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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur laserinduzierten
Fluoreszenzanalyse zur Erzeugung von Fluoreszenzlicht durch gelöste Substanzen
und zur Detektion dieses Lichts für eine chemische und biochemische
Analyse. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem eine Trennvorrichtung, die
eine derartige Vorrichtung umfasst.
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Es
ist bekannt, laserinduzierte Fluoreszenzmessungen durchzuführen, um
Substanzen zu identifizieren und zu quantifizieren, die, insbesondere
in Spurenform, in einer Lösung
vorhanden sind. Derartige Messungen besitzen zahlreiche Anwendungen, beispielsweise
in der Biochemie.
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Das
Dokument
US 6,011,882 beschreibt
einen chemischen Detektor, bei dem ein Rohr aus einem Polymermaterial,
das unter der eingetragenen Marke Teflon A.F. 2400
® bekannt
ist, das mit einem reaktiven Indikator in der flüssigen Phase gefüllt ist. Das
Rohr wird einer in der Gasphase befindlichen Substanz ausgesetzt,
die man detektieren möchte und
die auf Grund der Gaspermeabilität
des die Röhre
bildenden Materials durch die Wand der Röhre wandert. Man detektiert
so die Änderung
einer optischen Eigenschaft des reaktiven Indikators bei Kontakt
mit der fraglichen Substanz. Unter den verschiedenen, in diesem
Dokument betrachteten Detektionsarten werden die Absorptionsmessung
und die Messung von laserinduzierter Fluoreszenz beschrieben, für die man
eine das Innere des Rohrs, ausgehend von einem seiner Enden, axial
durchstrahlende Lichtquelle und eine optische Faser verwendet, die das
Licht am anderen Ende des Rohrs axial sammelt, um dieses einem Analyseinstrument
zuzuführen. Dieses
Anordnung ist auf jeden Fall bei einer Absorptionsmessung eher bevorzugt,
denn die Wellenleitungseigenschaften des Teflonrohrs führen das
am ersten Ende eingestrahlte Licht zum Analyseinstrument, so dass
im Fall einer Fluoreszenzmessung das Analyseinstrument ein starkes
Signal des eingestrahlten Lichts empfängt, welches dem zu detektierenden
Fluoreszenzlicht überlagert
ist, was der Empfindlichkeit der Fluoreszenzmessung sehr abträglich ist.
Außerdem
ist dieser Detektor nicht dazu vorgesehen, mit einem Trennsystem
zusammenzuwirken.
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Es
ist bekannt, dass die Empfindlichkeit einer Fluoreszenzdetektion
erhöht
wird, indem man vermeidet, gleichzeitig mit dem Fluoreszenzlicht
parasitäres
Licht und/oder reflektiertes oder gestreutes Anregungslicht zu detektieren.
Um zu vermeiden, dass Anregungslicht gesammelt wird, schlagen das
Dokument Analytical Chemistry Bd. 72, Nr. 15, Seiten 3422–3430 (2000)
und das Dokument
WO 00/04371 eine
Anordnung zur Kapillarelektrophorese vor, in der eine Quarzkapillare
verwendet wird, die außen
mit einer Polymerschicht mit einem geringeren Brechungsindex als
demjenigen eines Trennmediums, mit welchem das Innere der Kapillare
befüllt
ist, beschichtet ist, wobei man die Kapillare in einer senkrechten
Geometrie beleuchtet, so dass die Ausbreitungsrichtung des Anregungslichts
quer zur Kapillare orientiert ist, während das Fluoreszenzlicht
in einer axialen Richtung der Kapillare gesammelt wird. Gemäß diesem Dokument
breitet sich das in der Nähe
der Außenfläche der
Kapillare emittierte oder gestreute Licht spiralförmig entlang
der Kapillare in der Nähe
von deren Außenfläche aus,
während
das im Zentrum der Kapillare emittierte Licht, wie beispielsweise
die laserinduzierte Fluoreszenz, die Kapillare statistisch in der Nähe von deren
Zentrum verlässt,
was ein Raumfilterung des parasitären Lichts auf Höhe des Detektors ermöglicht.
Diese Dokumente schweigen jedoch im Hinblick auf die Montage des
Analyserohrs mit einer Trennkolonne oder einer Abzugsleitung eines
Trennsystems.
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Das
Dokument
WO 96/15438 offenbart
einen weiteren Fluoreszenzdetektor, bei welchem das in einer Anregungszone
eines Quarzrohrs erzeugte Fluoreszenzlicht mittels einer Sammelhülse von
der Anregungszone weggeführt
wird, die einen größeren Brechungsindex
als derjenige der Probe aufweisen muss, die das Innere des Rohrs
einnimmt, und die aus einem Material besteht, das im Wesentlichen
den gleichen Brechungsindex wie das Rohr hat, wobei die Hülse durch
Aufschmelzen, Verkleben oder Aufformen auf dem Rohr befestigt ist.
Dieser Detektor weist jedoch in der Hinsicht Nachteile auf, dass
die Sammelhülse
zusätzliche
Kosten verursacht und dass die Grenzfläche zwischen der Sammelhülse und
dem Rohr, welche den optischen Kontakt gewährleistet, schwierig herzustellen
ist, und/oder eine zeitlich eingeschränkte Wirksamkeit aufweist.
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Die
internationale Patentanmeldung
WO 00/60342 offenbart
eine Vorrichtung zur laserinduzierten Fluoreszenzanalyse, welche
aufweist:
- – Eine
Röhre,
die einen Kanal aufweist, der eine Lösung enthalten kann, welche
wenigstens eine Substanz umfasst, die eine laserinduzierte Fluoreszenzreaktion
durchführen
kann,
- – ein
Projektionsmittel, das einen Anregungslichtstrahl auf einen Abschnitt
des Kanals entlang einer Richtung projizieren kann, die einen Winkel von
mehr als 60° mit
der Längsachse
des Kanals bildet, wobei das Anregungslicht eine Fluoreszenzreaktion
in der oder einer der Substanz(en) induzieren kann,
- – ein
optisches Sammelmittel, das so angeordnet ist, dass Fluoreszenzlicht
aus dem Kanal gesammelt wird,
- – ein
optisches Messmittel, das so mit dem Sammelmittel gekoppelt ist,
dass es das gesammelte Fluoreszenzlicht messen kann,
- – ein
Verarbeitungsmittel, welches ein von dem Messmittel übertragenes
Messsignal verarbeiten kann, um ein Analyseergebnis der Lösung zu
liefern.
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Genauer
gesagt, weist die bekannte Vorrichtung eine Kapillare auf, in welcher,
ausgehend von einem Trennsystem, bei dem sich um ein System zur Hochleistungs-Flüssigkeitschromatografie
(HPLC) zur Mikrohochleistungs-Flüssigkeitschromatografie (μ-HPLC) oder
zur Kapillarelektrophorese (CE) handeln kann, eine zu analysierende
Lösung
transportiert wird, die einen gelösten Stoff enthält, der
bei Anregung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge fluoresziert. Ein Laser
durchstrahlt senkrecht zur Richtung der Kapillare eine Analysezelle
im Inneren der Kapillare, wobei die Wellenlänge des Lasers so gewählt ist,
um die Fluoreszenz des gelösten
Stoffes anzuregen. Außerdem
ist eine kugelförmige
Linse vorgesehen, um das Fluoreszenzlicht aus der Analysezelle zu
sammeln, sowie eine Photomultiplier-Röhre zur Messung des gesammelten
Fluoreszenzlichts und ein Mittel zur Analyse der von der Photomultiplier-Röhre erzeugten
Messsignale zur Erzeugung eines Analyseergebnisses.
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Bei
dieser Vorrichtung sind jedoch die optischen Strecken des Anregungslichts
und des Fluoreszenzlichts teilweise co-linear, so dass ein spektrales
Filtermittel in Form eines dichroitischen Spiegels erforderlich
ist, um sie zu trennen. Ferner sammeln derartige Systeme, welche
Fluoreszenz nur in Anregungsrichtung sammeln, nur einen kleinen
Teil der in diesem Raum isotrop ausgestrahlten Fluoreszenz.
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Das
Dokument
DE 198 17
738 A1 offenbart die Merkmale des Oberbegriffs des Anspruchs
1.
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es, eine Vorrichtung zur laserinduzierten
Fluoreszenzanalyse mit hoher Empfindlichkeit bereitzustellen, die mit
einem Trennsystem durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatografie, Mikrohochleistungs-Flüssigkeitschromatografie
oder Kapillarelektrophorese zusammenwirken oder in diesem enthalten
sein kann, und das die oben genannten Nachteile oder einige dieser
Nachteile nicht aufweist. Aufgabe der Erfindung ist es außerdem,
ein Gerät
zur Trennung und zur laserinduzierten Fluoreszenzanalyse bereitzustellen.
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Zu
diesem Zweck stellt die Erfindung eine Vorrichtung zur laserinduzierten
Fluoreszenzanalyse bereit, mit:
- – einer
Röhre,
die einen Kanal aufweist, der eine Lösung enthalten kann, welche
wenigstens eine Substanz umfasst, die eine laserinduzierte Fluoreszenzreaktion
durchführen
kann, wobei das Material der Röhre
für ein
Anregungslicht im Wesentlichen durchlässig ist,
- – wenigstens
einem Projektionsmittel, das einen Anregungslichtstrahl lokal auf
einen Abschnitt des Kanals entlang einer Richtung projizieren kann, die
einen Winkel von mehr als 60° mit
einer Längsachse
des Kanals bildet, wobei das Anregungslicht eine Fluoreszenzreaktion
in der oder einer der Substanz(en) induzieren kann,
- – wenigstens
einem optischen Sammelmittel, das so angeordnet ist, dass Fluoreszenzlicht
aus dem Kanal gesammelt wird,
- – wenigstens
einem optischen Messmittel, das so mit dem Sammelmittel gekoppelt
ist, dass es das gesammelte Fluoreszenzlicht messen kann,
- – einem
Verarbeitungsmittel, welches ein von dem Messmittel geliefertes
Messsignal verarbeiten kann, um ein Analyseergebnis der Lösung zu
erzeugen,
- – einem
ersten Sammelmittel, das mechanisch mit einem ersten Ende der Röhre gekoppelt
ist, wobei die Röhre
aus einem Material besteht, dessen Brechungsindex entweder kleiner
als derjenige des Wassers in dem Kanal oder gleichzeitig größer als
derjenige des Wassers in dem Kanal und als derjenige, der die Röhre umgebenden
Luft ist, so dass das Fluoreszenzlicht entlang des Kanals in dem
Kanal und/oder in der Wand der Röhre
bis zu dem ersten Sammelmittel geführt werden kann, welches angeordnet
ist, das Fluoreszenzlicht zu sammeln, welches sich im Wesentlichen
entlang der Längsrichtung
des Kanals ausbreitet,
- – einem
Verbindungsmittel, um funktionell ein zweites Ende der Röhre mit
einer Austrittsleitung eines Trennsystems so zu verbinden, dass
eine Zirkulation der Lösung
und/oder ein Transport der Substanz(en) in der Lösung zwischen dem Trennsystem
und der Röhre
ermöglicht
wird. Die Vorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, dass die Röhre auf
Höhe des
zweiten Endes eine Innenwand mit einer im Wesentlichen konischen,
ellipsoiden oder paraboloiden Form aufweist, deren eine Fläche in Richtung
des ersten Endes gerichtet ist und das Fluoreszenzlicht in Richtung
des ersten Endes reflektieren kann, wobei die Röhre einen verglichen mit demjenigen
der Austrittsleitung vergrößerten Innenquerschnitt
aufweist und eine Zelle zur Fluoreszenzdetektion bildet.
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Im
Sinne der Erfindung umfasst das Wasser in dem Kanal im Wesentlichen
Wasser (mit einem Berechungsindex in der Größenordnung von 1,33 bei einer
Wellenlänge
von 488 nm) oder mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel
in Wasser lösliche
Salze, üblicherweise
zum Transport von zu trennenden Substanzen verwendete Säuren oder
auch ein Hydrogel (beispielsweise mit einem Brechungsindex in der
Größenordnung
von 1,36) oder einen Elektrolyten. Im Sinne der Erfindung kann das
Rohr einen Flüssigkeitsfluss
oder einen Flüssigkeitsstrom
enthalten.
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Der
Vorteil einer Röhre,
deren Brechungsindex kleiner als derjenige der wässrigen Lösungen und der meisten üblichen
Lösungsmittel
ist, besteht darin, dass der Indexunterschied an der Grenzfläche zwischen
den Wänden
des Kanals mit Index n und der zu analysierenden Lösung mit
Index n' einen starken
Reflexionskoeffizienten erzeugt, der für Lichtstrahlen mit einer ausreichend
großen
Neigung gegenüber
der Grenzfläche
den Wert 1 erreicht (Totalreflexion). Genauer gesagt, wenn man den
Einfallswinkel eines in der Lösung
erzeugten Fluoreszenzlichtstrahls im Inneren des Kanals durch den
Winkel θ zwischen
diesem Strahl und dem zu dieser Grenzfläche senkrechten Vektor, der
ins Innere des Kanals gerichtet ist, misst, dann lautet die Bedingung
für Totalreflexion
für diesen
Strahl: θ ≥ Arcsin(n/n').
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Die
Röhre mit
ihrem mit der zu analysierenden Lösung gefüllten Kanal bildet somit einen
Wellenleiter mit flüssigem
Kern, der Fluoreszenzlicht entlang seiner Längsrichtung bei minimalen Verlusten führen kann.
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Gemäß einem
speziellen Merkmal der Erfindung schließt sich der lokal durch den
Anregungslichtstrahl beleuchtete Abschnitt der Röhre im Wesentlichen an das
Verbindungsmittel an, so dass die Detektionszelle den Anregungsbereich
der Substanz(en) enthält.
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Vorteilhaft
kann das Verbindungsmittel die Röhre
und die Austrittsleitung starr und im Wesentlichen fugendicht verbinden.
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Gegenüber der
Fläche
weist das zweite Ende der Röhre
vorteilhaft eine Innenschulter mit einem Querschnitt auf, der im
Wesentlichen den Außenquerschnitt
der Austrittsleitung entspricht und als Anschlag für den in
die Röhre
eingesetzten teil der Austrittsleitung dient.
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Vorteilhaft
entspricht der Innenquerschnitt der Austrittsleitung im Wesentlichen
dem Innenquerschnitt der Einschnürung,
welche zwischen der Schulter und der Fläche auf Höhe des zweiten Endes der Röhre definiert
wird.
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Bevorzugt
weist jedes Sammelmittel einen Wellenleiter auf, wobei ein hohler
T-Verbinder zwischen
dem Wellenleiter und dem entsprechenden Ende der Röhre angeordnet
ist, um sie in der Verlängerung
miteinander zu verbinden, wobei ein Seitenarm des Verbinders eine
Zirkulation der Lösung und/oder
einen Transport der Substanz(en) in der Lösung nach oder von außerhalb
der Röhre
ermöglicht.
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Vorteilhaft
verbindet bei der Kapillarelektrophorese der Seitenarm eines ersten
T-Verbinders das
erste Ende der Röhre
mit einem Reservoir, wobei eine erste Elektrode durch eine Wand
des Reservoirs hindurch so angeordnet ist, dass sie sich in Kontakt mit
der Lösung
befindet, wobei die Lösung
elektrisch leitfähig
ist und sich in Kontakt mit einer zweiten Elektrode befindet, die
von der ersten beabstandet angeordnet ist, wobei die Elektroden
so mit einer Spannungsquelle verbunden sind, dass eine elektrische Potenzialdifferenz
zwischen den beiden Enden der Röhre
entsteht, um die Substanz(en) durch Elektrophorese wandern zu lassen,
wobei der mit dem ersten Sammelmittel verbundene Wellenleiter über den ersten
Verbinder mit dem ersten Ende in der Verlängerung der Röhre verbunden
ist.
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Gemäß einem
speziellen Merkmal der Erfindung verbindet der Seitenarm eines zweiten
hohlen T-Verbinders das zweite Ende der Röhre mit dem oben genannten
Verbindungsmittel, wobei der einem zweiten Sammelmittel zugeordnete
Wellenleiter durch den zweiten T-Verbinder mit dem zweiten Ende der
Röhre in
deren Verlängerung
verbunden ist. In diesem Fall kann die Röhre ebenfalls auf Höhe des ersten
Endes eine Innenwand mit im Wesentlichen konischer, ellipsoider
oder paraboloider Form aufweisen, deren eine Fläche in Richtung des zweiten
Endes gerichtet ist und das Fluoreszenzlicht in Richtung des zweiten
Endes reflektieren kann.
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Gemäß einem
weiteren Merkmal der Erfindung ist (sind) die im Wesentlichen konische(n) (218),
ellipsoide(n) oder paraboloide(n) Innenwand (Innenwände) der
Röhre (2, 202)
mit einem oxidationsbeständigen,
reflektierenden Material (242) beschichtet.
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Vorzugsweise
weist die Röhre
einen Innendurchmesser von bis zu 200 μm für eine Verwendung bei der Kapillarelektrophorese
oder der μHPLC
und von bis zu 1000 μm
für eine
Verwendung bei der HPLC auf.
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Vorzugsweise
umfasst das Projektionsmittel eine Lichtquelle, die seitlich von
dem Kanal beabstandet angeordnet ist, sowie optische Mittel, die
zwischen der Lichtquelle und dem Kanal angeordnet sind, um den Querschnitt
des Anregungslichtstrahls an den Innendurchmesser des Kanals anzupassen.
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Man
kann vorsehen, dass die Außenwand der
Röhre,
abgesehen insbesondere von einem dem Anregungsbereich der Detektionszelle
gegenüber liegenden
Wandabschnitt, der für
den Lichtstrahl transparent bleiben muss, mit einem reflektierenden Material
beschichtet ist.
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Die
Erfindung stellt auch ein Gerät
zur chromatografischen oder elektrophoretischen Trennung bereit,
das eine solche Analysevorrichtung umfasst. In diesem Fall bildet
die Röhre
eine Trennkolonne des Geräts
oder ist mit einer solchen verbunden.
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Die
Erfindung wird besser verständlich
werden und weitere ihrer Ziele, Details, Eigenschaften und Vorteile
werden im Laufe der folgenden Beschreibung mehrerer spezieller Ausführungsformen der
Erfindung deutlicher werden, die rein illustrativ und nicht einschränkend unter
Bezugnahme auf beigefügte
Zeichnungen erfolgen. In den Zeichnungen:
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ist 1 eine
schematische Darstellung einer gesamten Anordnung einer Analysevorrichtung gemäß einer
ersten Ausführungsform
der Erfindung,
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ist 2 eine
schematische Darstellung einer gesamten Anordnung einer abgewandelten
Ausführungsform
der Vorrichtung der 1,
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ist 3 eine
schematische Darstellung einer gesamten Anordnung einer Analysevorrichtung gemäß einer
zweiten Ausführungsform
der Erfindung,
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ist 4 eine
vergrößerte Ansicht
eines mit IV umkreisten Details der Vorrichtung der 1,
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ist 5 eine
vergrößerte Ansicht
eines entsprechenden Details der Vorrichtung der 3.
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Gemäß einer
unter Bezugnahme auf 1 beschriebenen ersten Ausführungsform
weist die insgesamt mit 1 bezeichnete Analysevorrichtung
eine Röhre 2 auf,
die aus einem Polymer mit einem kleineren Brechungsindex als demjenigen
von Wasser oder Quarzglas besteht (beispielsweise mit einem Brechungsindex
von 1,45 bei einer Wellenlänge
von 488 nm). Die Röhre 2 ist
eine Röhre,
die von einem Lösungsfluss
durchströmt
wird, die von einem Trenngerät 35 mittels
einer Austrittsleitung 3 von Letzterem herangeführt wird,
bei welchem es sch beispielsweise um einen Chromatografiekolonne,
eine Röhre
aus Peek oder eine Stahlröhre
mit geringem Querschnitt handeln kann. Das Gerät 35 ist ein Gerät zur Trennung
durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatografie,
Mikro- oder Nanohochleistungs-Flüssigkeitschromatografie
eines dem Fachmann bekannten Typs und weist schematisch ein Hauptreservoir 32 für die zu
trennenden Substanzen, eine mit dem Reservoir 32 verbundene
Trennkolonne 33 und eine Pumpe 34 zur Erzeugung
eines Lösungsstromes
in der Trennkolonne 33 auf. Die Trennkolonne ist mit der
Austrittsleitung 3 verbunden oder fällt mit Letzterer zusammen.
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Die
Röhre 2 ist
starr und fugendicht mittels einer undurchsichtigen Verbindungshülse 4 ohne
Totvolumen mit der Austrittsleitung 3 verbunden. Im Inneren
der Hülse
ist ein Ende der Röhre 2 gegen
ein Ende der Leitung 3 in Anschlag. Die Lösung enthält eine
oder mehrere molekulare Substanzen, die in dem Trenngerät getrennt
wurden und die man durch Fluoreszenzmessung detektieren und quantifizieren will.
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Ein
Abschnitt 16 geringer Länge
der Röhre 2 wird
quer und lokal durch ein Projektionsmittel beleuchtet, das eine
Anregungslichtquelle 12 aufweist, die wenigstens eine Wellenlänge ausstrahlt,
die so gewählt
ist, dass eine Fluoreszenzreaktion in wenigstens einer der zu detektierenden
Substanzen induziert wird. Um gleichzeitig die Fluoreszenz mehrerer Substanzen
anzuregen, kann man auch mehrere Projektionsmittel mit Anregungslichtquellen
vorsehen, die unterschiedliche Wellenlängen aufweisen, welche Seite
an Seite entlang der Röhre 2 und/oder an
deren Umfang angeordnet sind. In diesem Fall tritt die Fluoreszenz
der unterschiedlichen Substanzen bei verschiedenen Wellenlängen auf
und es wäre sinnvoll,
den Sammelmitteln ein spektrales Trennsystem mit optischen Filtern,
Prismenmonochro matoren oder Beugungsgittern nachzuschalten, was
eine Auswahl von einem oder mehreren Emissionswellenlängenbändern ermöglicht.
Dies ist auch der Fall, wenn die Anregungsquelle ein Laser ist,
der in UV emittiert, wobei die verschiedenen Substanzen dann spezifische
native Fluoreszenzen zeigen können.
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Der
gerichtete Anregungslichtstrahl 13 durchquert einen Linsensatz 14,
den man so anpasst, dass der Strahl F auf dem Abschnitt 16 der Röhre so gebündelt wird,
dass der Durchmesser des Strahls F auf Höhe der Röhre 2 im Wesentlichen gleich
dem Innendurchmesser des Kanals 11 der Röhre 2 entspricht.
Somit wird der Verlust eines Teils des Anregungslichts, der nicht
auf die Lösung
trifft, minimiert, während
das beleuchtete Lösungsvolumen
ausreichen groß bleibt,
um Fluoreszenzstrahlung in einer detektierbaren Größenordnung
aus den sehr geringen Konzentrationen der fluoreszierenden Substanz
zu induzieren. Der Wirkungsgrad der Umwandlung von Anregungslicht
in Fluoreszenzlicht wird somit auf Grund der verwendeten orthogonalen Geometrie
optimiert.
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Der
Linsensatz 14 kann den Strahl F auch aufweiten, beispielsweise
in dem Fall, wo die Quelle 12 einen schmaleren Strahl 13 als
das Innere der Röhre 2 erzeugt.
Die Einstrahlrichtung des Strahls 5 bildet mit der Richtung
der Achse A der Röhre 2 einen
Winkel α von
mehr als 60° und,
in dem dargestellten Beispiel, von im Wesentlichen gleich 90°.
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Wenn
man die Einstrahlrichtung des Strahls F bezüglich der Achse A neigt, neigt
man sie vorzugsweise so, dass der Winkel α zwischen der Einstrahlrichtung
und der auf der Seite des Sammelmittels 5 befindlichen
Achse A verringert wird, um den Anregungsstrahl in die entgegengesetzte
Richtung der Messmittel zu orientieren und so die Streuung von Anregungslicht
in Richtung der Messmittel zu reduzieren.
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Wenn
die Röhre
eine Brechungsindex aufweist, der kleiner als derjenige von Wasser
ist, wird das lokal in dem beleuchteten Abschnitt 16 erzeugte Fluoreszenzlicht
entlang der axialen Richtung der Röhre 2 durch aufeinander
folgende Reflexionen an ihrer Innenfläche geleitet, so dass die Röhre 2 einen zylindrischen
Wellenleiter mit flüssigem
Kern bildet.
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In 4 ist
ein Strahl 27 des Fluoreszenzlichts dargestellt, das in
einem Punkt 28 der Lösung im
Inneren des Kanals 11 für
einen Lichtstrahl erzeugt wird, der eine ausreichende Neigung gegenüber dieser
Grenzfläche
aufweist. Man misst den Einfallwinkel des Strahls 27 durch
den Winkel θ zwischen
dem Strahl 27 und dem Vektor 29, der ins Innere
der Röhre 2 gerichtet
und senkrecht zu der Grenzfläche 31 zwischen
der Lösung
mit Brechungsindex n' und
der Röhre 2 mit
Brechungsindex n ist. Die Bedingung für Totalreflexion des Strahls 27 ist θ ≥ Arcsin(n/n'). So ist es durch
Wahl des Materials der Röhre 2 möglich, den
Brechungsindex n so zu minimieren, dass der Reflexionskoeffizient
an der Grenzfläche 31 für den größten Teil
der erzeugten Fluoreszenzlichtstrahlen erhöht wird und für Strahlen,
welche die oben genannte Bedingung erfüllen, gleich 1 wird.
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An
dem den Grenzsystem gegenüber
liegenden Ende der Röhre 2 ist
ein undurchsichtiger und hohler T-Verbinder so angesetzt, dass einerseits
die Röhre 2 mit
einer oder mehreren optischen Sammelfaser(n) 7 verbunden
wird, die in der Verlängerung der
Röhre 2 angeordnet
sind, und andererseits die Röhre 2 mit
einer Auslassleitung 6 verbunden wird, welche das Ausströmen der
Lösung
aus der Röhre 2 senkrecht
zu dieser ermöglicht.
Im Zentrum des Verbinders 5 befindet sich die Röhre 2 gegen
die Sammelfasern 7 so in Anlage, dass der Verlust an Fluoreszenzstrahlung
durch Streuung an deren Grenzfläche
minimiert wird. Der zu analysierende Lösungsstrom durchquert somit
die Röhre 2 um
durch den Seitenarm 30 des Verbinders 5 wieder
auszutreten.
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Die
optische(n) Faser(n) 7 sammelt (sammeln) das emittierte
Fluoreszenzlicht und führt
(führen)
es bis zu einer Photomultiplier-Röhre 8 oder einem anderen
optischen Detektor. Die Photomultiplier-Röhre 8 erzeugt ein
Messsignal, das mittels eines angepassten Verbindungsmittels 10 zu
einem Datenverarbeitungssystem 9 beispielsweise einem Mikrocomputer, übertragen
wird, welches dem Fachmann bekannte Softwaremittel aufweist, um
das empfangene Messsignal zu verarbeiten und ein Analysesignal zu
erzeugen, beispielsweise absolute oder relative quantita tive Messungen
der Konzentration der das Fluoreszenzlicht emittierenden Substanz(en).
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Der
innere Kanal 11 der Röhre 2 weist
auf Höhe
des in die Hülse 4 eingesetzten
Endes eine konische, ellipsoide oder paraboloide innere Umfangsfläche auf,
um die Reflexion des Fluoreszenzlichts in Richtung der Sammelfasern 7 zu
erhöhen,
wobei die Röhre
dann einen vergrößerten Innenquerschnitt
bezüglich
demjenigen der Leitung 3 aufweist.
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Auf
Grund der guten optischen Übertragung zwischen
der Röhre 2 und
der Sammelfaser 7 ist es nicht notwendig, spektrale oder
räumliche
Filtermittel zwischen der Röhre 2 und
dem optischen Detektor vorzusehen, obwohl es auch möglich ist,
diese vorzusehen, um die Detektionsschwelle zu verbessern. Obwohl
sie nicht dargestellt wurden, sind elektrische Versorgungsmittel
in die Photomultiplier-Röhre 8 und die
Lichtquelle 12 für
deren Betrieb integriert oder mit ihnen verbunden.
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Gemäß einer
in 2 dargestellten Variante der ersten Ausführungsform
weist die Analysevorrichtung 100 an Stelle der Verbindungshülse 4 einen zweiten
undurchsichtigen und hohlen T-Verbinder 105 auf, der identisch
ist mit dem T-Verbinder 5 oder diesem entspricht, welcher
die Röhre 2 mittels
eines rechtwinkligen Seitenarms 130, der mit einem Verbindungsmittel 104 verbunden
ist, mit einer Austrittsleitung 103 zusammenfügt, welche
der Leitung 3 entspricht, und eine zweite Gruppe 107 von
optischen Sammelfasern, welche identisch oder analog den Fasern 7 ist,
in der Verlängerung
der Röhre 2 mit
ihr verbindet, um Fluoreszenzlicht zu einer zweiten Photomultiplier-Röhre 108 zu
leiten, die identisch mit der Photomultiplier-Röhre 8 ist oder dieser
entspricht. Die Photomultiplier-Röhre 108 kann über eine
Leitung 110 mit dem oben genannten System 9 verbunden
sein. Bei dieser Variante ist die Montage an den beiden Enden der
Röhre 2 daher
symmetrisch, so dass das gesamte in der Röhre 2 gefangene Licht
unabhängig
von dessen Ausbreitungsrichtung gesammelt wird. Die Lösung tritt über die
Leitung 103 in die Röhre 2 ein
und verlässt
sie über
die Auslassleitung 6 wieder. Andere Bauteile der Vorrichtung 101 sind identisch
oder analog zu denen der Vorrichtung 1 der 1.
In dem Fall, weist ein oder weisen beide Enden (wie in 2 dargestellt)
der Röhre
eine konische, ellipsoide oder paraboloide Wand auf.
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Eine
zweite Ausführungsform
der Erfindung wird im Folgenden unter Bezugnahme auf 3 beschreiben,
in welcher die Bauelemente, die identisch oder analog mit denjenigen
der ersten Ausführungsform
sind, mit den gleichen um 200 erhöhten Bezugsziffern wie in 1 bezeichnet
sind. Die Analysevorrichtung 201 ist in Betrieb mit einem
Trennsystem durch Elektrophorese 235 verbunden, beispielsweise durch
Kapillarelektrophorese, Isotachophorese oder Elektrochromatografie,
dessen Austrittsleitung 203 eine Quarzkapillare oder eine
elektrophoretische Trennröhre
ist. Die Lösung
ist ein Elektrolyt, welcher das Hauptreservoir 232 des
Trennsystems 235 einnimmt, wobei die Leitung 203 über eine
Kolonne 233 mit dem Reservoir 232 verbunden ist,
und die Röhre 202 mit
der Leitung 203 verbunden ist sowie mit dem Inneren des
T-Verbinders 205 und einem seitlichen Pufferreservoir 206.
Der Elektrolyt befindet sich in elektrischem Kontakt mit einer ersten
Elektrode 224 des Trennsystems, welche in das Reservoir 232 eintaucht,
sowie mit einer zweiten Elektrode 217, die dicht durch
eine Wand des Pufferreservoirs 206 eingesetzt ist. Beispielsweise
hat das Reservoir 206 die Form eines Reagenzglases, dessen
offenes Ende dicht in den Seitenarm 230 des Verbinders 205 eingesetzt
ist und dessen Boden dich von der Elektrode 217 durchquert
wird. Selbstverständlich
befindet sich das Reservoir 206 über eine geeignete Öffnung auf Atmosphärendruck.
Somit wird die elektrische Kontinuität parallel zur Achse der Leitung 203 und
der Röhre 202 und,
auf Höhe
des T-Verbinders 205 senkrecht zur Achse der Röhre 202 gewährleistet.
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Im
Betrieb sind diese Elektroden mit einer Gleichspannungsquelle 226 des
Trennsystems 235 verbunden, die es ermöglicht, einen Potenzialgradienten
im Kreise der Leitung 203 und der Röhre 202 zu erzeugen,
um gelöste
Substanzen durch Elektrophorese voneinander zu trennen. Die Verbindung 204 zwischen
der Röhre 202 und
der Leitung 203 wird durch Einsetzen von Letzterer in Erstere
gewährleistet,
wobei der Innendurchmesser der Röhre 202 mit
dem Außendurchmesser
der Leitung 203 übereinstimmt.
Auf Höhe
dieser Verbindung weist die Innenwand der Röhre 202 eine kegelstumpfförmige oder
ellipsoide oder paraboloide Verengung auf, deren Fläche 218 eine
Rückreflexion
des Fluoreszenzlichts in Richtung der Sammelfasern 207 ermöglicht, so
dass die Sammeleffizienz des Fluoreszenzlichts durch die Fasern 207 wesentlich
verbessert wird. Bessere Leistungen erhält man, wenn die Fläche 218 mit
einem oxidationsbeständigen
reflektierenden material 242 beschichtet wird, wie beispielsweise
Gold, Silber, Platin, beispielsweise durch Abscheiden einer dünnen Schicht
durch Vakuumbedampfen (vgl. 5). Gegenüber der
geneigten Fläche 218 weist die
Einschnürung
eine Schulter 219 auf, die als Anschlag für den in
die Röhre 202 eingesetzten
Teil der Leitung 203 dient. Um zu verhindern, dass sich
Verunreinigungen auf Höhe
der Verbindung ansammeln, muss die Grenzfläche zwischen der Röhre 202 und der
Leitung 203 sehr gleichmäßig sein. Dies erreicht man
durch einen guten Oberflächenzustand
und eine durch Verkleben fixierte Ausrichtung.
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Die
Funktion der Analysevorrichtung 201 entspricht derjenigen
der Vorrichtung 1. Die Lichtquelle 212 und der
Linsensatz 214 lenken den Anregungslichtstrahl 213 auf
eine Abschnitt 216 der Röhre 202. Der den Gegenstand
der lokalen Anregungsbeleuchtung bildende Abschnitt 216 wird
vorzugsweise so gewählt,
dass er an die kegelstumpfförmige Verengung
und an die Verbindung mit der Leitung 203 angrenzt, um
das Totvolumen und den Einfluss von Innendurchmesserschwankungen
des durch die Leitung 203 und die Röhre 202 gebildeten
Trennrohrs zu verringern. Der photometrische Detektor 208 überträgt über Verbindungsmittel 210 ein
Messsignal an das Verarbeitungssystem 209.
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Die
Röhre 2 oder 202 weist
eine breiten Innendurchmesser von beispielsweise bis zu 200 μm für eine Anwendung
bei der Kapillarelektrophorese oder der μ-HPLC und bis zu 1000 μm für eine Anwendung
bei der HPLLC auf, um das beleuchtet Lösungsvolumen zu optimieren
und folglich die Empfindlichkeit der Fluoreszenzdetektion zu erhöhen.
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Die
zylindrische Form eines Kapillarkanals begünstigt die Ausbreitung der
im Inneren der Kapillarröhre
emittierten Fluoreszenz, vorausgesetzt, dass der Brechungs index
des Ausbreitungskanals größer als
der Index des benachbarten „äußeren" Mediums ist.
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Die
Ausbreitung findet dann in der flüssigen Ader statt, die in dem
Kapillarkanal 2 enthalten ist, wenn dieser aus einem Polymermaterial
besteht, das einen kleineren inneren Index als derjenige von Wasser
oder derjenige von üblicherweise
verwendeten Lösungsmitteln
aufweist.
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In 5 ist
eine Quarzröhre 202 mit
einem Brechungsindex n dargestellt, der größer als derjenige von Wasser
ist, mit einem Fluoreszenzlichtstrahl 227, der in einem
Punkt 228 der Lösung
im Inneren des Kanals 211 erzeugt wird. Man misst den Einfallswinkel
des Strahls 227 durch den Winkel θ zwischen dem Strahl 227 und
dem ins Innere der Röhre 202 gerichteten
und senkrecht zur Grenzfläche 231 zwischen
der Lösung
mit Brechungsindex n' und
der Wand der Röhre 202 mit
Brechungsindex n orientierten Vektor 229. Da n größer ist
als n', kann dort selbstverständlich keine
Totalreflexion des Strahls 227 auftreten, der sich in der
Wand aus Quarzglas ausbreitet. Da dieser Index n größer ist
als derjenige n'', der die Röhre 202 umgebenden
Luft, wird der Strahl abhängig
vom vorgenannten Einfallswinkel und dem gewählten Wert von n wenigstens
teilweise an der Grenzfläche
zwischen der Röhre
und der umgebenden Luft ins Innere der Wand und in den Kanal zurück reflektiert.
Vorzugsweise ist der Index n'' kleiner als der
Index n. Da das Sammeln entlang der Längsachse stattfindet, ist keine
Hülse erforderlich.
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Wie
man in den 4 und 5 erkennt,
ist hier eine Ausbreitungsrichtung bevorzugt: Dazu weist das Kapillarrohr
einen vergrößerten Querschnitt
auf, der eine an die Verbindungsmittel 204 angrenzende
Detektionszelle 216 bildet. Der vergrößerte Bereich mit konischer,
ellipsoider oder paraboloider Form kann im Inneren ebenfalls mit
einem reflektierenden Material aus Gold, Silber oder Platin mittels eines
Verfahrens beschichtet sein, wie beispielsweise Dünnschichtabscheidung
durch Vakuumverdampfen. Diese Vergrößerung der Kapillarröhre 202 auf Höhe des Anregungsbereichs 216 erlaubt
es, ein größeres Probenvolumen zu bestrahlen.
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Das
Hinzufügen
einer als Spiegel dienenden Beschichtung 243 auf der Außenwand
des Kapillarrohrs 202 ermöglicht es, den Grenzwinkel θ (Winkel bezüglich des
Vektors 229) zu verringern und so die in die die Röhre umgebende
Luft abgestrahlte/gestreute Fluoreszenz zu verringern. Diese Beschichtung 243 darf
jedoch den Anregungsbereich 216 der Detektionszelle nicht
bedecken, der für
den Strahl F transparent bleiben muss.
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Es
ist auch möglich,
eine Hülse
zu verwenden, welche die gleiche reflektierende äußere Beschichtung 243 aufweist,
wobei in die Hülse
Kapillartrennröhrchen 203 eingesetzt
und ausgerichtet sind und die größte Kapillarröhre 202 als
Detektionszelle dient, wobei diese vorzugsweise eingeklebt sind,
was es ermöglicht,
die Hülse
in der gewünschten
Form zu bearbeiten.
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Zur
Aufrechterhaltung der elektrophoretischen und chromatografischen
Auflösung
kann der Anregungsstrahl F einen elliptischen Querschnitt aufweisen,
wobei die Hauptachse dieser Ellipse senkrecht zur Längsachse
A des Kapillarrohrs orientiert und die Nebenachse der Ellipse parallel
zu der Achse A orientiert ist.
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Selbstverständlich kann
die Röhre 2 aus Quarzglas
und umgekehrt die Röhre 212 aus
einem Polymermaterial bestehen, ohne dass dadurch der durch die
Erfindung abgesteckte Rahmen verlassen wird.
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Obwohl
die Erfindung im Zusammenhang mit mehreren speziellen Ausführungsformen
beschrieben wurde, versteht es sich, dass die keineswegs darauf
beschränkt
ist und alle äquivalenten Techniken
der beschriebenen Mittel sowie deren Kombinationen umfasst, soweit
diese innerhalb des durch die Patenansprüche definierten Rahmens des Schutzbereichs
liegen.