-
Gebiet der Erfindung
-
Die Erfindung betrifft im allgemeinen
chromatographische Verfahren und Vorrichtungen für die chemische Analyse und
betrifft insbesondere eine Fluoreszenzkapillarflusszelle mit einem
verbesserten Signal/Rauschverhältnis.
-
In den Figuren wird jedes Element,
das mit einem Bezugszeichen gekennzeichnet ist, mit demselben Bezugszeichen
in jeder Figur versehnen, in der dieses Element vorkommt. Die erste
Ziffer jedes Bezugszeichen bezeichnet die erste Figur, in der das dazugehörige Element
vorgestellt wird.
-
Hintergrund der Erfindung
-
Chromatographische Verfahren werden
häufig
verwendet, um eine Mixtur bzw. eine Mischung in zahlreiche Komponenten
zu zerlegen, so dass diese Komponenten identifiziert und quantifiziert
werden können.
In einer Klasse chromatographischer Verfahren werden Mixturen entlang
einer Trennsäule
befördert,
durch welche die verschiedenen Komponenten mit unterschiedlichen
Flussgeschwindigkeiten wandern. Derartige Techniken werden sowohl
bei gasförmigen
Proben als auch bei flüssigen
Proben verwendet. Diese Techniken werden heutzutage in großem Maße in chemischen,
biologischen und medizinischen Anwendungen verwendet.
-
Eine Vielfalt von Verfahren wird
verwendet, um die gewünschte
Trennung zwischen den Komponenten der Mixtur zu erreichen. In einer
Klasse von Systemen ist die Wand der Röhre, durch die die Mixtur fließt, mit
einem Material beschichtet, das unterschiedliche Affinitäten bzgl.
unterschiedlicher Komponenten der Mixtur aufweist. Die Migrationsgeschwindigkeit
entlang des Kanals ist größer für Komponenten,
die eine schwächere
Affinität
gegenüber der
Wand aufweisen, wodurch eine Trennung der Mischungskomponenten gemäß deren
Affinität
hinsichtlich der beschichteten Wand hervorgerufen wird.
-
In einer weiteren Klasse von Systemen
ist die Säule
mit einem Material gepackt, wie beispielsweise einem Gel, das die
differentielle Wechselwirkung mit den Komponenten der Mischung bereitstellt. Die
Packung wirkt als ein Sieb, das physikalisch den Fluss größerer Moleküle mehr
behindert, als dieses den Fluss kleinerer Moleküle behindert. Zusätzlich kann
die Oberfläche
der Packung chemische Gruppen enthalten, die die Affinität zwischen
der Packung und den verschiedenen Komponenten der Mixtur steuern.
Daher stellen Packungen, wie beispielsweise ein Gel, aufgrund des
großen
Bereichs von Möglichkeiten
hinsichtlich der Porengröße und der
Oberflächengruppen
ein sehr flexibles Medium zum Trennen der Komponenten der Mixtur
dar. Das Probenfluid kann mittels einer Reihe von Techniken durch
diese Packung getrieben werden, wie beispielsweise einem Druckunterschied
zwischen dem Einlassende und dem Auslassende der Kapillare (hier
gleichfalls auch als "Säule" bezeichnet) und/oder
die Verwendung von Kapillarelektrophorese, um Probenionen durch
die Packung voran zu treiben.
-
Derartige Trennsäulen führen typischerweise die Probenlösung entlang
eines Detektors, der eine physikalische Eigenschaft der Komponenten
misst, wie beispielsweise das Absorptionsspektrum, das Fluoreszenzspektrum,
den Brechungsindex oder die elektrische Leitfähigkeit der Probenlösung. In
jedem der ersten drei dieser besonderen Fälle wird ein optischer Strahl
durch die Probe geführt.
Im Fall von Absorptionsmessungen wird ein Detektor entlang einer geraden
Linie durch die optische Quelle und die Trennsäule angeordnet, um den optischen
Strahl zu empfangen, nachdem dieser die Probe passiert hat. Die
Fluoreszenzdetektion weist die Vorteile einer besseren Selektivität und Empfindlichkeit
beim Detektieren zahlreicher Verbindungen auf.
-
Im Fall von Fluoreszenzmessungen
wird die Position des Detektors durch Überlegungen hinsichtlich des
Signal/Rauschverhältnisses
des Detektorausgabesignals bestimmt. Die U.S.-PS 4,548,498 mit dem
Titel "Laser Induced
Fluorescence Detection in Modern Liquid Chromatography With Conventional And
Micro Columns" (Folestad
et al), die am 22. Oktober 1985 erteilt worden ist, beschreibt,
dass der einfallende Lichtstrahl typischerweise senkrecht zu der
Achse der Kapillare verläuft
und daher an der Wand der Kapillare in eine Ebene gestreut wird,
die senkrecht zu der Achse der Kapillare orientiert ist und durch
den Punkt der Kapillare verläuft,
der durch den einfallenden Lichtstrahl beleuchtet wird. Um im Fall von
Fluoreszenzlichtdetektion derartiges gestreutes Licht zu vermeiden,
wird der Detektor außerhalb
dieser Ebene angeordnet und derart orientiert, Licht von der Probe
entlang einer Richtung unter einem Winkel von 30° hinsichtlich der Ebene des
gestreuten Lichts zu empfangen. Die U.S.-PS 4,675,300 mit dem Titel "Laser Excitation
Fluorescence Detection Electrokinetic Separation" (Zare et al), die am 23. Juni 1987 erteilt
worden ist, beschreibt, dass die Verwendung von kohärentem Licht
den Vorteil aufweist, die Raman- und Rayleigh-Streukomponenten des gestreuten Lichts
zu vermindern.
-
Herkömmliche Flusszellen für Fluoreszenzdetektoren
für die
Kapillarflüssigkeitschromatographie
verwenden oftmals eine Linse, um Anregungslicht auf die Flüssigkeitssäule zu fokussieren,
und verwenden oftmals ferner eine Linse, um das Fluoreszenzlicht
auf den Detektor zu fokussieren. In der Kapillarflusszelle, die
in dem Artikel "On-Column
Capillary Flow Cell Utilizing Optical Waveguides For Chromatographic
Applications" von
Alfredo E. Bruno et al, Anal. Chem. 1989, 61, Seiten 876 bis 883
beschrieben wird, werden optische Fasern verwendet, um inkohärentes Licht
zu der Flusszelle zu befördern, und
gleichfalls verwendet, um Fluoreszenzlicht von der Flusszelle zu
einem Detektor zu übertragen.
-
Dieser Artikel beschreibt ferner,
dass optische Fasern beim Richten des beleuchtenden Lichts durch
die Bohrung der Kapillare zu der Kapillarflusszelle genauso effektiv
wie Laserquellen sind. Für
eine Kapillare mit einem bestimmten Innen- und Außendurchmesser
wird eine Berechnung der Strahlenwege vorgestellt, die eine Bestimmung
des maximalen Durchmessers der optischen Faser der Quelle und des
minimalen Durchmessers der optischen Faser zum Sammeln erlauben,
die notwendig sind, damit im wesentlichen das gesamte Licht der
Quelle durch die Bohrung der Kapillare zu der sammelnden optischen Faser
durchgeführt
wird. Eine Analyse der Verteilung des gestreuten Lichts und des
Bruchteils des einfallende Lichts, das tatsächlich durch die Bohrung der Kapillare
durchtritt, ist ebenso in diesem Artikel beschrieben. Da von der
Kapillare auf die sammelnde optische Faser keine Fokussierung von
Licht stattfindet, ist die Sammeleffizienz der sammelnden optischen
Faser durch ihren Akzeptanzwinkel und den Abstand zwischen dem Eingangssignalende
der Kapillare dieser sammelnden optischen Faser begrenzt. Typischerweise
sammelt jedes dieser Fluoreszenzsysteme weniger als ein Achtel des
Fluoreszenzlichts, das von diesem System emittiert wird.
-
Die U.S.-PS 4,199,686 mit dem Titel "Dark Field Illuminator
And Kollektor Apparatus And Method" (Brunstig et al), die am 22. April
1980 erteilt worden ist, und die U.S.-PS 4,273,433 mit dem Titel "Method and Apparatus
For Measurement Of Reradiation In Particle Flow Cell Systems" (Walter P. Hogg), die
am 16. Juni 1981 erteilt worden ist, beschreiben optische Abschnitte
einer Vorrichtung zum Zählen von
Partikeln, wie beispielsweise von biologischen Zellen. Obwohl diese
optischen Abschnitte beim Sammeln von Fluoreszenzlicht effizient
ist, das von den Partikeln emittiert wird, die dem einfallende Licht ausgesetzt
sind, sammelt diese Vorrichtung das Licht, das durch diese Partikel
gestreut wird, genauso effizient wie das Licht, das durch den Partikelstrom durchtritt,
ohne von den Partikeln gestreut oder absorbiert zu werden. Daher
wird ein Mechanismus, wie beispielsweise ein dichromatischer Filter
oder ein Fresnelprisma, umfasst, um den nicht fluoreszenten Bruchteil
des Lichts abzulenken, das von dem optischen Bereich auf den Detektor
fokussiert wird. Die Notwendig keit dieses Mechanismus erhöht die Komplexität und die
Kosten dieses Systems. Da darüber hinaus
dieser Mechanismus bei der Ausscheidung des nicht fluoreszenten
Bruchteils des gesammelten Lichts nicht 100% effizient ist, weist
diese Struktur ein vermindertes Signal/Rauschverhältnis auf.
-
Die U.S.-PS 4,088,407 mit dem Titel "High Pressure Fluorescence
Flow-Through Cuvette" (Dietmar
M. Schoeffel et al), die am 9. Mai 1978 erteilt worden ist, beschreibt
eine Küvette
für die
Flüssigkeitschromatographieanalyse.
Ein Kollektor, der als eine reflektierende Beschichtung auf einer
Oberfläche
ausgebildet ist, die eine parabolische, kreisförmige oder eine elliptische
Rotationsoberfläche
darstellt, leitet einen Teil des Fluoreszenzlichts auf einen Detektor
um. Auf Grund der großen
Größe der Kammer, in
die die Probenflüssigkeit
für die
Fluoreszenzanregung geleitet wird, ist diese Struktur für die Verwendung
mit auf einer Kapillare basierenden Systemen, wie beispielsweise
einer Kapillare bei der Flüssigkeitschromatographie
und der Kapillarelektrophorese, ungeeignet, da ein völlig inakzeptabler
Grad an Bandenverbreiterung bei dem chromatographischen Trennprozess
hervorgerufen werden würde.
Da die Beschreibung keine Angaben bezüglich der Dimensionen des Kollektors
und der Breite des Strahls des bestrahlenden Lichts macht, ist es
unmöglich,
die Effizienz dieser Struktur beim Sammeln des Fluoreszenzlichts
von dem bestrahlten Bereich der Flüssigkeitsprobe zu bestimmen.
-
Da die Verwendung von Bohrungskapillaren mit
kleinen Durchmessern die Trennung zwischen den Komponenten einer
Probe verbessert, verwendet die Kapillarflüssigkeitschromatographie Säulen mit
sehr kleinen Innendurchmessern (typischerweise 5 bis 300 Mikrometer).
Aus diesem Grund wird lediglich eine sehr kleine Menge der Probe
(in der Größenordnung
von 1 bis 2 Nanoliter) zu einer gegebenen Zeit während einer Messung bestrahlt.
Daher ist das Signal/Rauschverhältnis
(auch als das "S/N-Verhältnis" bezeichnet) für solche
Systeme äußerst abhängig von:
dem Bruchteil des Fluoreszenzlichts von der Probe, der tatsächlich durch
einen Systemdetektor gesammelt wird; und die Menge von Streulicht, die
den Detektor erreicht. Eine grundlegende Beschränkung bei der Verwendung der
Fluoreszenzdetektion ist das erreichbare Signal/Rauschverhältnis gewesen.
-
Das S/N-Verhältnis ist durch die Verwendung von
stärkeren
Lichtquellen und/oder kohärenten Lichtquellen
verbessert worden, bei denen die Energie bei einer Wellenlänge konzentriert
ist, die bei der Erzeugung von Fluoreszenz besonders effizient ist. Diese
Verbesserung stammt daher von einer vergrößerten Amplitude des Signals.
Ein Teil der Rauschkomponente, wie beispielsweise gestreutes Licht,
ist jedoch proportional zu der Intensität des beleuchtenden Lichts.
Wenn dieser Teil des Rauschsignals einen signifikanten Bruchteil
des gesamten Rauschsignals darstellt, ist es daher wichtig, eine
solche Komponente zu minimieren. Es ist daher sehr wichtig, eine
Struktur zu verwenden, die im wesentlichen das gesamte gestreute
Licht daran hindert, den Detektor zu erreichen, so dass die Rauschkomponente
minimiert wird. Dies bedeutet, dass Sorgfalt angewendet werden muss,
um die Menge von gestreutem Licht zu minimieren, das erzeugt wird,
und um sicherzustellen, dass im wesentlichen kein gestreutes Licht
den Detektor erreicht. Es ist außerdem wichtig, sicherzustellen,
dass ein sehr großer
Bruchteil des Fluoreszenzlichts, das von der Probe emittiert wird,
den Detektor erreicht, so dass die Signalkomponente des Detektorausgangssignals
im wesentlichen maximiert wird.
-
Zusammenfassung der Erfindung
-
Die vorstehend erwähnten Ziele
werden gemäß der vorliegenden
Erfindung mittels der Fluoreszenzflusszellen erreicht, die in den
Ansprüchen
1 und 2 definiert sind.
-
Es wird eine Fluoreszenzflusszelle
beschrieben, die beim Sammeln von Fluoreszenzlicht sehr effizient
ist, das von einer Probe emittiert wird, die durch eine Kapillare
befördert
wird. Diese Flusszelle ist besonders nützlich bei der Kapillarflüssigkeitschromatographie
(capillary liquid chromatography; LC) und der Kapillarelektrophorese
(capillary electrophoresis; CE), ist jedoch gleichfalls bei jeglicher
Fluoreszenzmessung anwendbar, bei der die Probe in einer Kapillare
getrennt wird.
-
Um die chromatographische Integrität beizubehalten,
ist es bevorzugt, dass die Detektion "auf der Säule" (d. h. das gesammelte Fluoreszenzlicht wird
von dem Fluid innerhalb der Säule
oder innerhalb einer Säulenverlängerung
emittiert) durchgeführt
wird, um die Dispersion zu vermeiden, die bei einer Detektion "nach der Säule" (d. h. das gesammelte
Licht wird vom dem Fluid emittiert, nachdem es die Trennsäule verlassen
hat) auftreten kann. Eine Detektion nach der Säule kann jedoch gleichfalls
mit dieser Flusszelle durchgeführt
werden. Eine derartige Detektion nach der Säule kann beispielsweise mittels
eines frei fallenden Jets an einem Auslass der Kapillare erreicht
werden, indem der Fluss bei einem Auslass der Kapillare ummantelt
wird oder indem das bestrahlende Licht durch eine Kapillarlückenverbindung
gerichtet wird, wie es in dem Artikel von Michael Albin et al mit
dem Titel "Fluorescence
Detection in Capillary Electrophoresis: Evaluation of Derivatizing Reagents
and Techniques",
Analytical Chemistry, 1991, Band 63, Seiten 417 bis 422 beschrieben
wird. Ein elektrisches Feld, das entlang der Kapillarlückenverbindung
erzeugt wird, eliminiert im wesentlichen die Bandenverbreiterung,
wenn eine Probe diese Lückenverbindung
passiert. In all diesen Fällen,
beispielsweise ein Fluss von Flüssigkeit
innerhalb der Säule,
ein Fluss innerhalb einer Kapillarverlängerung, ein Fluss entlang
einer Kapillarlückenverbindung,
ein Fluss innerhalb eines frei fallenden Jets, ein Fluss innerhalb
eines ummantelten Flusses oder jedwedes anderen Flusses, der einen
zu dem Fluss innerhalb einer Kapillare vergleichbaren Fluss erzeugt,
wird in dieser Beschreibung als "Probenflüssigkeitsstrom" bezeichnet.
-
Die Flusszelle umfasst einen Fluoreszenzlichtkollektor,
der einen Raumwinkel von ungefähr
2π Steradian
oder mehr erfasst und der Fluoreszenzlicht innerhalb dieses Raumwinkels
zu einem Detektor umleitet. Da Fluoreszenzstrahlung im wesentlichen gleichförmig über einen
gesamten sphärischen Raumwinkel
verteilt ist, richtet dieser Kollektor ungefähr die Hälfte des Fluoreszenzlichts
zu dem Detektor. Dieser Kollektor weist vorzugsweise die Form einer
Rotationsfläche
mit einem Querschnitt auf, der gewählt ist, um das darauf einfallende
Licht auf einen Detektor zu richten. Die Symmetrie dieser Struktur erlaubt
eine einfachere Herstellung, als bei Ausführungsformen, die nicht diese
Symmetrie aufweisen. Systeme, die sich dieser Symmetrie annähern, weisen
jedoch im wesentlichen dasselbe verbesserte Signal/Rauschverhältnis auf.
Dieser Querschnitt ist vorzugsweise ein Kegelschnitt, wie beispielsweise eine
Halbellipse, eine Parabel oder ein Halbkreis. Dieser Kollektor weist
vorzugsweise eine reflektierende Beschichtung auf der Außenseite
eines festen Blocks von lichtdurchlässigem Material auf, da somit ein
robuster Kollektor bereitgestellt wird, der einfach hergestellt
werden kann und mit anderen Komponenten in dieser Flusszelle zusammengesetzt
werden kann.
-
Eine optische Quelle richtet einen
Strahl von bestrahlendem Licht auf einen Bereich (den "Bestrahlungsbereich") der Kapillare,
der vorzugsweise an die Rotationsachse des Kollektors angrenzt oder diese
schneidet, so dass der Kollektor und die Verteilung des Fluoreszenzlichts
eine gemeinsame Symmetrieachse aufweisen. Dies erzeugt einen Strahl von
Fluoreszenzlicht, der gleichfalls dieselbe Rotationssymmetrie aufweist.
Bei Ausführungsformen
auf der Säule,
ist der Bestrahlungsbereich an einem Punkt lokalisiert, an dem eine
schützende
Beschichtung von der Kapillare entfernt worden ist, um diese in
diesem Bereich transparent zu machen, oder ist an einer transparenten
Kapillarverlängerung
lokalisiert.
-
Ein lichtundurchlässiger Strahlungsblocker, der
zwischen der Kapillare und dem Kollektor angeordnet ist, ist enthalten,
um gestreutes Lichts daran zu hindern, den Kollektor zu erreichen.
Dies vermindert die Rauschkomponente des Ausgangssignals bedeutend,
wodurch eine bedeutende Steigerung des Signal/Rauschverhältnisses
im Vergleich zu anderen Fluoreszenzdetektionssystemen erreicht wird. In
den Ausführungsformen,
wo auf der Säule
gemessen wird, wird der größte Teil
des gestreuten Lichts durch die Streuung von Licht an den Außen- und
Innenflächen
der Kapillare erzeugt. In den Ausführungsformen, wo die Erfassung
nach der Säule
erfolgt, entsteht ein signifikanter Anteil des gestreuten Lichts
durch die Streuung von Licht an der zylindrischen Oberfläche der
Probe. In den Ausführungsformen,
bei denen das bestrahlende Licht die Form eines Strahls aufweist,
der senkrecht zu der Achse der Kapillare gerichtet ist, ist dieses
gestreute Licht stark in einem ebenen, scheibenförmigen Bereich konzentriert,
dessen Normale parallel zu der Achse der Kapillare verläuft. In
Ausführungsformen,
bei denen das bestrahlende Licht nicht senkrecht zu der Achse der Kapillare
verläuft,
wird das gestreute Licht gleichfalls primär in einen scheibenförmigen Bereich
gestreut. In derartigen Ausführungsformen
wird der Abschnitt des Strahlungsblockers, der das gestreute Licht
blockiert, typischerweise ein schmaler, bogenförmiger Bereich sein.
-
Dieser Strahlungsblocker kann gleichfalls
einen Abschnitt umfassen, der zwischen dem Kollektor und der Kapillare
angeordnet ist, um jedwedes Licht, das von dem Kollektor reflektiert
wird, daran zu hindern, außerhalb
des gewünschten
Bestrahlungsbereichs auf die Kapillare einzufallen. In der bevorzugten
Ausführungsform
ist das bestrahlende Licht senkrecht zu der Kapillare und der Strahlungsblocker weist
die Form eines Kreuzes mit einem Loch bei der Verbindung der zwei
Beine dieses Kreuzes auf.
-
In der bevorzugten Ausführungsform
weist der Kollektor die Form einer Rotationsfläche auf, die durch einen kreisförmigen Bogen
mit einer Winkelspannweite von weniger als π erzeugt wird. Die Mitte der
ebenen, kreisförmigen
Bodenkante davon ist über
dem Bestrahlungsbereich zentriert und grenzt an die Kapillare an,
so dass dieser Kollektor nahezu die Hälfte des Fluoreszenzlichts
sammelt, dass von dem Bestrahlungsbereich emittiert wird. Diese
Wahl ist vorteilhaft, da es sich dabei um eine kostengünstig herzustellende
Form handelt und da Fluoreszenzlicht von dem Bestrahlungsbereich
in einen konvergierenden oder gebündelten Lichtstrahl reflektiert
wird, der größer genug
im Durchmesser ist, als die Breiten der Beine des Strahlungsblockers,
so dass lediglich ein kleiner Teil dieses Fluoreszenzlichts, das
von dem Kollektor reflektiert wird, durch den Strahlungsblocker
absorbiert wird.
-
Obwohl die Quelle des bestrahlenden
Lichts innerhalb des Kollektors angeordnet sein kann, ist es vorteilhaft,
diese Quelle außerhalb
des Kollektors anzubringen und den Strahl des bestrahlenden Lichts entweder
entlang oder ungefähr
entlang der Symmetrieachse des Kollektors zu richten. Dies weist
den Vorteil auf, diese Quelle an einer Stelle anzuordnen, die es
erlaubt, diese ohne weiteres zu ersetzen und die die Kapillare von
der Seite bestrahlt, die dem Kollektor gegenüberliegt, so dass angrenzend
an die Kapillare, die dem Kollektor gegenüberliegt, die größtmögliche Fluoreszenz
pro Einheitsvolumen in der Probe erreicht wird.
-
Kurze Beschreibung der
Figuren
-
1 zeigt
eine Seitenquerschnittsansicht einer hocheffizienten Fluoreszenzflusszelle
für die Kapillarflüssigkeitschromatographie
oder die Kapillarelektrophorese.
-
2 zeigt
eine Bodenquerschnittsansicht der Flusszelle von 1.
-
Beschreibung der Erfindung
-
1 und 2 zeigen jeweils Seiten-
und Bodenquerschnitte einer hoch effizienten Fluoreszenzflusszelle 10 für die Kapillarchromatographie.
Wie in 1 dargestellt,
werden die mobile Phase und ein Probenanalyt durch eine Kapillare 11 mit
einem Außendurchmesser
typischerweise in der Größenordnung
von 50 bis 1000 Mikrometer und einem Innendurchmesser der Größenordnung
von 5 bis 300 Mikrometer geführt.
Die Kapillare kann gepackte Verbindungen oder Gele enthalten, um
diese Trennung zu unterstützen,
oder sie kann kein Packungsmedium enthalten (d. h. kann als eine
offene Röhre
mit einer beschichteten oder unbeschichteten Innenwand verwendet
werden). Der Fluss des Fluids durch die Kapillare kann mittels einer
Anzahl von Mechanismen erzeugt werden einschließlich hydrodynamischer Mittel,
elektrodynamischer Mittel (CE), Mittel unter Verwendung der Schwerkraft
und/oder Vakuummitteln.
-
Die Kapillare sind typischerweise
mit einer schützenden
Polyimidbeschichtung beschichtet, die einen physikalischen Schutz
der Kapillare gegen ein Zerkratzen und ein Zerbrechen bereitstellt.
In der bevorzugten Ausführungsform,
bei der die Erfassung auf der Säule
erfolgt, wird diese Beschichtung in einem Bestrahlungsbereich 12 einer
Länge der
Größenordnung
von einen wenigen Millimetern entfernt, um dem bestrahlenden Licht
zu ermöglichen,
die Probe zu erreichen, und um dem Fluoreszenzlicht zu ermöglichen,
aus der Kapillare auszutreten. Das Volumen des Bestrahlungsbereichs
liegt typischerweise in der Größenordnung
von 1 bis 2 Nanoliter.
-
Die Flusszelle 10 umfasst
eine Halterung 13 für
die optische Quelle, an die eine optische Quelle 15 angebracht
ist. Die Quelle 15 kann ein breites oder ein schmales Wellenlängenband
optischer Strahlung abgeben und kann eine kohärente oder eine inkohärente Quelle
sein. Eine derartige Quelle umfasst eine Fokussierungsoptik, um
den Strahl auf den Innendurchmesser des lichtdurchlässigen Abschnitts
der Kapillare 11 zu fokussieren. Typische Quellen umfassen
eine Deuteriumlampe, einen Laser, eine Xenonbogenlampe (kontinuierlich
oder gepulst) oder eine Tungstenhalogenlampe mit einem Monochromator
und/oder optischen Filtern, um den Strahl spektral zu definieren.
Dieses auf die Kapillare einfallende Licht ist ausgewählt, um
die Fluoreszenzemission von den untersuchten gelösten Stoffen anzuregen.
-
Ein Paar von Stiften 16 und 17 sind
jeweils mittels Presspassung durch eine dazugehörige Öffnung 18 und 19 in
der Halterung 13 der optische Quelle in eine dazugehörige zylindrische
Ausbuchtung 110 und 111 in einem Gehäuse 112 eingebracht, um
die Halterung der optische Quelle mit dem Gehäuse auszurichten und diese
daran anzubringen. Die Flusszelle umfasst einen Kollektor 113,
der verwendet wird, um Fluoreszenzlicht zu sammeln, das von einer
Probe innerhalb der Kapillare 11 emittiert wird, und um
dieses Licht auf einen Detektor zu richten, wie beispielsweise einen
Photomultiplier 114. Der Kollektor 113 besteht
aus einem festen Block 115 aus einem lichtdurchlässigen (vorzugsweise
transparenten) Material, wie beispielsweise Quarzglas, auf einer
bogenförmigen
Oberfläche,
auf der eine reflektierende Beschichtung 116 beschichtet
ist, wie beispielsweise Silber oder Aluminium.
-
Ein kreuzförmiger Rückhaltestab 117 ist
angepasst, die Kapillare in die Flusszelle einzuklemmen. Obwohl
dieser Stab gezeigt ist, wie er vertikal unterhalb des Gehäuses 112,
wie in 2 dargestellt,
verschoben ist, ist dieser tatsächlich
mittels eines Rückhaltestifts 20 drehbar
angebracht, so dass dieser ohne weiteres weg von der Kapillare gedreht werden
kann, um einen einfachen Mechanismus zum Austauschen der Kapillare
bereitzustellen. Dieser Stab besteht aus einem lichtundurchlässigen Material,
wie beispielsweise Aluminium, so dass dieser Stab dahin wirkt, den
Teil des bestrahlenden Lichts zu blockieren, der durch die Kapillare
in Richtung des Detektors durchtritt. Dies reduziert die Rauschkomponente
des Ausgangssignals des Detektors, wodurch das Signal/Rauschverhältnis dieser
Vorrichtung verbessert wird.
-
Die Kapillare passt schmiegsam in
einen Kanal, der durch eine Bodenfläche 118 des Blocks 115 und
eine Rille 119 in einer Oberseite des Rückhaltestabs 117 ausgebildet
ist. Wie in 2 dargestellt,
ist der Rückhaltestab 117 an
das Gehäuse 112 durch
einen Rückhaltestift 20 angebracht,
um den sich der Rückhaltestab 117 drehen
kann. Eine Sperre 21 wird verwendet, um den Rückhaltestab
gegen die Kapillare einzuklemmen. Wie in 1 dargestellt, drückt ein ringförmiges Druckpolster 120 aus
einem elastischen Material gegen die gebogene Oberseite des Blocks 115 und
erzeugt eine schmiegsame Passung zwischen der Halterung 13,
dem Druckpolster 120, dem Block 115 und einer
in 2 gezeigten Leiste 25. Eine
schmiegsame Passung wird zwischen dem Rückhaltestab 117, der
Kapillare 11, dem Strahlungsblocker 123 und der
Unterseite 118 des Kollektors 113 erzeugt, so
dass der Kollektor und die Kapillare fest an Ort und Stelle gehalten
werden. Dies drückt gleichfalls
die Kapillare innerhalb der Rille 119 in den Rückhaltestab,
so dass die Kapillare innerhalb der Flusszelle 10 akkurat
positioniert ist.
-
Ein Bereich 121 der reflektierenden
Beschichtung 116 ist entfernt, so dass Licht von der optischen
Quelle 15 durch eine Öffnung 122 in
der Halterung der optischen Quelle und durch den Bereich 121 passieren
kann, um die Kapillare in dem Bestrahlungsbereich 12 zu
bestrahlen, in dem die schützende
Kapillarbeschichtung entfernt worden ist. Die Öffnung 122 definiert
die längsseitige
Größe des Strahls,
der durch diese Öffnung
durchtritt. Eine Aussparung 14 in der Halterung 15 der
optischen Quelle ist enthalten, so dass die dünne Platte, die diese Öffnung enthält, während des
Aufbaus dieser Vorrichtung vor einer Beschädigung geschützt ist.
Ein lichtundurchlässiger
Strahlungsblocker 123, der zwischen der Kapillare 11 und
der Bodenfläche 118 des Blocks 115 angeordnet
ist, weist ein erstes Paar von Beinen 22 auf, die von der
Kapillare gestreutes Licht daran hindern, den Detektor 114 zu
erreichen, wodurch das Signal/Rauschverhältnis dieses Systems bedeutend
verbessert wird. Der Strahlungsblocker 123 umfasst ferner
ein zweites Paar von Beinen 23, die durch den Kollektor 113 reflektiertes
Licht daran hindern, mit dem Fluid innerhalb der Kapillare 11 zu wechselwirken.
Dies verhindert eine ungewollte Anregung außerhalb des Bestrahlungsbereichs 12. Dies
ist insofern wichtig, da die Kapillare dahin wirkt, örtlich verschiedene
Komponenten der Probe zu trennen. Wenn daher die Kapillare außerhalb
eines schmalen Bestrahlungsbereichs bestrahlt wird, dann wird die
spektrale Information eine Summe von Daten aus einem Bereich von
benachbarten, örtlich
getrennten Komponenten der Probe sein, wodurch die spektrale Information
verschlechtert wird. Ein wellenlängenselektives
Element, wie beispielsweise ein Filter 124, ist in dem
optischen Weg zwischen den Kollektor 113 und dem Detektor 114 enthalten,
um im wesentlichen nur die Wellenlängen durchzulassen, die in
dem Fluoreszenzlicht enthalten sind, das von der untersuchten Probe
emittiert wird.
-
Der Rückhaltestab 117 blockiert
gleichfalls das gestreute Licht. In einer weiteren Ausführungsform
können
die Beine 23 durch ein Paar von lichtundurchlässigen Hülsen ersetzt
werden, die die Kapillare 11 in den Bereichen umschreiben,
die in der Ausführungsform
von 1 und 2 durch die Beine 23 geschützt werden.
Ein Nachteil dieser letzteren Struktur besteht jedoch darin, dass
die Kapillare durch derartige Hülsen
geschraubt werden muss, was einen schwierigeren und zeitaufwändigeren
Vorgang darstellt, als die Positionierung des Strahlungsblockers,
so dass die Beine 23 die Kapillare 11 auf jeder
Seite der Bestrahlungsbereiche abschirmen. Ein Loch 24 in
der Überschneidung
dieser zwei Paare von Beinen ermöglicht
dem bestrahlenden Licht, auf die Kapillare in dem Bestrahlungsbereich
einzufallen, und definiert außerdem
den Durchmesser des Bestrahlungsbereichs.
-
Nachstehend werden vier alternative
Ausführungsformen
sowohl der Detektion auf der Säule als
auch der Detektion nach der Säule
beschrieben. In einer ersten alternativen Ausführungsform ist eine lichtdurchlässige Kapillarverlängerung
an die Kapillare angebracht und innerhalb dieser Flusszelle angeordnet,
so dass das bestrahlende Licht und das Fluoreszenzlicht durch die
Wand dieser Kapillarverlängerung
durchtreten. Da diese Kapillarverlängerung als ein Teil der Kapillare
wirkt, umfasst in den Ansprüchen
der Begriff "Kapillare" die Kapillare und
jedwede Kapillarverlängerung,
die daran angebracht ist, um Licht zu ermöglichen, von einer Probe und
zu dieser übertragen
zu werden.
-
In einer zweiten alternativen Ausführungsform
wird der Probe ermöglicht,
aus der Kapillare als ein frei fallender Flüssigkeitsjet auszutreten, durch den
das bestrahlende Licht angrenzend an das Auslassende der Kapillare
gerichtet ist. In dieser Ausführungsform
ist die Flusszelle derart orientiert, dass die Kapillare im wesentlichen
vertikal verläuft,
so dass die Probenflüssigkeit
aufgrund der Schwerkraft entlang der Achse der Kapillare fallen
wird. In einer dritten alternativen Ausführungsform erzeugt ein ummantelter
Fluss am Ausgang der Kapillare einen Bestrahlungsbereich angrenzend
an das Ausgabeende der Kapillare mit einem Durchmesser, der im wesentlichen
dem Innendurchmesser der Kapillare entspricht.
-
In einer vierten alternativen Ausführungsform
umfasst die Kapillare 11 eine Kapillarlückenverbindung im Bestrahlungsbereich 12.
Die Struktur von Kapillarlückenverbindungen
ist in dem Artikel von Michael Albin et al mit dem Titel "Fluorescence Detection
in Capillary Electrophoresis: Evaluation of Derivatizing Reagents
and Techniques",
Analytical Chemistry, 1991, Band 63, Seiten 417 bis 422 beschrieben.
In diesem System wird eine Kapillarlückenverbindung umfasst, über die
ein elektrisches Feld erzeugt wird, dass die Bandenverbreiterung
im wesentlichen eliminiert, wenn eine Probe entlang dieser Lückenverbindung
durch tritt. Jedes Ende der Kapillare ist in einen dazugehörigen Behälter eingebracht,
der das Elektrolyt enthält,
das durch die Kapillare bewegt wird. Das elektrische Feld entlang
der Lücke
ist lediglich ein Teil des elektrischen Feldes, das verwendet wird,
um die Probe durch die Kapillare mittels Kapillarelektrophorese
voran zu treiben. Dieses elektrisches Feld wird mit einer Spannungsquelle
erzeugt, beispielsweise einem Paar von Elektroden, von denen jede
in die Probenlösung
in jeweils einem dieser Behälter
eingebracht ist. Diese Lücke
stellt einen Bereich nach der Säule
bereit, durch den ein optischer Strahl gerichtet werden kann, um
Fluoreszenz in der Probe zu erzeugen.