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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur elektrophoretischen
Trennung und zum laserinduzierten Fluoreszenznachweis, um Fluoreszenzlicht
in Substanzen anzuregen, die in Flüssigkeitsadern gelöst sind,
die in Mikrokanälen
enthalten sind, welche in miniaturisierten flachen Trägern ausgebildet
sind, und um dieses Licht zum Zwecke chemischer oder biochemischer
Analysen zu detektieren.
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Es
ist bekannt, laserinduzierte Fluoreszenzmessungen durchzuführen, um
in einer Lösung,
insbesondere in Form von Spuren vorhandene Substanzen zu identifizieren
und zu quantifizieren. Derartige Messungen haben zahlreiche Anwendungen,
beispielsweise in der Biochemie gefunden.
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Die
elektrophoretischen Auftrennungen in Flüssigkeitsadern, die in Mikrokanälen enthalten sind,
die wiederum in miniaturisierte flache Träger eingefügt sind, erlauben es, sehr
kleine Volumina komplexer Gemische schnell aufzutrennen. Das geringe
injizierte Probenvolumen, die geringen Konzentrationen der zu analysierenden
Spezies und die geringen Abmessungen der Flüssigkeitsadern (einige μm), verlangen
den Einsatz einer sehr empfindlichen Nachweismethode.
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Die
am häufigsten
verwendete optische Nachweismethode, die bei Flüssigkeitsadern angewandt wird,
welche in Mikrokanälen
enthalten sind, die in miniaturisierte flache Träger einbeschrieben sind, ist
die laserinduzierte Fluoreszenz. Diese Nachweisart ist empfindlich,
denn sie ermöglicht
eine punktuelle Beleuchtung der flüssigen Mikroader mit einer
starken Strahlung. Der gegenwärtig
zur Durchführung
eines solchen Nachweises bei einer flüssigen Mikroader verwendete
optische Messaufbau ist ein konfokaler Messaufbau, der nach dem
Prinzip eines konfokalen Epifluoreszenzmikroskops arbeitet (siehe
G. J. M. Bruin, Electrophoresis (2000), Vol. 21, Seiten 3931–3951).
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Bei
konfokalen Systemen ist die Wirksamkeit des Sammelns der Fluoreszenz
gering. So ist nämlich
das beleuchtete Flüssigkeitsvolumen
gering, beispielsweise in der Größenordnung
von einigen hundert μm3, und das beobachtete Flüssigkeitsvolumen ist noch geringer,
nämlich
in der Größenordnung
von μm3. Es ist daher notwendig, die Fokustiefe
zu beschränken,
um dieses fluoreszenzemittierende Volumen zu beobachten, so dass
es nicht möglich
ist, die gesamte in der Flüssigkeitsader
emittierte Fluoreszenz zu sammeln. Da die Fokustiefe gering ist,
muss die numerische Apertur des verwendeten Objektivs um so größer sein,
was sehr kurze Arbeitswege verlangt. Wenn jedoch eine Polymer- oder
Quarzplatte die in miniaturisierte, flache Träger eingeformten Mikrokanäle bedeckt,
muss der Experimentator Objektive mit größeren Arbeitswegen verwenden
und erfasst daher ein geringeres Fluoreszenzsignal. Außerdem ist
die Positionierung eines solchen Detektors zum Sammeln der Fluoreszenz
extrem heikel, denn die Positionstoleranzen des Objektivs auf den
Mikrokanal sind sehr klein (geringer als ein μm).
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Das
Dokument
WO 00/04371 schlägt einen kapillarelektrophoretischen
Aufbau vor, bei dem eine Quarzkapillare verwendet wird, die außen mit
einer Polymerschicht bedeckt ist, die einen Brechungsindex aufweist,
der kleiner als derjenige eines Trennmediums ist, welches das Innere
der Kapillare füllt, wobei
man die Kapillare in einer senkrechten Geometrie beleuchtet, so
dass die Ausbreitungsrichtung des Anregungslichts quer zur Kapillare
ist, während das
Fluoreszenzlicht in axialer Richtung der Kapillare gesammelt wird.
Gemäß diesem
Dokument breitet sich das Licht, das in der Nähe der Außenfläche der Kapillare emittiert
oder gestreut wird, spiralförmig entlang
der Kapillare in der Nähe
von dessen Außenfläche aus,
während
das im Zentrum der Kapillare emittierte Licht, wie die laserinduzierte
Fluoreszenz, die Kapillare statistisch in der Nähe von deren Zentrum verlässt, was
eine Raumfilterung des Streulichts auf Höhe des Detektors ermöglicht.
Dieses Dokument beschreibt jedoch nicht die Anwendung auf flüssige Adern,
die in Mikrokanälen
enthalten sind, welche in miniaturisierte, flache Träger eingeformt
sind.
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es, eine Vorrichtung zur elektrophoretischen
Trennung und zum hochempfindlichen laserinduzierten Fluoreszenznachweis
für flüssige Adern
bereitzustellen, die in Mikrokanälen
enthalten sind, die in miniaturisierten, flachen Trägern ausgebildet
sind, welche die obengenannten Nachteile oder einige dieser Nachteile
nicht aufweist.
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Dazu
stellt die Erfindung eine Vorrichtung zur elektrophoretischen Trennung
auf einer flüssigen Ader
und zum laserinduzierten Fluoreszenznachweis bereit, welche umfasst:
- – einen
miniaturisierten flachen Träger,
der eine im wesentlichen ebene Oberfläche aufweist, auf der wenigstens
eine, den Trennelektrolyten und/oder zu analysierende Proben enthaltende Vertiefung
und wenigstens ein als flüssige
Ader dienender Wanderungs-Mikrokanal ausgespart sind, wobei der
Mikrokanal eine Lösung
enthalten kann, die wenigstens eine Substanz umfasst, die eine laserinduzierte
Fluoreszenzreaktion durchführen
kann, wobei das Material des Trägers
vorzugsweise im wesentlichen transparent für ein Anregungslicht ist,
- – wenigstens
ein Projektionsmittel, welches einen Anregungslichtstrahl lokal
auf einem Anregungsbereich des Mikrokanals entlang einer Richtung projizieren
kann, die einen Winkel von mehr als 60° mit einer Längsrichtung des Mikrokanals
bildet, wobei das Anregungslicht eine Fluoreszenzreaktion in der
oder den Substanz(en) induzieren kann,
wobei die Vorrichtung
gekennzeichnet ist durch: - – ein optisches Sammelmittel,
das mechanisch mit einem freien Ende des Mikrokanals verbunden und
so angeordnet ist, dass es Fluoreszenzstrahlung sammelt, die sich
im wesentlichen entlang der Längsrichtung
des Mikrokanals ausbreitet,
- – ein
optisches Messmittel, das mit dem Sammelmittel so gekoppelt ist,
dass die gesammelte Fluoreszenzstrahlung gemessen werden kann, ein Verarbeitungsmittel,
das ein von dem Messmittel übertragenes
Messsignal so verarbeiten kann, dass daraus ein Analyseergebnis
der Lösung
erzeugt wird,
wobei der Mikrokanal einen ersten, ein Reservoir
mit dem Abschnitt aufweist, der einen vergrößerten Innenquerschnitt besitzt,
der von dem freien Ende bis mindestens zu der Anregungszone reicht,
wobei sich der erste Abschnitt mit einer Innenwand mit im wesentlichen
konischer, ellipsoidaler oder paraboloider Form fortsetzt, deren
eine Fläche
in Richtung des freien Endes gerichtet ist und Fluoreszenzstrahlung in
Richtung des freien Endes zurückreflektieren kann,
und der in einem zweiten Abschnitt des Mikrokanals mit verringertem
Innenquerschnitt mündet, wobei
letzterer in kommunizierender Verbindung mit der oder den obengenannten
Vertiefung(en) steht.
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Aufgrund
der Verwendung einer konischen, ellipsoidalen oder paraboloiden
Wand der Flüssigkeitsader
auf Höhe
der Lasereinstrahlung, welche die Reflektion der Fluoreszenz in
Richtung einer an dem freien Ende der Flüssigkeitsader fixierten optischen Faser
ermöglicht,
ist diese Vorrichtung besonders wirksam.
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Vorteilhaft
ist die im wesentlichen konische, ellipsoidale oder paraboloide
Innenwand mit einer oxidationsbeständigen, reflektierenden metallischen Schicht,
beispielsweise aus Gold, Aluminium, Silber oder Platin, bedeckt,
insbesondere mittels eines Dampfabscheidungsverfahrens unter Vakuum.
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Gemäß einem
weiteren Merkmal der Erfindung sind alle Wände des Mikrokanals auf Höhe des Anregungsbereichs
mit diesem reflektierenden Material beschichtet, mit Ausnahme wenigstens
eines Teils des Bodens des Mikrokanals, der diese Beschichtung in
der Nähe
der obengenannten konisch, ellipsoidal oder paraboloid geformten
Innenwände nicht
aufweist.
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Vorteilhaft
weist der Träger
wenigstens zwei mit einer Spannungsquelle verbundene Elektroden auf,
die auf Höhe
einer Vertiefung beziehungsweise des Anregungsbereichs des Mikrokanals
so angeordnet sind, dass ein Potentialgefälle entlang des Mikrokanals
erzeugt werden kann, um die gelöste
Substanz(en) durch Elektrophorese wandern zu lassen.
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Vorteilhaft
dient die metallische Beschichtung auf Höhe der im wesentlichen konisch,
ellipsoidal oder paraboloid geformten Innenwand als kathodische
Elektrode.
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Vorzugsweise
umfasst das Projektionsmittel eine Strahlungsquelle, die seitlich
in einem Abstand zum Mikrokanal angeordnet ist, sowie optische Mittel,
die zwischen der Strahlungsquelle und dem Mikrokanal angeordnet
sind, um den Querschnitt des Anregungslichtstrahls an die Innenbreite
des Mikrokanals anzupassen.
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Vorzugsweise
weist der Laserstrahl einen elliptischen Querschnitt auf, dessen
große
Hauptachse im wesentlichen senkrecht zur Längsachse des Mikrokanals orientiert
ist und der sich im wesentlichen über die Breite des Mikrokanals
erstreckt, wobei die kleine Hauptachse im wesentlichen parallel
zur Längsachse
des Mikrokanals ist oder mit dieser zusammenfällt, was es ermöglicht,
die elektrophoretische Auflösung
der Trennungen aufrechtzuerhalten.
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Vorzugsweise
kann der Träger
aus einem Polymer mit einem Brechungsindex hergestellt sein, der
kleiner als derjenige von Wasser ist.
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Der
Träger
kann auch aus einem Material mit einem Brechungsindex bestehen,
der größer als
derjenige von Wasser ist, beispielsweise aus Quarzglas.
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Im
Sinne der Erfindung ist das Wasser in dem Mikrokanal ein im wesentlichen
aus Wasser bestehender Elektrolyt (mit einem Brechungsindex in der
Größenordnung
von 1,33 bei einer Wellenlänge in
der Größenordnung
von 488 nm) oder ein Elektrolyt aus mit Wasser mischbaren organischen
Lösungsmitteln,
Säuren,
in Wasser löslichen
Salzen, wie sie gegenwärtig
zum Transport der zu trennenden Substanzen verwendet werden, oder
auch aus einem Hydrogel (beispielsweise mit einem Brechungsindex
in der Größenordnung
von 1,36).
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Vorzugsweise
weist der Mikrokanal eine Tiefe von höchstens 100 μm und im
allgemeinen in der Größenordnung
von 10 μm,
und eine Breite von höchstens
400 μm und
im allgemeinen in der Größenordnung
von 50 μm
auf. Der Querschnitt des Mikrokanals ist vorzugsweise rechteckig
und auf der flachen Oberfläche
des Trägers
offen, aber er kann auch halbkreisförmig sein. Der Mikrokanal kann
zur Umgebungsluft hin offen sein, aber er kann auch mit einer Glasplatte
mit einer Dicke von 1 mm oder mit einem anderen transparenten Material
bedeckt sein.
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Die
Erfindung wird besser verständlich
werden und weitere ihrer Ziele, Details, Eigenschaften und Vorteile
werden deutlicher im Verlauf der folgenden Beschreibung einer speziellen
Ausführungsform der
Erfindung hervortreten, die rein illustrativ und nicht einschränkend unter
Bezugnahme auf beigefügte
Zeichnungen erfolgt. In den Zeichnungen:
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ist 1 eine
schematische Seitenansicht einer erfindungsgemäßen Vorrichtung,
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ist 2 eine
Aufsicht auf 1 entlang des Pfeils II, und
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ist 3 eine
vergrößerte Detailansicht
der Vorrichtung der 1.
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In 1 ist
die Analysevorrichtung 1 in eine miniaturisierte Trennvorrichtung
integriert, die Mikrokanäle 20, 21, 31 und 33 aufweist,
welche flüssige Adern
bilden, die auf der flachen Oberfläche 3 eines aus Polymer
oder Quarzglas bestehenden Trägers 2 mit
parallelepipeder Form ausgebildet sind. Man lässt chemische Substanzen in
einer Elektrolytlösung,
welche die Adern füllt,
unter der Wirkung einer mittels einer Gleichspannungsquelle 26 erzeugten elektrischen
Potentialdifferenz wandern. Das Polymer des Materials 2 kann
ein Polymer sein, das einen Brechungsindex aufweist, der kleiner
als derjenige der Elektrolytlösung
ist. Die flüssige(n)
Ader(n), welche die mittels Fluoreszenz zu detektierenden chemischen
Substanzen enthält
(enthalten), d.h. die Adern 20 und 21 in dem dargestellten
Beispiel, weisen an einem ersten blinden Ende eine anodische Vertiefung 23 auf,
in welcher sich eine anodische Elektrode 24 in elektrischem
Kontakt mit der elektrisch leitfähigen
Lösung
befindet, und, in der Nähe
eines zweiten freien Endes, einen vergrößerten Anregungsbereich 16,
in welchem eine kathodische Elektrode 25 in elektrischem
Kontakt mit der Lösung
steht. Die Elektroden 24 und 25 sind mit der Spannungsquelle 26 verbunden,
beispielsweise mittels elektrischer Kontakte, die auf der Oberfläche des
Substrats 2 gegenüber
den Adern 20 und 21 fixiert sind.
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Der
vergrößerte Anregungsbereich 16 wird von
einem Projektionsmittel beleuchtet, das eine Anregungslichtquelle 12 (bei
der es sich um einen Laser oder eine Lampe) handeln kann, und einem
Satz Linsen 14 umfasst. Die Anregungslichtquelle 12 projiziert
einen Anregungslichtstrahl 13 in einer Einstrahlrichtung,
der einen Winkel α von
mehr als 60° und,
in 1, im wesentlichen von 90°, mit der axialen Richtung A
der Ader 20 einschließt,
und der Linsensatz 14 ermöglicht eine Anpassung des Anregungslichtstrahls
F an den Querschnitt des vergrößerten Anregungsbereichs 16 der
Ader 20.
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Der
vergrößerte Anregungsbereich
ist in einem vergrößerten Bereich
des Kanals 20 enthalten und bildet ein Reservoir 5 bis
zu seinem freien Ende in Richtung einer optischen Sammelfaser 7,
die in der Verlängerung
der Ader 20 angeordnet ist. Auf der gegenüberliegenden
Seite verlängert
sich das Reservoir 5 durch eine Innenwand 22 mit
im wesentlichen konischer, ellipsoidaler oder paraboloider Form,
deren eine Fläche
in Richtung des freien Endes gerichtet ist und das Fluoreszenzlicht
in Richtung des freien Endes reflektieren kann. Die Wand 22 mündet in
einen zweiten Abschnitt des Mikrokanals 20 mit verringertem
Innenquerschnitt, wobei letzterer über den Mikrokanal 21 in
kommunizierender Verbindung mit der obengenannten Vertiefung 23 steht.
Die mechanische Kopplung zwischen der optischen Faser 7 und dem
Träger 2 wird
durch dichten Einbau oder durch Verkleben eines Teils des Endes
der optischen Faser 7 in einer Nut mit rechteckigem oder
halbzylindrischem Querschnitt 5 mit entsprechenden Abmessungen
realisiert, die in der Oberfläche
des Trägers 2 in der
Verlängerung
der Ader 20 ausgespart ist. Der Durchmesser der optischen
Faser entspricht zumindest der Breite des vergrößerten Anregungsbereichs 16.
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Der
gerichtete Strahl des Anregungslichts 13 durchquert einen
Linsensatz 14, der ihn so anpasst, dass das Strahlenbündel F auf
dem Abschnitt 16 des Mikrokanals 20 so gebündelt wird,
dass der Durchmesser des Strahlenbündels F auf Höhe des Mikrokanals 20 im
wesentlichen der Breite des Abschnitts 5 des Mikrokanals 20 entspricht.
Somit ist der Verlust eines Teils des Anregungslichts, der die Lösung nicht trifft,
minimal, während
das beleuchtete Volumen der Lösung
ausreichend groß bleibt,
um Fluoreszenzlicht in einer ausreichenden Menge von den sehr geringen Konzentrationen
der fluoreszierenden Substanz zu induzieren.
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Der
Linsensatz 14 kann das Strahlenbündel F auch aufweiten, beispielsweise
für den
Fall, dass die Quelle 12 einen Lichtstrahl 13 erzeigt,
der schmaler als das Innere des Mikrokanals 20 ist.
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Wenn
man die Einfallsrichtung des Strahlenbündels F gegenüber der
Achse A neigt, neigt man sie vorzugsweise so, dass der zu der optischen
Faser 7 weisende Winkel α zwischen
der Einfallsrichtung und der Achse A verringert wird, um das Anregungslicht
auf die der optischen Faser gegenüberliegende Seite zu orientieren und
so die Streuung des Anregungslichts in Richtung des Messmittels
zu reduzieren.
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Die
optische Faser (oder Fasern) 7 sammelt (sammeln) axial
das emittierte Fluoreszenzlicht und führt (führen) es bis zu einer Photomultiplierröhre 8 oder
zu einem anderen optischen Detektionsmittel. Die Photomultiplierröhre 8 erzeugt
ein Messsignal, das mit einem entsprechenden Verbindungsmittel 10 an
ein Datenverarbeitungssystem 9, beispielsweise einen Mikrocomputer, übermittelt
wird, der eine an sich bekannte Software enthält, um die empfangenen Messsignale
zu verarbeiten und ein Analyseergebnis zu erzeugen, beispielsweise
absolute oder relative quantitative Konzentrationsmessungen der
Fluoreszenzlicht emittierenden Substanz(en).
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Aufgrund
der guten optischen Übertragung zwischen
dem Mikrokanal 20 und der Sammelfaser 7 ist es
nicht notwendig, Spektral- oder Raumfiltermittel zwischen dem Mikrokanal 20 und
dem optischen Detektor anzuordnen, obwohl es auch möglich ist,
solche vorzusehen, um die Detektionsschwellen zu verbessern. Obwohl
nicht dargestellt, sind elektrische Versorgungsmittel in der Photomultiplierröhre 8 und der
Lichtquelle 12 enthalten oder mit diesen verbunden, um
sie in Betrieb zu nehmen.
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Wie
in 2 dargestellt weist die erfindungsgemäße elektrophoretische
Trennvorrichtung die beispielsweise mit Elektromigration, Elektroendoosmose,
Zonen- oder Mizellarelektrophorese, Isotachophorese oder Elektrochromatographie,
eine elektrolytische Lösung
auf, welche die Vertiefungen 23, 32 und 34 und
die Mikrokanäle 20, 21, 31 und 33 einnimmt.
Beispielsweise enthält
die Vertiefung 32 einen seitlichen Puffer, der die Migration
ermöglicht,
während
die Vertiefung 23 die zu analysierende Probe und die Vertiefung 34 einen
reaktiven Farbstoff zur Erzeugung eines fluoreszierenden Derivats
bei Kontakt mit der zu analysierenden und zu detektierenden Substanz
in dem Fall, wo die Substanz im Anregungslicht keine oder keine
ausreichende Fluoreszenz emittiert, enthalten. Jede der Vertiefungen
ist mit einer anodischen Elektrode versehen, die in einer vorgegebenen
Reihenfolge aktiviert wird. Beispielsweise kann man vorsehen, dass
die der Vertiefung 23 zugeordnete Elektrode als erstes
aktiviert wird, damit die zu detektierenden Substanzen bis zu der
Kreuzung oder dem Übergang 35 zwischen
den verschiedenen Mikrokanälen
wandern, während
anschließend
die der Vertiefung 34 zugeordnete Elektrode an deren Stelle
aktiviert wird, damit der reaktive Wirkstoff seinerseits die Kreuzung
und folglich die vorher bis zu der Kreuzung gewanderte Substanz
erreicht und mit dieser reagiert, und schließlich wird die der Vertiefung 32 zugeordnete
Elektrode aktiviert, damit die Substanzen in dem Mikrokanal 20 bis
zu dem Anregungsbereich 16 aufgetrennt werden. Es versteht sich,
dass die Erfindung nicht auf drei Vertiefungen beschränkt ist,
sondern Ausführungsformen
von einer oder mehreren Vertiefungen und von einem oder mehreren
Trennmikrokanälen
abdeckt.
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Der
Elektrolyt steht mit jeder sich in der entsprechenden Vertiefung
oder dem Reservoir 5 ausdehnenden Elektrode in elektrischem
Kontakt. Die Elektroden können
in dem Träger 2 integriert
sein.
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Die
Vergrößerung des
Mikrokanals 20 auf Höhe
des Anregungsbereichs 16 ermöglicht die Bestrahlung eines
größeren Probevolumens.
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3 zeigt
den vergrößerten Anregungsbereich
detalliert: Die Wand 22 weist eine konische oder ellipsoidale
oder paraboloide Fläche
auf, um die Reflektion des Fluoreszenzlichtes in Richtung einer
optischen Sammelfaser 7, die in der Verlängerung
der Nut 5 an deren kathodischen Ende angeordnet ist, zu begünstigen.
Eine metallisch spiegelnde Beschichtung aus Gold, Silber, Aluminium
oder Platin 27 ist beispielsweise mittels eines Dampfabscheidungsverfahrens
unter Vakuum auf den Boden des Mikrokanals und dessen Seitenwände mit
Ausnahme eines Bodenbereichs 28 des Mikrokanals in der
Nähe der Wand 22 aufgebracht,
um die Reflektion des Lichtstrahlenbündels F in den Mikrokanal zu
verhindern. Die metallische Fläche 27 kann
mit der Masse 29 verbunden sein, um den elektrischen Kreislauf
zu schließen,
der die Gleichspannung 26 liefert.
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Zur
gleichzeitigen Anregung der Fluoreszenz mehrerer Substanzen kann
man auch mehrere Projektionsmittel mit Anregungslichtquellen vorsehen, die
unterschiedliche Wellenlängen
besitzen, die Seite an Seite entlang des Trägers 2 und/oder an
dessen Umfang angeordnet sind. In diesem Fall findet die Fluoreszenz der
verschiedenen Substanzen bei unterschiedlichen Wellenlängen statt
und es ist zweckmäßig, vor
dem Sammelmittel ein spektrales Trennsystem, wie einen optischen
Filter, Prismenmonochromator oder ein Beugungsgitter anzuordnen,
das es ermöglicht,
ein oder mehrere Bänder
der Emissionswellenlängen
auszuwählen.
Dies ist auch dann der Fall, wenn die Anregungsquelle ein Laser
ist, der in UV emittiert, wobei die verschiedenen Substanzen dann
spezifische Eigenfluoreszenzen aufweisen können.
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Diese
Vorrichtung ist vorteilhaft bei der Fluoreszenzdetektion von mehreren
Trennmikrokanälen, die
ein Sammeln der Fluoreszenz in jedem der Mikrokanäle erfordern,
denn die Verwendung eines Bündels
von optischen Fasern wird erleichtert (eine optische Faser pro Mikrokanal).
In diesem Fall kann die Anregung entweder durch Unterteilen des
Laserstrahls mittels eines optischen Faserbündels oder durch schnelles
Verschwenken unter Verwendung eines drehbaren Spiegels erfolgen.
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Zur
Aufrechterhaltung der elektrophoretischen und chromatographischen
Trennungen kann der Anregungsstrahlenbündels F einen elliptischen Querschnitt
aufweisen, wobei die Hauptachse der Ellipse senkrecht zur Längsachse
A des Mikrokanals und die Nebenachse der Ellipse parallel zur Achse
A orientiert sind.
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Obwohl
die Erfindung im Zusammenhang mit einer speziellen Ausführungsform
beschrieben wurde, versteht es sich, dass sie keineswegs darauf beschränkt ist
und dass sie alle technischen Äquivalente
der beschriebenen Mittel, sowie deren Kombinationen umfasst, sofern
diese in den durch die Patentansprüche abgesteckten Rahmen fallen.