式孔室(一个或者多个)中进行动力学实验，然后进行时序(time-course)的颗粒迁移率测量(例如本文进一步讨论的归一化标准偏差(NSD))。这可以在将额外分析物或者不将额外分析物引入所述室/孔室溶液中的情况下进行。
一次性制品和仪器
根据本发明的一个实施方式的芯片设计包括用于例如免疫诊断的一次性盒，在所述一次性盒上可以进行ABO/Rh血液分型、抗体筛查和血浆过滤或者分离，除了弱D抗原之外，可以进行扩展表型分析、直接抗球蛋白检验(DAT)和抗体鉴定(见下文对这些用途的进一步说明)。一次性设计如图24中所示，图24显示了用于正向分型和反向分组血液检验(8个样品)的ABO/Rh盒、用于抗体筛查的盒(8个样品)和用于过滤的盒(2个样品)。图25的流程图显示用于正向分型、正向分型对照、反向分组、反向分组对照、抗体筛查和抗体筛查对照的过程步骤的总览。这些过程步骤可以在各种构造中进行，所述构造包括所示的有源一次性制品和无源一次性制品。流程图中所示的检验本身将在下文针对本发明的用途进行进一步的说明。虽然只显示一组过程步骤，但是有很多方式改变这些过程步骤以获得类似的结果或者以针对特定性能或者其他特性进行优化。
根据本发明的一个实施方式，其中为检验而插入过滤一次性制品601、ABO/Rh一次性制品602和抗体筛查(AbS)603一次性制品的仪器600显示在图26中。一次性制品601、602、603被插入到指定区域，并且仪器600能够容纳80盒过滤一次性制品601(160样品)、100盒ABO/Rh一次性制品(800个样品)和100盒AbS一次性制品(800个样品)。
仪器600具有用于管架(带有条形码读取器)的部件604、用于静态检验的吸移站605、用于非静态检验的吸移站606、37℃温育区607、25℃温育区608、静态过滤站609、非静态过滤区610、插入式液体盒区611、用于进行检验的照明区612和用于读取结果的读取器613。
本发明的仪器600可以是全自动化且受计算机控制，并且接受全血管子和瓶子(参见管架604)，并且不需要像常规检验那样手动读取结果。而且，本发明的一次性制品不需要经离心的血液作为输入物(并且因此没有外部离心，这是因其将在一次性制品之一上从全血分离出血浆)，并且在一次性制品本身内部具有一些试剂和任选的一些对照。因此，无论需要什么处理(例如血浆提取、溶液混合和细胞稀释)，所有的都可以通过联合使用计算机控制仪器和一次性制品来进行，并且无需使用者的介入。
单个检验需要10分钟，并且每小时可以进行12个成批检验。因此，采用本发明所使用的一次性制品，进行诸如血液分型和筛查等应用能够比常规方法快得多。
激励方法和装置
有若干个根据本发明的实施方式提供了激励方法，所述激励方法用于向平移平台114、颗粒108、颗粒108周围的流体施加力以确定结合相互作用是否发生。特别是，物理力施加单元包括使用外部激励单元例如下文的任意单元使平移平台114、颗粒108或者颗粒108周围的流体不连贯地或者连续地进行周期性移动。
a)压电/液压压力振荡器
图2A显示了微流体设备116的一次性测量室118，其带有入口401和出口402，所述入口401和出口402连接至例示性的压电或液压压力泵117，所述压力泵117分别包括高和低压力源403,404。螺线管阀405以给定的频率向室118中的样品107产生一系列的压电/液压压力脉冲。
在具有4倍放大倍率的物镜的明视场照射下进行的一个实验中，自由扩散或者结合二氧化硅珠子(4.8μm)悬浮在室118内的水中，振荡压力差横跨所述室118施加。振荡压力差轻缓地摄动颗粒108周围的流体，在颗粒108上形成比随机热力大的净压力，因此在结合和未结合颗粒108的行为上产生更大的差异。如图23所示，针对激励未结合珠子测得的归一化标准偏差(NSD)的分布具有更高的平均值和更窄的宽度，但是对于结合珠子，其基本上没有改变(参见下文对NSD法的进一步说明)。结合和未结合的分布的尾部在没有激励的情况下有些重叠，而采用激励样品，有一个大的空间将两种分布的尾部分开。因此，可以更加容易和可靠地将结合珠子和未结合珠子区分开。在测量不确定性或者噪音可能是问题的情况下，这种放大信号可以极大改善可信度水平。
b)压电液压致动器
图2B显示了微流体设备116的一次性测量室118，其带有入口401和出口402，所述入口401和出口402连接至例示性的压电-液压致动器406以以给定的频率和振幅向室118中的样品107产生振荡流。隔膜407可以任选地使用允许压电-液压致动器406致动的液压油或者气体介质408。
c)压电台式振荡器
图2C显示了一个例示性的压电台式振荡器，所述压电台式振荡器包括附接至压电致动器406的平移平台插件409，所述压电致动器406可以将控制信号转换成插件409的振荡运动。插件409的移动然后被转换成测量室118内部的颗粒108的周期性运动。
d)气动或液压阀调/摄动
图2D显示了一个例示性气动或液压阀调/摄动设备，芯上隔膜407通过气动/液压控制线路411和端口412由加压系统或者真空系统驱动。膜阀413包括隔膜407，移动所述隔膜407以阀调或者泵送样品407，从而导致流动。
e)热致动器
图2E显示了一个例示性的热致动器，所述热致动器包含加热元件414、隔膜407和之间密封的气体材料(或者其他高热膨胀材料)408。类热材料(thermoloid material)的体积在温度上升或者下降时显著变化，从而移动或者收缩隔膜407以振荡测量室118内部的样品107。
f)声音辐射
图2F显示了一个例示性声源415(即音速或者超音速发射器)，所述声源415传播声波通过测量室118，从而导致测量室118内部的样品10或者该样品10周围的流体的周期性振荡移动。这可以如所示的那样进行，或者采用声源相对于样品107的交替取向(alternate orientation)进行。例如，声源415可以沿着样品107的其他侧部或者顶部放置。系统可以以这种方式驱动以产生驻波图案、以避免驻波图案，或者以通过一次发射多个或者很多频率而具有随时间或者一次经历各种状态的扫描驻波图案。
g)孔室盖激励
在该实施方式中，设计“开孔样品盒(open well sample cartridge)”，其包括通过切割通过塑料片材的孔并在下方结合基底而形成的塑料盒116，其具有多个斑块或者捕获表面区域210等(例如参见图1G)。盖件700(参见图2G的图A)由伸出孔室705边缘的透明塑料片制成。盖件700在顶部和底部抛光以提供良好的光学质量。盖件700的底部应当与基底701的顶部间隔规定的距离。该距离优选为至少25μm，但是小于1mm。颗粒108被约束在盖件700的底部和基底701之间。
孔室盖700可以与机构704使用以使盖件在孔室705中前后滑动。孔室盖激励机构可以以各种方式实现，包括使用线性螺线管致动器704(参见图B)，其中孔室盖700通过导线连接至由函数发生器(未示出)驱动的螺线管圈(例如扬声器)。控制器703控制随时间的电流(并且因此控制随时间的施力)。运动引导件702可以包括在该系统中，以在没有盖件700转动的情况下限制沿着一个线性轴线的运动，但是也可以使用其他合适的方法来进行。
在根据本发明的另一个实施方式中，孔室盖700刚性地附接至底座(mount)上并且压电致动器704驱动盖件700左右移动(left-right)(参见图C)。可以使用任何适当的致动器来实现更加精确的移动。
盖件700的使用极大地降低了流体在运输过程中的对流、蒸发、晃动、振动易感性、颗粒的非均一沉淀、颗粒沿着底部表面的无意滚动、以及其他不希望的混杂效应。盖件的使用还限制了系统的高度，从而降低了颗粒沉淀至表面的时间的量，这是因为颗粒下降越快，它们与捕获表面区域相互作用越快，并且可以进行测量。
因此，在孔室盖700的任意实施方式中，波形(三角波是最简单的，因为速度在大多数时间是恒定的)、频率(约1Hz，在约10倍频程内)和振幅(约200微米，在5或者10的放大系数内)全部都可以控制。因此，移动的量和施加力的量级全部可以控制。可以输入力以分辨特异性结合(SB)和非特异性结合(NSB)-即，如果NSB弱于SB，则获得破坏较弱的NSB键的力并且不能破坏较强的SB键。因此，可以争夺样品107以更好地将结合和未结合颗粒/细胞108分开。这使得结合的确定要强得多地对抗测量噪音如聚焦、照射、灰尘或者缺陷。另外，由于未结合颗粒在采用结构419时移动更多，这有助于在测量周期期间应当已经找到结合位点但是还没有找到结合位点的颗粒108找到基底上的结合位点。这种机构还可以在温育阶段期间连续使用或者间歇性地使用，并且在测量周期期间可以进行激励或者不激励。
尽管已经描述了上述实施方式，但是本领域的技术人员应当知道的是，还有其他可以实现的激励方法和装置以将物理力施加于测量室118中的样品107。
这些激励方法的优点包括：1)更明显地将结合和未结合颗粒分开；2)更强地对抗照射强度变化、振动、稍微偏离焦点的颗粒、样品的平整度的缺陷、平台或者样品的调平缺陷以及将噪音引入到测量结果中的其他因素；3)通过使非特异性结合(NSB)和特异性结合差异化而有可能更主动地克服NSB，其中NSB可以具有比激励方法的驱动力低的结合强度；4)促使颗粒和基底之间的构造更快地探测，从而允许快速结合和/或更强地结合–由此加快检验测量。
方法
聚焦背景
在进行本发明的方法之前，可以进行显微装备的聚焦以获得最佳的结果。在典型光学显微镜中获得清晰图像一般需要单微米范围内的焦点精确度。较低的数值孔径可以产生清晰度较低的图像和较大的焦距深度，从而要求稍低的焦点精确度，并且选择适当的算法还可以一定程度地降低焦点公差。然而，焦点公差一般仍然在微米或者数十微米范围内。
传统的聚焦技术需要多焦点偏移，并且比较在这些不同焦点位置采集的图像。通过将焦点测量应用在每个图像，可以确定焦点偏移是否向真实焦点位置靠近。在大多数情况下，如果在显微应用中要求焦点精确度，这可能是一个缓慢的过程。另外，多视场、样品室、微流体室、或者微滴定孔板的测量可能需要多个聚焦事件。使样品物理移动多次以确定焦点的事实使得这种技术耗时。为了提高这种测量系统的流量，聚焦时间应当保持最小。
全息聚焦
与传统显微技术不同，使用相干光源100B照射颗粒108允许对样品107的单焦点外图像进行数值处理以以快速方式确定颗粒108的正确焦点平面(参见图1C)。例如使用相干光源100B照射透明样品室118中的具有颗粒108的样品107允许即使在明显处在焦点外时也能够对颗粒108的衍射图案进行成像。聚焦的数值解决方案允许在长范围的焦点外距离上进行快速聚焦。数值聚焦包括将焦点外图像传播至不同的距离，这允许以数值方式确定焦点。通过将焦点量度与每个数值传播图像关联，可以找到焦点量度的极值，从而允许通过单阶段移动来将样品定位在需要的焦点位置。这不同于传统聚焦方法，传统聚焦方法要求对样品进行比较慢的物理扫描通过不同的焦点距离，以根据一些焦点量度确定焦点位置。
因此，可以在长的距离范围上以数值方式传播所采集的焦点外衍射图案以确定使焦点量度最大化的距离(例如参见W.Li等，J.Opt.Soc.Am.A，第24卷，第10期，第3054-62页，2007)。一旦以数值方式确定该距离，可以进行单阶段移动来将样品107定位至所需的焦点位置。
在采集用以对其进行数值传播计算的图像中可以使用专门的聚焦照相机(未显示)。在一个实施方式中，该照相机可以放置在不同于用于迁移率测量的照相机112的成像平面的成像平面。因此，由收集自与测量照相机112相比定位在焦点外的平面中的该单独的照相机的图像进行聚焦计算。
聚焦以及迁移率测量还可以只使用单个照相机112进行。用于聚焦目的的图像可以在样品107的受控散焦后再收集。
图10展示了由来自校准样品107(参见图1C)的数值传播图像生成的校正曲线，在高于真实焦点位置1mm至低于真实焦点位置1mm的范围内对所述校准样品107进行扫描。在从焦点位置位移1mm的专用聚焦照相机上收集图像。所用的物镜142具有低放大倍率和低数值孔径物镜。还可以采用不同的物镜142和CCD位置生成校准曲线。校准曲线的x-轴显示校准样品107相对于焦点位置移动的真实距离，y-轴的数值示出数值传播焦点外图像的焦点量度的峰的位置。对于显著远离焦点位置散焦的样品107，可能需要多于一次数值焦点迭代以获得所需的聚焦准确度。更常见的是，可以采用多于一次的重聚焦步骤来确保所需的精确度，特别是在真实焦点位置和焦点外位置之间出现介质界面(例如空气-玻璃界面或者玻璃-水界面)的情况中。
图11展示了当针对在初始起点位置±1mm范围内进行三次聚焦迭代时使用图10的校准曲线的聚焦性能。可视化地确定真实焦点位置，并且该焦点位置具有约±μm的误差。相对于焦点平面的最终位置的值在可视化确定焦点位置测量的估计误差内是准确的。
沉降
在上述装置上进行本发明的方法包括将微观颗粒的群体导入样品室并且使颗粒沉降在表面上以测量任何的结合相互作用。
本发明可以采用不同的系统来使颗粒108沉降在基底200上。它们包括本领域已知的基于重力的系统、基于离心的系统、基于流动的系统、基于扩散的系统、磁性系统以及全息钳镊系统。
基于重力的系统
在一个实施方式中，颗粒足够大并且具有足够的密度以响应于重力而快速沉降在基底上。为此，颗粒108可以大于500nm，使用大至1μm的颗粒。在该实施方式中，载玻片或者样品室是倒置的并且未结合颗粒(即细胞/胶体)可以从表面109上落下。颗粒108可以沉积而与图案化基底200接触。可以实时监测载玻片或者样品室，或者可以让颗粒下落固定的时间，并且然后检查载玻片或者样品室的结合物质(即进行图像分析)。该系统的优点在于不需要外部试剂，移动部件少，具有成本效率，不需要外力机构。
基于离心的系统
在一个实施方式中，使用基于离心的系统，并且与基于重力的上述系统类似，不同之处在于利用离心力使颗粒从表面109移除。使载玻片或者样品室旋转并且在固定的时间之后，使离心系统停止并且检查结合(即进行图像分析)。该系统具有与基于重力的系统相同的优点，额外的优点是可以实现非常大的动力学范围。
基于流动的系统
在一个实施方式中，使用基于流动的系统，其中溶液流过结合至表面109的颗粒，利用黏滞力来探查结合。流动采用注射泵或者电泳流产生(例如使用单独检验)。检测系统可以包括流式细胞仪装置，或者单CCD/成像分析可以用来监测颗粒移除。该系统可能需要校准。该系统的优点在于相对便宜，具有非常大的动力学范围并且速度快。
基于扩散的系统
在一个实施方式中，采用基于扩散的系统，其中使颗粒108沉积至功能化表面109并且使用图像分析测量布朗运动的振幅。该系统的优点在于其具有成本效率，不需要外力机构，无需外部试剂，并且没有移动部件。
基于磁性的系统
在一个实施方式中，采用基于磁性的系统，其中使颗粒(即，细胞，顺磁性胶体)沉积至功能化表面109。在细胞的情况下，则使功能化磁性胶体分散到溶液中，其结合至细胞表面。然后施加磁场梯度(或者散装(bulk)或者探针在样品细胞外部)。未结合细胞/胶体被移除并且在B视场显微镜上使用反馈回路或者成像分析监测结合。优点包括具有基于非成像的检测的能力、相对较大的动力学范围、用于大批量以及显微应用领域的能力和快速。
全息光镊
在一个实施方式中，根据已知方法，全息光镊可选地在样品室118的表面上陷捕(trap)和移动颗粒。进行图像分析以检测结合相互作用。优点包括移动部件少，没有外部试剂，并且连续可调地施加力。
结合技术
图1A至1C显示了用于进行本发明的显微装置。将含有颗粒108的溶液放在载玻片上，或者使其流过孔板或者微流体设备116的室118并流过基底200，并且利用重力、离心力等(如上所述)使颗粒沉降在表面109上。检查颗粒108以确认颗粒108是否结合至基底200上的捕获表面区域210、211、212等(或者结合在其他颗粒108上)(参见图3)。
在一个实施方式中，基底200上的捕获表面区域210等包括使基底200能够特异性地与给定分析物或者其他化学实体相互作用的结合探针。“探针”是对给定标靶颗粒、分子、装配体(assembly)、配体或者其部分具有特异性结合偏好(“特异性”)的分子实体、颗粒、或者分子实体的装配体。分析物可以在基底200的表面上、在颗粒的表面上、或者在溶液中。捕获表面区域210等可以包括作为复合物的一部分的探针；例如与一个或者多个共价或者非共价地结合的分子或者颗粒的被固定分子。基底200还可以包括一组放置在基底200上离散空间位置的多个元件或者探针阵列，不管是一个时间距离或者多个时间距离，并且不管是规则间隔、周期性间隔还是其他形式的间隔。基底或者传感阵列200可以包括可以具有不同特异性的多个捕获表面区域201、211、212等。
颗粒108的表面包括诸如“化学物种”等实体，其是任意分子、分子装配体、大分子、大分子装配体或者部分。术语“化学物种”明确包括生物学和非生物学大分子，如肽、蛋白、碳水化合物、糖蛋白、抗体、核酸、聚合物、药物复合物以及诸如此类的物种。
在本发明中，玻璃质载玻片105、盖玻片、塑料或者二氧化硅基底可以具有带有特异性探针的多个捕获表面区域210等以形成传感阵列200，例如DNA阵列、蛋白阵列或者微阵列。任意尺寸的捕获表面区域210等都处在本发明的范围内。更具体地说，捕获表面区域210可以处于微米至厘米级范围内，并且可以大于颗粒108，在这种情况中，其可以与溶液中的多个颗粒108相互作用。而且，尺寸不需要在整个传感阵列200上都是均一的。虽然在此描述的实施例是按平面基底200进行说明的，但是捕获表面区域210等也可以是非平面基底或者第二颗粒的表面；例如可以观测较小的颗粒与较大的包被颗粒相互作用以形成捕获表面区域210。
在一个实施方式中，使含有颗粒108的溶液流入基底200上的室118，并且使颗粒108与基底200上的捕获表面区域210、211、212等接触。如上所述，接触可以利用重力让颗粒沉降而被动地发生，或者通过主动方式例如通过如上所述的离心、电泳、激励方法、或者使用光学陷阱技术等通过光学向颗粒施力或者将颗粒移动至基底来使接触发生。基底200的捕获表面区域210等或者较大的部分可以利用非透水性阻挡层限制边界以使溶液保持在基底200上。例如，基底200可以包括形成孔室418的壁部，或者捕获表面区域210等可以利用微流体设备领域已知的疏水性区域限制边界。
在至少一个颗粒108和基底200的对应捕获表面区域210等接触之后，如果在所述至少一个颗粒108的表面上存在特异性化学实体，则在它们之间可以发生特异性结合。在这种情况中，颗粒108和表面109之间的结合形成“表面关联”颗粒。对于大多数的分析目的，结合相互作用会是非共价的，但是也可以考虑特异性共价结合相互作用。另外，在由捕获表面区域210等呈递多探针分子的情况下，与颗粒108的这种相互作用可以是多价的。
如下文更加详细地描述那样，对于溶液中的分子的分析，可以将特异性化学实体提供在基底200上的表面上(于是其将一般会被呈递)，但是对于颗粒表面(例如细胞表面)的分析，特异性化学实体的存在或者数量一般是未知的，当然除了对照或者校准反应的情况之外。
由于溶液中颗粒108在重力下发生的沉降或者利用其他方法致使的沉降，可以确保与捕获表面区域210等的接触或者接近。在捕获表面区域210和颗粒表面上发现所需的结合伴侣物种的情况下，颗粒向表面109的接近起到确保伴侣化学物种将紧密接近以促进快速结合相互作用。与任何常规测定相比，这是有利的，在常规测定中，自由分子扩散是需要的，并且可能发生，从而限制了与表面结合的机会。因此，这种方法在实现结合的速度以及所实现的结合程度上都是有利的。
在一个实施方式中，每个颗粒108带有与捕获表面区域210等上的结合分子的装配体互补的分子的装配体(例如，受体-配体或者探针-标靶对)。结果，在颗粒108和捕获表面区域210等之间发生多种特异性结合反应，由此在颗粒108和捕获表面区域210等之间形成多个“系链”400。换言之，特异性结合相互作用显示出特征性的亲和力(即，由于与多价抗体的亲和力类似的多种化学/生物化学相互作用引起的协同性或者累积性亲和性)。系链400的互补结合伴侣分子可以固定至颗粒108和表面上，结合强度超过特异性结合反应(例如共价连接或者通过强的非共价相互作用的连接，例如生物素-抗生物素蛋白相互作用的连接)的强度。以上可以包括具有结合至一个捕获表面区域210等或者结合至多个捕获表面区域210、211、212的多个颗粒108的系集，所述捕获表面区域对不同化学实体具有相应亲和性。
颗粒波动
在本发明的一个实施方式中，一旦结合，颗粒108不破坏其与捕获表面区域210等的键，颗粒108展示自由度的程度反而可以用来确定分析物的存在、不存在或者数量。
在本发明的一个实施方式中，颗粒波动包括颗粒运动的多重、连续的变化。例如，颗粒108移动可以因布朗运动或者因根据上述的激励方法循环施加力而改变方向。这种平移移动或者位置波动可以由热动力学波动或者其他影响例如布朗运动、对流、声波或者其他力(即激励方法)引起。在一个具体的实施方式中，颗粒108的运动是在足够长的时间内近似抵消的力造成的，即，作用于颗粒108的净力近似为零。抵消的力的示例包括随机或者非随机力，例如周期力。例如，位置波动可以仅因为压力的波动或者由热能引起的移动引起。
在一个实施方式中，颗粒运动的量通过上述激励方法增加，以增强检测，而颗粒108仍然保持与捕获表面区域210等的结合。在该实施方式中，颗粒108可以在捕获表面区域210等上移动而没有实质性的滚动。在另一个实施方式中，即使通过施加力刺激运动(相对于如上所述的激励方法)，但是这种结合/滚动缺乏也得以保持，由此增加测量的灵敏度。如上所述，选择来自激励方法的力来增加运动而没有滚动/破坏颗粒108与捕获表面区域210的特异性结合。
当针对特定的温度范围将捕获表面区域210等的结合能适当调节至与颗粒108的特定亲和性时，颗粒108的位置自由度的测量结果揭示捕获表面区域210等与颗粒108之间的特异性结合相互作用的存在与位置自由度的量的降低有关。特定温度范围可以为例如0℃至40℃，或者更具体地为20℃至40℃，以最准确地进行测量。基底200和所粘附的颗粒108的温度可以使用热控机构(例如可以商购获得的温控显微平台)、水浴器、温育器、温控喷射器或者其他方法保持在指定范围内。
在本发明中，样品室118中的分析物的存在、不存在或者量的测量可以在这种结合能的条件下进行。在由于重力或者其他方法(例如离心、光学陷捕等)而沉降至基底200上之后，颗粒108可以由于溶液中的局部压力波动的影响而明显随机地平移移动。这种平移移动是指颗粒108的质量的中心的位置波动，这明显不同于滚动，其中滚动是指围绕所关注的颗粒108的质量的中心的运动。
图像采集和处理
使用上述显微装置10(图1A至1C)照射颗粒，暗视场、相衬、微分干涉对比(DIC)、全息成像和其他光学显微方法都可以使用。激光照射(参见图1C)的一个优点是其对比度高，而明视场具有的优点是其稳健性并且没有来自矫作物散射的噪音。DIC和相衬显微镜具有的优点是没有显示出与单色干涉有关的矫作物和一般斑点。
通过照相机收集颗粒108的图像并且使用计算机113分析。可以向颗粒108施加力，包括随机热力和其他的施加力，包括利用上述激励方法施加的力。通过照相机112收集视场中的颗粒的时间系列图像(至少N=2图像，但是更高数量的图像可以提供更高的精确度)。根据颗粒的类型和成像方法，可以选择的重要参数包括图像之间的时间间隔和观测颗粒的总时间。
待在图像中分析的颗粒108可以根据它们的尺寸、形状、取向、外观、与其他颗粒的接近性、它们在图像中的位置等进行选择，并且可以基于一个图像或者若干个图像。颗粒结合相互作用的统计学采样的显著性取决于被测量颗粒的数量，数量较大的被分析颗粒获得高的统计学显著性。虽然一些系统在N小于100时可以获得高的可信度水平，但是其他系统可以要求N为1000至10000，或者甚至更大。
位置波动的测量
位置波动的量度是表面关联颗粒108对刺激物的反应的数量量度，从该量度中推断给定表面关联颗粒108的位置自由度。观测和量化颗粒如何响应小的力(例如随机热力(即，布朗运动))、由基底/样品容器运动、声音振动和来自上述激励方法的其他的力引起而施加的压力(例如阀)导致的悬浮液体的大的运动(bulk motion)。
位置自由度的量度可以是归类性测量结果或者定性测量结果(例如二进制值)。或者，位置自由度的量度可以是数量值。例如，位置自由度的量度可以通过测量由捕获表面区域210等的规定“邻域(neighborhood)”(如下文所述)中一个或者更多个颗粒108散射的光在规定时间内的变化来获得。位置自由度的量度可以是描述规定邻域中的颗粒108的时间依赖性位置演化的统计学量度并且可是表示为方差、标准偏差、均方根(RMS)轨迹、或者与时间系列观测关联的颗粒位置的自动关联函数。
捕获表面区域210的“邻域”可以作为在其中观测运动的捕获表面区域210等中的已知颗粒108的位置周围的边界内的区域(例如圆形或者矩形区域)预定并且程序化到计算机113中。根据所用的测量技术，捕获表面区域210等的邻域的尺寸的选择可以要求统计学分析(例如来自校准数据)，并且可以被指定为含有颗粒108在给定的实验时间内的所有可能位置，并且可以被指定为足够小以使位置自由度测量结果的灵敏度最大化。
在捕获表面区域210等的指定区域(邻域)内观测位置波动，所述指定区域涵盖颗粒108在一段观测时间内的位置的预期范围。因此，如果粘附至捕获表面区域210等的颗粒108在一定量的时间或者一定数量的观测之后没能移动超过一定的距离，则确定该颗粒具有捕获表面区域210的呈递至其表面的特异性标靶。
位置波动的量度可以来自于基底200的表面的平面中的颗粒108的位置的所记录的时间系列测量结果，如果使用笛卡尔坐标系统，可以用x,y表示。可以将一些或者所有的记录观测结果储存到有型计算机存储器或者数据库中以供后期的位置自由度的处理和相关值(例如结合亲和性)的确定之用。或者，可以通过计算机程序连续地处理观测结果。
在z-轴(与基底200的表面限定的平面正交的方向)上的自由度的变化还可以通过偶联运动影响从x,y位置数据测得的位置波动。或者，z-轴上的运动可以通过计算机程序直接测量并且用于确定位置波动。也可以使用极坐标。时间系列的位置数据可以与第一表面区域的、样品保持器或者显微镜平台的、或者其他颗粒或者微观物体的参照标记(例如第一表面或者显微镜光学器件的)相关地测量。任选地，可以根据下述颗粒追踪方法追踪颗粒的路径并且将与该路径有关的数据存储至有形计算机介质。
可以针对每个颗粒单独地(包括通过多个颗粒的图像进行的并行处理)确定颗粒108的位置波动的量度，或者以不需要鉴定个体颗粒108的方式通过数学或者计算方法处理多个颗粒108的图像。例如，可以在两次或者更多次采集多个颗粒的连续图像，并使用图像的数字比较(例如图像差异化)作为时间依赖性自动关联函数或者时间依赖性概率函数的参数。
可以利用裸眼或者使用上述的显微装置10来实现位置波动的测量。在另一个实施方式中，使用包括相干照射的显微技术(全息波动显微术，使用图1C的装置)来测量位置波动。例如，全息显微术能够采集高分辨率的三维位置数据。因此，可以更快地对分析物的存在或者数量进行可信地确定，或者在给定的数据采集时间可以获得更高的可信度或者灵敏度。
因此，在一个实施方式中，在将样品107装载在传感阵列200上之后，将阵列200安装到装置10中，并且在颗粒沉降并且与捕获表面区域接触之后，可以手动启动分析或者按压按钮(物理的或者经由GUI)以启动计算机程序。
在所用的任意装置中，利用照相机112拍摄图像，并在构成计算机系统113的一部分的监视器后者屏幕上观察。在此描述的任何计算分析都可以作为构成在此描述的显微装置10的一部分的计算机程序进行。计算机程序可以通过计算机113运行，并且由显微装置10获得的所有数据都可以被处理并且保存在计算机存储器或者外部数据库中。
在一个自动化测量装置中，一旦开始分析，显微装置10的计算机程序就自动聚焦于捕获表面区域210等上。然后，计算机程序将自动找到一个或者更多个颗粒108，然后选择它们以马上分析。任选地，计算机程序将利用装置10来对颗粒108进行成像以确定其是否达到规定的标准组。
装置10可以使用图案识别常规程序、尺寸和形状数据(例如针对红细胞或者其他颗粒在规定外观范围内的物体的检测)、吸光度数据(例如，在红细胞中红色的检测)、荧光显微数据(例如染料或者标记的抗体的存在)以及其他光谱数据或者非光谱测量结果来进行这种测定。
通过照相机112采集时间系列图像(至少N=2，优选更多的图像)，并且根据颗粒的类型、成像方法和被检测的颗粒通过计算机113确定图像之间经历的时间和时间系列的长度。视场应当包含很多用于观测和测量的颗粒。另外，可以在单捕获表面区域210等或者多捕获表面区域210、211、212内对多视场进行采样。对于一些分析技术，只有1帧或者2帧需要存储在存储器中给定的时间。
可以采用的检测模式包括数值视频显微术(包括自动化显微术)、四象限光电二极管的使用、带有相干照射的显微术、散射光的测量、全息显微术和隐矢波技术。
对于随后的分析，计算机程序将把与其关联的捕获表面区域210等记录在计算机存储器、数据库或者其他计算机可读介质中。可以由机器可读取标记根据盒相对于参考标记的取向的认识或者其他方法来确定捕获表面区域的身份。使用上述光学自动聚焦步骤重复颗粒108的选择和分析，直到满足终止阈值。该阈值可以例如是被分析颗粒108的给定的总数量，在每个捕获表面区域210、211、212中分析的颗粒108的给定数量、经历的最大时间、统计学测量误差的超出。
结合检测算法
分析方法包括找到颗粒的位置自由度的值以确定结合的程度。位置自由度的程度可以通过从所采集的图像的序列测量颗粒的波动移动的程度来推断。这可以通过各种方法进行，所述方法包括颗粒识别和追踪、计算多个图像的平均值、计算连续图像帧之间的平均差异以及计算在整个图像时间序列上的像素级强度变化。典型地，进行计算以利用移动量度来表征颗粒。
在一个实施方式中，针对每个颗粒对像素强度值的统计学分布的分析进行计算，从中获得位置自由度的分布，从而获得颗粒的结合程度的分布。处理颗粒波动量度的概率分布的形状的统计数据以指示结合相互作用的性质。在这种分布的处理中，可以使用积分概率分布，测得的位置自由度高于/低于阈值的颗粒的级分、分布在随后测量之间如何变化或者是否变化、概率分布的矩(平均值、方差等)、分布与参考/校准分布的比较、或者其他分析来表征结合的程度。从结合的程度或者从移动分布的直接分析中可以推断感兴趣的量度(例如分析物的浓度、温度、粘度、pH、颗粒的性质等)。
确定位置波动的方法包括但不限于：1)颗粒108的可以使用颗粒追踪方法等测量的位移；2)颗粒位置的时间演化的统计学量度，例如针对在指定时间期间内的多个时间观测的一组颗粒位置计算的方差(例如标准偏差)；和3)来自位置波动中的变化的物理现象的量度，例如颗粒108或者颗粒108的系集的邻域中由于在适当的照射下由该颗粒108或者多个颗粒108散射的光引起的光强度的波动。
在一个实施方式中，由通过照相机112拍摄的尺寸为W×H的N个图像的序列通过使用计算机113计算该N个图像的像素级标准偏差来测量位置波动。于是，对于W×H输出图像中的每个像素，输出图像中的第一像素是该第一像素在N个输入图像中的标准偏差，以此类推。或者，可以通过计算机程序为输出图像中的第一像素分配一个归一化值，例如给它分配被除以第一像素在该N个输入图像中的平均值的第一像素在该N个输入图像中的标准偏差。针对在输入图像序列中观测到的每个颗粒，在该颗粒的限定邻域(捕获表面区域的区域)中对该输出图像进行求和运算或者求均运算。于是，为每个颗粒分配一个位置自由度量度。
在另一个实施方式中，使用N个输入图像的序列来生成作为连续输出图像中的像素级差异的绝对值的N-1个通过计算机程序算得的中间图像的序列。通过对这些N-1个中间图像进行平均计算来确定最终的输出图像。通过对在每个颗粒的限定邻域中的输出图像的值进行平均计算或者求和运算来分配个体颗粒波动值。
在另一个实施方式中，使用物体识别计算机程序来识别N帧中的每一个图像中的感兴趣颗粒的精确位置。通过计算机程序利用追踪算法来获得通过N帧找到的M个颗粒的追踪位置。通过计算帧内移动的均方根值dx(t)和dy(t)来分配个体颗粒波动值。
在另一个实施方式中，通过计算机程序使用在N帧上的M个颗粒的追踪位置来计算M个颗粒在N-1帧间隔上的确切的实际空间帧间位移。在N-1帧间隔的每一个间隔对这些M颗粒位移进行平均计算以获得在N-1帧间隔的每一个间隔的平均颗粒移动，dx_av(t)和dy_av(t)。对于经历随机施力、热激励、或者通过随机激励方法的系统，在没有对系统施加振动或者脉冲的情况下，平均颗粒移动应当大约为零。在实际系统中，振动、脉冲或者其他无意的场合可能会产生通过dx_av(t)和dy_av(t)可观测的显著的相关移动。通过计算机程序计算给定颗粒的帧间移动dx(t)和dy(t)，并且通过减去相关移动而算得相关帧间移动dx’(t)和dy’(t)：dx’(t)dx(t)-dx_av(t)，dy’(t)=dy(t)-dy_av()t。于是，减去了没有与致动的随机性质关联的无意相关移动。
在另一个实施方式中，采用追踪位置并且通过计算机程序计算平均帧间位移dx_av(t)和dy_av(t)，并将该平均帧间位移用于指示在平均(即，相关)帧间位移获得高到不可接受的水平的情况中的误差条件，其可以指示可能引起错误读取、仪器损坏或者其他不利结果的无意振动或对系统造成的影响的程度。
在其他一些实施方式中，结合激励方法(如上所述)使用追踪位置以在充分受控的激励的情况下获得一组更精确的颗粒波动值，其可以接近更高程度的施力或者更具有周期性或者更受控的施力(与通过随机热激励可以获得的相比)。
在一个所述实施方式中，通过上述方法之一实现激励以获得多施力间隔，其中在给定的间隔内施力是均一的。通过计算机程序采用颗粒追踪方法通过鉴定在给定施力间隔过程中颗粒的位置来鉴定对给定的规定的力的反应。在多间隔中如此进行可以实现响应于多施力水平或者方向的颗粒位置的测量，从而得到与结合的性质和程度有关的更加完整的信息，并且实现对其颗粒波动测量的更精确量度。
结果确定
在一个实施方式中，首先针对一个、两个或者更多个样品107获得校准数据。对于具有两个可能结果的简单检验，可以测量两个对照样品以获得校准数据。对于具有多于两个的可能结果的检验，例如可能希望连续变化量度(例如测量分析物的浓度、温度、pH等)的测量，可以使用多个校准样品。
在一个实施方式中，测量两个校准样品并且获得位置自由度测量的单(校准)阈值。将检验样品107中的的颗粒108的位置自由度的测量结果与该阈值比较，如果它们降到该阈值以下，则推断有结合相互作用。如果颗粒108具有高于该阈值的测量结果，则推断没有结合相互作用。于是，检验样品107中的颗粒108的数量的测量获得了被推断更强烈地结合的颗粒108的计数和结合强度较弱的那些颗粒的计数，这或者可以表示为强烈结合颗粒的百分比。对于给定的检验，通过将这些计数或者这种百分比与一个或者更多个基准值比较，可以将最终的结果称为例如“阳性”、“阴性”或者“兼性。
在另一个实施方式中，颗粒108的位置自由度测量组包括位置自由度分布。可以针对基准样品(例如由对照样品的很多轮校准确定的)以及目标检验样品获得位置自由度分布。可以将检验分布与基准分布组比较以确定与检验样品相似性最相近的是哪个对照样品。这可以通过很多方法以数值方式进行，所述方法包括投影法、关联法、点乘法、最小差异法、曲线积分区域法或者其他方法。这种方法可以获得二进制结果(例如“阳性”或者“阴性”)或者非二进制结果(例如0(阴性)、1(极弱)、1+、2、2+、3、3+、4、4+、5(极强))。于是，可以将波动测量结果集合与来自具有已知特性的基准样品的波动测量结果的集合比较。
另外，可以在进行比较之前处理所得到的曲线。例如，由于最感兴趣的是曲线的下限，因此可以将所有分布(例如检验分布和基准分布)乘以在0位置自由度处最高的函数从而使分布针对较高的位置自由度的量度向0下降。于是如此换算的分布在曲线的下限放置较高的权重。这对于想要在存在大数量的弱结合颗粒的情况下强调小数量的强结合颗粒的重要性的情形中可能是有利的。
或者，如果具有大数量的较强结合颗粒108和小数量的较弱结合颗粒108，可以通过在较小位置自由度测量时低而对于较高位置自由度测量时增加的函数来对分布进行换算。可以通过将这种加权引入到分布性质和它们彼此的相似性的计算中来实现类似的加权效应。因此，可以以各种方法处理所测得的分布以获得检验的报告结果，并且应当调整处理和判断的细节以强调分布的最重要的差异化特征。
诸如如上所述的方法可以用于一系列的系统，但是，对于特定的系统，应当检查对照分布的设置(以及测量误差的特性)以进一步优化判断标准和调校可信度区间或者“兼性”结果的可能报告。另外，注意上述测量和比较步骤可以通过计算机113进行计算机化和自动化。
应用—免疫诊断
血液分型
本发明至少对免疫诊断(其包括血液分型)的领域具有实用性，并且除了该领域之外，本发明还对其他诊断学具有实用性，包括药学活细胞测定(即，用于研究过去筛查(reserch past screening)和诊断检验)。特别是，本发明的一个例示性实施方式包括确定血液分型。
背景
有30种人类血型为国际输血协会(International Society of BloodTransfusion，ISBT)所认可，在人类血液输注中最重要的是ABO血型。血型包括A、B、AB和O。第二位最重要的血型系统是Rh系统。在30种血型中，有超过600种血型抗原，Rh系统目前具有50种抗原，最重要的是D抗原。
因此，红细胞(RBC)在它们的表面上具有很多抗原，其中一些抗原可以与血液“类型”关联(血型A、B、AB和O)，并且大多数常见抗原(称为A、B和D抗原)形成一个人的在献血的人的供体卡片上常常被讨论的ABO Rh血型(例如，A-、A+、B-、B+、O-、O+、Rh+、Rh-)。
针对这些表面抗原的检验一般称为“正向分型(FT)”或者“ABO/Rh抗原分型”。这是在每个血液供体和可能的供体接受者上进行，一般至少进行两次以作为备份。如果并且仅仅是如果，一个人在他们的RBC上没有A抗原，他们将在它们的血浆中具有抗-A抗体。类似的，如果并且仅仅是如果，一个人在他们的RBC上没有B抗原，则他们将在他们的血浆中具有抗-B抗体。换言之，如果一个人在他们的RBC上只具有A抗原(并且因此存在抗-B抗体)，则他们的血型为血型A，并且如果他们在他们的血浆中只具有B抗原(并且只存在抗-A抗体)，则他们具有血型B血液。AB型将在RBC上同时具有A抗原和B抗原而不存在抗体，而O型则在RBC上没有抗原并且同时存在抗-A和抗-B抗体。
“反向分组(RG)”或者反向分型是指确定一个人的血浆是否在其中具有抗-A和/或抗-B抗体。有效的是，这对于正向分型是冗余信息，因此是对正向分型的结果的另一种检查。存在很多的细节，但是对于最重要的部分，这是简单的对应。因此，为了进行完全的“ABO/Rh血液分型”，进行正向分型以寻找RBC上的A、B和D抗原，而通过反向分组寻找血浆中的抗-A和抗-B抗体。
如上所述，在RBC上有很多其他的抗原，但是焦点最强烈地集中在A、B和D抗原上，因为它们在临床上是最重要的—即，如果没有匹配，被输注的患者将很可能经受输注反应，这可能是致命的。但是，根据它们的临床重要性(如果抗体/抗原没有匹配，人们很容易经受输注反应)，在超过600种抗原中有18个其他抗原的名单，其重要性落在A、B和D之后的第二梯度上。如果针对这些抗原进行检验，根据是否无差别地寻找所有的18个抗原(扩展表型分型)还是靶向感兴趣的特异性抗原(抗原表征)，称为“扩展表型分型”或者“抗原表征”。
当一个人出生时，不管他是否在他们的RBC上表达抗原，他都没有正常地具有抗18种抗原的抗体。但是，如果他暴露于18种这些RBC表面抗原的任意抗原，他们将会产生抗这些抗原的抗体，即，“免疫”。这可能通过怀孕(他可能暴露于他的孩子的血液并因此暴露于孩子的RBC上的抗原)或者通过血液输注而发生。如果一个人在被输注，很可能给他们提供具有18种这些抗原中的一些他们所没有的抗原的血液，并且他们的身体可能对这些抗原产生免疫反应(即，开始产生抗体)。这是不重要的，除非这个人暴露于更多的具有他们对其具有免疫性的抗原的血液(即，单独输注)。下次，免疫反应可能是强烈的或者抗体可能攻击所输注的血液，从而破坏供体RBC并且引起各种临床问题。对于这些原因，筛查接受血液输注的任何人以确定他们是否具有抗18种这些抗原的抗体。这称为“抗体筛查(AbS)”。
针对一种或者更多种来自这些18种抗体的“未预料到的抗体”筛查一个人是呈阳性或者阴性。如果他们筛查为阳性，则需要确定这种或者这些抗体的特异性。这个过程称为“抗体鉴定(AbID)”。因此，呈阳性AbS的患者样品将进行AbID以鉴定存在的抗体的特异性。然后，医院或者实验室必须对大量的ABO/Rh相容性血液单位使用扩展表型分型或者抗原表征测量找到没有相应抗原的血液。最后，在输注之前，医院进行“交叉匹配”(这在美国一般需要将患者和供体血液混合在一起以检查反应(RBC的聚集)。如果交叉匹配通过，则释放血液以供输注。
因此，在最广泛的意义上，血液分型是寻找一些数量的RBC表面抗原以及一些数量的抗RBC表面抗原的抗体。可以鉴定细胞上抗原(或者受体/结合位点)的存在/不存在以及溶液中抗体(或者可能的其他分子)的存在/不存在/浓度的技术在医学诊断筛查和检验、药学等中是有价值的。
如上所述，在现有技术中，过去用于这种检验的最常见的方法是将RBC和带有抗体的血浆或者血清溶液混合以检查细胞聚集(血液凝集或凝结)。例如，为针对A或者B抗原进行RBC的FT检验，将RBC分别与抗-A或者抗-B抗体的溶液混合，以确定是否有血液凝集。如果有血液凝集，这个人将分别具有A型血液或者B型血液。如果当同时与抗-A和抗-B抗体(或者抗-AB)混合时RBC聚集，则这个人具有AB型血液。然而，如果RBC在于抗-A或者抗-B抗体混合时没有粘结在一起，则这个人具有O型血。
在第一次检验(即，针对A抗原)后没有出现血液凝集，则需要进行第二次检验以确定是否存在B抗原和针对D抗原(Rh)的第三次检验以确定血型—从而完成全部正向分型检验。例如，使用Rh分型，如果在与抗-Rh混合时RBC凝集，则这个人具有Rh-阳性血液。如果该血液在与抗-Rh血清混合时没有凝结，则这个人具有Rh-阴性血液。
反向分型检验是类似的。在将具有已知抗原谱的RBC添加至血浆或者血清样品时检查血液凝集。例如，如果血液样品只是在将具有A或者B抗原的RBC添加至样品时凝集，则这个人分别具有抗-A或者抗-B抗体，因此分别具有A型血液或者B型血液。如果血液样品在将具有A或者B抗原的RBC添加至样品时都凝集，则这个人具有O型血液。如果血细胞在将样品与两种类型血液同时(含有A抗原和B抗原)混合时凝集，则这个人具有AB型血液。
为了进行AbS检验，一般采用来自2人或者3人(即，3个人)的RBC组。对于如何进行有若干种变体，但是必须将受检血浆与细胞类型之一混合以检查凝集，然后针对其他细胞类型重复进行。
例示性实施方式—正向分型
图3-5例示性地展示本发明的例示性实施方式，以使用例如图1A至1C的显微装置通过确定放置在传感阵列200上的血细胞的位置自由度来鉴定血液类型。具体地说，传感阵列200是通过本领域已知的技术制得的玻璃质显微镜载玻片，包括清洁并使用能够结合包含抗体的捕获表面区域210、211、212(即斑块)上的探针或者探针复合物的功能性接头310使载玻片200硅烷化。如上所述，探针是对给定的标靶颗粒、分子、装配体、配体或者其部分具有特异性结合偏好的颗粒、分子实体或者分子实体的装配体。在这种情况中，探针300,300'对血液抗原具有特异性。探针300,300'经由接头310(参见图4)稳健地(例如共价地)附接至玻璃质载玻片或者基底200上而进行固定。
尽管该实施例涉及血液分型，但是所描述的方法可以应用于其他细胞类型或者应用于非细胞颗粒以及应用于其他类型的表面分子或者部分。
在该实施例中，传感阵列200包括三个捕获表面区域210、211、212，每个捕获表面区域对不同的红细胞(RBC)表面抗原(即，A、B或者Rh)具有亲和性，以确定血型(即，正向分型)。传感阵列被放在室118中，而血液(任选地使用适当的缓冲液稀释)通过入口401(参见图2A)进入样品室118，并被布置在传感阵列200上。如前文所述那样，利用重力或者任何其他适当的方式(例如，离心等)让血液沉降。
图3显示了带有多个沉降在捕获表面区域210至212的表面上的红细胞220和白血病230。任选地，通过使用冲洗缓冲液洗涤而移除来自血液的过量细胞或者碎片并通过出口402排出(参见图2A)。
如图4中所示并且如上所述，红细胞220具有表面抗原225，所述表面抗原225将通过传感阵列200进行检测以确定患者血液的类型(正向分型)。由于在该实施例中的红细胞来自单个患者，因此表面抗原225的针对样品107中的所有红细胞的设置一般都是一样的。如图4的截面图所示(但是不成比例)，传感阵列200具有例如分别带有探针300和300'的第一捕获表面区域210和第二捕获表面区域211(捕获表面区域212为简洁目的没有示出)。因此，在该实施例中，探针300,300'是抗红细胞抗原的单克隆抗体，但是可以是本领域已知的任何适当的具有生物学特异性或者化学特异性的探针分子(例如多克隆抗体，核酸探针，适体(aptamer)、全合成探针等)。
图5显示了图4的在沉降并且与探针300,300'联合后的红细胞。在沉降之后，抗原225和探针300,300'将在空间上彼此接近，从而允许特异性结合反应发生。结合相互作用的结果是一点或者更多点的连接，称为“系链”400。在捕获表面区域210,211具有对存在于红细胞220的表面上的抗原具有特异性的探针300,300'时，系链400将排他性地或者大量地形成。结合反应快速发生，并且对于效率和速度，可以通过适当的检测装置如上文所述的那些装置(包括图1A至1C的显微装置10)进行测量。
特别是并且如上所述，使用检测装置10来检测多个与捕获表面区域210,211等联合的红细胞220的位置自由度的量度。位置波动应该取决于所形成的系链400的数量，系链400的数量越大，颗粒移动越少，抗原存在于该红细胞上的可能性更大。因此，使用测得的位置波动来确定特定分析物的存在或者不存在。
对适当的分析物进行多次这样的测量使得检测装置10可以确定血液类型。例如，如上所述，可以将颗粒或者红细胞位置的标准偏差与预定的或者得自具有血细胞或者血细胞模拟物(例如带有RBC抗原的颗粒)的对照反应的阈值比较。低于该阈值的测得位置波动(指示颗粒的移动在统计学上较少)将指示细胞上抗原的存在。
图6显示了正向分型中的一个实验，其中检验B型血液的RBC200在抗-A抗体斑块(即布置在图4中的捕获表面区域210上)和抗-B抗体斑块上(即布置在图4中的捕获表面区域211上)的位置波动。所得到的图显示了在带有抗-A和抗-B抗体包层(分别为斑块210,211)的基底200上的B型(对抗原B呈阳性)红细胞220的时间平均扩散速度。结果显示所观测的受检B型RBC220的均方位移为测量时间间隔的函数。
具体地说，图6中的每条线代表RBC220。B型细胞220结合至抗-B抗体斑块(即捕获表面区域211)，但是没有结合至抗-A抗体斑块(即捕获表面区域210)。因此，抗-A抗体斑块210的RBC220显示出较高的总体位移，对于较长测量间隔，移位稳定地增加，表明B型RBC220(在图中RBC显示基本笔直向上的线条)自由扩散，而抗-B抗体斑块上的RBC220在较长测量时间时显示出平整的位移，因为它们的行程距离因结合至基底200而受到限制。尽管抗-B抗体斑块211上的B型RBC220在短的时间量程内系连至表面上，它们显示出与抗-A抗体斑块210上的RBC类似，然而在较长的时间量程上，它们变得平坦了。因此，存在用于观察颗粒或者RBC的位置波动的约5至10秒的特征性时间量程以便看出图的特征性特征，并且B型细胞220在抗-B抗体斑块上211上具有较低的位置自由度的结果表明B型细胞发生结合。
图7显示了根据本发明的正向分型实验的图，其中使用例如显微装置10，并且其中使用上文讨论的方法计算RBC的归一化标准偏差(NSD)的概率分布。
正向分型实验与图6的实验类似，包括布置在抗-A和抗-B抗体斑块210,211的A型血细胞220。所得的图显示了基底200的分别包被有抗-A和抗-B抗体的捕获表面区域210,211上的A型(具有A抗原)的红细胞220的归一化标准偏差(NSD)的概率分布。如上所述，NSD是位置自由度的量度，并且抗-A抗体捕获表面区域210等的窄的低值分布指示颗粒或者RBC220的迁移率小。换言之，大部分的A型红细胞220结合至基底200。相反，抗-B抗体捕获表面区域211等的宽的分布指示大部分或者所有的颗粒或者RBC220自由扩散而没有结合。
本发明的方法和装置的优点不仅在于在某些情况下的速度上，而且还在于测量在达到平衡之前进行，这使用常规技术的话一般需要数小时。在常规方法中，例如，技术人员将查找细胞的可以看到(一般对于肉眼来说)的大团块，包括不均一的表面，或者带有红色团块等的白色表面，这在某些情况下会花费大量的时间。然而，在本发明中，所有这些只需要确定一定数量的个体细胞的结合事件的统计学显著水平(而不是确定在平衡后通过显微镜可以看到的平均结合水平)，这可以快速且有效地进行。
实施例—反向分组
在根据本发明的另一个实施方式中，图8示出了用来鉴定血浆是否在其中具有例如抗-A和/或抗-B抗体的传感阵列或者基底200(即反向分组(RG))。反向分组技术基本上与上述的正向分型相同，但是根据结合至抗体320的红细胞220的位置自由度的确定来检测抗体，所述抗体320被结合至布置在基底或者传感阵列200的捕获表面区域210、211上的红细胞220的抗原225。如在正向分型实施例中一样，可以使用显微装置10。
更具体地说，在如图8所示的该例示性实施方式中，传感阵列200是玻璃质显微镜载玻片，其通过本领域已知的技术如上所述制得，包括清洁并且使用能够结合基底或者载玻片200上的捕获表面区域210、211、212上的红细胞的功能性接头310(在图8中未示出)使载玻片200硅烷化。可以使每个捕获表面区域210、211、212特异性地检测特定的抗体。
将红细胞220的水溶液引入室118并且利用重力或者利用离心或者其他上述技术等使红细胞220沉降在传感阵列200的捕获表面区域210、211、212(即斑块)上，并通过接头310使红细胞220结合至或者粘附至捕获表面区域210、211、212上。从室118移除红细胞220的水溶液，并通过将去离子水添加至室118中使结合的红细胞220裂解以使红细胞220平躺在传感阵列200上，从而使红细胞220铺展在捕获表面区域210、211、212上并基本上填充了所有空隙。然后通过出口402(参见图2A)移除去离子水并添加保护液(溶解在水中的右旋糖)，使传感阵列200风干，或者将其在干燥器中干燥。使用扁平化的红细胞220覆盖所得的传感阵列200，使传感阵列200具有一层薄的干燥的保护层，该保护层有助于保护红细胞220上的抗原225的反应性并延长它们的使用寿命。
为了进行反向分组(RG)检验，在一个例示性的实施方式中，将血浆添加至室118中并且将阵列200于约25℃温育。血浆中的抗体320落下并包被传感阵列200的捕获表面区域210、211、212的表面上。抗体320是上面具有5个反应器的IgM(免疫球蛋白M)抗体，于是一个或者两个所述反应器将结合至从室118的底部表面竖起的抗原225，其他反应器保持自由。如果抗体320没有结合至或者粘附至扁平化红细胞220的抗原225并包被底部表面(表明抗体被呈递给该特异性抗原)，则使用缓冲溶液通过出口402洗掉血浆，并且这意味着所需的抗体没有存在(注意对于该检验来说洗涤步骤是任选的)。
如果来自血浆的抗体320结合至或者粘附至扁平化红细胞220上，那么将带有所希望的抗原225的探针红细胞220的水溶液引入室118，并且探针红细胞220将落下并结合至抗体320(该抗体320被结合至底部表面上的扁平化红细胞220的抗原225上)，从而形成夹心式测定。
因此，如果血浆具有针对特定抗原的抗体(即，在夹心式测定中结合至底部表面上的红细胞220上的A抗原和结合至室118中的探针红细胞220上的A抗原的抗-A抗体)，则结合反应(即系链400的数量)将是高的，并且位置自由度的程度将是低的。如果探针红细胞220的位置自由度的程度高，则血浆不含有所述特定抗原(即，没有抗-A抗体)，并且结合反应的数量将是低的。在确定红细胞220的位置自由度时，检测装置(即，显微装置10)计算红细胞位置的标准偏差(与阈值相比)以确定所希望的抗原的存在或者不存在。本发明的优点如针对正向分型所述。
实施例—细胞的扁平化
在一个实施方式中，可以在连续系链400在系链形成阶段形成的时候使特异性结合颗粒108(如果在施加的力下屈服)扁平化(包括成链、扁平化或者形态上的其他变化)。可以使用显微装置10以显微方式观测颗粒108(即，红细胞)的这种扁平化，并且其本身可以指示捕获表面区域210、211等对其具有特异性的分析物(即，红细胞抗原)的存在、不存在或者数量。
对于血液分型的应用，还观测到颗粒108的扁平化与红细胞的中央凹陷的失去相关联，这种特征可以用来指示捕获表面区域210等对其具有特异性的红细胞抗原的存在、不存在或者数量。可以自动地(例如通过使用自动化显微镜以及图1C的显微装置的图案识别软件)检测所述扁平化和凹陷失去。可以单独使用这种扁平化效应或者结合位置自由度测量来自动化地标明血液类型。
例示性实施方式—抗体筛查
a.IgM类抗体
在根据本发明的另一个实施方式中，以与上述的反向分组(RG)相同的方式进行抗体筛查(IgM类抗体)。另外，由于人类在暴露后只生成IgM类抗体，因此这是频率较低的检验。
b.IgG类抗体
然而，对于更经常进行的(但是也是更难的)检验，进行IgG免疫球蛋白G类抗体筛查(与IgM和RG检验相比，其采用抗人类球蛋白(AHG))来查找例如所述18种不同的人类抗体。在该实施方式中，技术与反向分组(RG)的类似，并且可以使用例如图1A至1C的显微装置10。但是，这种检验确实需要在其他类型检验(即，IgM、RG)中不是必需的洗涤步骤(参见下文)。
更具体地说，在如图9中所示的该例示性实施方式中，传感阵列200是玻璃质显微镜载玻片，其通过本领域已知的技术如上所述制得，包括清洁并且使用能够结合基底或者载玻片200上的捕获表面区域210、211、212上的红细胞的功能性接头310(在图9中未示出)使载玻片200硅烷化。捕获表面区域210、211、212包括来自若干人的血液组，其中在他们之间表达所有18种抗体。
如反向分组(RG)那样，将红细胞220的水溶液引入室118并且利用重力或者利用离心或者其他技术等使红细胞220沉降在传感阵列200的捕获表面区域210、211、212(即斑块)上，并通过接头(在图9中未示出)使红细胞220结合至或者粘附至捕获表面区域210、211、212。从室118移除红细胞220的水溶液，并通过将去离子水添加至室118中使结合的红细胞220裂解以使红细胞220平躺在传感阵列200上，从而使红细胞220铺展在捕获表面区域210、211、212上并基本上填充了所有空隙。然后通过出口402(参见图2A)移除去离子水并添加保护液(溶解在水中的右旋糖)，使传感阵列200风干，或者将其在干燥器中干燥。使用扁平化的红细胞220覆盖所得的传感阵列200，使传感阵列200具有一层薄的干燥的保护层，该保护层有助于保护红细胞220上的抗原225的反应性并延长它们的使用寿命。
为了进行IgG检验，在一个例示性的实施方式中，将与增效剂混合的血浆添加至室118中。将阵列200于约37℃温育。增效剂加快了传感阵列200的捕获表面区域210、211、212的表面上的某些抗体/抗原之间的反应。增效剂可以选择为通过很多不同方式(例如本领域已知的沉淀方式或者静电方式)驱动反应。
温育后，使用缓冲溶液通过出口402(参见图2A)将血浆非常彻底地洗出，以防止残留的IgG使抗-IgG抗体颗粒320饱和。然后，利用重力、离心或者其他技术等将探针颗粒330引入到室118中并使探针颗粒330沉降在扁平化红细胞220的表面上。探针颗粒330可以是带有适当表面化学性质的胶体(玻璃微珠)330或者RBC(在图9中未示出)。可以使用抗-IgG抗体320来形成已经粘附至基底(扁平化)RBC220的抗-IgG抗体320和探针颗粒330它们本身之间的桥键。
因此，抗-IgG抗体颗粒320将结合至扁平化RBC220的表面上。抗-IgG抗体320最初可以是结合至探针颗粒330或者可以是游离的。在任意情况中，探针颗粒330经由感兴趣的来自受检血浆的抗-IgG抗体320或者经由探针颗粒330上的抗-IgG抗体320终止对室118的底部表面上的抗原225的结合。
还可以使用其他方法，并且该方法可以应用于不同类型的抗原。
因此，可以检查所有类型的抗体(即，18种抗体)以便看出何种探针红细胞330结合至哪个捕获表面区域210、211、212，以及18种抗原中的任意抗原是否存在。
如上文针对其他形式的筛查所述的那样，如果探针颗粒330的位置自由度的程度高，则不存在特定的18种抗原，并且结合反应的数量应当是低的。在确定探针颗粒330的位置自由度时，使用如上所述的算法，检测装置(即，显微装置10)计算探针颗粒330的标准偏差(与阈值比较)以确定所希望的抗体的存在或者不存在。本发明的优点如上文针对正向分型所述。
传染性疾病筛查
在根据本发明的其他一些实施方式中，本文公开的方法和装置适合于传染性疾病筛查(例如人类免疫缺陷病毒(HIV)、肝炎B型病毒(HBV)、梅毒(syphilis)、人类T淋巴细胞病毒(HTLV)、肝炎C型病毒(HCV)、梅毒(syphillis)等)，其通过针对抗这些传染性媒介物的抗体进行检验。很多这些传染性疾病需要多重筛查以确定是否存在该疾病以及以防止供血系统包含这些疾病。
在一个实施方式中，标靶抗体取自血液样品，并且针对经过独特处理的表面的阵列进行检验以确定抗体谱。具体地说，标靶抗体取自用于检测病毒感染目的的血液样品。在给定病毒的表面上出现的蛋白可以被固定在该表面(即，固相)上，从而能够捕获抗该病毒的特异性抗体。另外，包被有与该病毒抗体的另一区域互补的抗体的颗粒存在于该检验中，使得在标靶病毒抗体存在的情况下，可以发生颗粒的固定，从而对抗体在血液样品中的存在进行信号传导。使用适当的对照进行这种测量以对感染进行诊断或者以量化标靶抗体浓度。
在本发明中，所用的装置和方法与上文针对血液分型所述的类似。
a)HIV
HIV检验目前是抗体、抗原和核酸检验(NAT)，这些检验为西方国家所采用。从1985年起，在美国使用酶联免疫吸附测定(ELISA)，然后使用NAT。
相反，在该例示性的实施方式中，在通过本领域已知并且如上所述制得基底200(即，玻璃质显微镜载玻片)(包括清洁并使载玻片200硅烷化)之后，通过各种已知的方法(例如通过使用接头310)将重组HIV抗原附接至基底或者传感阵列200。
根据如上所述并且例如如图8所示的方法，通过将RBC200的血清引导至室118而使基底200暴露于患者血清。利用重力或者离心方法等让RBC200沉降在基底200的表面上，如果存在HIV抗体335，则HIV抗体335将结合至基底200的HIV抗原336。
如上所述，使用缓冲溶液洗涤通过出口402移除患者血清，留下基本没有受到干扰的特异性结合HIV抗体335。将对人类抗体(例如兔抗-人IgG)具有特异性的颗粒标记抗体340引导到室118并经由颗粒340的位置自由度的量度检测与HIV抗体335的特异性结合。
这种类型的测定在多路技术(multiplexing)的情况下是特别有利的，因为只需要一种或者只需要少量几种颗粒标记探针340就可以确定很多类型的分析物分子。因此，在抗体结合足够的时间之后，可以添加颗粒标记抗人抗体340(例如抗-IgG、抗-IgM、抗-IgG和IgA或者其组合)的溶液并允许其结合至捕获表面区域。然后使用通过图1A至1C的显微装置10进行的位置波动测量来探查颗粒340的反应以得到关于患者的过去病原暴露、免疫状态、癌症预后或者其他医学状态的结论。
这种技术可以利用少量标记颗粒类型(例如1至4种标记颗粒类型)并行应用于若干种、数十种或者甚至数百种抗原。因为需要的颗粒类型如此之少，因此，例如使用具有不同的激发或者发射波长的荧光团给每种颗粒类型加上标签以对结果进行去卷积(deconvolve)是相对简单的。例如，可以使用不同的荧光团使抗-IgG和抗-IgM抗体带上标签。注意使用标签的多路技术可以应用于在各种实施方式中描述的其他测定类型，包括那些涉及固体颗粒和细胞(可以使用例如荧光抗体使其带上标签)的测定。在另一个实施例中，可以就用于诊断变态反应目的的众多抗原确定患者的抗体谱。
b)病原体
在另一个实施方式中，经由探针将分析物偶联至基底。将对经常存在于病原体(细菌或者病毒)上的抗原具有特异性的探针抗体共价地偶联至基底以形成捕获表面区域。将被怀疑含有细菌或者病毒的样品添加至所述室中并使其沉降(利用重力、离心或者其他方式)，并进行结合反应。添加带有共价结合的对病原体具有特异性的抗体的探针颗粒并且使用显微装置10通过显微观测和量化它们的位置波动来确定它们的结合程度。或者，可以使用与图19A和19B相关地进行概述的间接测定法来检测结合的病原体。
互补抗原的独特组合的检测
根据所希望的分析，还可以利用探针类型和特异性的组合。例如，可以使用传感阵列200的带有多种经固定的单克隆抗体的捕获表面区域210/211/212来检测带有互补抗原的独特组合的细胞(例如某种癌症细胞或者干细胞)的存在。
化学中的例示性实施方式
在其他一些实施方式中，本发明的方法可以包括化学变体和技术，如下文所述那样参考图4至5和8至9。
生物学惰性部分
图17显示了基底200上的捕获表面区域214和215，所述捕获表面区域同时包括探针300,300'和生物学惰性部分820。生物学惰性部分820可以为例如亲水性聚合物，例如经由硅烷连接体310连接至基底200的聚乙二醇部分。接头310还可以具有生物学惰性或者具有生物学惰性补体。生物学惰性部分820用于降低探针300,300'密度，使得对细胞(未示出)和捕获表面区域214、215之间的非特异性结合相互作用的贡献最小或者为负数。
生物学惰性部分820还可以包括在位于捕获表面区域214、215之间的区域216上。还可以通过将探针300,300'与具有反应性但是为生物学惰性的试剂—例如在使用胺-反应性交联剂时的甘氨酸或者在使用巯基反应性交联剂时的丝氨酸进行组合来改变探针300,300'的面密度。
直接测定法—偶联至基底的分析物
在根据本发明的一个实施方式中，如下文针对图18A至19B所述，可以首先将分析物226附接至基底200并使用颗粒800或者另外的探针和颗粒进行探查。
在图18A至8B中示意性地展示的实施方式中，直接测定法包括将分析物226,226'结合至或者捕获至基底200上，并测量其表面上固定有探针300,300'的报告颗粒800的位置波动。例如，可以使用带有例如固定抗体的0.01至100微米直径的玻璃或者塑料珠子800来探查特异性或者非特异性地结合至(或者捕获至)基底200的标靶分析物226'。可以将分析物226,226'共价地或者非共价地连接至基底200。还可以将探针300,300'和标记800组合成单个生物学实体，例如表达用作探针的表面蛋白的天然的或者经过遗传改造的细胞。
特别是，在图18A中，将例如分析物抗原226结合至捕获表面区域210，并且使带有固定抗体探针300的颗粒800与捕获表面区域210接触并使其结合至捕获表面区域210。然后通过上述已知的方法使用显微装置10测量位置波动。如果抗体300如图18A所示那样识别抗原226，那么它们之间存在结合，因此位置波动比如图18B中所示的情况(其中抗体300没有识别非结合抗原226'(即没有发生结合))小。
或者，标靶分析物226可以是抗体，颗粒800上的探针300可以是抗原(例如参见图5)。分析物226还可以是细胞表面的一部分，其中所述细胞粘附至基底200。
间接测定法—探针复合物
一种间接测定法包括检测第二探针300(参见图19A)的特性，所述第二探针300结合至第一探针320以形成复合物(例如生物分子复合物)，该复合物将同源结合伴侣分子呈递至读出颗粒800。第二探针300对第一探针320的化学部分可以具有特异性，或者对第一探针320(特定的或者其他的)的标记可以具有特异性。另外，还可以使用(三元、四元等)复合物。复合物的另外实施例还结合图20至21的实施方式给出。和上述的直接测定法类似，所观测的颗粒800特征是颗粒800的提供其位置自由度的位置波动。
在图19A中展示的例示性实施方式中，可以将未标记的单克隆小鼠抗体320用作第一探针320并将其与固定标靶抗原226(例如直接固定在基底200上或者一体形成至固定细胞)接触。第二探针300可以是使用所连接的探针部分300标记的颗粒800，所述探针部分300是多克隆兔抗小鼠抗体。可以根据上述方法，将第二探针颗粒300与第一探针抗体320接触，使其结合，并且使用适当的显微装置10通过观测颗粒800(即在布朗运动的影响下)的波动反应来检测特异性结合相互作用。
如图19B所示，缺乏特异性结合反应导致位置波动的相应差异并且所得到的颗粒800的位置自由度较大。
竞争测定法
常规的竞争性测定法包括检测与结合分析物或者报告分子或者其他分子的位移相关联的事件。但是，竞争测定法常常以串行方式进行，获得很少的数据点。
相反，本发明的竞争测定法如上所述可以以并行方式进行，即，通过同时或者快速连续的方式获得多个颗粒的位置波动测量结果。结果，可以获得更多的数据点以用于可信度更高的结果和/或可以检验更多类型的标靶。
图20和21展示了测定配置的一些例示性实施方式，这些实施方式利用对颗粒的位置自由度的确定来确定结合相互作用。
如图20A所示，在基底200的捕获表面区域214,215处形成三元夹心式结构。该夹心式结构由如下部分组成：(i)基底200结合探针300'；(ii)位置标示符分子227；和(iii)固定在颗粒800上的颗粒结合探针320。位置标识符分子227对基底结合和颗粒结合探针300,320两者分别具有特异性亲和性。位置标识符分子227对探针300,320可以具有结合能，这与标靶样品中感兴趣的分析物的类似。
例如，位置标识符分子227可以是感兴趣的抗原的重组体形式。另外，基底结合探针300可以对不同感兴趣的分析物具有不同的亲和性或特异性，并且可以预装配为三元复合物(其为系链400形式)，带有适当的位置标识符分子227和颗粒结合探针320。
如图20B所示，当样品添加有对探针300,320具有亲和性的分析物分子226时，如果向平衡靠近的时间适当，分析物分子226将倾向于将位置标识符分子227置换到依赖于相对结合常数和质量作用的程度。如果捕获表面区域214,215上的夹心式结构和颗粒800在所添加的分析物226的中间浓度下以多价方式相互作用(即具有亲和力)，则只有一些位置标识符分子227倾向于被竞争性置换，并且系链400相应地受到破坏。通过显微装置10，这种竞争性置换状态可以被检测为位置波动的差异，如上所述。
在一个备选的实施方式中，图21显示了用于竞争测定法的反应方案，其中位置标识符分子227对探针300,320具有比对分析物分子226低的亲和性。基底200上的捕获表面区域214,215具有探针300，而颗粒800具有探针320，这些探针对位置标识符分子227具有特异性，但是对分析物226具有更大的亲和性。结果，如果位置标识符分子227被来自所添加的样品的标靶分析物226竞争性置换，捕获表面区域215和颗粒800之间的结合相互作用的强度将增大。这可以通过显微装置10进行检测，因为捕获表面区域215中的颗粒800的测得位置波动下降(与捕获表面区域214相比)。如果捕获表面区域214对非交叉反应分析物具有亲和性，捕获表面区域214中的夹心式结构的结合力将不受干扰。和其他测定法实施方式一样，这种方法可以以并行方式在多个颗粒(例如3、5、10、100或者更多颗粒)上进行。
分析物特异性
图22显示了沿着上文针对竞争测定法讨论的线路的夹心式测定法。基底200的捕获表面区域214,215对不同分析物具有特异性，捕获表面区域215对分析物226具有特异性亲和性，而捕获表面区域214对不同分析物具有特异性。
将含有分析物226的液体分配至室118中和捕获表面区域214,215上。如果条件正确(即温育等)，分析物226结合至捕获表面区域215中的探针300。添加带有对分析物226具有特异性亲和性的探针320的报告颗粒800。报告颗粒800将对与捕获表面区域214互补的分析物也具有亲和性，或者也可以包括带有这种亲和性的另一种颗粒。利用重力、离心或者其他方式沉降后，使用显微装置10确定颗粒800的位置波动。捕获表面区域215中的颗粒800的小的迁移率指示结合，并且指示夹心式结构中的分析物226的存在。如果颗粒800具有相对较大的迁移率，如在捕获表面区域214中那样，则没有结合反应。
共价系链
虽然图20展示了非共价系链的使用，但是共价系链的使用也是可能的。例如，核酸寡聚物延伸和连接测定也可以被用来共价地连接特异性地形成的系链。也可以采用本领域已知的其他酶促、化学或者光化学连接机制。
筛查分子文库
在该实施方式中，图18A至18B的测定法例如被用来筛查分子文库。分子文库常常使用联合化学方法(即用于配体)或者以诸如购买物质文库等其他方法生成。因此，文库可以含有小分子(例如潜在的药物前导物(drug lead))、生物学分子或者带有编码信息的潜在配体的偶联物(例如在珠子上的DNA编码小分子文库或者抗体的酵母展示文库)。
可以以空间解析方式使用分子文库，在这种情况中，定位(例如基底200上的斑块或者捕获表面区域210等，或者孔板或者微滴定盒的特定的孔)揭示何种物质产生阳性信号。
在一个实施方式中，将物质文库结合至颗粒，然后将颗粒混合在一起。于是将存在大量的颗粒，其中每个颗粒包被有取自具有数以千计的化合物的文库的单个化合物。将颗粒混合物在一起以使得有可能一次对数千个化合物进行单次实验，而不是对单个化合物进行数千次实验。
在实验结束时，为了鉴定何种物质引起结合(或者在一些情况中，阻止结合)，进行如下步骤：
(a)使用本发明的装置和方法测量结合(或者未结合)的颗粒(即，使用显微装置10确定颗粒的结合)；
(b)使用已知的技术如微型吸移管、磁性珠子操作或者光学陷捕系统等提取那些感兴趣的颗粒(即，其包被有感兴趣的物质的颗粒)；和
(c)确定包被颗粒的物质的性质(即，如果其是DNA则通过对其进行测序或者通过其他已知方法)以确定哪种物质或者那些物质提供所希望的反应。
可以对具有希望的性质的颗粒进行进一步表征、扩增或者将其用于其他检验。因此，可以鉴定哪种分子对例如诊断检验或者对药物开发具有给定的特异性。
洗涤步骤
由于位置自由度的变化以及所得到的阳性和阴性颗粒的可测量的位置波动的原因，不需要洗涤步骤就可以进行辨别。因此，一般情况下，使用本发明的装置和方法进行的测定不需要洗涤步骤(上文标注了例外情况，其中洗涤步骤是进行探针颗粒的导入的方法的一部分)。
洗涤步骤可以破坏分析物与标靶或者探针与分析物的特异性结合。尽管在常规技术中，标记的未结合部分被洗掉，但是由于在本发明中，标记连接至落在表面上并且可以看到的较大颗粒上，因此在这些实施方式中不需要洗涤步骤。
或者，可以采用比常规测定的严格程度较低的洗涤。如在常规免疫测定中的那样可以洗涤粘附的颗粒，以消除假保留颗粒。在这种情况中，洗涤可以比常规免疫测定所要求的轻柔，因为可以基于本文描述的位置波动的测量结果分辨结合和未结合颗粒。结果，测定数据可以具有高于使用常规技术得到的数据的质量(例如，较高的灵敏度或者动力学范围)。结果，可以得到较强的信号和/或动力学范围。
鉴定传感阵列(I.D.)
上述方法使用的传感阵列200或者其他基底可以包括机器可读取标识符205(例如条形码或者射频识别(RFID)标签)(参见图3)。标识符205可以含有独特的标识符(例如系列号)。可以使用标识符250来查寻(例如从压缩盘、互联网等)与芯片来源、批号、传感阵列200上的捕获表面区域210、211等的特异性、校准曲线、或者其他质量控制数据、机器操作或者分析程序有关的信息。标识符205可以与医疗记录系统中的患者身份和最终的测定结果关联。一些这样的数据还可以直接编码在标识符205上。本发明的其他实施方式(包括本文描述的那些实施方式)还可以使用标识符205来测定溶液中分子。标识符205还可以包括允许定制例如自动化显微装置10的操作的信息。例如，标识符205可以包含传感阵列200上的捕获表面区域210、211、212的坐标、校准数据或者所建议的照射强度等。
如上所述，可以使用各种本领域已知的技术来制得传感阵列200。例如，和本领域已知的那样，可以清洁玻璃质显微镜载玻片200(例如参见图3)并且使用能够结合探针或者探针复合物(即220)的功能性接头310进行硅烷化(还参见Toney Cass和Frances Ligler的“Immobilized Biomolecules in Analysis:APractical Approach”,Oxford University Press,1998，以及微阵列、生物芯片和蛋白阵列领域中的各种公开物，包括美国专利公报2005/0048219，在此通过参引方式将其内容全部引入本文)。
对照捕获表面区域
在根据本发明的另一个实施方式中，可以使用带有多种固定单克隆抗体的捕获表面区域210、211、212来检测两种或者更多种类型的细胞中的一种类型细胞，在该情况中，如果需要的话，将需要至少一个另外的分析步骤来解析细胞类型。一般来说，还可以包括对照和虚设/空白捕获表面区域210、211、212和颗粒来控制质量。
颗粒尺寸
颗粒800的尺寸(例如参见图21)可以选择为增强位置自由度的分析。潜在的结合位点的数量与颗粒的截面积成比例，并且对于盘状(例如RBC)用r2换算，而对于球形颗粒采用线性换算。结果，对于较小的颗粒800，可能需要检查更多数目的颗粒800。使用过小的颗粒800(例如对于给定的颗粒密度)可以减缓沉降，同时降低颗粒800沿着表面的移动。充分的颗粒尺寸和密度可以防止从基底200扩散开，这可以简化位置自由度的分析。因此，在此公开的本发明的实施方式可以具有使用足以获得快速沉降同时具有足以进行快速且准确的分析的迁移率的颗粒尺寸的特征。
系链长度
在根据本发明的一个实施方式中，可以与参照基准(未示出)相关地测量颗粒800的位置。所述基准可以与基底200关联或者与分析显微镜的光学器件关联。
在根据本发明的另一个实施方式中，用以确定位置自由度的颗粒运动可以比系链400的长度大得多。例如，系链400可以在10nm长度级别(例如在2nm至50nm之间)，而受检运动在100nm以上级别。
在根据本发明的又一个实施方式中，位置自由度的检测包括估计系链400的长度和确定细胞220或者颗粒800是否行进大于所述系链长度的距离。可以通过计算机程序过滤来自显微装置10的记录数据以排除小于所述预定阈值距离的行程。例如，所述行程在数据库中可以记录为“事件”。多个这样的事件(例如100至10000个事件)可以记录在数据库中并通过计算机程序进行分析以获得统计学上满意的测量结果。根据系链长度和阈值，利用计算机程序通过观测颗粒1秒至30秒来获得统计学上满意的数据组。
基准值
在根据本发明的另一个实施方式中，如果粘附在捕获表面区域210等上的颗粒(例如RBC220，颗粒800)在预定的一定量的时间之后或者在预定的一定数次的观测之后没有移动超过预定的一定距离，则确定所述颗粒具有存在于其表面上的捕获表面区域210的特异性结合标靶。
而且，如上所述，可以将利用显微装置10测得的颗粒波动与预定的基准值(即，从对照样品上很多轮校准进行统计学确定的基准值)比较，以确定其是否可能对应于结合或者未结合的颗粒。在另一个实施方式中，可以将波动测量集体与来自具有已知特性的基准样品的波动测量结果集体比较。
实验例
以下实施例涉及血液分型(在此进行进一步讨论)。
图12显示了在抗-A抗体包被表面上测量的两个不同样品的归一化标准偏差(“NSD”)(其度量位置自由度)柱状图的图。黑色柱状图是来自对A抗原呈阳性(即A型)的红细胞的测量结果。这些细胞被分散在带有固定抗-A抗体的表面上。红色柱状图是来自对A抗原呈阴性(即B型或者A阴性)的红细胞的测量结果。这些细胞被分散在带有固定抗-A抗体的另一个表面上。对每个细胞的NSD进行作图，标明每个细胞在其处在表面上的同时生成的强度波动的量级，反映了表面上细胞移动的量。
B型细胞(红色柱状图)展示了高的归一化标准偏差值，表明所述细胞自由扩散并且证实红细胞表面上的B型抗原与附接在固体基底(即盖玻片)的抗-A抗体之间没有任何固定化相互作用。A型细胞(黑色柱状图)展示了窄的低归一化标准偏差值的分布，表明这些细胞由于存在在红细胞表面上的A型抗原与附接在固体基底的抗-A抗体之间形成的特异性结合而被固定。这些图清楚地示出了使用NSD测量程序区分特异性结合红细胞(即由于A-抗原/抗-A抗体结合形成)与非结合细胞的能力。因此，这些图还显示了本发明的实施方式针对A-抗原的存在而对红细胞进行正向分型的能力。
在该实施例中，在细胞被分散到样品室之后10分钟至20分钟进行测量，并且采集数据约10秒钟，从而从60帧计算得到像素强度波动(即归一化标准偏差图像)的统计学图像。
图13显示了在抗-B抗体包被的基底表面上测量的两种不同样品(在该情况中，一种具有A型血液(红色柱状图)，另一种具有B型血液(黑色柱状图)的NSD柱状图的图。红色柱状图是来自对B抗原呈阴性(即A型或者B阴性)的红细胞的测量结果。这些细胞被分散在带有固定抗-B抗体的另一个表面上。对每个细胞的NSD进行作图，标明每个细胞在其处在表面上的同时生成的强度波动的量级，反映了表面上细胞移动的量。
A型细胞(红色柱状图)展示了高的NSD值，表明所述细胞自由扩散并且证实红细胞表面上的A型抗原与附接在固体基底(即盖玻片)的抗-B之间没有任何固定化相互作用。另一方面，B型细胞(黑色柱状图)展示了窄的低NSD值的分布，表明这些细胞由于存在在红细胞表面上的B型抗原与附接在固体基底的抗-B之间形成的特异性结合而被固定。这些图清楚地示出了使用NSD测量程序区分特异性结合红细胞(即由于B-抗原/抗-B结合形成)与非结合细胞的能力。因此，该数据显示了本发明的实施方式针对B-抗原的存在而对红细胞进行正向分型的能力。
在该实施例中，在细胞被分散到样品室之后10分钟至20分钟进行测量，并且采集数据约10秒钟，从而从60帧计算得到像素强度波动的统计学图像(即归一化标准偏差图像)。
图14显示了在抗-D抗体包被的基底表面上测量的两种不同样品(一种具有D阴性血液(红色柱状图)，另一种具有D阳性血液(黑色柱状图))的NSD柱状图的图。每种类型的细胞被分散在带有固定抗-D抗体的独立表面上。对每个细胞的NSD进行作图，标明每个细胞在其处在表面上的同时生成的强度波动的量级，并且因此反映了表面上细胞移动的量。
D阴性细胞(红色柱状图)展示了高的NSD值，表明所述细胞是完全自由扩散的，并且证实红细胞表面上的抗原与附接在固体基底(即盖玻片)的抗-D抗体之间没有任何显著的固定化相互作用。D阳性细胞(黑色柱状图)展示了较低的NSD值，表明更多的这些细胞由于存在在红细胞表面上的D阳性型抗原与附接在固体基底的抗-D抗体之间形成的特异性结合而被固定。虽然这些分布确实显示出一些重叠，但是每种分布的平均值仍然明显不同。无论如何，这些图清楚地示出了使用NSD测量程序区分高度特异性结合组的红细胞(即由于D-抗原/抗-D抗体结合形成)与高度非特异性结合组的细胞的能力。因此，该数据展示了本发明的实施方式针对D-抗原的存在而对红细胞全体进行正向分型的能力。
在该实施例中，在细胞被分散到样品室之后10分钟至20分钟进行测量，并且采集数据约10秒钟，从而从60帧计算得到像素强度波动的统计学图像(即归一化标准偏差图像)。
图15A显示了在不同时间针对红细胞样品获得的一系列NSD柱状图。样品由在表面(B抗原在玻璃质盖玻片表面上)上的合成血浆中存在高浓度的抗-A IgM类抗体(100nM)的情况下的A型红细胞组成。通过使用裂解的B型红细胞包被玻璃质盖玻片而制得B抗原表面。该测量配置类似于反向血液分型方法，在反向血液分型方法中，通过检测具有已知类型抗原的表面上的已知类型血细胞之间的结合程度来检测受试者的血浆的天然存在抗体的存在或者不存在。在反向方法中结合的存在指示能够同时结合血细胞和表面由此将它们固定的抗体的存在。
图15A的底部柱状图是在含有100nM抗-A抗体的合成血浆中分散的A型细胞被引导到带有B抗原的表面上之后13分钟测得的。每个柱状图通过分析(细胞NSD计算)以每秒5帧的速度采集的40个图像帧的序列来生成。如可观测的NSD的高平均值所证明的那样，细胞能够扩散。所述细胞在后期也显示了类似的扩散行为，如从在21、29、37、和45分钟时间标记处测得的柱状图的相似性可以看出的那样。
图15B显示了在类似于图15A的条件下的时间系列柱状图，不同的是通过使用裂解的A型红细胞制备表面，使得其被制备为在上面具有A型抗原(不同于图15A中的B型抗原表面测量)。选择高浓度的抗-A抗体(100nM)以确保A细胞结合至A型表面(如可视化证实的那样)。
在细胞被引导到表面上之后14分钟获得的第一个测定柱状图(底部柱状图)显示细胞被固定(低的平均NSD和窄的宽度)。在后期，细胞还保持结合，如在22、30、38和46分钟处测量的类似NSD柱状图所见到的。图15A和图15B的柱状图的比较让本发明人选择NSD阈值以确定细胞是否结合。在这些条件下7%的阈值是合适的，其中图15A的未结合群体中的大部分细胞高于该阈值，而图15B的结合群体中的大部分细胞低于该阈值。
图16A和16B类似于图15A和15B中测量的条件，不同的是使用浓度低得多的抗体；在合成血浆中存在的抗-A抗体只有1nM。在图16A中，NSD测量程序指示，含有分散在B型表面上的1nM抗-A抗体的合成血浆中的A型细胞大部分在样品被引导到表面上之后19分钟时的首次测量中没有结合。在25、31、37、43、49和55分钟标记处的随后测量显示类似的行为。
在图16B中，在含有1nM抗-A抗体的合成血浆中的A型细胞在被引导到带有A型抗原的表面上之后进行测量。在18分钟之后，可以检测到比在图16A中测得的对照组细胞(即未结合细胞)稍高的NSD低的细胞级分。这种低NSD级分随时间的推移量级增加，如通过柱状图中渐次向左偏移所能看到的。抗-A的1nM的低浓度降低了在细胞和表面之间发生结合的速度，相比而言，在使用100nM抗-A抗体时，细胞和表面之间的结合相互作用要快得多(参见图15B，其中发现实际上所有细胞在14分钟内结合)。
总而言之，图15A、15B、16A和16B展示了使用在抗原包被表面上的红细胞的NSD测量可以在血浆溶液中检测到抗体浓度的范围。
本发明的另外一些实施方式基于这样的发现，即，对于至少一些探针类型，沉降颗粒发生非特异性结合的速度比特异性结合快。结果发现可以基于颗粒沉降之后的早期时间点测量位置波动信号。可以从基于后期时间点的位置波动测量结果减去这种早期位置波动。
换言之，位置波动的计算可以包括这样的步骤，在该步骤中，操作计算机程序以计算与颗粒位置的时间演化相关的量度，并任选地针对非特异性结合进行校正，其中非特异性结合发生的动力学时间常数大于非特异性结合的时间常数。如上所述，这可以通过曲线拟合或者动力学或者分子阵列技术领域中已知的其他算法来进行。
至此，应当强调的是，本发明的上述实施方式仅仅是为清楚理解本发明的原理而给出的一些可能的实施例。在不偏离本发明的精神和原理的情况下可以对本发明的上述实施方式进行多种改变和改进。所有这些改进和改变在此拟被包括在本发明的范围内并且通过如下特征进行保护。

Claims (48)

1.一种测量溶液中的颗粒和表面之间的结合程度的方法，所述方法包括：
使用成像装置对样品保持器中的流体中的多个颗粒进行成像；
其中，所述样品保持器包括样品室，所述样品室具有与所述颗粒相互作用的至少一个捕获表面区域；并且
测量至少一些所述颗粒的位置自由度作为所述颗粒与所述至少一个捕获表面区域的结合的程度的量度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法进一步包括：
在来自所述成像装置的的照射源的照射下，将所述多个颗粒悬浮在所述样品室中的所述流体中；
其中所述样品保持器是流式设备的一部分。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法进一步包括：
对所述流体中的所述颗粒使用激励机构。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述方法进一步包括：
使用所述激励机构在测量所述位置自由度的过程中移动所述样品室中的所述流体。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法进一步包括：
利用基于重力的系统、基于离心的系统、基于流动的系统、基于扩散的系统、基于磁性的系统、或者全息光学钳镊系统，使所述样品室中的所述颗粒沉降。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个捕获表面区域结合至能够形成复合物的探针。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法进一步包括：
使用所述处理器确定每个所述颗粒的位置自由度，以确定分析物的存在、不存在或数量。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述成像装置是光学显微装置，包括全息成像装置。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述方法进一步包括：
使用来自所述光学显微装置的照相机采集所述颗粒的时间系列图像，以确定所述位置自由度；和
使用所述处理器分析所述图像。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述位置自由度的所述确定通过使用所述处理器测量由所述至少一个捕获表面区域的预定邻域内的至少一个所述颗粒散射的光的变化预定的时间来进行。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述位置自由度是描述所述预定邻域中的所述至少一个所述颗粒的时间依赖性位置演化的统计学量度，并且表达为方差、标准偏差、均方根(RMS)行程、或者颗粒位置与时间系列观测结果关联的自动关联函数。
12.根据权利要求10所述的方法，其中，所述至少一个捕获表面区域的所述邻域是围绕所述颗粒中运动被观测的一个已知颗粒的位置的预定区界。
13.根据权利要求11所述的方法，其中，所述位置自由度是使用所述处理器通过如下方式进行确定：计算所述颗粒的多个采集图像的平均值，计算所述颗粒的连续图像帧之间的平均差异，并且计算所述图像的整个时间序列的像素级强度变化。
14.根据权利要求11所述的方法，其中，使用所述处理器，针对从中获得每个所述颗粒的结合程度的分布和位置自由度的分布的每个所述颗粒，计算像素强度值的统计学分布的分析。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述方法进一步包括：
使用所述处理器计算所述颗粒的位置自由度分布。
16.根据权利要求1所述的方法，其中，所述颗粒是血细胞。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述血细胞是红细胞，并且对所述红细胞进行正向分型，其中所述红细胞含有特异性抗原，所述特异性抗原与含有特异性抗体的捕获表面区域结合。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述血细胞是红细胞，并且对血浆或血清样品中的一种进行反向分组，其中所述红细胞之一含有或者缺乏特异性的血型抗原，所述特异性的血型抗原能够与标靶抗体结合，所述标靶抗体连接至放置在所述捕获表面区域上的红细胞的抗原。
19.根据权利要求16所述的方法，其中，其中所述颗粒被扁平化。
20.根据权利要求18所述的方法，其中，所述颗粒是分析物，并且被实施检测或测量中的一种的所述分析物是抗体。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，其中进行抗体筛查。
22.根据权利要求17所述的方法，其中，其中进行传染性疾病筛查。
23.根据权利要求17所述的方法，其中，进行针对分子文库的筛查。
24.一种用于检测颗粒的位置自由度的装置，所述装置包括：
成像装置，所述成像装置包括显微镜；
透明样品保持器，所述透明样品保持器具有样品室，颗粒样品被放置在所述透明样品保持器上；
检测机构，所述检测机构用于使用所述成像装置检测被放置在所述样品室中的所述颗粒的位置自由度。
25.根据权利要求24所述的装置，其中，所述样品保持器是具有入口和出口的自动流式设备的样品室。
26.根据权利要求24所述的装置，其中，所述样品保持器包括布置在所述样品保持器上的至少一个捕获表面区域。
27.根据权利要求24所述的装置，其中，所述传感阵列结合至所述样品保持器的下表面，并且使用用于具体用途的适当的化学方式处理所述传感阵列。
28.根据权利要求24所述的装置，
其中，所述样品保持器形成孔板的一部分，所述样品保持器在其中央具有用于所述样品室的开口；
其中，基底结合在所述样品保持器的下表面上；并且
其中，使用用于具体用途的适当的化学方式处理所述基底。
29.根据权利要求25所述的装置，其中，所述自动流式设备具有定制构造，包括光学透明盖、样品输送区、样品观察区、密封衬垫和溢流槽中的至少一种。
30.根据权利要求24所述的装置，其中，所述颗粒是红细胞。
31.根据权利要求25所述的装置，其中，所述自动流式设备是微流体盒，并且所述样品室包括：
顶层，所述顶层具有用于所述入口和所述出口的两个开口；
底层，在所述底层具有通道的图案，并且所述底层结合至所述顶层；和
基底，在所述基底上带有适当的化学物质，并且所述基底结合至所述底层的下表面；
其中所述底层的所述通道进入所述样品室；并且
其中，含有所述样品的流体通过所述入口进入所述样品室并通过所述出口。
32.根据权利要求31所述的装置，其中，所述微流体盒包括在所述基底上的多个区域，所述多个区域被功能化为用于结合的捕获表面区域。
33.根据权利要求32所述的装置，其中，所述微流体盒与数据采集和分析兼容。
34.根据权利要求33所述的装置，其中，所述微流体盒与用于所述样品的自动化和并行流体输送的机器人机床一体形成。
35.根据权利要求24所述的装置，其中，所述装置进一步包括：
泵，所述泵包括相对较高的和相对较低的压力源；和
至少一个电磁阀，所述至少一个电磁阀以预定的频率或预定的速度中的一种向所述样品室中的所述样品产生至少一个串行流。
36.根据权利要求24所述的装置，其中，所述装置进一步包括：
压电-液压致动器，所述压电-液压致动器以预定的频率和振幅向所述颗粒产生振荡流。
37.根据权利要求24所述的装置，其中，所述装置进一步包括：
隔膜，所述隔膜由液压油或气体介质激励。
38.根据权利要求24所述的装置，其中，所述装置进一步包括：
平移平台插件，所述平移台插件附接至所述致动器，将控制信号转换为所述插件的振荡运动。
39.根据权利要求24所述的装置，其中，所述装置进一步包括：
阀调/摄动设备，所述阀调/摄动设备使所述样品中的所述颗粒流动通过所述微流体盒，所述微流体盒包括由所述阀调/摄动设备驱动的芯片上隔膜。
40.根据权利要求24所述的装置，其中，所述装置进一步包括：
热致动器，所述热致动器包括加热元件、隔膜和之间密封的气体材料。
41.根据权利要求24所述的装置，其中，所述装置进一步包括：
声源，所述声源传播声波通过所述样品室。
42.根据权利要求28所述的装置，其中，所述装置进一步包括：
孔室盖激励结构，所述孔室盖激励机构使所述孔室盖横跨所述微流体盒的孔室来回滑动。
43.根据权利要求24所述的装置，其中，所述装置进一步包括：
离心机，所述离心机使所述样品室旋转以使其中的所述颗粒沉降。
44.根据权利要求24所述的装置，其中，所述装置进一步包括：
流式机构，所述流式机构使所述样品横跨所述样品室的所述表面流动。
45.根据权利要求24所述的装置，其中，所述成像装置是捕获所述颗粒并使所述颗粒移动通过所述样品室的全息光学钳镊系统。
46.根据权利要求24所述的装置，其中，所述装置进一步包括：
热控制机构，所述热控制机构使所述样品保持器和任何结合颗粒的温度保持在指定的范围内。
47.用于免疫诊断的自动化装置，所述自动化装置包括：
用于容纳免疫诊断学用一次性盒的多个区域；
用于多个管架的区域；
吸移站；
插入式液体盒区域；
照射区域，检测在所述照射区域中进行；和
读取器，所述读取器用于读取检测结果；和
用于全自动操作所述装置的单元。
48.根据权利要求47所述的自动化装置，其中，所述自动化装置进一步包括：
静态过滤部件或非静态过滤部件中的一种。
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