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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Immunoassay ist ein eingeführtes biospezifisches
Assayverfahren, das in großem
Umfang in der Routinediagnostik und in Forschungslabors eingesetzt
wird. Eine andere Gruppe biospezifischer Assays sind DNA- und RNA-Hybridisierungsasssays.
In biospezifischen Assays werden üblicherweise zwei biospezifische
Sonden, eine primäre
Sonde und eine sekundäre
Sonde (d. h. ein Antikörper,
DNA- oder RNA-Sonde), verwendet. Sie werden beide an die spezifischen
Determinanten der Analytenmoleküle gebunden
und bilden einen Komplex aus drei Molekülen (Sandwich-Struktur). Normalerweise
ist eines dieser zwei Reagenzien markiert. Heutzutage sind üblicherweise
verwendete Markierungen Radioisotope, Enzyme, lumineszierende und
fluoreszierende Markierungen. Das gängigste Probenmaterial, das analysiert
wird, ist Blutserum.
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Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung
bezieht sich auf solche fluorometrischen biospezifischen Assays,
in denen ein biospezifisches Reagenz an Mikropartikel angeheftet
ist, die als feste Matrix dienen. Die feste Matrix mit den angehefteten (beziehungsweise
gebundenen) Komponenten wird später
als die feste Phase bezeichnet. Das zweite biospezifische Reagenz
ist mit einer fluoreszierenden Markierung markiert und wird später einfach
als Markierung bezeichnet. Bezüglich
ihrer Funktionsprinzipien können
Assays in zwei Hauptgruppen unterteilt werden: 1) Assays, die überschüssiges Reagenz
an eine feste Phase gebunden haben, die in der Immunologie als immunometrische
Assays bezeichnet werden, und 2) Assays, die eine begrenzte Menge
an Reagenz an eine feste Phase gebunden haben. Diese werden als
kompetitive Assays bezeichnet.
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Der erste Typ ist für das Analytenmolekül Ag anwendbar,
das mindestens zwei spezifische Determinanten bereitstellen kann.
In diesem Assaytyp übersteigt
die Anfangskonzentration des biospezifischen Reagenzes Ab, das an
die feste Phase gebunden ist, die Menge des Analyten Ag. Das andere
Reagenz in der Reaktion ist das markierte Reagenz Ab*. Komplexe
AbAgAb* werden an die feste Phase gebunden und die Signalantwort
des Assays ist linear. DNA- und RNA-Assays werden auch nach demselben
Prinzip durchgeführt.
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Der zweite Typ ist auf kleine Analytenmoleküle Ag anwendbar.
In diesem Assay liegt das biospezifische Reagenz Ab, das an die
feste Phase A gebunden ist, in einer begrenzten Konzentration bezüglich des
Analyten vor. Das andere Reagenz in der Reaktion ist das markierte
Analytenmolekül
Ag*, das heißt,
das markierte Analytenmolekül
wird als Reagenz verwendet. Die Komponenten Ag und Ag* binden im
Verhältnis
ihrer relativen Konzentrationen an das Festphasenreagenz Ab. Diese
Reaktion ist als kompetitive Bindungsreaktion bekannt und die Signalantwort
dieses Assaytyps ist nicht-linear.
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Das Verfahren ist außer auf
diese zwei Hauptgruppen anwendbar, um die Reaktionskinetik zwischen
verschiedenen Biomolekülen
Ab und Ab* zu untersuchen, das heißt um die Bildung von Reaktionsprodukten
als Funktion der Zeit zu überwachen. Bei
diesen Untersuchungen überwachen
wir einfach, wie das markierte Molekül Ab* an das Festphasenmolekül Ab bindet.
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Die vorstehend verwendeten Symbole
Ab, Ag und Ab* beziehen sich hier auf biospezifische Moleküle im Allgemeinen
und sind nicht auf immunologische Antikörper und Antigene beschränkt.
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Das Problem bei herkömmlichen
Assays und Forschungsverfahren liegt in ihrer Komplexität. Zum Beispiel
erfordert die Bestimmung von Hormonen aus Blut mit einem fluorometrischen
im munometrischen Assayverfahren oft mehrere Stufen: Abtrennung von
Zellen aus dem Serum, Verteilung und Verdünnung der Serumprobe, Inkubation
mit der festen Phase, Abtrennung der freien Fraktion durch Waschen,
Inkubation mit der Markierung, Abtrennung der freien Markierung
durch Waschen, Zusatz einer Messlösung und Messen des Signals.
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Eine Abtrennung von Zellen aus dem
Serum ist notwendig, da die starke Lichtabsorption von Hämoglobin
in herkömmlichen
fluorometrischen Assays die Messungen beeinträchtigt. Im oben genannten ersten
Assaytyp müssen
die Reagenzien in zwei getrennten Phasen zugesetzt werden, was eine
Abtrennung der freien Fraktion von der gebundenen Fraktion zwischen
diesen Schritten einschließt;
andernfalls ist die Assayantwort (d. h. die Konzentration des Produktes
AbAgAb*) verringert, wenn die Analytenkonzentration die Bindungskapazität der festen
Phase übersteigt.
Dieses gefährliche
Phänomen
tritt nur auf, wenn alle Assaykomponenten gleichzeitig zugesetzt werden
und es wird in der Literatur als "Hook-Effekt" bezeichnet. Die freie
Markierung muss auch abgetrennt werden; andernfalls kann das Signal
aus der gebundenen Markierung nicht gemessen werden, da das hohe
Hintergrundsignal von der freien Markierung beigesteuert wird.
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Es besteht ein ständiger Bedarf für einfachere
und kostengünstigere
Analysen bei der Routinediagnostik. Das neue biospezifische Assayverfahren der
vorliegenden Erfindung, das fluoreszierende Markierungen verwendet,
beinhaltet nur eine Stufe und erfordert keine Abtrennung der Markierung
und ist insbesondere für
Assays bei Vollblut oder bei anderen biologischen Suspensionen geeignet.
Außerdem
macht die vorliegende Erfindung es möglich, Echtzeit-Messungen der
Bioaffinitätsreaktionskinetik durchzuführen.
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Zwei-Photonen-Anregung
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Eine Zwei-Photonen-Anregung wird
erzeugt, wenn die Dichte von Photonen pro Volumeneinheit und pro
Zeiteinheit durch Fokussieren einer intensiven Lichtquelle hoch
genug wird, damit zwei Photonen in demselben Chromophor absorbiert
werden. In diesem Fall ist die absorbierte Energie die Summe der
Energien der zwei Photonen. Nach dem Wahrscheinlichkeitskonzept
ist die Absorption eines einzelnen Photons in einem Farbstoff ein
unabhängiges Event
und ist die Absorption mehrerer Photonen eine Reihe von einzelnen
unabhängigen
Events. Die Absorptionswahrscheinlichkeit eines einzelnen Photons kann
als lineare Funktion beschrieben werden, solange die Energiezustände, die
angeregt werden sollen, nicht gesättigt sind. Die Absorption
von zwei Photonen ist ein nicht-linearer Prozess. Bei der Zwei-Photonen-Anregung
werden Farbstoffmoleküle nur
angeregt, wenn beide Photonen gleichzeitig absorbiert werden. Die
Absorptionswahrscheinlichkeit von zwei Photonen ist gleich dem Wahrscheinlichkeitsprodukt
der Absorptionsverteilungen der einzelnen Photonen. Die Emission
von zwei Photonen ist demnach ein quadratischer Prozess.
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Die Eigenschaften des optischen Systems, das
zur Fluoreszenzanregung verwendet wird, können mit der Reaktion des Systems
auf eine punktartige Lichtquelle beschrieben werden. Eine punktartige
Lichtquelle bildet in Folge von Diffraktion eine Intensitätsverteilung
in der Brennebene, die für
das optische System charakteristisch ist (Punktausbreitungsfunktion).
Bei Normalisierung ist diese Punktausbreitungsfunktion die Wahrscheinlichkeitsverteilung,
mit der die Photonen aus der Lichtquelle den Brennbereich (bzw.
fokalen Bereich) erreichen. Bei der Zwei-Photonen-Anregung entspricht
die Verteilungswahrscheinlichkeit der Anregung dem normalisierten
Produkt der Intensitätsverteilungen
der zwei Photonen. Die so abgeleitete Wahrscheinlichkeitsverteilung
ist insbesondere in vertikaler Richtung dreidimensional und ist
deutlich weiter eingeschränkt als
für ein
einzelnes Photon. So wird bei der Zwei-Photonen-Anregung nur die
Fluoreszenz angeregt, die in der deutlich eingeschränkten dreidimensionalen
Nachbarschaft des Brennpunktes gebildet wird.
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Wenn ein Farbstoff Zwei-Photonen-angeregt wird,
wird die Lichtstreuung in der Nachbarschaft des Brennpunktes und
die von den optischen Komponenten im Vergleich zur normalen Anregung
deutlich verringert. Darüber
hinaus verringert die Zwei-Photonen-Anregung
die Hintergrundfluoreszenz außerhalb des
Brennpunktes, in der Umgebung der Probe und im optischen System.
Da der Anregungslichtstrahl auf einen möglichst kleinen Punkt fokussiert
werden muss, ist die Zwei-Photonen-Anregung für die Betrachtung kleiner Probenvolumina
und -strukturen am besten geeignet, was auch bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
der Fall ist.
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Der Vorteil einer Zwei-Photonen-Anregung basiert
auch auf der Tatsache, dass sichtbares Licht oder Licht des nahen
Infrarot (NIR) zum Beispiel zur Anregung im ultravioletten Bereich
oder blauen Bereich verwendet werden kann. In gleicher Weise kann eine
Anregung im sichtbaren Bereich durch NIR-Licht erreicht werden.
Da die Wellenlänge
der Lichtquelle beträchtlich
länger
als die Emissionswellenlänge
des Farbstoffs ist, können
die Streuung bei einer Wellenlänge
der Lichtquelle und die mögliche
Autofluoreszenz durch Verwendung von Tiefpassfiltern (Abschwächung um
mindestens 10 Größenordnungen) wirksam
abgeschwächt
werden, um zu verhindern, dass sie den Detektor erreichen.
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Da bei der Zwei-Photonen-Anregung
die Photonendichte pro Volumeneinheit und pro Zeiteinheit sehr hoch
sein muss, damit zwei Photonen in denselben Chromophor absorbiert
werden, ist es nützlich,
Laser zu verwenden, die kurze Pulse mit hoher Wiederholungsfrequenz
erzeugen. Ein für
die Zwei-Photonen-Anregung
verwendbarer Laser ist zum Beispiel ein passiv gütegesteuerter Nd:YAG-Laser
mit einer Pulslänge
von 1 ns.
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EP
0 723 146 offenbart Verfahren, Zusammensetzungen und eine
Apparatur zur Durchführung einer
empfindlichen Detektion von Analyten, zum Beispiel biologischen
Makromolekülen
und anderen Analyten, durch Markierung eines Sondenmoleküls mit einer
nach oben konvertierenden Markierung, einschließlich Sandwichbindungsassays,
die Magnetperlen verwenden, welche als festes Substrat dienen.
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WO 94/16313 offenbart ein Verfahren
zur Identifizierung eines Moleküls
oder einer geringen Anzahl von Molekülen, insbesondere bei einer
Verdünnung
von ≤ 1 μM unter Verwendung
einer laserstimulierten Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie bei
Messzeiten von ≤ 500
ms und kurzen Diffusionswegen für
die zu analysierenden Moleküle;
die Messung wird dabei vorzugsweise an geringen Volumina von knapp ≤ 10–14 Liter
durchgeführt,
um Parameter zu messen, die für
das Material spezifisch sind und die durch Lumineszenzmessungen
an den zu untersuchenden Molekülen
bestimmt werden können.
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WO 96/22521 offenbart eine fluorometrische Strömungsvorrichtung
und ein Verfahren, das eine Zwei-Photonen-Anregung und/oder ein
konfokales optisches System verwendet. Das optische System ist für die Zählung kleiner
fluoreszierender biologischer Partikel optimal.
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AUFGABE DER
VORLIEGENDEN ERFINDUNG UND ZUSAMMENFASSUNG
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Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung
betrifft ein verbessertes biospezifisches Assayverfahren und eine
Vorrichtung, die Mikropartikel als feste Phase verwenden. Eine andere
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Verbesserung des mul tiparametrischen
Verfahrens und der entsprechenden Vorrichtung, wie sie von den Erfindern
in der internationalen Patentpublikation WO 96/22531 beschrieben
sind. Im erfindungsgemäßen Verfahren
wird das biospezifische Reagenz mit einer fluoreszierenden Markierung
markiert. Die Fluoreszenzanregung basiert auf einer Zwei-Photonen-Anregung.
Da eine Zwei-Photonen-Anregung
auf ein Diffraktions-begrenztes fokales Volumen beschränkt ist,
passt nur ein Mikropartikel auf ein Mal in das Zwei-Photonen-angeregte
fokale Volumen und die freien Markierungen außerhalb des fokalen Volumens
tragen zu keinem signifikanten Hintergrundsignal bei.
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Das Verfahren und die Vorrichtung,
auf die oben Bezug genommen wird und die in der Patentpublikation
WO 96/22531 beschrieben ist, ermöglicht einen
trennungsfreien Assay für
sehr kleine Probenvolumina, allerdings erfordert der methodologische und
instrumentale Aufbau des Assaysystems in der präsentierten Form ein kompliziertes
Mikrofluidsystem. Die Aufgabe dieser Erfindung besteht weiterhin in
der Verbesserung dieses Verfahrens und der Vorrichtung. Um das Verfahren
und die Vorrichtung einfacher und kosteneffektiver zu machen, betrifft
die Erfindung der vorliegenden Erfindung die folgenden Aufbauanforderungen:
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- 1) Wegen des wachsenden Interesses eine zentrifugale Trennung
des Blutserums zu vermeiden, wird der mit Vollblut oder anderen
Zellsuspensionen ohne Abtrennung der Zellen durchgeführte Assay
wirksamer.
- 2) Eine Vereinfachung des Flüssigkeitshandhabungssystems
reduziert die Systemkosten stark.
- 3) Diagnostische Konzentrationen bestimmter Analyten decken
einen sehr großen
dynamischen Bereich ab. Außerdem
sollte ein Multiparameter-Assaysystem eine gleichzeitige Messung
ver schiedener Analyten ermöglichen – ein Analyt,
der seine klinischen Referenzkonzentrationen am unteren Ende hat,
und ein anderer Analyt, der seine klinischen Referenzkonzentrationen
am oberen Ende hat. Folglich hat der benötigte gesamte dynamische Bereich
mehrere Größenordnungen.
- 4) Der Assay sollte schnell sein. Dies bedeutet, dass die Mikropartikel
mit hoher Geschwindigkeit gemessen werden sollten und das Signal,
das von jedem Partikel erhalten wird, sollte ausreichend hoch sein.
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Der entscheidende Punkt des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist der, dass der Assay in einfacher Weise durchgeführt werden
kann, indem der Laserstrahl direkt auf die Reaktionssuspension fokussiert
wird und die Bildung der Komplexe an der Oberfläche der Mikroteilchen ohne
die Notwendigkeit komplizierter Flüssigkeits-Handhabungs- und
Strömungssysteme überwacht
werden kann. Die vorliegende Erfindung führt zu einer deutlichen methodologischen
Vereinfachung, ermöglicht
aber viele andere nützliche
Merkmale, die den oben definierten Assayanforderungen entsprechen,
und die in diesem Text später
diskutiert werden.
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Die wesentlichen Merkmale der vorliegenden
Erfindung werden in den Ansprüchen
dargelegt.
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Das Verfahren der vorliegenden Erfindung betrifft
die Messung des Endpunkts und die Überwachung der Echtzeit-Kinetik
einer Bioaffinitätsreaktion in
biologischen Flüssigkeiten
oder Suspensionen. Das Verfahren verwendet Mikropartikel als Bioaffinität-bindende
feste Phase, an die ein erstes biospezifisches Reagenz gebunden
ist, ein biospezifisches zweites Reagenz, das mit einem fluoreszierenden Molekül oder einem
fluoreszierenden Nanopartikel markiert ist, und ein Fluoreszenzdetektionssystem, das
auf einer Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Anregung basiert. Die Mikropartikel
werden gleichzeitig mit dem Analyten und dem markierten zweiten
Reagenz im Reaktionsvolumen in Kontakt gebracht, es wird eine Bildung
der Reaktionsprodukte der Komponenten initiiert. Zum Erhalt eines
Signals, das zur Analytenkonzentration in Relation steht, wird ein
Zwei-Photonen-Anregungs-Laserstrahl
in die Reaktionssuspension fokussiert und die Fluoreszenzemission
wird von den einzelnen Mikropartikeln gemessen, wenn sie zufallsverteilt
durch das fokale Volumen des Laserstrahls flotieren.
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Die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
benötigte
Vorrichtung führt
eine Messung des Endpunkts durch oder überwacht die Echtzeit-Kinetik
der Bioaffinitätsreaktion.
Die Vorrichtung umfasst ein Mittel zur Erzeugung eines Zwei-Photonen-Anregungs-Laserstrahls,
der zur Messung der Fluoreszenzemission aus den einzelnen Mikropartikeln,
wenn sie zufallsverteilt durch das fokale Volumen des Laserstrahls
flotieren, fokussiert werden kann.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Bevorzugte Ausführungsformen
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Die Effizienz der Messung kann durch
aktive Auffangtechniken verbessert werden, was bedeutet, das die
Mikropartikel für
den Zeitraum der Fluoreszenzdetektion mit einer optischen Falle
eingefangen werden, was vorzugsweise mit demselben Laserstrahl durchgeführt wird,
wie er zur Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Anregung
verwendet wird.
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Der Arbeitszyklus des Auffangens
kann durch einen mechanischen oder optischen Scanner verbessert
werden, der die Probe, die die Mikropartikel enthält, in Relation
zum Brennpunkt bewegt; die Scannerbewegung kann durch ein Signal,
das von einem konfokalen Detektor erhalten wird, welcher die Licht- streuung oder -reflektion
von den. Mikropartikeln misst, kontrolliert werden und für den Zeitraum der
Messung der Fluoreszenzemission wird die Abtastgeschwindigkeit reduziert.
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Das erfindungsgemäße Verfahren betrifft die Verbesserung
des dynamischen Bereichs des Assays durch Durchführung der folgenden Stufen:
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- – Während des
Anfangszeitraums, der Reaktion, bevor sich die Reaktion einem Gleichgewicht
nähert, wird
ein Parameter g, der die Signal-Wachstumsgeschwindigkeit angibt
zu einem Zeitpunkt oder zu verschiedenen Zeitpunkten oder innerhalb
eines Zeitraums, aufgezeichnet, und
- – die
Signalantwort R des markierten Reaktionsproduktes wird am Endpunkt
der Reaktion gemessen, und
- – die
Konzentration p des Analyten P wird auf der Basis der Standardkurve
p = P(R) oder p = P(g) bestimmt, wenn die Konzentration des Analyten
niedriger beziehungsweise höher
als die Konzentration des primären
Reagenzes ist. Die Wachstumsrate der Signalintensität wird bestimmt,
indem eine Polynomfunktion für
die Kurve der Signalintensität,
gemessen als Funktion der Zeit, angepasst wird; und die Konzentration
des Analyten p wird aus den Koeffizienten der Polynomfunktion bestimmt.
Wenn die angepasste Funktion erster Ordnung ist, wird die Konzentration des
Analyten aus der Steigung der Funktion bestimmt .
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Nach einer bevorzugten Ausführungsform umfasst
die Vorrichtung eine Objektivlinse und einen Laser, der durch diese
Objektivlinse in das Reaktionsvolumen fokussiert werden kann, zur
Durchführung
eines optischen Auffangens der Mikropartikel; die Laserleistung
und die numerische Öffnung
der Objektivlinse wurden zur Durchführung des optischen Auffangens
in nerhalb des fokalen Volumens der Zwei-Photonen-Anregung optimiert.
Die Vorrichtung kann einen mechanischen oder optischen Scanner eingebaut
haben, der durch ein Trigger-Signal gesteuert wird, das aus einem
Lichtstreuungsdetektor erhalten wird, um die Probe, die die Mikropartikel enthält, in Relation
zum Brennpunkt zu bewegen; sie kann auch ein Kontrollsystem zur
Verringerung der Abtastgeschwindigkeit für den Zeitraum der Fluoreszenzdetektion
eingebaut haben. Der Lichtstreuungsdetektor ist mit dem Laserstrahl
konfokal. Die Vorrichtung kann ein flaches dünnes Substrat, zum Beispiel eine
Kunststofffolie, eingearbeitet haben, auf das die Reaktionskomponenten
verteilt werden, und das Material des Substrats kann aus einem hydrophoben Material
ausgewählt
werden, das es ermöglicht,
dass die Oberflächenspannung
der Flüssigkeit
das Reaktionsvolumen in Form eines Tröpfchens hält.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann wie folgt
durchgeführt
werden:
Die Probe, die den zu bestimmenden Analyten enthält, und
das biospezifische markierte Reagenz werden gleichzeitig mit den
Mikropartikeln, die mit dem biospezifischen Reagenz überzogen
sind, in Kontakt gebracht. In Folge der Bioaffinität werden
Komplexe, die aus dem Analyten und dem markierten biospezifischen
Reagenz bestehen, an die feste Phase an der Oberfläche der
Mikropartikel gebunden. Die Komponenten der Reaktionssuspension
werden auf der Oberfläche
eines dünnen
transparenten Substrats verteilt, was es ermöglicht, dass ein Lichtstrahl
aus einem gepulsten Laser des nahen Infrarots (NIR-Laser) durch
das Substrat in die Reaktionssuspension fokussiert wird. Das Volumen
der Reaktionssuspension ist klein genug, z. B. 1 μl, um das
Reaktionsvolumen als Tröpfchen
auf der flachen Oberfläche
oder in einer flachen Vertiefung zu halten.
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Da das fokale Volumen des Laserstrahls durch
Diffraktion beschränkt
ist, wird der Laserstrahl zu einer Zeit nur auf ein einzelnes Mikropartikel
fokussiert. Durch Bewegungen der Suspension bewegen sich die Mikropartikel
zufallsverteilt in das fokale Volumen und heraus. Die Markierung
an der Oberfläche
jedes Mikropartikels, das in das fokale Volumen flotiert, wird durch
Zwei-Photonen-Absorptionen angeregt und seine Fluoreszenzemission
wird mit einem Photonendetektor gemessen. Das Signal, das in Relation
zur Photonenzählrate
(photon count rate) steht und das aus dem Detektor erhalten wird,
hängt von
der Reaktionsgeschwindigkeit und der Konzentration des interessierenden
Analyten ab. Indem das Signalwachstum verfolgt wird, ist es möglich, Informationen über kinetische
Reaktionsparameter und die Analytenkonzentration zu erhalten, bevor
die Reaktion ein Gleichgewicht erreicht hat.
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Direkte Messung
einer Komplexbildung im Reaktionsvolumen
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Die Verwendung von monodispersen
Mikropartikeln als feste Phase in diesem biospezifischen Assay stellt
eine schnelle Bioaffinitätsreaktion
sicher. Da in der Reaktion, die an der Oberfläche der Mikropartikel abläuft, der
durchschnittliche Abstand zwischen den Reaktionskomponenten sehr
klein ist, wird das Reaktionsgleichgewicht schnell erreicht. Monodisperse
sphärische
Mikropartikel mit einem Durchmesser von 0,01 bis 100 μm können aus
geeignetem Polymer, Glas und anderem optisch transparentem Material
hergestellt werden, so dass sie für Wassersuspensionen gut geeignet
sind. Geeignete Oberflächeneigenschaften
können
zur Bindung von Makromolekülen
durch physikalische Adsorption wie auch durch kovalente Kopplung
bereitgestellt werden.
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Die Mikropartikel, die als feste
Phase der biospezifischen Reaktion fungieren, sind in einer kontinuierlichen
statistischen (beziehungsweise zufallsverteilten) Bewegung in der
Suspension, die die Probe und das Reagenz enthält. Diese Bewegung, Diffusion
genannt, wird durch thermische Schwingungs kräfte verursacht. Als Folge der
Diffusion flotieren die Partikel zufallsverteilt durch das fokale
Zwei-Photonen-Anregungsvolumen
und es wird ein Signal aufgezeichnet, das proportional zur Menge
der fluoreszierenden Markierung an der Oberfläche des Mikropartikels ist.
Die Dauer des Fluoreszenzsignals hängt von der Übergangszeit
ab, das heißt
von der Zeit, die ein Mikropartikel im fokalen Volumen bleibt. Die
erwartete Dauer der Übergangszeit
für 3 μm-Partikel, errechnet
auf der Basis der Diffusionstheorie, liegt in der Größen-ordnung von einer
Millisekunde.
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Wir haben allerdings beobachtet,
dass, wenn die Mikropartikel durch die freie Diffusion zufallsverteilt
durch das fokale Volumen flotieren gelassen werden, die Übergangszeit
in der Größenordnung
von 300 ms für
3 μm-Partikel
sein kann. Dies führte
zu der Entdeckung, dass der starke Laserstrahl, der für eine Zwei-Photonen-Anregung
benötigt
wurde, als optische Falle entweder zweidimensional oder dreidimensional,
in Abhängigkeit
von der Laserleistung und der numerischen Öffnung der Objektivlinse, fungieren
kann. Die dreidimensionale Falle erlaubt eine lange Auffangzeit,
bis das Partikel aus der Falle freigesetzt wird. Dies kann zum Beispiel
dadurch erreicht werden, dass der Laser für kurze Zeit abgeschaltet wird.
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Die optische Auffangwirkung basiert
auf dem Strahlungsdruck und den Abstoßungskräften, die durch die Laserstrahlung
verursacht werden. Die Richtung und Stärke der Auffangkräfte hängen von der
Größe, Gestalt
und dem Brechungsindex des Partikels ab. Außerdem spielen die Wellenlänge der Strahlung
wie auch die Lichtabsorptionsfähigkeit
und -reflektionsfähigkeit
des Partikels eine wichtige Rolle. Ein Laserstrahl mit einem sehr
engen Brennpunkt wird Auffangkräfte
sowohl in axialer Richtung als auch in lateralen Richtungen ausüben. Ein
Laserstrahl mit einem kleineren Fokussierungswinkel (geringe numerische Öffnung der
Fokussierungslinse) wird Auffangkräfte in lateraler Richtung und
Antriebskräfte
in axialer Richtung entwickeln. In diesem zuletzt genannten Fall
wird ein Mikropartikel, das in die Nachbarschaft des fokalen Volumens
flotiert, in die zweidimensionale potentielle Vertiefung im Inneren des
fokalen Volumens fallen und dort bleiben, bis es durch die Propulsionskräfte aus
dem fokalen Volumen gestoßen
wird. Die Theorie und Anwendungen der optischen, Falle (des optischen
Auffangens) sind in der Literatur beschrieben (Ashkin A., Phys.Rev.Lett.
24(4):156, 1970 ja Ashikin, A., Dziedzic, J.M., Bjorkholm, J.E.
und Chu, S. Opt. Lett. 11(5):288, 1986).
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1 stellt
ein Konturmodell für
das Laserintensitätsprofil
mit Doppeltrichterbildung (Punktausbreitungsfunktion) um den fokalen
Punkt im zweidimensionalen Fall dar. Die vertikale Achse ist die Richtung
des Laserstrahls. Die Konturen geben die relative Intensitätsverteilung
an. Das Modell wurde auf der Basis der Theorie, die von Richards & Wolf 1959 aufgestellt
wurde und die zum Beispiel in: Stamnes, J.J. (1986), Waves in focal
regions: Propagation, Diffraction and Focusing of Light, Sound and
Water Waves, S. 461-. Bristol, England: Adam Hilger, Herausg. IOP
Publishing Limited, beschrieben ist, errechnet. Die Dimension einer
Skalaeinheit ist 4 μm. Die
numerische Öffnung
der Objektivlinse für
dieses Modell ist 0,65. Der Strahlungsdruck, dem ein Partikel ausgesetzt
ist, bewirkt das Einsaugen des Partikels in das ellipsoidförmige Zwei-Photonen-Anregungsvolumen
und danach Ausstoßen
in Richtung der vertikalen Achse. 1 zeigt,
wie ein 3 μm-Partikel durch den
Trichter wandern wird und wie es sich durch das Zentrum des Brennpunktes
bewegt und wie es relativ lange Zeit unter Zwei-Photonen-Anregung
bleibt. Die Verwendung der zweidimensionalen Falle führt in jedem
Fall zu einer viel längeren
durchschnittlichen Übergangszeit
als wenn das Partikel nur durch transversale Diffusion beeinflusst
würde.
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Folglich ist die Gesamtanzahl der
Photonenzählungen
während
der Übergangszeit
größer als ohne
Auffangeffekt.
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In unserem Experiment fungierte derselbe Laser
zur Zwei-Photonen-Anregung
des Fluoreszenzfarbstoffs und als Mittel für das zweidimensionale optische
Auffangen der Mikropartikel. In diesem Experiment verwendeten wir
einen passiv gütegesteuerten
Nd:YAG-Laser mit einer Leistung von 30 mW bei einer Wellenlänge von
1064 nm und Objektivlinsen mit einer numerischen Öffnung von
0,65 bis 0,8.
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Der Auffangeffekt erwies sich im
Kontext mit der vorliegenden Erfindung als sehr wichtig, da er die Gesamtzählungen
an detektierten Photonen erhöht. Da
die Mikropartikel längere
Zeit im fokalen Volumen bleiben und ein größerer Teil der sich zufallsverteilt bewegenden
Partikel durch das Zentrum des Brennpunkts flotieren wird, ist die
Schwankung der Zählungen,
erhalten von verschiedenen Partikeln, geringer.
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Untersuchung
von Vollblut und anderen Zellsuspensionen
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Es ist bekannt, dass das Hintergrundsignal, das
durch Streuung und Autofluoreszenz verursacht wird, durch Verwendung
einer Zwei-Photonen-Anregung eliminiert werden kann (WO 96/22531). Überraschenderweise
haben wir festgestellt, dass Anregungslicht, zum Beispiel mit einer
Wellenlänge
von 1064 nm, keine Fluoreszenz von Hämoglobin (Protoporphyrin IX)
hervorruft und daher die Hintergrundfluoreszenz, die durch Erythrozyten
verursacht wird, nicht signifikant ist, selbst wenn die Mikropartikelsuspension
eine beachtliche Menge an Erythrozyten enthält. Es ist klar, dass die Lichtabsorption
im NIR-Bereich durch Erythrozyten und insbesondere die von Hämoglobin
sehr gering ist, allerdings scheint der Zwei-Photonen-Anregungsenergietransfermechanismus
von Porphyrinen vollständig
anders zu sein als der der Ein-Photonen-Anregung und als Folge liefert die
Autofluoreszenz von Erythrozyten in der Suspension ein überraschend
niedriges oder sogar vernachlässigbares
Hintergrundsignal.
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Die Beobachtung bezüglich der
Differenz zwischen Ein-Photonen-
und Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Anregung von Porphyrinen führte zu
einer Möglichkeit,
die Notwendigkeit der Abtrennung der Zellen zu eliminieren und den
Assay direkt in Zellsuspension durchzuführen, ohne dass eine signifikante Störung durch
die Autofluoreszenz bewirkt wird.
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Vereinfachung
des Flüssigkeitshandhabungssystems
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Eine andere Möglichkeit, die durch das Konzept
der vorliegenden Erfindung geboten wird, besteht in der Vereinfachung
des Flüssigkeitshandhabungssystems.
Dies kann in einfacher Weise erreicht werden, indem der Zwei-Photonen-Anregungs-Laserstrahl durch
ein transparentes Fenster der Reaktionsküvette oder des Substrats in
das Reaktionsvolumen fokussiert wird. Auf diese Weise wird ein Fluoreszenzsignal
erhalten, wenn ein Mikropartikel infolge einer Diffusion oder einer
Flüssigkeitsbewegung zufallsverteilt
in das fokale Volumen oder heraus flotiert.
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Das Reaktionssubstrat ist zum Tragen
einer großen
Anzahl von Proben mit sehr geringen Volumina hergestellt. Das Detektionssystem,
das auf einer Zwei-Photonen-Anregung basiert, lässt sehr geringe Reaktionsvolumina
zu, ohne dass ein Verlust an Leistungsfähigkeit auftritt; folglich
wird das in der Praxis kleinste Reaktionsvolumen durch die Verteilungstechniken
und eher durch die Verdampfung als durch die Detektion beschränkt. Es
ist offensichtlich, dass ein Reaktionsvolumen in der Größenordnung
von 1 μl unter
verschiedenen Gesichtspunkten praktikabel sein würde. Ein derart kleines Volumen
kann in einer flachen Vertiefung in einem Fett-Substrat ver teilt
werden und dieses Substrat kann eine große Anzahl solcher Vertiefungen
eingebaut haben. Alternativ kann das Volumen auf einer flachen Oberfläche, einer Scheibe,
Platte oder Folie verteilt werden. Wenn das Material des Substrats
aus einem hydrophoben Material ausgewählt wurde, hält die Oberflächenspannung
der Flüssigkeit
das Reaktionsvolumen auf der Oberfläche in der Form eines Tröpfchens.
Der Laserstrahl zur Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Anregung wird mit
einer Objektivlinse mit großer
numerischer Öffnung
auf das Reaktionsvolumen fokussiert; eine derartige Linse hat einen
Betriebsabstand von kürzer als
zum Beispiel 0,3 mm. Daher muss das Substrat ein dünnes Fenster,
vorzugsweise dünner
als 0,2 mm bereitstellen, damit eine Fokussierung des Strahls in der
Suspension möglich
ist. Ein Band, hergestellt aus einer geeigneten Kunststofffolie
(z. B. Perfluorethylenpropylen, FEP-Folie hergestellt von DuPont)
ist besonders geeignet, da sie dünn
gemacht werden kann, z. B. 0,05 mm, und billig ist und eine große Menge
eines solchen Bands in das System eingebracht werden kann. Die Oberflächenkräfte halten das
Tröpfchen
in einer festen Position auf der Oberfläche, und zwar ungeachtet der
Position des Substrats bezüglich
der Gravitation. Die Objektivlinse kann durch das dünne Substrat
auf das Tröpfchen
oder direkt in das Tröpfchen
fokussiert werden.
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Eine Verteilung von Mikrovolumina
kann zum Beispiel unter Verwendung von Tröpfchengeneratoren, die auf
der Verwendung piezoelektrischer Aktuatoren basieren, durchgeführt werden.
Ein typischer Tröpfchengenerator,
der derzeit im Handel verfügbar ist,
kann 0,1 bis 1 nl-Tröpfchen
mit einer Frequenz von 1 bis 2 kHz herstellen.
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Kinetische Überwachung
der Reaktionsgeschwindigkeit
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Wenn ein Laserstrahl in die Suspension
fokussiert wird, wird das Fluoreszenzsignal erhalten, wenn ein Partikel
der Zwei- Photonen-Anregung
ausgesetzt ist. Da die Fluoreszenzsignalamplitude zu der Menge an
gebundener Markierung auf den Mikropartikeln direkt proportional
ist, wird dieses Konzept als Echtzeitüberwachung der Reaktionskinetik
bis zum Gleichgewicht fungieren. Die Amplitude des Signals, das
von einem Mikropartikel erhalten wird, hängt auch davon ab, wie die
flotierenden Mikropartikel das fokale Volumen zufallsverteilt durchkreuzen. Wenn
eine statistisch ausreichende Zahl von Mikropartikeln in einem kurzen
Zeitraum gemessen wird, dann ist es möglich, die Kinetik der Bioaffinitätsreaktion
ausreichend genau durch Überwachung
der Fluoreszenzintensität
zu verfolgen.
-
Erhöhung der
Partikelgeschwindigkeit
-
Viele Anwendungen der biospezifischen
Assays beinhalten eine große
Probenanzahl. Ein hoher Probendurchsatz wie auch die Überwachung
der kinetischen Reaktionsgeschwindigkeit erfordern eine hohe Signalausbeute
und eine gute statistische Genauigkeit in kurzem Zeitraum. Bei Anwendung
auf das erfindungsgemäße Verfahren
führen
diese Anforderungen zu der Forderung einer hohen Partikelgeschwindigkeit
und einer kurzen Zählzeit.
-
Im Assaysystem gemäß der vorliegenden Erfindung
können
die Mikropartikel zum Beispiel in Folge der Diffusion zufallsverteilt
in das fokale Volumen des Laserstrahls flotieren. Die Geschwindigkeit der
Mikropartikel, die in das fokale Volumen flotieren, hängt von
der Mikropartikelkonzentration ab. Um die Messung zu beschleunigen
kann die Suspension bewegt werden oder die Küvette oder ein beliebiger Behälter, der
die Suspension enthält,
kann mit einer gewünschten
Geschwindigkeit gerührt
oder gedreht werden. Je schneller die Bewegung ist, desto höher ist
die Geschwindigkeit der Partikel, die zufallsverteilt durch das
fokale Volumen flotieren.
-
Die Partikelgeschwindigkeit, die
Anzahl der Partikel, die pro Sekunde durch das fokale Volumen flotieren,
ist proportional zur Partikelkonzentration. Die Partikelgröße und – konzentration
in einem Assay haben ein Optimum, das von den Assay-Leistungsparametern
abhängt,
und es ist günstig,
kleine Partikel und relativ niedrige Konzentrationen zu verwenden.
Wenn zum Beispiel 2 μm-Partikel
verwendet werden, ist die optimale Partikelkonzentration für die höchste Leistung
kleiner als 107 Partikel/ml und dies ist
mindestens eine Größenordnung
kleiner als für eine
vernünftige
Partikelgeschwindigkeit bei freier Diffusion erforderlich ist. Die
Fluoreszenzemissi – on findet
nur während
des Zeitraums, wenn die Partikel sich durch das fokale Volumen bewegen
und unter Zwei-Photonen-Anregung
sind, statt. Kleine Partikel bewegen sich schneller als große Partikel
und sie bleiben für
eine viel kürzere
Zeit im fokalen Volumen. Dies führt
zu einer Definition des Anregungs-Arbeitscyclus, der das Verhältnis zwischen
der gesamten Anregungszeit und der gesamten vergangenen Zeit ist.
In dem oben gegebenen Beispiel liegt der Arbeitscyclus in der Größenordnung
von 10–2,
was sehr niedrig ist. Ein derart niedriger Arbeitscyclus bedeutet,
dass die Zählung
nur für
eine sehr kleine Fraktion oder vergangenen Zeit aktiv ist und folglich
die Anzahl der Photonenzählungen
niedrig bleibt und die Gesamtzählzeit,
die für
die erforderliche statistische Genauigkeit notwendig ist, lang ist.
-
Die Partikelgeschwindigkeit kann
erhöht werden,
indem die Suspension oder die Reaktionskammer in Bezug auf den Brennpunkt
bewegt wird. Die Partikelgeschwindigkeit wird erhöht, indem
die Geschwindigkeit der Bewegung erhöht wird. Ein Abtasten (bzw.
Scanning) bei bis zu 100 μm/s
hält das
3 μm-Partikel in der zweidimensionalen
Falle, wenn allerdings die Abtastgeschwindigkeit erhöht wird,
wird das Partikel aus der fokalen Falle freigesetzt. Bei erhöhter Abtastgeschwindigkeit werden
die Auffangkräfte
der optischen Falle zu gering, um das Partikel in der Falle zu halten,
da die optischen Auffangkräfte die
Viskositätsreibungskräfte nicht
aushalten können.
Daher wird mit erhöhter
Geschwindigkeit die Übergangszeit
in demselben Verhältnis
kürzer,
der Arbeitscyclus bleibt bei demselben niedrigen Level.
-
Wir haben allerdings festgestellt,
dass der Arbeitscyclus mit der aktiven Auffangtechnik verbessert
werden kann. Dies wird erreicht, indem ein elektronisch kontrolliertes
mechanisches oder optisches Abtastsystem (bzw. Scanning-System)
zur Bewegung der Mikropartikelsuspension bezüglich des Brennpunkts oder
umgekehrt verwendet wird. Die Bewegung sollte schnell genug sein,
so dass ein neues Partikel viel schneller als durch Diffusion in
das fokale Volumen gebracht wird. Ein Feedback vom Detektor zum
Scanning-System reduziert die Abtastgeschwindigkeit unverzüglich, wenn
das Signal, das durch das Mikropartikel verursacht wird, nachgewiesen
wird. Die Abtastgeschwindigke t wird nur für einen kurzen Zeitraum reduziert.
Wenn eine zweidimensionale Falle verwendet wird, wird die Abtastgeschwindigkeit
für den
Zeitraum, der der Auffangzeit des Mikropartikels im fokalen Trichter
entspricht, reduziert. Nach diesem kurzen Zeitraum wird die Abtastgeschwindigkeit
zum Auffinden eines neuen Partikels wiederhergestellt.
-
Wir haben festgestellt, dass durch
Verwendung eines Scanners mit mechanischer Stufe für die Reaktionsküvette und
durch Durchführen
einer kreisförmigen
Abtastbewegung mit einem Radius von 0,5 mm der Arbeitscyclus signifikant
verbessert werden kann. Durch Optimierung der Laserleistung und
der numerischen Öffnung
der Objektivlinse kann die Übergangszeit
kürzer
beziehungsweise die Partikelgeschwindigkeit höher gemacht werden.
-
Der mechanische Auffangscanner kann
mit einem elektromechanischen, galvanometrischen oder piezoelektrischen
Aktuator betrieben werden. Das Signal, das zur Steuerung des Auffangscanners benötigt wird,
kann am besten aus einem Streuungsdetektor mit der Laserwellenlänge erhalten
werden. Bei Verwendung von Mikropartikeln aus Latex oder anderem
optisch transparenten Material mit hohem Brechungsindex ist das
Streuungssignal stark. Das Streuungssignal wird früh genug
benötigt,
wenn das Mikropartikel sich dem fokalen Volumen der Zwei-Photonen-Anregung
nähert,
um die Scanning-Geschwindigkeit zu verringern und den Auffangeffekt
wirken zu lassen. Durch Verwendung eines konfokalen Streuungsdetektionssystems
mit einer geeigneten Öffnung
vor dem Streuungsdetektor ist es möglich, die Größe der räumlichen
Streuungsantwortfunktion zu optimieren.
-
Intensität des Fluoreszenzsignals
-
Eine Zwei-Photonen-Fluoreszenzanregung liefert
im Vergleich zu dem der Ein-Photonen-Anregung oft einen sehr niedrigen
Signallevel. Allerdings kann sogar bis zu einem Einmoleküllevel eine
sehr hohe Empfindlichkeit erreicht werden, da auch das Hintergrundsignal
sehr gering ist. Ungeachtet der Empfindlichkeit kann eine niedrige
Signalausbeute zu einer langen Zählzeit
führen.
Für einen
hohen Durchsatz und insbesondere zur kinetischen Überwachung
ist es wichtig, die Signalintensität, ausgedrückt als detektierte Photonen
pro Sekunde, zu maximieren. Wir haben festgestellt, dass im Handel
verfügbare
fluoreszierende Latexnanopartikel zur Markierung von biospezifischen
Reagenzien sehr nützlich
sind. Ein Antikörper
oder wenige Antikörper
können
an ein solches Nanopartikel kovalent oder passiv angeheftet (markiert)
werden. Ein Nanopartikel mit einem Durchmesser von 10 bis 100 nm
kann eine große
Anzahl fluoreszierender Farbstoffmoleküle einbauen. Ein 20 nm-Nanopartikel
kann zum Beispiel 1000 fluoreszierende Mo leküle einbauen und die Signalintensität ist 1000
mal größer als
die eines einzelnen Moleküls.
Außerdem
unterliegen die Farbstoffmoleküle
im Inneren des Mikropartikels in geringerem Ausmaß einer
Lösungsmittel-Auslöschung,
einer Selbstauslöschung
und engeren Emissionsbanden als die freien Moleküle in Lösung, und sie liefern eine
höhere
Fluoreszenzausbeute und eine bessere Spektralauflösung bei
demselben Anregungslevel.
-
Großer dynamischer
Bereich
-
Die Assaysignalantwort R bezieht
sich auf den Wert der Signalintensität I, der von der Markierung
als Funktion der Analytenkonzentration P erhalten wird. Die Signalintensität I bezieht
sich auf die Signalintensität,
die von der Markierung in der spezifischen Zeit t erhalten wird.
Der Peakwert der Signalantwort bezieht sich auf den Punkt, an dem
die Signalreaktion des Assays, das heißt die Standardkurve, ihren
höchsten
Wert erreicht (in 6.H).
-
Das Problem bei herkömmlichen
Assayverfahren liegt in ihrer Komplexität und darin, dass die Dynamik
auf Werte unterhalb der Konzentration der Reagenzien beschränkt ist.
Normalerweise müssen die
Reagenzien in zwei getrennten Schritten in die Reaktionsküvette gegeben
werden und die Küvette muss
zwischen diesen Schritten gewaschen werden. Der Zweck einer Verwendung
von zwei Stufen und des Waschens besteht darin, die Assayantwort
so zu beschränken,
dass sie der Bindungskapazität
der festen Phase entspricht. Dies ist notwendig, da in einem einstufigen
Assay die Signalantwort R abnimmt, wenn die Analytenkonzentration
P die Bindungskapazität
des primären
Reagenzes übersteigt.
Sobald die Konzentration an Analyt Ag die Bindungskapazität von Reagenzien übersteigt,
umfassen die Reaktionsprodukte zusätzlich zu den Komplexen AbAgAb* die
Komplexe AgAb*, die in Anteilsmengen gebildet werden, welche zu
den Konzentrationen der festen Phase Ab und des Analyten Ag in Relation
stehen. Je größer die
Menge an überschüssigem Analyten
Ag in Relation zu der Bindungskapazität des primären Reagenz Ab ist, desto schwächer ist
die Assaysignalantwort R. Dieses gefährliche Phänomen tritt nur auf, wenn alle
Assaykomponenten gleichzeitig dosiert werden und wird in der Literatur
als der "Hook-Effekt" bezeichnet. Wegen des Hook-Effekts ist die Assayantwort zweideutig
und daher wird der dynamische Bereich des Systems üblicherweise
so eingeschränkt,
dass er der Kapazität
des primären Reagenzes
Ab entspricht. Um darüber
hinaus mögliche
falsche Resultate mit den herkömmlichen
Verfahren zu vermeiden, wird, nachdem der Analyt Ag mit dem primären Reagenz
Ab umgesetzt wurde, das potentielle überschüssige Material in der Reaktionslösung unter
Anwendung eines geeigneten Verfahrens aus der Reaktionslösung abgetrennt.
Wenn eines der Reagenzien an die feste Phase gebunden ist, zum Beispiel
an die Oberfläche
der Küvette.,
besteht das gängigste
Trennverfahren im Waschen der Küvette.
-
Die Gefahr von falschen Resultaten
durch den Hook-Effekt hat die umfangreiche Verwendung von einstufigen
Assays eingeschränkt,
obgleich ein konstanter Bedarf für
einfachere und kosteneffektivere Analysen bei der Routinediagnostik
besteht. Das vorliegende Merkmal der vorliegenden Erfindung ermöglicht einen
einstufigen Assay mit einem dynamischen Bereich, der größer ist
als bei herkömmlichen mehrstufigen
Assays und eliminiert die Gefahr falscher Resultate, die durch den
Hook-Effekt verursacht
werden.
-
Ein charakteristisches Merkmal der
vorliegenden Erfindung besteht darin, dass das hier präsentierte
Messsystem optisch zwischen dem Signal, das von den Komplexen AbAgAb*
imitiert wird, und dem Signal, das von dem freien markierten Reagenz imitiert
wird, unterscheiden kann. Außerdem
besteht ein charakteristisches Merkmal der vorliegenden Erfindung
darin, dass die Probe und die primären und sekundären Reagenzien
gleichzeitig zugesetzt werden und dass die Signalintensität des Reaktionsproduktes
von Beginn der Reaktion an als Funktion der Zeit überwacht
wird. Dies wird später
kinetische Messung genannt. Eine kinetische Messung liefert uns
Informationen über
die Analytenkonzentration lange bevor die Reaktion ein Gleichgewicht
erreicht hat. Die Wachstumsrate dI/dt der Signalintensität ist proportional
zur Analytenanfangskonzentration P; diese Information kann bereits
in den frühen
Stufen der Reaktion verwendet werden, um die ungefähre Analytenkonzentration
zu bestimmen und spezifischer zu bestimmen, ob die Analytenkonzentration
höher als die
Bindungskapazität
des primären
Reagenzes Ab ist. Somit definiert die kinetische Messung, ob das Reaktionsgleichgewicht
auf der rechten oder linken Seite des Peakwerts H in der Standardkurve
erreicht wird (6). Auf
der Basis der Reaktionskinetik werden Analytenkonzentrationen beobachtet,
die die Bindungskapazität
der festen Phase übersteigen;
somit ist es möglich,
im Vergleich zu herkömmlichen Assayverfahren
ohne Gefahr falscher Resultate höhere
Analytenkonzentrationen zu messen. Der dynamische Bereich des Systems
kann so deutlich ausgedehnt werden. Beispielsweise können die
drei Größenordnungen
des dynamischen Bereichs mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auf fünf bis sechs Größenordnungen
erhöht
werden.
-
Das tatsächliche Merkmal der Erfindung kann
durch die folgenden Stufen charakterisiert werden:
-
- – durch
Verwendung von bekannten Standardproben werden zu Eichzwecken zwei
Standardkurven gemessen. Die erste Standardkurve g = g(P) bezeichnet
die Wachstumsrate dI/dt der Signalintensität I im spezifischen Zeitraum
t1 + Δt
als Funktion der Analytenkonzentration P. Die zweite Standardkurve
bezeichnet den Wert der Signalantwort R(t2,
P) nach einer spe zifischen Reaktionszeit t2 als
Funktion der Analytenkonzentration P.
- – bei
Messung unbekannter Proben wird die Signalintensität I als
Funktion der Zeit aufgezeichnet und Parameter g, der die Wachstumsrate
der Signalintensität
I charakterisiert, wird gemessen. Nach einer spezifizierten Reaktionszeit
wird auch die Signalantwort R(P) gemessen.
- – Wenn
die Reaktion in die Nähe
des Gleichgewichts fortgeschritten ist, wird die Umkehrfunktion
P = P(g) der Standardkurve g = g(P) verwendet, um zu bestimmen,
ob die Konzentration P der unbekannten Probe kleiner als, etwa gleich
oder höher
als die Konzentration q der festen Phase ist.
Wenn P < q, wird die Probenkonzentration
P von der Standardkurve P = P(R) abgelesen;
Wenn P = q, wird
die Probenkonzentration P von der Standardkurve P = P(g) abgelesen
und
Wenn P > q,
wird die Probenkonzentration P von jeder Kurve abgelesen.
-
Beispiel
-
Das oben beschriebene Verfahren kann
detaillierter unter Verwendung eines Anwendungsbeispiels erläutert werden.
Reaktionsdiagramme, Reaktionsgleichungen, Standardkurven und Signalintensitätskurven,
die in den 2 bis 7 dargestellt sind, wurden
unter Anwendung einer mathematischen Modellierung hergestellt.
-
Als praktisches Beispiel für die vorliegende Erfindung
stellen wir einen Assay dar, der ein biospezifisches Reagenz an
die feste Phase gebunden verwendet. 2 zeigt
das Reaktionsschema des Assays. Die Anfangskomponenten der Reaktion
umfassen ein biospezifisches Reagenz Ab, an die feste Phase ge bunden,
den Analyten Ag und ein markiertes Reagenz Ab*. Die Komponenten
Ab, Ag und Ab* werden gleichzeitig in die Reaktionslösung gegeben. Die
Reaktionsgleichungen (Formeln 1–4),
die in 3 dargestellt sind, decken
alle möglichen
Reaktionen und Produkte ab. Die Buchstaben k beziehen sich auf die
Reaktionsassoziations- und Dissoziations-Geschwindigkeiten. Reaktionsgeschwindigkeiten
differieren naturgemäß stark.
Reaktionen, die in der flüssigen
Phase ablaufen, sind schnell, wohingegen Reaktionen, die mit der
festen Phase verbunden sind, langsamer sind. In diesem Beispiel
sind die ausgewählten
Reaktionskonstantenwerte für
diese Assaytypen typisch. Der ausgewählte Gleichgewichtswert (Affinität) der biospezifischen
Reagenzien Ab und Ab* ist K = 1 × 1010 l/mol.
-
Die ausgewählten Assoziationsgeschwindigkeiten
verschiedener Reaktionen sind wie folgt:
k1 = 1 × 107 1 mol–
1 s–1
k3 = 1 × 109 1 mol–
1 s–1
k5 = 1 × 107 1 mol–
1 s–1
k7 = 1 × 107 1 mol–
1 s–1
Da
kdiss = kass/K,
sind die ausgewählten
Dissoziationskonstanten:
k2 =
1 × 10–3 1
mol–
1 s–1
k4 = 1 × 10–1 1
mol–
1 s–1
k6 = 1 × 10–
3 1 mol–
1 s–1
k8 = 1 × 10–3 1
mol–
1 s–1
-
Außerdem wird angenommen, dass
die Konzentration an Reagenz Ab, gebunden in der festen Phase A,
q = 1 × 10–9 mol/l
und dass die Konzentration des markierten Reagenzes Ab* q* = 1 × 10–9 mol/l.
-
Zur Vereinfachung entsprechen diese
Reaktionsgleichungen den Reaktionen in der Lösung und es wird angenommen,
dass die Assoziationsgeschwindigkeitskonstanten alle Diffusionsfaktoren
umfasst. Der Effekt von Konzentrationsgradienten infolge von Diffusion
ist im Endresultat dieses Modells minimal, da die feste Phase in
Form von Mikropartikeln vorliegt, die wiederum in der Suspension
gleichmäßig verteilt
sind und daher sind die durchschnittlichen Diffusionsentfernungen
sehr gering. Es wird einfach angenommen, dass Assoziations- und
Dissoziations-Geschwindigkeiten der Reaktion mit der festen Phase
ein oder zwei Größenordnungen
langsamer als die entsprechenden Geschwindigkeiten in der Lösung sind.
Diese Annahme deckt die Trägheit
ab, die durch Diffusion bei der Reaktion, welche mit der festen
Phase abläuft,
verursacht wird.
-
3 zeigt
Differenzialgleichungen (Gleichungen 5 bis 10),
die von den Reaktionsgleichungen abgeleitet sind. Ihre Lösung erläutert die
Reaktionskinetik. Die Werte für
die Variablen x1 sind im System der Gleichungen
als Gleichung 11 bezeichnet und die Einheiten der Ausdrücke sind
als Gleichung 12 bezeichnet. Nur eine numerische Lösung dieser Differenzialgleichung
ist möglich
und wir haben zu ihrer Lösung
Mathcad 6.0 + mathematische Software (Matsoft Inc., Cambridge, Mass,
USA) verwendet. Diese mathematische Modellbildung macht es möglich, Reaktionskinetik
und Verbrauch und Bildung verschiedener Reaktionskomponenten unter
verschiedenen Anfangsbedingungen, einschließlich der Reaktionsgeschwindigkeitskonstanten
und Konzentrationen der Reagenzien und anderer möglicher Anfangswerte, die die
Reaktion beeinflussen könnten, zu
simulieren.
-
Die 4 und 5 beschreiben die Assay-Reaktionskinetik,
das heißt
den Wert der Signalintensität
als Funktion der Zeit. Da in diesem Modell verwendete Affinitätskonstanten
erläuternd
sind, muss auch die Zeitachse als relativ angesehen werden. Die Signalintensität ist zu
der Konzentration des Produkts AbAgAb*, das in der Reaktion gebildet
wird, direkt proportional. 4 zeigt
eine transiente Signalintensität
als Funktion der Zeit t. 5 zeigt
die integrierte Signalintensität
im Zeitraum 0 – t
als Funktion der Zeit t. Die Verwendung eines Integrals verbessert das
Signal-Geräusch-Verhältnis der
Messung. Die 4 und 5 stellen Signalintensitätskurven
bei verschiedenen Analytenkonzentrationen dar: a) 10–11 mol/l,
b) 10–10 mol/l,
c) 10–9 mol/l,
d) 10–8 mol/l
und e) 10–7 mol/l. 6 zeigt eine Signalantwortkurve,
das heißt
eine Assaystandardkurve, die die Konzentration R des Produktes AbAgAb*,
das in der Reaktion gebildet wird, als Funktion der Konzentration
P des Analyten Ag darstellt. Der Peakwert der Antwortkurve in dem
Assay ist als H in 6 gekennzeichnet.
-
4 zeigt,
dass die Signalintensitätswachstumsrate
direkt proportional zur Konzentration P des Analyten Ag ist, das
heißt,
eine höhere
Analytenkonzentration liefert bei einer spezifizierten Zeit eine
höhere
Signalintensität.
Wenn die Reaktion ein Gleichgewicht erreicht, neigen sich die Signalintensitätskurven
asymptotisch zum Gleichgewichtswert (Kurven a, b und c).
Sobald die Analytenkonzentration P die Bindungskapazität q der
festen Phase übersteigt,
das heißt
in diesem Beispiel die Konzentration 10–9 mol/l,
steigt die Signalintensität
zuerst rasch an (Kurven d und e), neigt sich aber bald zum Gleichgewicht,
das der Signalintensität
bei der niedrigeren Analytenkonzentration entspricht. Die Kurvengruppe in 5 zeigt die gesamte integrierte
Signalintensität in
der Zeitspanne 0 – t
als Funktion der Zeit bei verschiedenen Analytenkonzentrationen.
In diesem Fall ist die Steigung der Kurven a, b, c, d und e weniger steil.
-
Die mit 4 und 5 dargestellten
Kurven beweisen den vorher erwähnten
Hook-Effekt, so dass, wenn Analytenkon zentrationen die Bindungskapazität der festen
Phase übersteigen,
die Signalintensität bei
einem bestimmten Level bleibt, der niedriger ist als der Signallevel
für geringe
Konzentrationen. Darüber
hinaus wird das Reaktionsgleichgewicht viel schneller erreicht.
-
Das Wachstum der Signalintensität und der potentielle
Hook-Effekt können vorausgesehen
werden, indem die Wachstumsrate dI/dt der Signalintensität bei unterschiedlichen
Zeiten t aufgezeichnet wird. Wenn die Reaktion ein Gleichgewicht
erreicht, fällt
die Wachstumsrate der Signalintensität auf 0. Wenn die Analytenkonzentrationen
die Bindungskapazität
der festen Phase übersteigen,
wird das Reaktionsgleichgewicht früher erreicht als mit Analytenkonzentrationen,
die niedriger als die Bindungskapazität sind. Durch Anpassen einer
linearen Polynomfunktion oder einer Funktion höheren Grades oder einer anderen
Funktion an die Reaktionskurve bei einen spezifizierten Zeitraum
kann der Konzentrationsbereich des Analyten bestimmt werden, indem
die eingestellten Anpassungsparameter verwendet werden. Die Überwachung
der Signalintensitätswachstumsrate
ist einfach und geräuschtolerant.
Natürlich kann
die Anpassung der Kurven entweder an einer linearen oder an einer
logarithmischen Skala erfolgen. Bei der linearen Skala kann die
Analytenkonzentration direkt aus der Wachstumsrate dI/dt der Signalintensität bestimmt
werden.
-
Als Beispiel sind die Kurven a und d in
den 4 und 5 angepasst, wobei die Funktionen
ersten Grades verwendet wurden, das heißt die Linien auf der logarithmischen
Skala und mit der Zeitspanne t = 0 – 300s. Diese Linien sind als
"aa" beziehungsweise "dd" gekennzeichnet. Diese Regressionslinien
werden mathematisch log[R(t)] = g log t) + c bezeichnet, worin R(t)
eine zeitabhängige
Signalantwort ist, g die Steigung der Regressionslinie, die die
Reaktionsgeschwindigkeit angibt, ist, und c eine Konstante ist,
die den Wert der Signal antwort am Punkt t = ls angibt. Die Konstante
c stellt auch die Konzentration des Analyten dar.
-
Durch Standardisierung einer Messvorrichtung
mit bekannten Standardproben können
die oben genannten kinetischen Signalantworten für unterschiedliche Konzentrationen
des Analyten Ag bestimmt werden und anschließend können die obigen Regressionslinien
bestimmt werden. Dies führt
zu einer Gruppe von Linien, deren Steigung als Funktion der Analytenkonzentration
Ag variiert, wenn die Analytenkonzentration die Konzentration übersteigt,
die dem Peakwert entspricht. Eine Funktion kann an die Steigung
dieser Liniengruppe angepasst werden. Ein Beispiel für eine solche
Funktion, die für
die Integralkurven von 5 angepasst
ist, ist in 6 dargestellt.
Diese Kurve zeigt, dass im Assayantwortbereich die Steigung bis
zum Spitzenwert denselben Wert besitzt, aber sobald die Konzentration
des Analyten Ag den Peakwert übersteigt,
fällt der
Wert der Steigung g scharf ab.
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Wenn eine unbekannte Probe gemessen wird,
wird die Signalantwort und ihr Integral überwacht, bis die Reaktion
sich einem Gleichgewicht nähert,
wie es früher
beschrieben wurde; und später wird
der Wert der Steigung der Regressionslinie bestimmt. Durch Ablesen
der entsprechenden Probenkonzentration von der in 7 dargestellten Kurve kann bestätigt werden,
ob die Konzentration der unbekannten Probe geringer oder höher als
die Konzentration des Analyten bei seinem Spitzenwert ist. Wenn
die Konzentration niedriger ist, wird die Konzentration der unbekannten
Probe nach einem spezifizierten Reaktionszeitraum aus der Standardkurve
P = P(R), die in 6 dargestellt
ist, abgelesen. Wenn andererseits die Konzentration innerhalb des
Bereichs des Peakwertes liegt, wird die Konzentration der unbekannten
Probe auf der in 7 dargestellten
Kurve P = P(g) abgelesen. Wenn schließlich die Konzentration den
Spitzenwert übersteigt,
kann die Konzentration der unbekannten Probe von jeder der Kurven,
die in 6 und 7 dargestellt sind, abgelesen
werden.
-
Die in dem vorstehenden Beispielen
verwendete angepasste lineare Funktion für die Wachstumsraten der Signalintensität ist nur
erläuternd.
Es ist klar, dass, wenn die Standardkurve P = P(g) bestimmt wird,
auch andere mathematische Interpretationsverfahren eingesetzt werden
können.
Wenn zum Beispiel Polynome eines höheren Grades für kinetische
Messkurven angepasst werden, charakterisieren die Polynomkoeffizienten
das Fortschreiten der Reaktion. Die Koeffizienten können Informationen auch
aus komplexeren Reaktionsbedingungen enthalten. Durch Untersuchung
dieser Koeffizienten können
die erforderlichen Antwortsignale bestimmt werden.
-
Zusammenfassung
-
Das für die erfindungsgemäße Vorrichtung verwendete
mikrophotometrische Messsystem kann optisch zwischen der Fluoreszenz,
die von der Oberfläche
der Mikropartikel imitiert wird, und der Fluoreszenz, die von der
Lösung,
die die Partikel umgibt, imitiert wird, unterscheiden. Diese Auflösungsfähigkeit basiert
auf der Tatsache, dass in einer geeignet verdünnten Reaktionssuspension zu
einer Zeit nur ein Partikel in das fokale Volumen passt. Die Mikropartikel
konzentrieren die Reaktionsprodukte und die Konzentration der Markierungen,
ausgedrückt
als mol/l, im mikroskopischen Volumen des Mikropartikels des um
viele Größenordnungen
höher als
die der freien Markierungsmoleküle
in der Suspension. Folglich ist das Hintergrundsignal, das durch
freie Markierungsreagenzien erzeugt wird, minimal. Eine optische
Trennung gewährleistet
eine ausreichende Auflösungsfähigkeit
zwischen freier und gebundener Fraktion ohne chemische oder physikalische
Trennung. Eine Kombination der Merkmale der vorliegenden Erfindung,
wie sie oben beschrieben wurden, mit dem Assaysystem auf Mikroparti kelbasis,
ermöglicht ein
Verfahren und eine Vorrichtung zur Durchführung eines schnellen, einstufigen,
biospezifischen Assays für
sehr kleine Probenvolumina an Zellsuspensionen wie Vollblut oder
anderen klinischen Proben wie Serumproben. Der Assay ist trennungsfrei
und ohne Gefahr, falsche Analysenresultate für hohe Konzentrationen durch
den Hook-Effekt zu erhalten, da der Hook-Effekt aus der Wachstumsrate
des kinetischen Signals vorausgesehen werden kann.
-
Charakteristisch für die vorliegende
Erfindung ist, dass die Notwendigkeit einer Mikrofluid-Flüssigkeitshandhabung
auf ein Minimum beschränkt
wird, indem der Laserstrahl direkt in das Reaktionsvolumen fokussiert
wird. Dieses Konzept erlaubt eine Echtzeit-Überwachung der Reaktionskinetik.
Darüber
hinaus kann die Mikropartikelgeschwindigkeit wie auch die Photonenzählgeschwindigkeit erhöht werden,
indem eine aktive optische Falle verwendet wird und auch durch Verwendung
von fluoreszierenden Nanopartikeln zur biospezifischen Markierung.
Die Echtzeit-Überwachung
erlaubt außerdem
die Ausnützung
der Assayantwort unterhalb des Hook-Punktes der Assaystandardkurve.
-
Das erfindungsgemäße Verfahren und die entsprechende
Vorrichtung können
auf verschiedene Art und Weise realisiert werden. Ein wesentliches Merkmal
der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass der Laserstrahl direkt
in die Reaktionssuspension fokussiert werden kann, das Fortschreiten
der Reaktion überwacht
werden kann und dass das biologische Material, zum Beispiel Zellen
und insbesondere Erythrozyten ungeachtet der Tatsache, ob diese
Zellen im Brennpunkt oder außerhalb
des Brennpunkts gefunden werden, ein unbedeutendes Hintergrundsignal
verursachen. Ein statistisch genaues Messresultat kann in einem
kurzen Zeitraum erzielt werden, da der Detektionsarbeitscyclus durch
das aktive Auffangverfahren hochgehalten werden kann. Der Fluoreszenz-Detektor
wird nur für
die Dauer des Laserpulses, der für
die Zwei-Photonen-Anregung verwendet wird, aktiviert, was bedeutet,
dass Photoneuemissionen oder thermische Geräuschzählungen, die zwischen den Anregungsintervallen
auftreten, nicht gemessen werden. Gleichzeitig kann der Photonen-Detektor
nur in dem kurzen Augenblick, in dem das Mikropartikel das fokale
Volumen trifft, aktiviert werden. Angaben über die Position von Mikropartikeln
in fokalen Volumen werden zum Beispiel durch Streuung und Reflektion
bei der Laserstrahlwellenlänge
erhalten. Der beste Weg zur Messung der Streuung ist die Verwendung
eines konfokalen Systems. Das Streuungssignal der Blutzellen ist
kleiner, da ihr relativer Brechungsindex viel niedriger als der der
im Verfahren verwendeten Mikropartikel ist. Streuung und Hintergrund,
die durch Zellen verursacht werden, kann durch Perforieren von Zellmembranen
mit isotonischer Lösung
weiter verringert werden. Das Resultat ist, dass intrazelluläre Flüssigkeiten
und Hämoglobin
in der Assaysuspension verdünnt
werden.
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Das erfindungsgemäße Verfahren, das auf der Verwendung
einer Zwei-Photonen-Anregung beruht, kann auch ein Multiparameterassay
sein, wie er in der internationalen Patentanmeldung WO 96/22531
dargestellt wird. In diesem Assay werden Mikropartikel in viele
verschiedene Kategorien eingeteilt und sind mit verschiedenen primären Agentien, die
verschiedene Analyten binden, überzogen.
In Anbetracht der Herstellungskosten der Messvorrichtung ist es äußerst wichtig,
dass das zur Detektion der Partikel und zur Zwei-Photonen-Anregung
der Markierung verwendete Licht mit demselben Laserstrahl, der entweder
den roten oder NIR-Bereich der Wellenlänge verwendet, gebildet werden
kann.
-
Einem Fachmann auf diesem Gebiet
wird klar sein, dass die verschiedenen Anwendungen der Erfindung
innerhalb des Umfangs der Ansprüche,
die im folgenden Abschnitt angegeben sind, variieren können.