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Hintergrund der Erfindung
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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen optische Erfassungssysteme
zur Verwendung in einer analytischen Instrumentenausrüstung mit
mehreren Kapillaren. Insbesondere beinhaltet die vorliegende Erfindung
eine Vorrichtung und Verfahren zum automatischen Ausrichten eines
elektromagnetischen Strahls auf die Mitten von jeder einer Vielzahl
von Kapillaren, die gemeinsam eine Kapillaranordnung bilden.
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Beschreibung
des Standes der Technik
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Elektrophoretische
Trennverfahren wurden für
Jahrzehnte verwendet, um Moleküle
gemäß Unterschieden
der effektiven Ladung der Moleküle und/oder
gemäß Unterschieden
der Molekülgröße der Moleküle zu trennen.
Bis in letzter Zeit wurden elektrophoretische Trennungen in Gelplatten
oder offenen Gelbetten durchgeführt,
die typischerweise aus Polyacrylamid-Gelmaterial hergestellt waren.
In jüngerer
Zeit haben Kapillarelektrophoreseverfahren in Kombination mit photometrischen
Erfassungsverfahren die Automatisierung und schnelle quantitative Analyse
von Molekülen
ermöglicht.
Trennungen mit hoher Auflösung
von Molekülen
mit verschiedenen effektiven Ladungen wurden durch Anwenden von elektrophoretischen
Prinzipien auf mit Puffer gefüllte oder
mit Gel gefüllte
schmale Kapillarrohre erreicht.
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Typischerweise
werden Kapillarsäulen,
die bei der Kapillarelektrophorese verwendet werden, aus Längen einer
Siliziumdioxidrohrleitung mit Durchmessern in der Größenordnung
von 25 μm
bis 200 μm
und Längen
von etwa 10 bis 200 cm hergestellt. Die Puffer- und Geltrennmedien
werden direkt in die Säuleninnenräume gepumpt,
analytische Proben werden in ein Ende der Säule bewegt und ein elektrisches
Feld wird an die Säule
angelegt. Geladene Spezies innerhalb der Säule wandern unter dem Einfluss
des elektrischen Feldes mit einer Rate, die von ihrer elektrophoretischen
Beweglichkeit abhängt. Die
Kapillarelektrophorese wird verwendet, um zahlreiche Arten von Molekülen zu trennen,
einschließlich
Peptiden, Proteinen und Oligonukleotiden, Nukleinsäuren und
anderen geladenen Molekülspezies. Das
Gebiet der elektrophoretischen Trenntechnologie erfährt eine
kontinuierliche Weiterentwicklung bezüglich der Arten und Größen von
Molekülen,
die unter Verwendung von Kapillarelektrophoreseprozeduren getrennt
und erfasst werden können.
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Die
Vorteile, die mit der Kapillarelektrophorese verbunden sind, sind
zahlreich. Eine quantitative Information kann mit sehr kleinen Probengrößen erreicht
werden und die Menge an Gel oder Puffer, das/der verbraucht wird,
ist winzig. Ferner ist die Zeit, die für die Trennungen erforderlich
ist, deutlich verringert im Vergleich zu Plattengelverfahren und
das Verfahren eignet sich zur Automatisierung und zur elektronischen
Datenspeicherung und Datenverarbeitung.
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In
letzter Zeit hat die Kopplung von Detektoren für durch Laser induzierte Fluoreszenz
(LIF) mit der Kapillarelektrophorese-Instrumentenausrüstung (CE-LIF)
die Erfassungsempfindlichkeit, die mit der Kapillarelektrophorese
verbunden ist, um Größenordnungen
verbessert. Dies hat zur Fähigkeit
geführt, subpikomolare
Mengen von fluoreszent markierten Molekülen innerhalb einer Kapillare
zu erfassen. Da die Kapillarelektrophorese und insbesondere die CE-LIF-Technologie
für die
schnelle automatisierte Trennung und Erfassung von winzigen Mengen
von Material gesorgt haben, ist sie besonders attraktiv für Trenn-
und Analyseverfahren bei Anwendungen, bei denen nur Mikroliter von
Probenvolumen, das nanomolare Konzentrationen von Analyt enthält, zur
Verfügung
stehen. Ein Nachteil, der mit herkömmlichen Kapillarelektrophoresesystemen
verbunden ist, ist ihr gesamter Probendurchsatz. Herkömmliche
Plattengel-Elektrophoresesysteme
erfordern typischerweise längere
Durchlaufzeiten, aber jede Platte ist in der Lage, eine große Anzahl
von Proben zu analysieren, was die Anzahl von Trennungen innerhalb
eines gegebenen Zeitraums größer macht.
Eine typische Kapillarelektrophoresetrennung und -analyse kann beispielsweise
nur 15 Minuten für
eine einzelne Probe erfordern, oder vier Trennungen pro Stunde.
Im Gegensatz dazu kann eine Plattengeltrennung zehn Proben aufnehmen
und eine Stunde Durchlaufzeit erfordern, oder zehn Trennungen pro
Stunde.
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Beim
Angehen des Problems des Gesamtdurchsatzes wurden mehrere Elektrophoresesysteme
mit mehreren Kapillaren vorgeschlagen. Ein solches System ist im
US-Patent Nrn. 5 091 652 und 5 274 240 beschrieben. Ein weiteres
System, das im gleichzeitig anhängigen
US-Patent S/N 08/429 406 beschrieben ist, verwendet eine Anordnung
von Kapillarsäulen,
die in einer bandartigen Konfiguration angeordnet sind, und einen
einzelnen Detektor zum Erfassen des Analyten in allen Säulen. In
diesem auf einer galvanometrischen Abtastvorrichtung basierenden
Erfassungssystem wird veranlasst, dass sich ein galvanometrischer
Abtastspiegel schrittweise bewegt, um fokussierte elektromagnetische
Strahlung nacheinander auf jede Kapillare in der Anordnung zu richten.
Um die höchstmögliche Detektorempfindlichkeit
und das effizienteste Tastverhältnis
zu erreichen, ist es erwünscht,
dass der fokussierte Strahl jede Kapillare in ihrer Mitte beleuchtet
oder abfragt. Dies stellt sicher, dass die Zeit, in der der Beleuchtungsstrahl
auf die Mitte abzielt, maximiert wird und die Zeit, in der der Strahl
außermittig
ist, minimiert wird.
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Das
US-Patent Nr. 5 274 240 beschreibt eine durch einen Laser angeregte
Kapillaranordnungs-Abtastungsvorrichtung mit einer Vielzahl von Kapillaren
mit einer parallelen, nebeneinander liegenden, koplanaren Beziehung
und einem durch einen Laser angeregten konfokalen Fluoreszenzdetektor
zum Erfassen der Fluoreszenz von ausgewählten Innenvolumina von jeder
der Kapillaren nacheinander und wiederholt während der Elektrophorese oder einem
anderen Trennverfahren. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren
zum Analysieren einer Vielzahl von Kapillaren mit einer einzigen
Abtastvorrichtung durch Abtasten einer Vielzahl von Kapillardurchgängen in
einer nebeneinander liegenden Beziehung und periodisches und wiederholtes
Erfassen der Fluoreszenz von jedem Kapillardurchgang während der Elektrophorese
oder einem anderen Trennverfahren.
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Da
Kapillaren von Elektrophoresesystemen mit mehreren Kapillaren häufig vom
Benutzer ausgetauscht werden und zwischen den Durchläufen aufgrund
von kleinen Temperaturänderungen
oder Druckschwankungen, die durch Austauschen von Gel und/oder Puffern
verursacht werden, physikalisch getrennt werden können, verbessert
die Fähigkeit,
einen Quellenstrahl bezüglich
der Mitte jeder Kapillare genau auszurichten, die Leistung des Systems.
Die Fähigkeit,
die Position eines fokussierten Quellenstrahls bezüglich der
Mitte jeder Kapillare vor jedem elektrophoretischen Durchlauf in
einem Vorabtast-Ausrichtungsschritt
schnell und automatisch auszurichten, ist tatsächlich sehr erwünscht.
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ZUSAMMENFASSUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine Vorrichtung und Verfahren zum
automatischen Ausrichten eines fokussierten Quellenstrahls auf die
Mitte jeder Kapillare in einem Elektrophoresesystem mit mehreren
Kapillaren bereit. Eine solche Vorrichtung und solche Verfahren
zur automatischen Ausrichtung ermöglichen Benutzern, Kapillaren
auszuwechseln und sich über
die wiederholte Empfindlichkeit und Genauigkeit in ihren Tests mit
mehreren Kapillaren sicher zu sein.
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Folglich
wird eine automatisierte Vorrichtung und ein automatisiertes Verfahren
zur optischen Ausrichtung dargelegt, die durch eine Ausrichtungssequenz
die Mitten von jeder einer Vielzahl von Kapillarsäulen ermitteln,
die in einer bandartigen Anordnung konfiguriert sind. Für diesen
Zweck wird mindestens eine Quelle für elektromagnetische Strahlung,
vorzugsweise ein Laser, bereitgestellt, um elektromagnetische Strahlung
zu emittieren. Auf eine kontinuierliche und schnelle Weise bewegt
eine galvanometrische Abtastvorrichtung einen Spiegel in sehr kleinen
Schrittinkrementen, was bewirkt, dass ein Laserstrahl mit elektromagnetischer
Strahlung die Kapillaren in der Kapillaranordnung überstreicht. Der
Strahl tritt mit jeder der Kapillarsäulen in Wechselwirkung, um
ein Lichtmuster mit variabler Intensität von durchgelassener und gestreuter
Strahlung vorzusehen. Während
der Abtastung überwacht
ein geeignet angeordneter Detektor die Intensität des durchgelassenen Strahls
als Funktion der Spiegelposition. Ein Prozessor leitet Strahlungsintensitäten ab, die
darauf hindeuten, dass der Strahl auf die Mitte der Säulen auftrifft,
und ermittelt die diesen Kapillarenmitten entsprechenden Spiegelpositionen.
Die Positionen des Abtastspiegels, die dem Strahl, der auf jede Säulenmitte
auftrifft, entsprechen, werden ausgewählt und gespeichert. Da die
Vorabtastung die elektromagnetische Quelle optisch auf die Mitten
der Säulen
ausgerichtet hat, steuert der Prozessor anschließend den Abtastspiegel, um
den Strahl von Säulenmitte
zu Säulenmitte
sehr schnell schrittweise abzulenken. Auf diese Weise wird die mit
der Beleuchtung jeder Kapillare in den außermittigen Positionen verbrachte
Zeit minimiert, wobei das Tastverhältnis optimiert und maximale
Empfindlichkeit bereitgestellt wird. In Systemen mit mehreren Kapillaren,
in denen die Erfassung auf Fluoreszenz basiert, sehen die Verfahren
und die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung vorteilhafterweise
eine erhöhte Empfindlichkeit
für sowohl
Anregung als auch Emission vor.
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Gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Vorrichtung zum Ermitteln
der horizontalen Mittelposition einer Vielzahl von Kapillarsäulen in
einer Kapillaranordnung bereitgestellt, mit:
einem Erzeugungsmittel
zum Erzeugen von elektromagnetischer Strahlung; einem Mittel zum
Lenken von elektromagnetischer Strahlung zum Lenken der elektromagnetischen
Strahlung auf jede der Säulen, wobei
die elektromagnetische Strahlung die Säulen abtastet, um ein Strahlungsmuster
mit variabler Intensität
zu erzeugen; und einem Detektormittel zum Erfassen des variablen
Strahlungsintensitätsmusters,
dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung ferner ein Prozessormittel
zum Vergleichen der Position des Lenkmittels mit dem erfassten Strahlungsmuster
umfasst, um die Positionen des Lenkmittels entsprechend dem Lenkmittel,
das elektromagnetische Strahlung auf die horizontale Säulenmitte
jeder Kapillarsäule
lenkt, zu ermitteln.
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Das
Lenkmittel kann zu Positionsänderungen
in der Lage sein, um jede der Säulen
in einer horizontalen Richtung nacheinander abzutasten, um die Strahlungsmuster
mit variabler Intensität
zu liefern.
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Die
Vorrichtung kann ferner ein Sensormittel zum Abtasten der Position
des Lenkmittels während der
Abtastung umfassen, und das Prozessormittel vergleicht die Position
des Lenkmittels mit dem erfassten Strahlungsmuster, um die Positionen
des Lenkmittels entsprechend dem Lenkmittel, das elektromagnetische
Strahlung auf die Säulenmitten
lenkt, zu ermitteln.
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Das
Lenkmittel kann ein Reflektor sein.
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Das
Lenkmittel kann die elektromagnetische Strahlung entlang einer Laserachse
auf die Anordnung lenken, wobei der Detektor entlang der Achse und
hinter der Anordnung angeordnet ist.
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Alternativ
kann das Lenkmittel die elektromagnetische Strahlung entlang einer
Laserachse auf die Anordnung lenken, wobei der Detektor in einer
von der Achse versetzten Position und hinter der Anordnung angeordnet
ist.
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Das
Lenkmittel kann ein Spiegel sein, der an einer galvanometrischen
Abtastvorrichtung montiert ist.
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Das
Erzeugungsmittel kann ein Laser sein.
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Das
Lenkmittel kann einen Abtastreflektor, der zum Reflektieren des
Strahls von elektromagnetischer Strahlung auf die Anordnung positionierbar ist,
um Fluoreszenz zu induzieren; und
einen Detektor für induzierte
Fluoreszenz, um die Fluoreszenzintensität der Proben in den Kapillaren zu
erfassen, umfassen.
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Der
Intensitätsmusterdetektor
kann eine Photodiode sein.
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Eine
Achse kann durch den durch den Reflektor auf die horizontale Mitte
der Anordnung reflektierten Strahl definiert werden, wobei der Intensitätsmusterdetektor
auf der Achse hinter der Anordnung angeordnet ist.
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Eine
Achse kann durch den Strahl, der vom Reflektor auf die horizontale
Mitte der Anordnung reflektiert wird, definiert werden, wobei der
Intensitätsmusterdetektor
in einer von der Achse beabstandeten Position angeordnet ist.
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Gemäß einem
zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum
Ermitteln der horizontalen Mitte für jede Kapillare einer Anordnung bereitgestellt,
umfassend:
Betätigen
eines Lenkmittels zum Lenken von elektromagnetischer Strahlung von
einer Quelle zum Abtasten jeder Kapillare der Anordnung, um ein
Strahlungsmuster mit variabler Intensität für jede Kapillare zu erzeugen,
das eine Mitte für
die Kapillare angibt; Erfassen der Strahlungsintensitätsmuster;
und Feststellen einer Abtastposition des Lenkmittels entsprechend
einer Position, in der das Lenkmittel elektromagnetische Strahlung
auf jede Mitte lenkt, und Verarbeiten der Information, um die Position
des Lenkmittels mit dem erfassten Strahlungsmuster zu vergleichen,
um die Positionen des Lenkmittels entsprechend dem Lenkmittel, das
elektromagnetische Strahlung auf die horizontale Säulenmitte
jeder Kapillarsäule
lenkt, zu ermitteln.
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Zusätzliche
Merkmale und Vorteile der Vorrichtung und des Verfahrens der vorliegenden
Erfindung werden mit Bezug auf die Beschreibung, die Ansprüche und
die Zeichnungen erkannt, in denen gilt:
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ZEICHNUNGEN
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1 stellt
ein optisches System mit mehreren Kapillaren dar, das vom Verfahren
und von der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung profitiert.
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2 stellt
eine Vorrichtung gemäß der vorliegenden
Erfindung dar, die einen Detektor auf der Achse und einen bevorzugten
außeraxialen
Detektor zeigt.
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3 stellt
ein Intensitätsmuster
von elektromagnetischer Strahlung dar, das von einem Detektor auf
der Achse und einem außeraxialen
Detektor erfasst wird, wenn ein Quellenstrahl über eine Kapillarsäule abgelenkt
wird.
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4 ist
ein Ablaufplan, der die Operationssequenzen zum Ermitteln der Säulenmitten
darstellt.
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5 ist
ein Spektrum eines Intensitätsmusters,
das von einem Detektor auf der Achse wahrgenommen wird, wenn ein
Quellenstrahl über
eine Anordnung von acht Kapillarsäulen abgelenkt wird.
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6 ist
ein vergrößertes Spektrum
einer Kapillare, die im Spektrum von 5 gezeigt
ist.
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7 ist
ein Spektrum eines Intensitätsmusters,
das von einem außeraxialen
Detektor beobachtet wird, wenn ein Quellenstrahl über eine
Anordnung von acht Kapillarsäulen
abgelenkt wird.
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8 ist
ein Überlagerungsspektrum,
das durch Kombinieren des Spektrums des Detektors auf der Achse
von 5 und des Spektrums des außeraxialen Detektors von 7 erhalten
wird.
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9 ist
eine Tabelle, die die Positionen von außeraxialen Detektoren und die
Anzahl von Schritten der galvanometrischen Abtastvorrichtung von
der mittleren Position einer Kapillare versetzt darstellt.
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10 stellt
eine Vorrichtung eines alternatives Ausführungsbeispiels der vorliegenden
Erfindung dar.
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BESCHREIBUNG
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Die
vorliegende Erfindung ist auf eine Vorrichtung und Verfahren zur
automatisierten optischen Ausrichtung gerichtet, die in elektrophoretischen Trennsystemen
mit mehreren Kapillaren Verwendung finden. Fachleute werden erkennen,
dass die hierin beschriebene Erfindung zur Verwendung in Systemen
mit der Erfassung auf optischer Basis, einschließlich, jedoch nicht begrenzt
auf Fluoreszenz, UV-sichtbar, Brechungsindex, thermooptisches Absorptionsvermögen und
entartete Vier-Wellen-Abbildung, geeignet ist. Da die Fluoreszenzerfassung
typischerweise das Verfahren der Wahl zum Erzielen einer Erfassung
mit hoher Empfindlichkeit nach der Kapillarelektrophoresetrennung
ist, verwendet das bevorzugte Ausführungsbeispiel eine Laserquelle
und Fluoreszenzerfassung (CE-LIF). Fachleute würden auch erkennen, dass die
Funktionsweise und das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung
auch bei anderen Anwendungen verwendet werden könnten, bei denen die Ermittlung
der Mitten von transparenten oder halbtransparenten Säulen oder
Rohren erforderlich ist.
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Als
Hintergrund sind die Vorrichtung und das Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung dazu ausgelegt, mit einem CE-LIF-System 10 verwendet zu
werden, das in 1 allgemein gezeigt ist und das
in der anhängigen
US-Patentanmeldung
Ser.-Nr. 08/429 406 beschrieben ist, deren Beschreibung für Hintergrundzwecke
durch Bezugnahme aufgenommen wird. Um die Abfrage zur Analyse durchzuführen, erfordert
das CE-LIF-System 10 im Allgemeinen das Lenken von elektromagnetischer
Abfragestrahlung auf jedes Probenvolumen, das in jeder Kapillarsäule 11 in
einer Anordnung 12 mit mehreren Kapillaren enthalten ist.
Typischerweise wird die Abfrage nacheinander und wiederholt durchgeführt, in
der Praxis sind jedoch die Vorrichtung und das Verfahren vielseitig
und eine beliebige einzelne Kapillare in irgendeiner Reihenfolge
kann abgefragt werden. Makromoleküle, die mit Fluoreszenzmarkern
markiert sind, fluoreszieren, wenn sie durch die elektromagnetische
Abfragestrahlung angeregt werden. Diese Fluoreszenz wird gesammelt
und erfasst, um die Anwesenheit, Konzentration und den Ort der markierten Makromoleküle zu ermitteln.
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Um
die elektromagnetische Strahlung auf die Anordnung 12 zur
Erfassung zu lenken, umfasst unter weiterer Bezugnahme auf 1 das
CE-LIF-System 10 mindestens eine Quelle für elektromagnetische
Strahlung, die für
Erläuterungszwecke
als Paar von Lasern 14A, B gezeigt ist. Das CE-LIF-System 10 kann
auch mehrere Quellen für
elektromagnetische Strahlung umfassen Der Laser 14A kann
ein Diodenlaser sein, der eine Wellenlänge von 655 nm emittiert, wohingegen
der Laser 14B eine Wellenlänge von 755 nm aufweisen kann.
Es soll selbstverständlich
sein, dass in Abhängigkeit
von der Markierung der Makromoleküle eine Vielzahl von Quellen für elektromagnetische
Strahlung verwendet werden können,
um eine Vielzahl von Wellenlängen
zur Anregung eines geeignet markierten Makromoleküls in jeder
Kapillarsäule 11 auszurichten.
Das Ausgangssignal der Laser 14A, 14B wird durch
Linienfilter 16A, 16B zu einem Strahlkombinator 18 wie
z.B. einem dichroitischen Spiegel geleitet, der zum Lenken der Strahlen 20 von
den Lasern 14A, 14B entlang eines gemeinsamen
optischen Weges A wirkt.
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Um
die Abfragestrahlen 20 auf die Anordnung 12 zu
lenken, umfasst das System 10 eine galvanometrische Abtastvorrichtung 22,
die einen Reflektor wie z.B. einen Spiegel 23 umfasst.
Die Abtastvorrichtung 22 ist von der Art, die von General
Scanning in Kalifornien hergestellt wird. Die Abtastvorrichtung 22 ist
eine elektromechanische Präzisionsvorrichtung
mit hoher Geschwindigkeit, die aufgrund ihres vorteilhaften Drehmoment-Trägheits-Verhältnisses
eine schnelle dynamische Reaktion aufweist. Das Anlegen einer Abtastspannung
an die Abtastvorrichtung 22 bewirkt, dass sich der Spiegel 23 bewegt, um
den Strahl 20 so zu reflektieren, dass er, wie nachstehend
beschrieben, die Kapillaranordnung 12 abtastet.
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An
der Abtastvorrichtung 22 wird der Strahl durch eine Abtastfokussierlinse 24 auf
die Kapillaranordnung 12 reflektiert. In dem gezeigten
System beleuchtet der reflektierte Strahl 20 jede Kapillare
oder fragt diese ab und regt geeignet fluoreszierende Verbindungen
an, damit sie Fluoreszenzstrahlung emittieren. Insofern als ein
Paar von elektromagnetischen Quellen, die Laser 14A und 14B,
in 1 gezeigt sind, geschieht die Abfrage jeder Kapillarsäule der Anordnung 12 vorzugsweise
mit einer ersten Wellenlänge,
d.h. dem vom Laser 14A emittierten Strahl für alle Kapillarsäulen, und
anschließend
geschieht dieselbe Abfrage mit dem reflektierten Strahl, der vom Laser 14B emittiert
wird. In der Praxis können
alle Abfragewellenlängen
in einer einzelnen Abtastung gehandhabt werden.
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Um
die durch einen Laser induzierte Fluoreszenzstrahlung, die von den
Säulen 11 emittiert
wird, aufzufangen und zu sammeln und um die Strahlung in einen LIF-Detektor 26 zu lenken,
umfasst das CE-LIF-System 10 einen parabolischen Kollektor 28 mit
hohem Sammelwirkungsgrad. Die Kapillaranordnung 12, wie
in 1 dargestellt, ist um den Brennpunkt des Kollektors 28 angeordnet.
Die Abfragestrahlen werden durch die Fokussierlinse 26 durch eine Öffnung (nicht
dargestellt) in einer Seite des Kollektors 28 gelenkt.
Fluoreszenzemission, die als Strahlen 30 von jeder abgefragten
Kapillarsäule
dargestellt ist, wird durch den Kollektor 28 gesammelt und
auf den Detektor 26 gelenkt, der eine Photovervielfacherröhre oder
ein anderer geeigneter Detektor ist. Zwischen dem Detektor 26 und
der Anordnung 12 kann ein Streustab 32 in einer
zur Achse der Anordnung 12 senkrechten Ebene angeordnet
sein, um starkes Laserstreulicht, das die Säulen 11 umgibt, in dieser
Ebene zu sperren. Ein oder mehrere Filter 34 können auch
selektiv angeordnet sein, um jegliche Streu- oder Hintergrundanregungsstrahlung
von der Quelle zu sperren und die Übertragung von ausgewählter Emissionsfluoreszenz
von den angeregten Proben in den Kapillarsäulen 11 zu ermöglichen.
Eine Detektorlinse 35 fokussiert die Strahlen 32 auf
den Detektor 26.
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Der
Detektor 26 liefert ein Signal als Reaktion auf die Anwesenheit
der emittierten Strahlen 30 zu einem Prozessor, der allgemein
mit 36 bezeichnet ist, zur Ermittlung der Anwesenheit und
Konzentration des entsprechenden markierten Makromoleküls. Wie in 1 dargestellt,
umfasst die Anordnung 12 acht koplanare, parallel angeordnete
Kapillarsäulen 11, die
nebeneinander postiert sind. Es sollte selbstverständlich sein,
dass eine beliebige Anzahl von Säulen 11,
wie z.B. zwölf,
an der Anordnung 12 vorgesehen sein kann. Die Kapillarsäulen 11 werden
aus Quarz hergestellt und weisen Abmessungen auf, die mit der speziellen
Anwendung variieren können.
Geeignete Kapillarenabmessungen können für diejenigen typisch sein,
die bei Kapillarelektrophoreseverfahren verwendet werden, und umfassen
Längen zwischen
20 cm und 500 cm und Durchmesser zwischen 20 μm und 500 μm. Vorzugsweise weisen die Kapillaren
relativ große
Wanddicken von ungefähr
50 μm auf.
Die Säulen 11 werden
manuell auf einem Anordnungssubstrat zusammengeklebt, um die Säulenposition
sicherzustellen. Für
die nachstehenden Zwecke wird auf einen Kapillarenaußendurchmesser von
200 μm und
einen Innendurchmesser von 100 μm
für Erörterungszwecke
Bezug genommen, wenn nicht anders angegeben. Die Anordnung 12 ist
so in Stellung gebracht, dass der fokussierte Strahl 20 zu den
Längsachsen
der zylindrischen Säulen 11 senkrecht
verläuft.
Sobald zusammengefügt,
wird die Anordnung 12 durch eine Haltevorrichtung (nicht
dargestellt) entnehmbar und austauschbar im Kapillarelektrophoresesystem 10 gehalten.
Eine Hochspannungsversorgung wird mit der Anordnung 12 und
jeder Säule 11 gekoppelt,
ebenso wie ein Rohrverteiler (auch nicht gezeigt). Der Rohrverteiler
liefert ein Trennmedium, das Gel und/oder Puffer unter hohem Druck
umfassen kann, zu jeder der Kapillarsäulen 11.
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Wie
vorstehend erörtert,
wird, um die analytische Empfindlichkeit zu maximieren und das effizienteste
Tastverhältnis
durch Minimieren der Zeit, die der Abfragestrahl von der Säulenmitte
entfernt verbringt, vorzusehen, die vorliegende Erfindung bereitgestellt,
um den Abfragestrahl örtlich
festzulegen und optisch auf jede der Säulenmitten der Säulen der
Anordnung 12 auszurichten.
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Die
vorliegende Erfindung beruht auf der Beobachtung, dass, wenn ein
reflektierter Strahl über eine
Anordnung von Kapillaren abgelenkt wird, ein Lichtmuster mit variabler
Intensität
an einer Stelle hinter der Anordnung beobachtet wird. Vorteilhafterweise
kann die Intensitätsänderung
des Musters, wenn ein Strahl über
die Anordnung abgelenkt wird, verwendet werden, um die Positionen
der Mitten der Kapillarsäulen
zu ermitteln.
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Mit
Bezug auf 2 ist eine Vorrichtung 100 zum
optischen Ausrichten eines reflektierten Laserstrahls 110 gemäß der vorliegenden
Erfindung dargestellt. Die Vorrichtung 100 umfasst einen
Detektor 112a (oder 112b), der hinter einer Kapillaranordnung 114 zum
Erfassen von Mustern 116 von elektromagnetischer Strahlung
mit variabler Intensität
angeordnet ist, welche während
einer Ablenkung eines reflektierten Strahls 110 über die
Anordnung 114 erzeugt werden. Der Detektor 112a und 112b kann
von beliebiger Art sein, die für
erfasste elektromagnetische Strahlung innerhalb des Wellenlängenbereichs
des durchgelassenen Strahls geeignet ist. Photodioden sind wegen
ihrer Einfachheit und leichten Handhabung bevorzugt.
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Der
Weg des reflektierten Strahls 110 durch die Mitte der Anordnung 114 legt
eine zentrale Achse 120 fest. Wie in 2 gezeigt,
kann der Detektor 112a und 112b auf der Achse 120 (wie
durch die Position des Detektors 112a angegeben) oder in
einer außeraxialen
Position 120 (wie durch die Position des Detektors 112b angegeben)
angeordnet sein. Wie nachstehend erörtert, ist der Detektor vorzugsweise
in einer Position hinter der Anordnung 114 und außerhalb
der Achse 120 angeordnet, um beste Ergebnisse zu liefern.
In den am meisten bevorzugten Ausführungsbeispielen befindet sich
der Detektor 112b 130 mm hinter der Kapillaranordnung 114 und 20
mm außerhalb
der Achse 120.
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Um
mit dem Detektor 112a oder 112b zusammenzuwirken,
wird eine galvanometrische Abtastvorrichtung 122 und ein
zugehöriger
Abtastspiegel 122a, der an der Abtastvorrichtung 122 montiert ist,
durch einen Prozessor (nicht dargestellt) gesteuert, der eine Folge
von Spannungen an die Abtastvorrichtung 122 anlegt. Die
Folge von angelegten Spannungen bewirkt, dass sich der Abtastspiegel
in schnellen, sehr kleinen Inkrementschritten bewegt und den Strahl 110 auf
eine Weise reflektiert, die bewirkt, dass der Strahl durch die Fokussierlinse 150 hindurchtritt
und über
die Kapillaranordnung 114 hin- und herläuft. Ein Positionssensor für den Abtastspiegel 122a,
z.B. ein Kapazitätspositionssensor,
sendet Signale zu einer Abtastvorrichtungssteuereinheit entsprechend
der Position des Spiegels 122a. Das Positionssignal des
Spiegels 122a entspricht jeder Inkrementposition des Strahls 110 an
der Anordnung 114.
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Gemäß dem in 2 gezeigten
Ausführungsbeispiel
und der speziellen verwendeten galvanometrischen Abtastvorrichtung
führt ein
Schritt von 1,8 mV in der Spannung für die Abtastvorrichtung 122 zu
einem diskreten Schritt in der resultierenden Strahlposition bei 114.
Auf der Basis der Positionierung des Abtastspiegels 122a und
der Kapillaren, die gemeinsam die Anordnung 114 bilden,
ist der Schritt von 1,8 mV für
die Abtastvorrichtung 122 gleich einem Schritt von 7,7 μm + 0,6 μm an der
Anordnung 114. Folglich kann bewirkt werden, dass die Abtastvorrichtung 122 den
Abtastspiegel 122a bewegt, indem eine Folge von Schrittspannungen
in schneller Folge ausgegeben wird, oder die Abtastvorrichtung 122 kann
durch Anlegen der geeigneten Spannung an diskreten Stellen an der
Anordnung 114 positioniert werden.
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Mit
Bezug auf 3 ist ein typisches Muster einer
elektromagnetischen Strahlung mit variabler Intensität dargestellt,
das gebildet wird, wenn der reflektierte Strahl 110 über eine
einzelne Kapillarsäule der
Anordnung 114 abgelenkt wird. Das Muster mit variabler
Intensität
ist für
die Positionen des Detektors 112a auf der Achse und des
außeraxialen
Detektors 112b dargestellt. Wenn der Strahl 110 die
Kapillarsäule
verfehlt, wird die elektromagnetische Strahlung als Strahl mit maximaler
Intensität
durchgelassen. Wenn der Strahl 110 über die Wand der Kapillarsäule streicht,
wird ein diffuses Muster mit niedrigerer Intensität präsentiert,
das mit der Intensität zunimmt, wenn
der Strahl zur Mitte der Kapillarsäule weitergeht. Wenn sich der
Strahl in der Säulenmitte
befindet, ist das Muster der durchgelassenen Lichtintensität symmetrisch,
wobei die Intensität
in der Mitte groß ist
und an den Kanten gestreut. Beim Wegbewegen von der Säulenmittenposition
fällt die
Intensität
ab, da die Strahlung diffus durch die Kapillarwand durchgelassen
wird. Schließlich
läuft der
Strahl zu einer Stelle zwischen der Kapillare und ihrer benachbarten
Kapillare und wird als weiterer eng fokussierter Strahl mit maximaler
Intensität
erfasst.
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Es
ist zu sehen, dass die erfasste elektromagnetische Strahlung ein
Spektrum mit variabler Intensität
erzeugt, das vorteilhafterweise verwendet werden kann, um die Position
der Abtastvorrichtung 122 entsprechend dem reflektierenden
Strahl 110 an jeder Kapillarmitte zu ermitteln. Da jede
Abtastvorrichtungsposition einen eindeutigen angelegten Spannungswert
hat, können
durch Korrelieren der angelegten Spannung entsprechend dem Strahlungsmuster,
das jeder Säulenmitte
zugeordnet ist, Abtastspiegelpositionen für jede Säulenmitte ermittelt werden.
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Mit
erneutem Bezug auf 3 nimmt der Detektor 112a auf
der Achse ein sehr starkes schmales Signal wahr, wenn der Strahl
eine Kapillare verfehlt, entweder weil er die Anordnung verfehlt
oder sich zwischen den Kapillaren befindet. Der Detektor 112a nimmt
ein schwaches, breites, diffuses Signal wahr, wenn der Strahl auf
eine Kapillarwand auftrifft, und einen hellen Punkt, der das breite
Streumuster durchquert, wenn der Strahl die Mitte der Kapillare überstreicht.
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Bei
einem weiteren Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung ist der Detektor außeraxial (Detektor 112b)
und 20 mm zur Seite der Laserachse 120 angeordnet. Wie
in 3 dargestellt, nimmt der außeraxiale Detektor 112b geringfügig unterschiedliche
Muster im Vergleich zu den vom Detektor 112a auf der Achse
erfassten wahr. Der Detektor 112b erfasst kein Licht, wenn
der Laser eine Kapillare verfehlt, aber erfasst einen starken Lichtpunkt,
wenn der Strahl durch die Kapillarmitte abtastet. Wie von Fachleuten
erkannt werden kann, ist der außeraxiale
Detektor 112b angeordnet, um eine verbesserte Empfindlichkeit
für den
Säulenmitten-Ermittlungsprozess vorzusehen.
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Das
Verfahren zum Ermitteln der Positionen der Abtastvorrichtung 122,
die der Mitte jeder Kapillarensäulenanordnung 114 entsprechen,
umfasst Sequenzen, die in 4 aufgezeichnet
sind. Nachdem die Anordnung 114 im Brennpunkt des parabolischen Kollektors 124 installiert
ist, leitet mit Bezug auf 3 in Verbindung
mit 4 ein Prozessor einen Vorabtastschritt für den Laser
N1, beispielsweise die Laserquelle 126a,
ein. Während
der Vorabtastung wird eine Sequenz eingeleitet, die eine Spannung
an die Abtastvorrichtung 122 ausgibt, um den Spiegel 122a in
einer Endposition anzuordnen. Anschließend wird eine schnelle Folge
von Spannungen an die Abtastvorrichtung 122 ausgegeben,
um den Abtastspiegel 122a schnell schrittweise zu ändern, um
den reflektierten Strahl 110 hin und her über die
Anordnung 114 abzulenken.
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5 stellt
ein Spektrum des Intensitätsmusters
dar, das vom Detektor 112a auf der Achse wahrgenommen wird,
wenn der Strahl 110 jede Kapillare der Anordnung 114 hin
und her abtastet. 7 stellt ein ähnliches
Spektrum des Intensitätsmusters dar,
das vom außeraxialen
Detektor 112b wahrgenommen wird, wenn der Strahl 120 jede
Kapillare der Anordnung 114 abtastet. Signale entsprechend
den Intensitäten,
die vom Detektor 112a erfasst werden, werden zum Prozessor
gesandt. Wie vorstehend angegeben, entspricht jeder Schritt der
Abtastvorrichtung 122 einer Spannungseingabe von 1,8 mV
und 7,7 +/– 0,6
Mikrometer.
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Eine
Datei wird mit der Detektorsignalintensität als Funktion der Position
der galvanometrischen Abtastvorrichtung oder des Spiegels erzeugt.
Ein Prozessor analysiert die Daten und gewinnt die Positionen des
Abtastspiegels 122a, die diesen Spannungsintensitäten entsprechen,
die vom Detektor 112a erfasst werden, die die Mitten der
Kapillarsäulen
angeben. Diese Mittenpositionsdaten werden dann bei der anschließenden Datensammlung
während
der Elektrophoresedurchläufe
verwendet. Am Ende der Ausrichtungsabtastung für den Laser 126a wird
dieselbe Ausrichtungsvorabtastung für den Laser 126b und
anschließend
für beliebige
zusätzliche Quellen
eingeleitet und ausgeführt.
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Mit
erneutem Bezug auf 5 ist das Intensitätsmuster
der elektromagnetischen Strahlung als Funktion der Position der
Abtastvorrichtung 122 für eine
Anordnung mit acht Kapillarsäulen
(a–h)
gezeigt, wie es vom auf der Achse liegenden Detektor 112a,
der hinter der Anordnung 114 angeordnet ist, erfasst wird.
Das Muster umfasst Maxima 58 a–h entsprechend den Positionen
des Abtastspiegels 122a, wenn der reflektierte Strahl 110 auf
die Mitte jeder Säule
auftrifft. Die Endteile 60 des Spektrums von 5 verdeutlichen,
wenn der Strahl die Anordnung vollständig verfehlt, wohingegen die
Zwischenspitzen zwischen den Maxima 58a–h für die Säulen 11 das starke
Signal angeben, das empfangen wird, wenn der Strahl den Bereich
zwischen den Kapillaren beleuchtet. Während der Vorabtastausrichtung
tastet der Strahl an den Enden der Anordnung 114 vorbei ab
und erzeugt die äußerst starken
Spitzen, die als Endteile 60 gezeigt sind, die verarbeitet
werden, um die Enden der Anordnung 114 zu ermitteln. 6 stellt
einen vergrößerten Teil
von 5 entsprechend dem Strahlungsintensitätsmuster
bereit, das erhalten wird, wenn die Kapillare h abgetastet wird.
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Mit
erneutem Bezug auf 7 ist das Intensitätsmuster
der elektromagnetischen Strahlung als Funktion der Position der
Abtastvorrichtung 122 für eine
Anordnung mit acht Kapillarsäulen
(a–h)
gezeigt, wie vom außeraxialen
Detektor 112b erfasst, der hinter der Anordnung 114 angeordnet
ist. Das Intensitätsmuster
der durchgelassenen elektromagnetischen Strahlung, das während der
Abtastung erzeugt wird, erzeugt acht diskrete Maxima 62a–h, die die
Strahlpositionen angeben, die geringfügig außerhalb der Säulenmitte
und in der Säulenbohrung
der 8 Säulen
(a–h)
liegen. (Siehe 3 und das Lichtmuster, das vom
außeraxialen
Detektor wahrgenommen wird). Es ist zu sehen, dass die vom außeraxialen Detektor 112b wahrgenommenen
Spitzen keine Maxima erreichen, bis einige Schritte, nachdem der
Detektor auf der Achse eine Kapillarmitte registriert. Dies liegt
daran, dass der helle Punkt, der durch den Strahl 110 verursacht
wird, der durch die Kapillarmitte durchgelassen wird, entlang der
Abtastachse läuft und
im Vergleich zum Detektor auf der Achse mehrere Schritte erfordert,
damit er vom außeraxialen
Detektor gesehen wird. Beim dargestellten Ausführungsbeispiel, bei dem der
außeraxiale
Detektor 20 mm außerhalb
der Achse liegt, ist die Anzahl von Schritten 2. Dieses Phänomen ist
in 8 ersichtlich, die eine Überlagerung des Intensitätsmusters
von 5 und 7 ist und den Versatz zwischen
der Kapillarmitte, wie vom Detektor auf der Achse und vom außeraxialen
Detektor erfasst, darstellt. Wie vorstehend erwähnt, sind in diesem Ausführungsbeispiel
die Kapillarmitten, die vom Detektor 112a auf der Achse
wahrgenommen werden, im Allgemeinen vier Schritte von den Maxima,
die vom Detektor 112b beobachtet werden, entfernt, dessen
erfasste Maxima durch die gestrichelten Linien gezeigt sind. Aus der
Information, die für
die Positionen der galvanometrischen Abtastvorrichtung und des Spiegels
bekannt ist, und der in 5 und 7 gefundenen
Information ist die Anzahl von Spiegelpositionen oder Schritten
der galvanometrischen Abtastvorrichtung, die erforderlich sind,
um eine einzelne Kapillare abzutasten, und daher der beim Bewegen
des Spiegels um einen Schritt abgetastete Abstand bekannt. Insbesondere
sind 26 Schritte von 1,8 mV/Schritt erforderlich, um den Spiegel
der galvanometrischen Abtastvorrichtung über eine Kapillare abzulenken.
Im vorliegenden Ausführungsbeispiel
ist eine einzelne Kapillare 200 μm
breit, so dass ein Schritt von 1,8 mV gleich 7,7 +/– 0,6 μm ist. Folglich
liegt ein Versatz von zwei Schritten in der Nähe von 15,5 Mikrometern und ein
Versatz von vier Schritten entspricht etwa 31 μm.
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Aus
den in 5–8 gezeigten
Spektren ist klar, dass die vom außeraxialen Detektor 112b wahrgenommenen
Intensitätsmuster
diskretere Maximaintensitäten
(und folglich ein einfacheres Spektrum) für die Kapillarsäulenmitten-Ermittlung
vorsehen. Folglich wird der Detektor bei bevorzugten Ausführungsbeispielen
außeraxial
angeordnet. Selbst wenn die um 20 mm außeraxiale Position bevorzugt ist,
werden Fachleute erkennen, dass ein beliebiger geeigneter Detektor,
der zum Erfassen irgendeines Teils der gestreuten und durchgelassenen
elektromagnetischen Strahlung angeordnet ist, wenn der Abtastspiegel
einen Strahl über
eine Anordnung lenkt, bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung
verwendet werden kann. 9 stellt dieses Konzept durch
tabellarische Darstellung der Anzahl von Schritten der galvanometrischen
Abtastvorrichtung, die von jeder tatsächlichen Kapillarmitte versetzt sind,
dar, wie für
eine Anzahl von verschiedenen außeraxialen Detektorpositionen
beobachtet. Für
den um 20 mm außeraxialen
Detektor beträgt
beispielsweise an der Kapillare Nr. 3 der Anordnung der Versatz
von der echten Mitte vier Schritte oder etwa 31 μm. Wenn der Detektor weiter
von der Position auf der Achse wegbewegt wird, nimmt der Versatz
zu, wie durch die Versätze
gezeigt, die einem um 25 mm außeraxial
angeordneten Detektor zugeordnet sind. Aus der in 9 bereitgestellten
Information ist ersichtlich, dass die Innen- und Außendurchmesser
der Kapillaren variieren, was eine Variation im Versatz verursacht.
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Sobald
die Kapillarmitten ermittelt wurden und die Positionen des Spiegels 122a der
galvanometrischen Abtastvorrichtung entsprechend jeder Kapillarmitte
für jede
der elektromagnetischen Quellen durch Durchführen des vorstehend beschriebenen
automatischen Ausrichtungsverfahrens ermittelt sind, ist das System
mit mehreren Kapillaren von 1 bereit,
analytische Prozeduren durchzuführen, wie
vorstehend beschrieben. Das heißt,
jeder der fokussierten Quellenstrahlen wird auf die durch Vorabtastung
ermittelten Mitten von jeder der Kapillarsäulen der Anordnung 12 gelenkt,
um eine elektromagnetische Strahlung zur Wechselwirkung mit einer Probe
in den Kapillaren bereitzustellen. In jeder Kapillarmitte kann die
Abtastvorrichtung 22 ihre Position für eine vorgegebene Zeit, beispielsweise
15,7 ms, halten und anschließend
schnell als Reaktion auf die Positionierungsspannung weiterschalten,
um den Strahl 20 auf die nächste Säulenmitte zu lenken. Bei dieser
Betriebsart kann der Fokusstrahl 20 schnell von Mitte zu
Mitte jeder Kapillare 11 schreiten, und zwar mit einer
resultierenden sehr effizienten Probenbeleuchtung und -abfrage.
Dieses Tastverhältnis beinhaltet
das Halten des Strahls in jeder Kapillarmitte für vorgegebene Intervalle. Wenn
beispielsweise acht Kapillaren mit einer effektiven Abtastrate von
2 Hz überwacht
werden sollen, die Zeit zum Durchschreiten von 200 μm (Mitte
zu Mitte der Kapillaren für
100/200 Kapillaren) 400 μs
ist und die Rücklaufabtastzeit
1 ms ist, dann stehen 99,24% der gesamten Abtastzeit als Verweilzeit
zur Verfügung,
wenn die Datensammlung in den Kapillarmitten stattfindet.
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Mit
Bezug auf 10 wird ein weiteres Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung gezeigt, wobei gleiche Komponenten gleiche
Bezugsziffern im Vergleich zu 2 aufweisen.
Gemäß dem in 10 dargestellten
Ausführungsbeispiel
wird ein sekundärer
Spiegel 130 verwendet, um die elektromagnetischen Intensitätsmuster
auf einen Detektor 140a und 140b zu reflektieren.
Wie gezeigt, kann der Detektor im Weg der reflektierten Achse, Detektor 140a,
oder außeraxial,
Detektor 140b, angeordnet sein, um die vorstehend angeführten Intensitätsmuster
zu erhalten. Dieses Ausführungsbeispiel
würde die
Anordnung des Detektors an einer geeigneten Stelle ermöglichen,
sollte die in 1 gezeigte Konfiguration aufgrund
von Größen- oder Anlagenanordnungseinschränkungen
nicht möglich
sein. Die Vorrichtung und die Verfahren der vorliegenden Erfindung
werden typischerweise in einer Vorabtastausrichtung für die anschließende Analyse
unter Verwendung des in 1 gezeigten Systems verwendet.
Es ist jedoch für
Fachleute zu erkennen, dass die automatische Ausrichtungsvorrichtung
oder das automatische Ausrichtungsverfahren der vorliegenden Erfindung
jederzeit Nutzen hat und nicht auf Vorabtastungen begrenzt ist.
Wenn beispielsweise die Kapillarsäulen mit Gel unter hohem Druck
gefüllt
sind, kann eine Ausrichtung eingeleitet werden, um die Ausrichtung
zu bestätigen,
selbst wenn keine Analyse unmittelbar nach dem Austausch des Gels
durchgeführt
werden kann.