DE2606481A1

DE2606481A1 - Fluorometer

Info

Publication number: DE2606481A1
Application number: DE19762606481
Authority: DE
Inventors: Gerald Lee Klein
Original assignee: Beckman Instruments Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1975-02-24
Filing date: 1976-02-18
Publication date: 1976-09-30
Also published as: FR2301822A1; DE2606481B2; FR2301822B1; US4031399A; GB1495912A; JPS564226Y2; CH604162A5; JPS51123084U; DE2606481C3

Description

Patentanwälte

Α? ?ri5S^a'^ⁿ Η. FEB. 1976

Dr. T. Haibach ' 15^30 H/tt

Dipl.-Ing. R. Feldkamp

8 München 2
Kaufingerstr. 8. Tel. (089) 240275

Beckman Instrumente, Inc., Pullerton, CaI., UBA

Fluorometer

Die Erfindung betrifft allgemein ein Fluorometer und näherhin ein Fluorometer, bei welchem die von einer Probe bei Beaufschlagung der Probe mit einer kleinen Erregerlichtfläche emittierte Fluor eszenzetrahlung nachgewiesen wird.

Fluorometer haben verbreitet Anwendung für Labor- und klinische Analysezwecke zur Identifizierung und untersuchung des Verhaltene vieler Stoffe und biologischer Substanzen gefunden. Eine Fluoreszenzprobe absorbiert Licht einer gegebenen Wellenlänge und emittiert in Abhängigkeit hiervon Licht einer hiervon verschiedenen Wellenlänge. Oftmals ist

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der Wirkungsgrad (die Ausbeute) der Absorption und der Emission so gering, daß Fluorometer immer höhererEmpfindlichkeit für die emittierte Strahlung für verläßliche Analysen erforderlich sind. Hit zunehmender Empfindlichkeit wächst jedoch auch die Wahrscheinlichkeit, daß Strahlungen von Fremdquellen oder von der Anregungsstrahlungsquelle den Nachweis uod di.· tfoeeuoe der von de? Probe ausgehenden Fluoreszenzstrahlung nachteilig beeinflussen.

ψ-

Bei den derzeit verfügbaren Fluoroaetern, bei welchen entweder eine Probe mit einer ^-Strahlungsquelle angestrahlt oder ein Lichtspalt von Licht des gewünschten Wellenlängenbandes auf die Probe abgebildet wird, bereitet entweder die Sammlung und der Nachweis der gewünschten Fluoreszenz-Strahlung unter Ausschluß von Strahlung anderer Strahlungsquellen Schwierigkeiten, oder sie sind so kompliziert und aufwendig in ihrem Aufbau, daß sie für viele Anwendungszwecke unangemessen werden. In diesem Zusammenhang ist zu berücksichtigen, daß bei Anstrahlung einer Probe mit UV-Strahlung alle Fluoreszenzstoffe in der Nachbarschaft der Probe, wie beispielsweise benachbarte Proben oder auch Fremdstoffe» Fluoreszenz zeigen. Dies hat zur Folge, daß umfangreiche Lichtlenk- und Abschirmvorrichtungen erforderlich sind, um zu verhindern, daß diese ungewünschte Strahlung in den Detektor gelangt. Die Abbildung eines Lichtspaltes gewünschter Bandbreite auf der Probe hat bisher komplizierte Anordnung'von Dispersioneelementen, wie beispielsweise optische Prismen oder Gitter, erforderlich gemacht, was allgemein relativ niedrige Anregungsenergiepegel zur Folge hat und somit stärkere Strahlungsquellen erforderlich macht. Außerdem wird bei beiden bekannten Verfahren, um den Eintritt von Streulicht in das System möglichst zu verringern und die Ansprechempfindlich*

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keit des Systems für die Emissionsstrahlung zu erhöhen, der Detektor entweder benachbart der zu analysierenden Probe angeordnet bzw. ist eine entfernte Anordnung nur bei Verwendung eines komplizierten optischen Systems zwischen der Probe und dem Detektor möglich.

Der vorliegenden Erfindung liegt als Aufgabe die Schaffung eines Iluorometers'erhöhter Empfindlichkeit für die von einem Probenmaterial emittierte Strahlung zugrunde, bei dem die Nachteile der bekannten Systeme vermieden werde·» und das die erwähnte erhöhte Empflüdlichkeit in einer kommerziell vertretbaren Form gewährleistet, d· h. bei verhältnismäßig einfachem, kompakten und billigem Aufbau und zuverlässiger Arbeitsweise·

Gemäß einer bevorzugten Ausführungeform der Erfindung weist das Fluorometer ein Anregungssystem zur Abbildung einer kleinen Lichtfläche in die Ebene der zu analysierenden Probe auf, sowie eine Vorrichtung zur Übertragung der von der Probe emittierten Strahlung an einen entfernt angeordneten Detektor· Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist die Übertragungsvorrichtung eine opake Lichtabschirmung mit einem unmittelbar benachbart der Probe auf der mit der Lichtspalt-Anregungsstrahlung beaufschlagten Seite der Probenebene gelegenen Einlaß auf, der einen Sektor der von der Probe emittierten Strahlung auffängt und sammelt. Die von dem Durchlaß aufgefangene Emissionsstrahlung wird von einem Lichtleiter, dessen eines Ende innerhalb des Durchlasses der Lichtabschirmung angeordnet ist, aufgefangen und gesammelt und an den entfernt angeordneten Detektor übertragen·

Im folgenden werden Aueführungsbeispiele der Erfindung an

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Hand der Zeichnung beschrieben; in dieser zeigen

Fig· 1 in perspektivischer Schemadarstellung den optischen Teil eines Fluorometers gemäß der Erfindung,

Fig. 2 in vergrößerter Draufsicht eine in dem optischen System aus Fig. 1 verwendete Liohtübertragungsabschirmung,

Fig. 3 die Abschirmung aus Fig. 2 in Schnittansicht im Schnitt längs der Linie 3-3 in Fig. 2,

Fig· 4 in Teilseitenansicht den in. dem Fluorometer von Fig. 1 verwendeten Lichtleiter.

Fig. 1 veranschaulicht eine Aueführungsform eines erfindungsgemäßen Fluorometers, in welchem eine Fluoreszenzprobe mit Lichtstrahlungsenergie angeregt und die von der Probe emittierte Strahlung nachgewiesen wird. Das Fluorometer weist ein als Ganzes mit 10 bezeichnetes Anregungssystem zur Erzeugung einer kleinen Lichtfläche, wie beispielsweise eines schmalen Schlitzes 12, auf, der bzw. die in der Ebene der zu analysierenden Probe abgebildet werden, derart, daß der Lichtschlitz auf die Probe trifft» Die (in Fig. 1 nicht dargestellte) Probe kann in dem Fluorometer in herkömmlicher Weise montiert oder gehaltert werden· Beispielsweise kann die Probe auf einem Glas- oder Kunststoffträger angeordnet sein, der zur Ausrichtung der Probe mit dem Schlitz 12 montiert ist· Um die Probe in Ausrichtung mit dem Schlitz zu bringen, kann ein Schlitten oder eine anderweitige Transportvorrichtung vorgesehen sein. Für Zwecke einer Beihenanalyse können mehrere auf einem oder auf mehreren Trägern angeordnete Proben mittels der Transportvorrichtung aufeinanderfolgend an dem Schlitz vorbeigeführt werden.

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Das Anregungssystem 10 weist eine Lichtquelle 14 in Gestalt einer Wolframlampe mit Glühfaden 16, zwei Kondensorlinsen 18, eine Schlitzplatte 20, zwei Objektivlinsen 22, einen Diagonalspiegel 24 sowie ein Primärfilter 26, sämtlich in herkömmlicher Ausführung, auf. Die Kondensorlinsen 18 fokussieren ein verkleinertes Bild des Glühfadens 16 der Erregungsstrahlenquelle auf die Schlitzplatte 20· Die Objektivlinsen 22 zusammen mit dem Spiegel 24 erzeugen ein scharfes Bild des beleuchteten Schlitzes in der Platte 20 in der Probenebene· Das für die Erregung der Probe gewünschte Vellenlängenbend wird durch das Primärfilter 26 ausgesondert, dessen Durchlaßbereich den gewünschten Wellenlängen entspricht· Um verschiedene Proben analysieren zu können, soll das Filter 26 leicht auswechselbar und durch Filter mit unterschiedlichen Durchlaßeigenschaften je nach der speziell interessierenden Probe ersetzbar sein.

Nach dem Grundgedanken der Erfindung ist unmittelbar benachbart der Probe eine als Ganzes mit 30 bezeichnete Llchtüberführungs- bzw. -übertragungsvorrichtung vorgesehen, welche die von der Probe emittierte Strahlung sammelt und zu einem entfernt angeordneten Detektor überträgt· Die Übertragungsvorrichtung weist einen Lichtleiter 32 mit einer unmittelbar benachbart der Probe angeordneten schrägen Stirnfläche 34 auf; das entgegengesetzte Ende des Lichtleiters ist auf einen Detektor 36, wie beispielsweise eine Photomultipllerröhre, ausgerichtet. In dem Übertragungssystem 30 zwischen der Lichtleitung und dem Detektor ist ein Sekundärfilter 38 angeordnet, um zu gewährleisten, daß nur von der Probe emittierte Strahlung in den Detektor übertragen wird. Zu diesem Zweck weist das Sekundärfilter eine DurchlaBcharakterietlk auf, welche von dem Erregersystem 10 erzeugte Wellenlängen unterdrückte

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Die Übertragungsvorrichtung 30 weist, wie aus den Fig. 2 und 3 ersichtlich, auch eine opake Lichtabschirmung 40 eng benachbart der Ebene der zu analysierenden Probe auf. In Fig· 1 ist die Lichtabschirmung der Übersichtlichkeit halber nicht dargestellt. Die Lichtabschirmung 40 weist eine öffnung 42 auf, durch welche hindurch der Licht schlitz bzw« -spalt 12 aus dem Erregersystem 10 in die Ebene der Probe abgebildet wird. Der Spalt 12 erstreckt sich in Fig. 3 senkrecht zur Zeichenebene und ist in Fig. 3 lediglich als Lichtpunkt dargestellt. Die als Ganzes mit 44- dargestellte Probenebene kann einen Träger mit einer oder mehreren Probe(n) aufweisen, der in Pfeilrichtung verschiebbar ist, um die Proben am Ort des Lichtspaltes 12 in Stellung zu bringen. Die Erregung der Probe durch den schmalen, fokuseierten Lichtspalt gewährleistet, daß nur die jeweils interessierende Probe und gegebenenfalls sogar nur eine bestimmte Zone dieser Probe erregt wird. Die öffnung 42 der Abschirmung 40 ist so bemessen, daß das Bild des Lichtspaltes 12 von der Abschirmung hindurchgelassen wird, daß jedoch Streubilder in dem optischen System durch die Abschirmung zurückgehalten werden.

Die Lichtabschirmung 40 weist ferner einen der öffnung 42 benachbarten Durchlaß 46 auf, der auf die Probenebene ausgerichtet ist und einen Sektor der von der Probe emittierten Strahlung auffängt. Der Durchlaß 46 weist eine die Probenebene unter einem spitzen Winkel schneidende Längsachse auf. Er steht mit einem senkrecht hierzu in der Lichtabschirmung verlaufenden Kanal 48 in Verbindung. Das eine Ende des Lichtleiters 32 ist in dem Kanal 48 befestigt, und zwar so, daß die schräge Stirnfläche 34- des Lichtleiters am Schnittpunkt des Durchlasses 46 und des Kanals 48 zu liegen kommt und so die in dem Durchlaß aufgefangene Strahlung aufnimmt und sie im Inneren des

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Lichtleiters in Sichtung auf den Detektor 34 umlenkt.

Der Lichtleiter 32 ist aus einem geeigneten lichtdurchlässigen Material hergestellt, das keine fluoreszenz in dem interessierenden Erregungswellenlängenbereich besitzt. Das eine Ende des Leiters ist zur Bildung der Fläche 34- unter einem Winkel von 45° bezüglich der Leiterlängsachse geschnitten und poliert; am anderen Ende ist der Lichtleiter unter 90° geschnitten und poliert· Die Sammlung der von der Probe ausgehenden Strahlung durch den Lichtleiter ist in Fig. 4 veranschaulicht· Von der mit dem Lichtspalt 12 bestrahlten Fläche der Probe ausgehende Strahlung, welche in den Lichtleiter rechtwinklig zu dessen Längsachse eintritt, wird an der schrägen Stirnfläche 34- durch innere Reflexion parallel zur Achse des Lichtleiters in Richtung auf dessen anderes Ende umgelenkt· Strahlung, die unter einem anderen als einem rechten Winkel eintritt (in Fig. 4 gestrichelt angedeutet), wird ebenfalls durch innere Reflexionen an der Stirnfläche 34- und an der Wandung des Lichtleiters in Richtung auf das andere Ende des Lichtleiters gelenkt· Somit wird von dem Durchlaß 46 aufgefangene Strahlung durch den Lichtleiter aufgesammelt und entlang diesem dem Detektor 36 zugeführt· Vorzugsweise ist der Lichtleiter mit einem opaken Material bedeckt bzw. überzogen, um den Eintritt von Streu·« oder anderweitigem Fremdlicht zu verhindern·

Durch die Erfindung wird somit ein Fluorometer geschaffen, das außerordentlich empfindlich und gleichwohl einfach in der Konstruktion ist. Von der Probe ausgehende Strahlung wird an einer unmittelbar benachbart der Probe gelegenen Stelle auf der gleichen Seite der Probenebene wie das auf die Probe auftreffende Erregerlicht gesammelt. Hierdurch wird ein möglichst großer feil der Fluoreszenzenergie

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gesammelt und so die Empfindlichkeit des Systems erhöht. Außerdem werden hierdurch Fehler infolge von Löschung, d. h. Strahlungsreabsorptiön entweder in der Probe oder im Probenträger, weitgehend verringert· Außerdem werden Fehler infolge von Rückstreuung von Erregungsenergie durch das Sekundärfilter 38 weitgehend verringert, das von dem Erregungssyetem 10 erzeugte Wellenlängen unterdrückt. Außerdem ermöglicht die erhöhte Empfindlichkeit des Fluoro· meters die Verwendung einer Wolframstrahlungsquelle 15 als UV-Strahlungsquelle· Serartige Wolframstrahlungsquellen sind gewöhnlich wegen ihrer verhältnismäßig niedrigen UV-Emission als UV-Strahlungsquellen nicht geeignet.

Die Erfindung wurde vorstehend an Hand eines bevorzugten Ausführungebeispiele beschrieben, das in mannigfachen Einzelheiten abgewandelt werden kann, ohne daß hierdurch der Rahmen der Erfindung verlassen wird.

Zusammenfassung

Gegenstand der Erfindung ist ein Fluorometer zur Analyse einer Probe durch Nachweis der durch Lichtstrahlung induzierten Strahlungsemission der Probe· Das ELuorometer weist eine Vorrichtung zur Erzeugung eines schmalen Anregungslichtepaltes (bzw. -spaltbildes) in der Ebene der Probe auf, des weiteren eine Übertragungsvorrichtung mit einer Lichtabschirmung, welche einen unmittelbar benachbart der Probe unter einem spitzen Winkel angeordneten Durchlaß zur Aufnahme und Sammlung der von der Probe emittierten Strahlung und zur Übertragung der Strahlung über einen Lichtleiter an einen entfernt angeordneten Detektor aufweist·

Patentansprüche: 609840/0673

Claims

P at ent anspräche

( 1»)3JTuorometer mit einer Glühlampe als Erregtmgsstrahluags-— quelle und einem Folrassierijngssystem zur Erzeugung einer kleinen Lichtflächa ans Licht innerhalb eines ersten Wellenlängenbandee in der Ebene einer zu analysierenden Probe, wobei die Probe in Abhängigkeit von der auf sie auftreffenden Errögerstrahlung Strahlung innerhalb eines zweiten Weilenlängenbereichs emittiert, da-. durch gekennzeichnet, daß auf der mit der Erregungsstrahlung beaufschlagten Seite der Probenebene (44) und unmittelbar benachbart der Probe eine Übertragungsvorrichtung (50) vorgesehen ist, welche von der Probe emittierte Strahlung sammelt und unter Ausschluß der Erregungsstrahlung einem von der Probe entfernt angeordneten Detektor (36) für Analysezwecke zuführt, wobei die Übertragungsvorrichtung (30) einen Lichtleiter (32) aufweist, dessen eines Ende (34) unmittelbar benachbart der Probe angeordnet ist, um einen Sektor der von der Probe emittierten Strahlung aufzufangen und zu sammeln, und dessen von der Probe entferntes anderes Ende auf den Strahlungsdetektor (36) ausgerichtet ist·
2. Fluorometer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Fokussierungssystem eine Aperturvorrichtung (20) sowie eine Vorrichtung (18) zur Fokussierung des von der Glühlampe (14) ausgehenden Lichtes auf eine vorgegebene Apertur in der Aperturvorrichtung aufweist, sowie eine Vorrichtung (22, 24) zur Erzeugung eines scharfen Bildes (12) der vorgegebenen Apertur in der Probenebene (44).
3· Fluorometer nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn-

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zeichnet, daß die Übertragungsvorrichtung (30) eine opake Lichtabschirmung (40) mit einem unmittelbar benachbart der Probe angeordneten Durchlaß (46) aufweist, der so bemessen ist» daß er einen Sektor der von der Probe emittierten Strahlung auffängt und sammelt, und 'daß der Lichtleiter (32) in der Abschirmung (40) so angeordnet ist, daß das eine Ende (34) des Lichtleiters in dem Durchlaß (46) der Abschirmung zu liegen kommt und dessen Längsachse schneidet.
4. Fluorometer nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtabschirmung (40) eine dem Durchlaß (46) benachbarte öffnung (42) für den Durchtritt der Erregerstrahlung aufweist, die so bemessen ist, daß sie die Erregerstrahlung von der Erregerglühlampe (14) zu der Probenebene (44) hindurchläßt, während in der Anregungsvorrichtung erzeugte Streubilder durch die Abschirmung zurückgehalten werden·

5· Fluorometer nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das eine, unmittelbar benachbart der Probe angeordnete Ende (34) des Lichtleiters (32) unter einem spitzen Winkel geneigt ist.

6· Fluorometer nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß am anderen Ende des Lichtleiters (32) und benachbart dem Detektor (36) ein Strahlungsfilter (38) vorgesehen ist, das nur Strahlung innerhalb des zweiten, von der Probe emittierten Wellenlängenbereiche durchläßt.

7· Fluorometer nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die als Anregungs· strahlungsquelle dienende Glühlampe eine Wolframglühfadenlampe (14) ist.

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