DE2446032A1

DE2446032A1 - Verfahren und vorrichtung zur feststellung submikrometrisch bemessener partikel

Info

Publication number: DE2446032A1
Application number: DE19742446032
Authority: DE
Inventors: Myron J Block
Original assignee: Block Engineering Inc
Current assignee: Block Engineering Inc
Priority date: 1973-09-27
Filing date: 1974-09-26
Publication date: 1975-04-10
Also published as: CH585903A5; FR2245944A1; GB1483815A; US3975084A; CA1013170A; AU497080B2; NL7412807A; JPS5078371A; AU7324374A

Description

Block Engineering, Ino. Cambridge» Massachusetts/USA

Verfahren und Vorrichtung zur Peststellung submikrometrisch bemessener Partikel

Die Erfindung bezieht sich auf optische Systeme« insbesondere zur Auffindung und Klassifikation submikrometrlaoh bemessener Partikel, z.B. von Viren, die in einer Flüssigkeit suspendiert sind.

Das Auffinden und die Klassifizierung von submikrometrisch bemessenen Partikeln, insbesondere von Viren, ist seit langer Zeit als wichtige Aufgabe erkannt, jedooh ist die Lösung durch eine Zahl schwerwiegender Probleme erschwert. Eine Standardannäherung erfolgte durch Elektronenmikroskop!θ, jedoch kann dieses Verfahren nicht in einfacher Weise mit freischwimmenden oder "lebenden" Objekten durchgeführt werden und außerdem sind aufwendige, zeitraubende Objektvorbereitungen erforderlich und es muß eine komplexe teure Anlage verwendet werden. , ·

Im allgemeinen haben sich optische Mikroskope als nur sehr begrenzt anwendbar erwiesen, weil die Virenpartikel so dimensioniert sind, daß sie.weit unter den Auflösungsgrenzen des

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Lichtmikroskops liegen.

Außerdem haben Betrachtungsoptiken mit sehr hoher Vergrößerung nur eine sehr begrenzte Schärfentiefe in der Größenordnung von wenigen Mikrometern. Eine Absorption und Beugung von den nicht fokusierten Partikeln oder Aufbauteil im Sichtfeld bewirken eine schwerwiegende Verminderung des Kontrastes und sie machen es schwierig, diejenigen Partikel zu unterscheiden, die tatsächlich fokusiert sind, d.h. das Verhältnis Signal/ Störpegel ist sehr schlecht, Es ist jedoch ein optisches System bekannt, mit welchem kleine Partikel suspendiert In einem flüssigen Medium mit Koherentem-X-lcht beleuchtet werden. Das von den Partikeln zurUokgestreute Licht wird dann durch Überlagerüngsspektrometrie (Hefcerodyn-Spekferoiietpie) betrachtet, um Daten über die Braun¹ sehe Bewegung üet Partikel zu erhalten, denn diese Braun'sehe Bewegung ISßfc einen Bücksehluß auf die Partikelgröße zu« Kurz gesagt ist es bekamt, die Partikelgröße dadurch zu messen* daß die Doppler-Ausbreitung des gestreuten Lichtes bestimmt wird« Die beobachtete Frequenzverteilung der Partikelg@sehwindigkeiten wird durch eine Lorentzian-Funktion beschrieben* deren halbe Breit© proportional der Partikelgröße ist. Diesem Verfahren haften Jedoch mehrere Nachteile an. Erstens Ist die Benutzung !coherent ®r Strahlung zwingend^ damit man die Yergleldisweise langsame Braunsche Oeschwlndig-.kelt messen kann. AuSerdem !saum Iceine Unterscheidung zwisciieia verschiedenen Partikeln getroffen werden^ da die Streuung von allen Partikeln aufgezeichnet wird«, Dies trifft zu_s well die Summe einer Vielzahl Lorentzsclier Funktionen-schwierig In die Bestandteile aufzulösen Ist und! es danes* sshwlerlg 1st, die Partikel in komponenten Größen aufzulösen, wenn ein Bereich von Partikeltypen gegeben Ist» Außerdem ist die von einem Partikel gestreute LIehtmenge proportional der seeiisten Potenz des Par-

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tikeldurchmessers, so daß die Signale von großen Partikeln die Neigung haben, die Signale von kleineren Partikeln zu überdecken.

In der älteren Patentanmeldung P 24 31 203.6 der Anmelderin ist ein System beschrieben,-welches einige der oben erwähnten Schwierigkeiten in der Überlagerungsspektroskopie vermeidet. Dabei wird eine fluorisierende Einfärbung benutzt, um zwischen verschiedenen Partikeltypen unterscheiden zu können. Da die Fluoreszenz-Emission breitbandig und nicht schmalbandig ist, ist die Benutzung der Doppler-Ausbreitung als Größendiskrimlnator nicht möglich. Stattdessen wird gemäß den Vorschlägen der älteren Anmeldung ein räumliches Filter, beispielsweise eine Aperturöffnung benutzt, um die Fluoreszenz-Emission der Partikel zu modulieren und um ein Fluktuationsspektrum zu erzeugen, welches eine Funktion der Geschwindigkeiten der fluoreszierenden Partikel darstellt. Außer im Hinblick auf die Unterscheidung zwischen verschiedenen Typen von Partikeln durch fluoreszierende Methoden ist das Verfahren vielen der Nachteile der Doppler-Streuverfahren unterworfen. So hat z.B. eine

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reguläre Apertur Ränder, die ihrer Natur nach sine (d.h.sin χ ).

Eine Konvolution der Randbewegung und derartiger sine Wellenränder führt zu einer Lorentz¹sehen Kurve. Wenn mehrere Partikelgrößen gleichzeitig beobachtet werden, ist das beobachtete Singal, welches vorzugsweise erkannt wird, die Summe der unterschiedlichen Lorentz¹ sehen Kurven, die schwer in ihre komponenten Funktionen aufzulösen sind. Mit dem in der älteren Patentanmeldung beschriebenen System ist die optimale Blendenöffnung zur Bestimmung der Größe ven Viren mit vernünftiger Genauigkeit etwa ein Zehntel einer Wellenlänge. Eine solche öffnung kann natürlich nicht mit herkömmlichen optischen Techniken erlangt werden,weil sich hinsichtlich der Beugung Grenzen ergeben

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Außerdem führt die Benutzung einer einzigen kleinen Öffnung zur Beobachtung eines entsprechend kleinen Volumens der Objektflüssigkeit*. so daß wenn Messungen der Partikel in 'der Flüssigkeit innerhalb einer- vernünftigen Zeitspanne durchgeführt werden sollen, eine hohe Partikeldichte erforderlich ist» Bei Benutzung der Vorrichtung gemäß der älteren Anmeldung für Fluoreszenz-Mikroskopie beleuchten herkömmliche Verfahren ein beträchtlich größeres Materialvolumen als jenesj, das sich jeweils im kritischen Fokus befindet. Im Hinblick auf die Fluoreszenz-Emissionen ergibt sioh ein hoher Hintergrundpegel infolge dea Vorhandenseins des Fluoreszenz-Farbstoffes selbst In dar Lösung und des Vorhandenseins voa gefärbten Partikeln, auf die eine Scharfeinstellung nicht erfolgt 1st» Wie erwähnt führt dieser hohe Hintergrundpegel zu einem geringen Kontrast»

Der Erfindimg liegt dl© Aufgabe zugpuraäe eine Anzahl der obigen Probleme zu 19sen,und zwar Insbesondere die Probleme^ die in Verbindung mit dem System gemäß der älteren Patentanmeldung auftreten«

31a weiteres widriges Merkmal der Erfindung besteht darin, einen apparat ot @@3riaffea oma ©la ¥©ffaSiren %n entwicMn, mit ifeSLehen 3Ufemikr@raeter£(3©fe feemessene Partikel raster wesentlich verbesserter Unfc@Mrl®löMg <ä®r HnttsrgrsaMesfesion festgestellt werden Scönaea» ÄuSeMera ©oll ein iyet@a gesetaffen werden* das Filter föeiMfcsfeß ei ola _

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strahlung. Ferner soll eine Vorrichtung geschaffen werden, die einfach und verhältnismäßig billig im Vergleich zum Stande der Technik ist.

Zur Lösung der gestellten Aufgabe benutzt die Erfindung ein Phänomen, das unter der Bezeichnung "abklingende Welle" oder "inhomogene Welle" bekannt ist. Nach dem Gesetz von Snell tritt eine sogenannte totale Reflektion des Strahles auf, wenn ein Lichtstrahl, der in einem ersten Medium mit gegebenen Brechungsindex läuft auf eine Zwischenfläche zwischen dem ersten Medium und einem zweiten Medium mit unterschiedlichem Brechungsindex in einem Einfallwinkel auftrifft, der größer ist als der kritische Winkel. Der einfallende Strahl wird Jedoch außerdem eine inhomogene optische Oberflächenwelle im zweiten Medium erzeugen. Diese letztere Welle, die als abklingende oder seitliche Welle bezeichnet wird, schreitet parallel zu der reflektierenden Zwischenfläche fort und ihre Feldstärke schwächt sich exponentiell in einer Richtung normal zu der Zwischenfläche ab. Wenn das zweite Medium nicht absorbierend ist, kehrt die Energie der abklingenden Welle schließlich in den reflektierten Strahl im ersten Medium zurück, woduroh die Reflektion tatsächlich total erfolgt. Wenn das zweite Medium absorbierend ist, dann wird ein Teil der abklingenden Welle absorbiert und die Reflektion ist nicht wirklich total. Dieses Phänomen tritt auf, wenn Licht eine Vielzahl abschwächender total reflektierender. Platten oder Zellen durohläuft und es wird daher als ATR-Phttnomen bezeichnet. Das gleiche Phänomen tritt auf bei Licht, welches eine Wellenführung oder eine Liohtführung durchquert, beispielsweise einen Film aus lichtdurchlässigem' Material mit einer Dicke etwa in der Größenordnung der Lichtquellenlänge. Das ATR-Phänomen wurde zuerst 1959 durch Fahrenfort angewandt, der die Energie des reflektierten Strahles ge-

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messen hat, um das Ausmaß der Absorption durch das Objekt zu bestimmen, das das zweite Medium bildete. Das ATR-Phänomen hat seither eine weit verbreitete Anwendung in der analytischen Technik gefunden, wie dies aus dem Buch von N.J. Harrick "Internal Reflection Speetrqscopy" New York, Interscience 196y, hervorgeht. ATR in Lichtleitern und Systemen zur Kopplung solcher Lichtleiter an Lichtquellen sind.beschrieben in dem Artikel von P.K. Tien in "Light Waves in Thin Films and Integrated Optics", Applied OptlOB,Nwr.l971« S.2395 -

Die Objektpartikel in einem flüaägen Medium wird anfänglich so vorbereitet, daß die Population auf öle gewünschten Partikel begrenzt wlrdo So wird beispielsweise das Objekt mit einer komplexen Kfuklelnsäure sp©slflachen Farbe gefärbt, die selektiv alle lukleinslure enthaltenden Partikel und Moleküle fluorcteoralerfc. Bei einen biologischen Objekt umfassen die angefärtofean Partikel gang© Zellen, Mitochondiien, Chromosome« Ritoosotiei, Messenger und -tfeergangsriboniikleinsäure (RNA), sowie auch Viren«, Die erafeea drei«, <&le sehr viel größer sind, als seifest die größten Viren, kSnnen wirksam durch Filterung das Objekts uuroh ein aillipopöses Filter zurückgehalten werden. Die letztgenannten beiden, die ein sehr viel kleineres Molekulargewicht haben, als- die Icleiasten Viren können völlig eliiainiert werde» durch setmelle Dialyse Ie einer Hohlfaser φ Auf diese Meise wirö ©In Objekt vorbereitete, bei üem die einzigen fluoreazieFeaten Partikel Viren _g Ribosoraen, die grtStea Messenger BlA aai einige Fragment® größerer Partikel sind·

Dieses Objekt wird so angeoriii©fe_# daß eine ZftisohenfläOhe mit einer ATR-Zelle odei? einem dtfemen Filmliehtlelter geschaffen wird und ei» ErregungastrahlöEg, die auf die Zelle oder den

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Film gerlohtet wird erzeugt eine Erregungszone oder einen Bereich im Objekt. Da die Braun*sehe Bewegung die Partikel durch diesen Bereich hindurchtreten läßt, findet eine Im wesentlichen vollständige Modulation ihrer Emission Über einigen wenigen hundert Ä der Bewegung statt. Die Schärfe der Grenze des Bereichs ist derart, daß die Modulationsfrequenzen die durch Autokorrelation des äußeren Randstörpegels im Signal erhalten werden von 0 bis 1 kHz gehen« wenn die Virusgrößen 18O - 3500 A beträgt.

Wenn nun in einer geeigneten Instrumentenschaltung die log-log-Pourier Transformation der Autokorrelationskurve der Durohschnittswechselstrom-Signalkoraponente des fluorlsierenden Signals berechnet wird, kann'man eine gerade Liniendarstellung der Schleife erlangen, die proportional dem hydrodynamischen Partikelradius 1st und deren Abschnitt proportional zu dem Produkt von Partikelkonzentration mal Partikelnukleinsäuregehalt ist.

Nachstehend werden AusfUhrungsbelspiele der Erfindung anhand der Zeichnung beschrieben. In der Zeichnung zeigen:

Fig. 1 eine sohematisohe, teilweise abgebrochene Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung; .

Flg. 2 eine der Figur I entsprechende Ansicht einer abgewandelten Ausführungsform der Erfindung;

Fig. 3 ein Blockschaltbild der Vorrichtung zur Feststellung und Klassifizierung kleiner Partikel, z.B. von Viren;

Fig. 4 ein Diagramm, welches ein von der Vorrichtung nach Figur 1 eltgeleitetes Signal erkennen läßt;

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Pig. 5 eine schematische perspektivische Ansicht eines Teils einer weiteren Ausführungsform der Erfindung.

Im folgenden wird zunächst auf Figur 1 der Zeichnung Bezug genommen. Hier ist eine Vorrichtung dargestellt, die die Prinzipien derErfindung verkörpert und diese Vorrichtung weist einen innen total reflektierenden Körper oder Lichtleiter in Gestalt einer Zelle 20 auf» Als eine Bedingung zur Erlangung einer abklingenden Welle muß die Zelle 20 einen optischen Pfad durch ein Material bieten, das einen größeren Breohungsindex hat* als der Bereich von Indices des flüssigen Mediums« das die zu untersuchenden Partikel trägt» Das Material äer Zelle 20 muß außerdem über den Wellenlangenbareioh des erregenden Strahlungsstrahles transparent sein und sollte außerdem eine genügende physikalische und chemische Stabilität sowohl im Hinblick auf die Erregungs· strahlung als anoti das flüssige Medium haben_s welches die ZwisohenflKohe mit üer Zelle bildet«, Unter den typischen Materialien* die benutzt wenden können, sind Gläser z.B. Mondglas wad Flintglas, -Quarz^ gesetwnolzenes Silicium und synthetische ©pgamlgeiie Polymere« s®Bo Polystyrol und PoIy-

System weist vorzugsweise eine Quelle % liefert-, welcher in typischen Fall X®n Wellenlängenteanä liegt und nach © Srfinätmg beruht aiefat auf dieser Beaietang ist eine 3s wird _a wie

cnit einem fOFgloisSaswelse .setaalen Uellealängenband zu erregen^

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welches sich wesentlich von dem Wellenlängenband der erregten Fluoreszenz-Emission unterscheidet. So 1st die Quelle 22 im typischen Fall ein Monochromator oder vorzugsweise ein Laser, um eine Quelle mit hoher Intensität zur Verfügung zu haben, was im Hinblick auf die Kleinheit der Partikel wünschenswert ist.

Der Monochromator weist gewöhnlich Mittel auf, um den Ausgangsstrahl 24 zu sammeln« was vom Standpunkt der totalen Heflektion aus ebenfalls sehr erwünscht 1st.

Die Zelle 20 kann verschieden ausgebildet sein. Figur 1 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform, wobei die Dicke zur Veranschaulichung übertrieben dargestellt ist. Die hier benutzte Zelle mit totaler Reflektion besteht aus einem rechteckigen flachen Blatt oder einem dünnen Film aus einem Material, welohes für den Strahl 24 transparent 1st. Die grüßten gegenüberliegenden Selten, d.h. die Oberflächen 26 und 27 des Blattes sind im wesentlichen eben und verlaufen parallel zueinander. Bei optimaler Ausbildung sind die Oberflächen 26 und 27 optisoh eben, so daß ein Liohtleckstrom infolge winziger Fehlstellen vermieden wird, die den Einfallwinkel eines reflektierten Strahles veranlassen könnten, den kritischen Winkel an der Fehlstelle zu überschreiten. Im typischen Fall besteht die Zelle 20 aus einer etwa 75 χ 25 mm großen Sillciummlkroskoplersoheibe mit etwa 1 mm Dicke. Die gegenüberliegenden Ränder 28 und 29 der , Zelle 20 sind poliert und in Winkeln abgeschrägt, die im Hinblick auf die kritischen Winkel für innere Reflektion und die Länge der Platte so gewählt sind, daß eine geeignete Pfadlänge sich ergibt, um eine innere mehrfaoh Totalreflektion zwischen den Rändern 28 und 29 zu erreichen, wobei der Strahl der an einem Seitenrand eintritt, etwa normal zur Oberfläche in diese

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eintritt und aus dem anderen Hand In gleioher Weise austritt.

Stattdessen kann» wie dies bekannt ist, eine der Oberflächen 26 oder 27 dadurch gebildet werden, daß mittels eines geeigneten optischen Kitts mit richtigem Brechungsindex ein Prisma angekittet wird, das die Eingangsoberfläche bildet, in die der Brregersträhl 24 eingeführt werden kann.

Wie erwähnt wird eine.abklingende Welle, die z.B. an der Zwischenfläche erzeugt wird, wo die Oberfläche 26 das flüssige- Medium 30 berührt expodentiell in Richtung normal zu der Grenze oder Zwisohenflache abgeiohwäoht. Für bestehende optische Materialien kann bei einer praktischen Beleuohtungsgeometrie die Tiefe der Zone oder des Bereiches der so beleuchtet wird, ein Minimum werden und etwa 1/20 einer Wellenlänge betragen, d.h. sehr viel weniger als die durch Beugung begrenzte Auflösung, die bei gewöhnlichen Lichtquellen möglich 1st. OlelohzeitIg beträgt der beleuchtete Bereich infolge der Wellenleitung längs der Oberfläche mehrere mm , selbst bei einer Dicke von nur 250 A . Der Abstand (1/e) über den die Welle wirksam in das flüssige Medium eintritt, kann zwisohen dem oben erwähnten Minimalwert und mehreren Wellenlängen dadurch geändert werden, daß der Einfallwinkele des innen in der Zelle 20 mehrfach reflektierten Strahls insbesondere in der Nähe des kritischen Winkels geändert wird. Um diese Änderung durchführen zu können, kann die erflndungsgemäBe Vorrichtung eine Abstimmvorrichtung aufweisen, die In ihrer einfachsten Form als Drehspiegel 32 ausgebildet 1st, der zwisohen dem Eintrittsrand 28 der Zelle und dem Aus-' tritt der Strahlungsquelle 22 vorgesehen ist, so daß der Winkel geändert werden kann, unter* dem fler Strahl 24 in die Oberfläohe des Randes 28 eintritt. Wenn der am Rand 28 einfallende

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Strahl relativ breitbandig ist, sollte er so dioht als möglich zu der normalen auf der Oberfläche des Randes 28 eingeführt werden, um eine chromatische Dispersion des Strahles zu vermelden. Wie erwähnt 1st es daher erwünsoht, einen schmalbandigen oder monochromatischen Strahl zu benutzen, so daß bei Abstimmung der ATR-ZeHe gegenüber der wirksamen Eindringtiefe der sich abschwächenden Welle der Eingangsstrahl in den Rand 28 unter eine m variablen Winkel eingeführt werden kann, ohne daß chromatische Effekte auftreten. .

Wie aus Figur 1 ersichtlich, ist benachbart zu der Oberfläche 26, auf welcher eine Sohicht der Objektträgerflüssigkeit angeordnet ist, eine Einrichtung vorgesehen, um die Strahlemission der Partikel festzustellen, die sich in die abklingende Welle hinein und aus dieser heraus bewegen. Vorzugswelse wird als Detektor dafür eine Betraohtungsoptik, beispielsweise ein Mikroskop Jk benutzt, welches nur sohematisoh abgebrochen dargestellt ist: Es ist klar, daß der spezielle Typ des optischen Systems nicht kritisoh 1st und es können demgemäß sowohl brechende als auch reflektierende Optiken benutzt werden. Wenn Abbildungsoptiken benutzt werden, sind zweokmäßigerweise Verstellantriebe, wie z.B. Zahnstange und Ritzel 35 vorgesehen, um das optische System fokusieren zu können. Die erste konjugierte Ebene, d.h. die Objektebene des optischen Systems (unter der Annahme eines ana&tigmatisohen Systems) kann auf diese Welse im wesentlichen in die gleiche Ebene mit dem Bereich (im folgenden als "Erregungsbereich" bezeichnet) in dem Medium gebracht werden, der durch die abklingende Welle durchsetzt wird, die gemäß dem Durohtritt des Erregerstrahles 24 durch die Zelle 20 durch mehrfach Totalreflektion im Inneren erzeugt wurde.

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Im Betrieb wird Licht, das eine Strahlung von Ultraviolett bis Infrarot einschließen soll durch den Spiegel 32 unter einem geeigneten Winkel in den Rand 28 der Zelle 20 geschickt. Eine Objektträgerflüssigkeit 30, die die aufzufindenden Partikel enthält, wird wie dargestellt, auf der oberen Oberfläche 26 der Zelle 20 aufgebracht. Auf diese Weise wird die Zelle durch den Strahl 24 so beleuchtet, daß totale innere Mehrfachbrechung an den Zwichenflachen zwischen der Oberfläche 26 und dem Medium 30 auftrifft. Wie erwähnt, breitet sich die durch die Reflektionen des Strahls erzeugte abklingende Welle parallel zur Oberfläche 26 auf und sie wird exponentiell in dem Medium 30 von der Zwischenfläche zwischen dem Medium und der Zelle 20 abgeschwächt. Die Braun¹sehe Bewegung kleiner Partikel in dem Medium 30 bewegt damit letzteres in den Erregungsbereich im Medium 30 und aus diesem heraus, in dem die abklingende Welle eine beträchtliche Feldstärke besitzt. Da die Partikel durch das Mikroskop 34 entweder durch Beugung der abklingenden Welle oder durch Fluoreszenz erregt in den Partikeln durch die abklingende Welle beobachtet werden, wir-d die Emission der Partikel moduliert, d.h. sie scheint zu skintillieren, wobei die Sklntillationsdauer durch die Länge der Zeit bestimmt wird, während der die Partikel im Erregungsbereich innerhalb des Mediums 30 verbleiben. Die Partikel außerhalb der Erregungszone emitieren natürlich keine Strahlung und sind deshalb nicht sichtbar.

Der Erregungsbereich wirkt so als "Blendenöffnung", von der nur eine Abmessung,nämlich die Dicke extrem klein ist. Diese wirksame Öffnung ist wie gesagt kleiner als die Auflösungskraft irgendeines optischen Bilderzeugungs-Systems, weil sie notwendigerweise unter der durch die Beugung gesetzten Grenze liegt. Da

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jedoch nur eine Dimension des Erregungsbereiches im Medium J)O klein ist, kann ein vernünftig bemessenes Volumen erhalten werden. Wenn z.B. die 1/e-Dicke des Erregungsbereichs 1/10 einer Wellenlänge ist und die Betrachtungsoptik Jk ein herkömmliches optisches Mikroskop ist, umfaßt das Gesichtsfeld des MikroskopobjektiV'S einen Teil des Erregungsbereichs; der im typischen Falle wenige hundert Kubik Mikrometer-Volumen umfaßt. So ist eine hohe Partikelkonzentration in dem Flüssigkeitsmedium nicht erforderlich, um eine statistisch hinreichende Aufstellung von Partikelsignalen in einer vernünftig kurzen Zeit zu erhalten, weil das vom optischen System 56 erfaßte Volumen relativ groß ist. Auch ist die Funktion 1/e selbst-apodizierend, da die erhaltene Auflösung größer ist, als die von Aperturöffnungen zu erwartende, die eine gleiche Größe haben, jedoch nicht apodizierend sind.

Der "Apertur"-Abschnitt des erregten Bereiches unterscheidet gegenüber großen Partikeln da nur ein kleiner Teil dieser großen Partikel gleichzeitig in dem erregten Bereich sein kann. So erzeugen die großen Partikel keine Signale, die die den kleinen Partikeln entsprechenden Signale überdecken könnten· Der Erregungsbeeich ist unmittelbar angrenzend an eine physikalische Grenze und die durch die abklingende Welle erzeugte Beleuchtung ist prinzipiell auf die Stagnationsschicht der Flüssigkeit begrenzt, so daß die Wirkung von Konvektionsströmen in den Partikeln (bei Objektträgern mit Mulde ein Problem) bei der Erfindung vermindert ist. Weil der erregte Bereich so dünn ist, ist die Durchschnittsverweilzeit für die Partikel, die durch Braun'sehe Bewegung durch den Bereich hindurchbewegt¹ werden, sehr kurz. Dies führt zu einer relativ hohen Modulationsfrequenz der Amplitude des Lichtsignals, das von den Partikeln ausgeht. Wegen dieser Hochfrequenz, die durch die ATR Aperturöffnung aufgeprägt wird, kann das relativ niederfrequente Signal,

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welches von der Drehung eines langgestreckten Partikels herrührt, wirksam unterschieden werden.

Eine andere Art der Unterscheidung gegenüber unerwünschten Effekten liegt in der Tatsache, daß bei der ATR Beleuchtung der Poynting-Vektor parallel zur Oberfläche liegt. So wird die Fotophorese als Störungseffekt vermindert, da die fotophoretlsch induzierte Bewegung Bewegung parallel zu der Zwischenfläche verläuft, statt normal hierzu, während die "Aperturöffnung¹¹ eine maximale Modulation des Signals liefert, das von einem Partikel her rührt, der sich in einer Richtung normal zur Zwischenfläche bewegt.

Gemäß einem Merkmal der Erfindung wird die Objektträgerflüssigkeit mit einem oder mehreren fluoreszierenden Farbstoffen behandelt, die den Partikeln spezifisch sind oder Bestandteile solcher Partikel sind. So kann man beispielsweise die Nukleinsäuren der Virenpartikel mit einer Zahl von Farbstoffen einfärben, die fluoreszieren, wenn sie in geeigneter Weise erregt werden. Zu dteem Zweck können bekannte Farbstoffe benutzt werden, wie z.B. Akridin-Orange, Chinakrin-Mustard, Äthydiumbromid, Pyronin B, Aurophosphin, Euchrysln 2GNX, Vesuvin, Rhodamin S, Rhodamin B, Rhodamin 6g, Coriphosphln 0, Civanol, Acriflavin, Atabrin, Phosphin, Benzoflavin, Rheonin A, Thio-.flavin T, Berberin und viele andere Verbindungen. Der Eingangsstrahl 24 ist vorzugsweise auf Wellenlängen begrenzt, die im Absorptionsband der speziell benutzten Farbe liegen. Die abklingende Welle erregt eine Fluoreszenz in den Molekülen,der dünn über das Strömungsmittel J50 dispergieren Farbstoffe aber nur im Erregungsbereich der letzteren und es wird ebenfalls eine Fluoreszenz in den Farbkonzentrationen in den eingefärbten Partikeln bewirkt, die im Erregungsbereich des Mediums 30 liegen. In Bezug auf die gefärbten Partikel führt

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die geringe Dicke der Apertur-Öffnung bzw. des erregten Bereiches zusammen mit der Bewegung der Partikel zu einem beträchtlich verminderten Ausbleichen oder anderen fotochemischen Reaktionen, da die Partikel nicht alle gleichzeitig im Strahl sind, da sie nach dem Überlagerungsverfahren behandelt werden. .

Gemäß einer abgewandelten Ausführungsform der Erfindung, die in Figur 2 dargestellt ist, wird die Zwischenfläche zwischen der Objektträgerflüssigkeit 30 und der ATR-Zelle 20 von der unteren Oberfläche 27 der Zelle 20 gebildet, statt von der Oberseite. Dies geschieht dadurch, daß ein mit einer Mulde versehener Qlasobjektträger oder ein anderer Behälter 36 unter die ATR Zelle gebracht wird und daß der Behälter 36 mit einer Objektträgerflüssigkeit 30 angefüllt wird. Bei dem Aufbau nach Figur 1 ergibt sich, daß die Fluoreszenz, die in den erregten Bereichen des Mediums 30 auftritt, durch die übrige Flüssigkeit hindurchlaufen muß, bevor sie durch das Mikroskop 30 gesammelt wird und wenn das Flüssigkeitsmedium trübe oder sonstwie absorbierend innerhalb der Emissionsbandbreite der fluoreszierenden Partikel ist, dann werden die Fluoreszenz-Signale abgeschwächt. Andererseits wird die Fluoreszenz-Emission, die im Erregungsbereich des Mediums 30 auftritt, einer nicht so hohen Absorption unterworfen, weil bei dem Ausführungsbeispiel nach Figur 2 die Betrachtungsoptik J>k den Erregungsbereich durch die ATR Zelle betrachtet, so daß der grüßte Teil des FlUssigkeltsmedlums 30 außerhalb des Strahlenpfades zwischen dem Erregungsbereich und der Betrachtungsoptik 34 liegt.

Die Feststellung der skintillierenden Partikel kann natürlich einfach durch Beobachtung der Skintillationen durch das Okular

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des Mikroskops 3^ erfolgen. Der Wert solcher Beobachtungen ist jedoch beschränkt auf die Bestimmung, ob derartige gesuchte Partikel vorhanden sind oder nicht. Wenn man beispielsweise ein Objekt mit einem Farbstoff einfärbt, der einer Nukleinsäure spezifisch ist, das Objekt mit einer abklingenden Lichtwelle geeigneter Wellenlänge erregt und den Erregungsbereich des Objekts durch eine geeignete Optik betrachtet entsprechend gefiltert, um nur die Wellenlängen der erwarteten Fluoreszenz zu sehen, dann kann das Fehlen oder Vorhandensein von Viren festgestellt werden. Eine Unterscheidung zwischen den Partikeln der Größe nach kann jedoch nur durch visuelle Beobachtung nicht auf einfache Weise erfolgen.

Figur 3 zeigt eine Vorrichtung, der in der genannten älteren Patentanmeldung beschriebenen Bauart abgewandelt^nach den Lehren der Erfindung. Diese Vorrichtung wird vorzugsweise benutzt, um eine Unterscheidung der Größe durchzuführen. In Figur 5 bezeichnen gleiche Bezugszeichen die gleichen Teile. Die Strahlungsquelle 24 projeziert Licht durch ein räumliches Filter in Gestalt einer ATR Zelle 20. Das AusfUhrungsbeispiel gemäß Figur 3 hat wiederum eine konventionelle Optik 34 zum Erkennen von Licht, welches In einem erregten Bereich der Objektträgerflüssigkeit auftritt und um dieses Licht auf einen Strahlenteiler 38 gelangen zu lassen, wodurch es in zwei oder mehrere Strahlen aufgeteilt wird, die durch Bandpaßfilter 40 und 42 hindurchtreten und dann auf entsprechende Detektoren 44 und 46 gerichtet werden. Die Filtei 4o und 42 dienen zur Begrenzung der wirksamen spektralen Bänder, die durch die Detektoren 40 und 46 erkannt werden, so daß das System zwischen Fluoreszenzen unterscheiden kann, die aus Partikeln austreten, welche unterschiedliche Farbaffinitäten besitzen. Es ist beispielsweise bekannt, daß Viren im wesentlichen

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entweder aus Deoxyribonukleinsäure oder Ribonukleinsäure bestehen, die gewöhnlich von einer Proteinschale umgeben ist und daß derartige Nukleinsäuren durch gewisse Farbstoffe eingefärbt werden können, die jeweils ein charakteristisches Fluoreszenz-Emissionsspektrum liefern, wobei die Spektren einander sehr unterschiedlich sind. Die Detektoren 44 und 46 sind im typischen Falle Fotozellen, z.B. Fotospannungszellen oder Fotowiderstände, die ein elektrisches Signal proportional zur Amplitude der einfallenden Lichtintensität liefern und die in der Lage sind, extrem schnell anzusprechen. Die Ausgänge der Detektoren 44 und 46 sind mit entsprechenden Verstärkern 48 und 50 verbunden, deren Ausgänge, mit bekannten Typen von Frequenzanalysatoren 52 und 54 verbunden sind, die im einzelnen weiter unten beschrieben werden. Die Frequenzanalysatoren sind vorzugsweise synchronisiert, beispielsweise durch einen gemeinsamen Zeitgeberkreis, der ihnen zugeordnet ist. Der Ausgang des Frequenzanalysator kann visuell oder vorzugsweise durch automatische Aufzeichnung auf Streifenkarten beobachtet werden oder man kann den Ausgang einem Computer zuführen, um eine weitere Behandlung zu bewirken.

Im Betrieb der gemäß Figur 5 ausgebildeten Anlage werden die von den Detektoren 44 und 46 empfangenen Signale durch die Bewegung der lichtemitierenden Partikel im Erregungsbereich des Flüssigkeitsmediums 30 moduliert, und zwar durch die Bewegung in einer Richtung mit einer Komponente normal zur Zwischenfläche zwichen dem Flüssigkeitsmedium 30 und der ATR Zelle 20. Die Modulation erscheint im wesentlichen in Gestalt von Lichtimpulsen, wobei jeder Impuls das Vorhandensein eines Partikels repräsentiert, während die Impulsbreite die Verweilzeit des Partikels im Erregungsbereich angibt. Ein Rand der ATR "Apertur-Öffnung" ist die von der Oberfläche der Zelle 20 gebildete-Grenze, so daß die Partikel diesen Rand nicht übertreten. Der andere oder

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der offene Rand <ir ATR öffnung ist das Feld der abklingenden Welle, dessen Stärke von der Zwischenfläche exponentiell abfällt. Wenn ein Partikel diesen letzteren Rand überschreitet und in den Erregungsbereich eintritt oder aus diesem austritt, steigt die Emisäons-Intensität des Partikels exponentiell an oder fällt exponentiell ab. Der von jdem Partikel erzeugte Impuls hat demgemäß exponentiell ansteigende und abfallende Flanken, wenn der Partikel sich durch die Öffnung bewegt.

Die Detektoren 44 und 46 erkennen jeweils ein Intensitätsspektrum von Licht aus eimer Mehrzahl von Partikeln, die sich im Erregungsbereich bewegen. Dieses Licht ist eine Summierung sämtlicher Impulse innerhalb eines bestimmten Wellenlängenbandes und jedes hat Impulsränder, die sich exponentiell gemäß der Geschwindigkeit der Partikel über dem offenen Rand ändern. Die Schärfe des offenen Randes ist derart, daß Modulationsfrequenzen, die durch Autokorrelation aus dem Umgebungsstör-

ο nebel erhalten werden bei einer Virusgröße von 180-3500 A, von 0 bis 1 kHz reichen. Das von jedem Detektor erzeugte Ausgangs signal wird dann einer Fourier-Transformation unterworfen und dies wird in einem der Frequenzanalysatoren 52 und 54 vorgenommen. Die Ausgänge der letzteren stellen dann graphisch aufgezeichnet Kurven in Ausdrücken der Modulationsftequenz in Abhängigkeit von einer Funktion der Signalintensität dar.

Ein typisches Diagramm des Ausgangs eines Frequenzanalysator 52 oder 54 ist in Figur 4 dargestellt. Hier sind mehrere Extremwerte vorhanden, deren Lage jeweils proportional dem äquivalenten Diffusionsdurchmesser der verschiedenen Partikel ist. Di« Höhe des Extremwertes und die Fläche sind proportional zur Menge der vorhandenen Partikel,deren Größe durch die Lage der

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Extremwerte angezeigt wird. Ein solches Diagramm, welches zunächst mit einer Vielzahl von Partikeln bekannter Größe aufgenommen wird, kann benutzt werden, um das System zu eichen, so daß die Lage der Maximalpunkte in der graphischen Darstellung hergestellt mit Partikeln unbekannter Größe einen Rückschluß auf deren Größe zuläßt.

Natürlich können auch andere Frequenzanalyse-Verfahren benutzt werden. Zum Beispiel kann ein etwas verwickelteres System benutzt werden, bei dem ein Korrelator zur selbstätigen Korrelation des Ausgangs vom Detektor verwendet wird, bevor die Frequenzanalyse durchgeführt wird. So führt der Frequenzanalysator eine Fourier-Transformation der Autokorrelationsfunktion durch. Nach Linearisierung Jender Fourier-Transformation können die erhaltenen Daten ganz einfach interpretiert werden. Man kann z.B. das System benutzen welches D.S. Thompson in seinem Artikel "A Simple Method for Analyzing an Inelastic Light Scattering Spectra", Rev. of Scientific Instruments, Band ²U, Seiten 1228-1229, August 1970, beschrieben hat. .

Zusätzlich zu den vorstehend erwähnten Vorteilen gibt es weitere Aspekte der Erfindung, die von Interesse sind. So ist die Feldstärke der abklingenden Welle im freien Raum größer als jene des Erregungsstrahles und es wird praktisch eine Verstärkung bewirkt. Ein anderer Weg der Erklärung des Vorstehenden besteht darin, daß der Strahlquerschnitt wirksam komprimiert wird, obgleich Leistung erhalten wird und die Intensität, die von der Beleuchtungsquelle benötigt wird, um ein gegebenes Signal von einem kleinen Partikel zu erhalten, vermindert ist. Außerdem ermöglicht die Benutzung der ATR Zelle die Anwendung eines Dunkelfeld-Beleuch-. tungsmikroskops mit numerischen Aperturen über den gegenwärtig praktischen Grenzwerten von etwa 1.2· Der Grund dafür ist darin zu suchen, daß bei gegenwärtig verfügbaren Dunkelfeldsystemen der

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der Kondenser, der mit seiner höchsten numerischen Apertur arbeitet, einen Ring oder einen Lichtring oder Lichtkonus beleuchten muß, der kleiner ist, als der von der numerischen Apertur des Mikroskops aufgenommen würde. Ein eingetauchter Kondensator kann einen Beleuchtungskonus mit einer NA von ungefähr bis zu 1,4 bilden. Nur der äußere Rand des Mikroskopfeldes kann beobachtet werden, während der innere Teil des Kondenserfeldes verdunkelt 1st. Dies beschränkt die größte numerische Apertur, die in Verbindung mit dem Mikroskopkondensor benutzbar ist schwerwiegend und auch den festen Sammelwinkel des Objektivs,gemäß&er vorliegenden Erfindung wird die Beleuchtung wirksam in Gestalt eines flachen Blattes winziger Dicke, d.h. im Erregungsbereich, so daß zur Beobachtung des Dunkelfeldes ein Mikroskop mit der größten verfügbaren numerischen Apertur benutzt werden kann.

Wie erwähnt, erfolgt die Modulation gemäß der Erfindung aus der Bewegung der Partikel in einer Richtung, die eine Komponente hat, welche zur ATR Zwischenfläche bewegt wird. Wenn es erwünscht ist, kann man jedoch auch eine Modulation erhalten, die in anderen Achsen liegt, d.h. parallel zu der ATR Fläche. Ein Gerät das dies bewirkt, ist in Figur 5 gezeigt, wo wiederum entsprechende Teile mit gleichen Bezugszeichen versehen sind. Hier ist eine gleiche ATR Zelle 20, eine Lichtquelle 22, ein Medium 30 und eine Abbildungsoptik 34 vorgesehen, wie sie den Ausführungsbeispielen nach Figur 1 und 2 entsprechen. Zusätzlich dazu ist jedoch ein Strahlteiler 38 vorgesehen, der den Ausgangsstrahl 40 der Strahlquelle 20 in zwei Strahlen 42 und 44 aufspaltet, die in einer gemeinsamen Ebene liegen, jedoch divergieren oder konvergieren, und zwar um einen ganz geringen Winkel Θ. Die Strahlaufepaltvorrichtung 38 ist vorzugsweise so einstellbar, daß θ geändert werden kann. Die Strahlen werden beide in den Rand 28 der Zelle 20 gerichtet, so daß sie auf die Oberfläche 27 mit

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- 21 -

einem gewissen Einfallswinkel auftreffen.

Bei dem Ausführungsbeispiel nach Figur 5 sollte die Lichtquelle 22 einen Lichtstrahl mit monochromatischer Strahlung erzeugen. Es zeigt sich dann, daß wegen der winkelmäßigen Trennung zwischen den Strahlen 42 und 44 die beiden Strahlen zeitlich koherent sind und ein Interferenzmuster innerhalb der Zelle 20 ergeben. Das in der Zelle 20 erzeugte Interferenzmuster ergibt keine Effekte, die durch die Optik 24 sichtbar sind und daher ist es wichtiger, daß die durch jeden Strahl 42 und 44 erzeugten abklingenden Wellen miteinander interferieren, wodurch ein Interferenzmuster von erregten und nicht erregten Partikeln im Bereich des Mediums 30 erhalten wird, in den die abklingenden Wellen eindringen. Weil die abklingenden Wellen langsame Wellen sind, kann das interferenzmuster mit Dimensionen erzeugt werden, die in der Größenordnung eines Bruchteils einer Wellenlänge der ursprünglichen Erregungsstrahlung liegen. Der Abstand im Muster kann durch Änderung des Winkels θ verändert werden. Ein Partikel, der sich parallel zur Ebene der Zwischenfläche bewegt und innerhalb des Feldes der abklingenden Wellen befindlich ist, wird dann aufeinanderfolgend durch das Feld erregt bzw. nicht erregt in Abhängigkeit von der Natur des Interferenzmusters und die erregte Emission von den Partikeln wird in entsprechender Welse moduliert.

Es können gewisse Änderungen bei den vorstehend beschriebenen Apparaturen und Verfahren vorgenommen werden ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen.

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Claims

Ansprüche

.J Vorrichtung zur Peststellung submikrometrisch bemessener Partikel in einem flüssigen Medium dadurch gekennzeichnet, daß eine mit totaler Innenreflektion versehene Zellef26) wenigstens teilweise durch eine Zwischenfläche mit dem FlüssigkeitsmediumC^O)in Berührung steht und daß eine optische Betrachtungseinrichtung(j54)vorgesehen ist, die derart fokusiert werden kann, daß die erste konjugierte Ebene im wesentlichen mit dem Bereich des Mediums zusammenfällt, der' von einer abklingenden Welle durchsetzt wirdi die durch die InneraPeflektion eines Erregungsstrahls(24)durch Strahlung innerhalb der Zelle erzeugt wird.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß die erste konjugierte Ebene mit dem Bereich zusammenfällt.
J. Vorrichtung nach Anspruch 1 dadurch.gekennzeichnet, daß Mittel vorgesehen sind, um die in der Braun¹sehen Bewegung befindlichen Partikel in diesem Bereich festzustellen, wobei eine Intensitätsmodulation der Strahlung stattfindet, die durch diese Partikel gemäß der abklingenden Welle erzeugt wird. .
4. Vorrichtung nach Anspruch 3 dadurch gekennzeichnet, daß ein Frequenzanalysator($2.,54Jvorgesehen ist, um die Modulation zu analysieren.
5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1-4 dadurch gekennzeichnet, daß die totalreflektierende Zelle (2.0) aus einem Material besteht, das einen höheren Brechungsindex besitzt, als das flüssige Medium.

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6. Vorrichtung nach Anspruch 5 dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel zur Feststellung der Strahlungsemission aus einem Mikroskop bestehen.
7. Vorrichtung nach Anspruch 5 dadurch gekennzeichnet, daß Mittel vorgesehen sind, um einen Beleuchtungsstrahl in die Zelle unter einem einstellbaren Winkel gegenüber der Zwischenfläche zu schicken.
8. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1-5 dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle(20)zwischen dem Detektor und dem Bereich in dem flüssigen Medium angeordnet ist.
9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1-8 dadurch gekennzeichnet, daß der Bereich zwischen der Zelle(20)und dem Detektor liegt.
10. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1-9 dadurch gekennzeichnet, daß Bandfilterf4o,42)vorgesehen sind, um die Strahlungsemission zu filtern, bevor sie auf den Detektor gelangt.
11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1-10 dadurch gekennzeichnet, daß eine Beleuchtungsquelle (22jvorgesehen ist.
12. Vorrichtung nach Anspruch 11 dadurch gekennzeichnet, daß die Beleuchtungsquelle monochromatisches Licht ausstrahlt.
13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1-12 dadurch gekennzeichnet, daß Mittel vorgesehen sind, um zwei zeitlich koherente koplanare Strahlen zu erzeugen, die einem Winkel θ zueinander in ihrer gemeinsamen Ebene einschließen und mit Bezug auf die Zelle (20) so angeordnet sind, daß die Strahlen die Zelle durch totale Innenreflektion durchsetzen können,

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wobei sie wenigstens zum Teil von der Oberfläche mit im wesentlichen dem gleichen Winkel abgestrahlt werden.
14. Vorrichtung nach AnspruchYl5^dadurch gekennzeichnet, daß ein Detektor vorgesehen ist, der die Strahlungsemission von den in Braun'scher Bewegung in dem Bereich des Mediums benachbart zur Zwischenfläche befindlichen Partikeln feststellt.
15. Vorrichtung nach Anspruch IjJ dadurch gekennzeichnet, daß der Winkel θ größenmäßig einstellbar ist.
16. Vorrichtung nach Anspruch IJ dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Strahlen monochromatisch sind und im wesentlichen die gleiche Wellenlänge besitzen.
17. Vorrichtung nach Anspruch 13 dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung zur Erzeugung der Strahlen eine Strahlungsquelle für im wesentlichen monochromatisches Licht aufweist, der ein Strahlteiler(38 )vorgeschaltet ist, um die monochromatische Strahlung in die beiden Strahlen aufzuteilen.
18. Verfahren zur Peststellung submikrometrisch bemessener Partikel in einem flüssigen Medium, vorzugsweise unter Benutzung der Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 - I7 dadurch gekennzeichnet, daß das Medium mit abklingenden Wellen be- ' leuchtet wird, die in einem Bereich des Strömungsmediums benachbart zu einer Zwischenfläche zwischen dem flüssigen Medium und einer Oberfläche auftreten, die ein anderes Medium mit höherem Brechungsindex begrenzt, durch das der Erregerstrahl durch Totalreflektion wenigstens zum Teil in der Zwischenfläche fortschreitet,

daß die emitierte Strahlung, die gemäß der abklingenden Welle durch Partikel erzeugt wird, die sich in jenem Bereich in Braun¹scher Bewegung befinden, festgestellt wird und

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daß die Modulation der Strahlungsemission einer Frequenzanalyse unterworfen wird, die durch Bewegung der Partikel über die Grenzen des Bereiches entstanden ist.
19· Verfahren nach Anspruch 18.dadurch gekennzeichnet, daß der Detektor die Streuung der abklingenden Wellen von den Partikeln feststellt.
20. Verfahren nach Anspruch 18 dadurch gekennzeichnet, daß

der Erregerstrahl Wellenlängen umfaßt, die in der Lage sind, eine Fluoreszenz in Jenen Partikeln zu erzeugen
21. Verfahren nach Anspruch 18 dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel mit einer Fluoreszenz-Farbe eingefärbt werden und daß die Beleuchtung mit abklingenden Wellen erfolgt, die ausgehen von der Ausbreitung einer Erregungsstrahlung, die Erregerwellenlängen dieser Farbe besitzt.
22. Verfahren nach Anspruch 18 dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel mit mehreren fluoreszierenden Farben eingefärbt werden, von denen Jede ein anderes unterschiedliches Charakter· istisches Fluoreszenz-Emissionsband besitzt und daß die,Beleuchtung mit abklingenden Wellen stattfindet, die aus der Ausbreitung einer Erregungsstrahlung gewonnen werden, die Erregungswellenlängen für diese Farbe besitzt und daß Bandfilter die Strahlung, die von diesen Partikeln ausgeht ausfiltern, um zwischen den Fluoreszenzen zu unterscheiden, die von unterschiedlichen Einfärbungen ausgehen.

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