DE2606481B2

DE2606481B2 - Fluorometer

Info

Publication number: DE2606481B2
Application number: DE2606481A
Authority: DE
Inventors: Gerald Lee Orange Calif. Klein (V.St.A.)
Original assignee: Beckman Instruments Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1975-02-24
Filing date: 1976-02-18
Publication date: 1979-10-25
Also published as: JPS564226Y2; US4031399A; DE2606481C3; DE2606481A1; FR2301822B1; FR2301822A1; JPS51123084U; CH604162A5; GB1495912A

Description

Die Erfindung betrifft ein Fluorometer gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs I.

Ein derartiges Fluorometer ist bereits aus dem Prospekt »Fluorometric« FT-67 der Fa. CAMAG bekannt. Bei diesen bekannten Geräten werden als Quellen ultravioletter Strahlung teure Quecksilberdampflampen verwendet.

Fluorometer haben verbreitet Anwendung für Labor und klinische Analysezwecke zur Identifizierung und Untersuchung des Verhaltens vieler Stoffe und biologischer Substanzen gefunden. Eine Fluoreszenzprobe absorbiert Licht einer gegebenen Wellenlänge und emittiert in Abhängigkeit hiervon Licht einer hiervon verschiedenen Wellenlänge. Oftmals ist der WirJ-.ungs grad (die Ausbeute) der Absorption und der Emission so gering, daß Fluorometer immer höherer Empfindlichkeit für die emittierte Strahlung für verläßliche Analysen erforderlich sind. Mit zunehmender Empfindlichkeit wächst jedoch auch die Wahrscheinlichkeit, daß

•⁵ Strahlungen von Fremdquellen oder von der Anregungsstrahlungsquelle den Nachweis und die Messung der von der Probe ausgehenden Fluoreszenzstrahlung nachteilig beeinflussen.

Bei den derzeit verfügbaren Fluorometern. bei

weichen entweder eine Probe mit einer UV-Strahlungsquelle angestrahlt oder ein Lichtspalt von Licht des gewünschten Wellenlängenbandes auf die Probe abgebildet wird, bereitet entweder die Sammlung und der Nachweis der gewünschten Fluoreszenzstrahlung unter Ausschuß von Strahlung anderer Strahlungsquellen Schwierigkeiten, oder sie sind so kompliziert und aufwendig in ihrem Aufbau, daß sie für viele Anwendungszwecke unangemessen werden. In diesem Zusammenhang ist zu berücksichtigen, daß bei Anstrah lung einer Probe mit UV-Strahlung alle Fluoreszenz stoffe in der Nachbarschaft der Probe, wie beispielsweise benachbarte Proben oder auch Fremdstoffe, Fluoreszenz zeigen. Dies hat zur Folge, daß umfangreiche Lichtlenk- und Abschirmvorrichtungen erforderlich sind, um zu verhindern, daß diese ungewünschte Strahlung in den Detektor gelangt Die Abbildung eines Lichtspaltes gewünschter Bandbreite auf der Probe hat bisher komplizierte Anordnungen von Dispersionselementen, wie beispielsweise optische Prismen oder

•»ο Gitter, erforderlich gemacht, was aligemein relativ niedrige Anregungsenergiepegel zur Folge hat und somit stärkere Strahlungsquellen erforderlich macht. Außerdem wird bei beiden bekannten Verfahren, um den Eintritt von Streulicht in das System möglichst zu

⁴S verringern und die Ansprechempfindlichkeit des Systems für die Emissionsstrahlung zu erhöhen, der Detektor entweder benachbart der zu analysierenden Probe angeordnet bzw. ist eine entfernte Anordnung nur bei Verwendung eines komplizierten optischen

Systems zwischen der Probe und dem Detektor möglich. Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe

zugrunde, ein Fluorometer zu schaffen, das ohne die

Verwendung so aufwendiger Quellen ultravioletter Strahlung wie einer Quecksilberdampflampe auskommt

_und das dennoch eine hohe Empfindlichkeit aufweist.

Die Erfindung löst diese Aufgabe durch ein Fluorometer der eingangs genannten Art, das erfindungsgemäß die Merkmale des kennzeichnenden Teil des Patentanspruchs I aufweist.

Waren bisher Glühlampen als schlechte UV-Strahler für die Verwendung in Fluorometern abgelehnt worden, so wird durch die Fokussierung des Lichtes der Glühlampe eine UV-Strahlung ausreichender Konzentration auf die Probe gerichtet.

Durch die Erfindung wird somit ein Fluorometer geschaffen, das außerordentlich empfindlich und gleichwohl einfach in der Konstruktion ist. Von der Probe ausgehende Strahlung wird an einer unmittelbar

benachbart der Probe gelegenen Stelle auf der gleichen Seite der Probenebene wie das auf die Probe auftreffende Erregerlicht gesammelt Hierdurch wird ein möglichst großer Teil der Fluoreszenzenergie gesammelt und so die Empfindlichkeit des Systems erhöht. Außerdem werden hierdurch Fehler infolge von Löschung, d. h. Strahlungsreabsorption entweder in der Probe oder im Probenträger, weitgehend verringert. Außerdem werden Fehler infolge von Rückstreuung von Erregungsenergie durch das Sekundärfilter weitgehend verringert, das von dem Erregungssystem erzeugte Wellenlängen unterdrückt Außerdem ermöglicht die erhöhte Empfindlichkeit des Fluorometers die Verwendung einer Wolframstrahlungsquelle als UV-Strahlungsquelle. Derartige Wolframstrahlungsquellen sind gewöhnlich wegen ihrer verhältnismäßig niedrigen UV-Emission als UV-Strahlungsquellen nicht geeignet

Hierdurch erreicht man einerseits den Vorteil einer einfachen und billigen Strahlungsquelle. Andererseits kann die gleiche Strahlungsquelle in dem gleichen Instrument als Erregungsstrahlungsquel'e für ein Densitometer mit sichtbarem Licht und für ein Fluoromete^r mit UV-Licht verwendet werden.

Im folgenden werden Ausführungsbeispieie der Erfindung an Hand der Zeichnung beschrieben; in dieser zeigt

F i g. 1 in perspektivischer Schemadarstellung den optischen Teil eines Fluorometers gemäß der Erfindung,

Fig.2 in vergrößerter Draufsicht eine in dem optischen System aus F i g. 1 verwendete Lichtübertragungsabschirmung,

Fig.3 die Abschirmung aus Fig.2 in Schnittansicht im Schnitt längs der Linie 3-3 in F i g. 2,

Fig.4 in Teilseitenansicht den in dem Fluorometer von F i g. 1 verwendeten Lichtleiter. J5

F i g. 1 veranschaulicht eine Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Fluorometers, in welchem eine Fluoreszenzprobe mit Lichtstrahlungsenergie angeregt und die von der Probe emittierte Strahlung nachgewiesen wird. Das Fluorometer weist ein Ganzes mit 10 bezeichnetes Anregungssystem zur Erzeugung einer kleinen Lichtlläche, wie beispielsweise eines schmalen Schlitzes 12, auf, der bzw. die in der Ebene der zu analysierenden Probe abgebildet werden, derart, daß der Lichtschlitz auf die Probe trifft. Die (in Fi g. I nicht dargestellte) Probe kann in dem Fluorometer in herkömmlicher Weise montiert oder gehaltert werden. Beispielsweise kann die Probe auf einem Glas- oder Kunststoffträger angeordnet sein, der zur Ausrichtung der Probe mit dem Schlitz 12 montiert ist. Um die Probe in Ausrichtung mit dem Schlitz zu bringen, kann ein Schlitten oder eine anderswcitige Transportvorrichtung vorgesehen sein. Für Zwecke einer Reihenanalyse können mehrere auf einem oder auf mehreren Trägern angeordnete Proben mittels der Transportvorrichtung aufeinanderfolgend an dem Schlitz vorbeigeführt werden.

Das Anregiingssystem 10 weist eine Lichtquelle 14 in Gestalt einer Wolframlampe mit Glühfaden 16, zwei Kondensorlinsen 18, eine Schutzplatte 20, zwei Objektivlinsen 22, einen Diagonalspiegel 24 sowie ein Primärfilter 26, sämtlich in herkömmlicher Ausführung, auf. Die Kondensorlinsen 18 fokussieren ein verkleinertes Bild des Glühfadens 16 der Erregungsstrahlenquelle auf die Schlitzplatte 20. Die Objetivlinsen 22 zusammen mit dem Spiegel 24 erzeugen ein scharfes Bild des beleuchteten Schlitzes in der Platte 20 in der Probenebene. Das für die Erregung der Probe gewünschte Wellenlöngenband wird durch das Primärfilter 26 ausgesondert, dessen Durchlaßbereich den gewünschten Wellenlängen entspricht Um verschiedene Proben analysieren zu können, soll das Filter 26 leicht auswechselbar und durch Filter mit unterschiedlichen Durchlaßeigenschaften je nach der speziell interessierenden Probe ersetzbar sein.

Nach dem Grundgedanken der Erfindung ist unmittelbar benachbart der Probe eine als Ganzes mit 30 bezeichnete Lichtüberführungs- bzw. -übertragungsvorrichtung vorgesehen, welche die von der Probe emittierte Strahlung sammelt und zu einem entfernt angeordneten Detektor überträgt Die Übertragungsvorrichtung weist einen Lichtleiter 32 mit einer unmittelbar benachbart der Probe angeordneten schrägen Stirnfläche 34 auf; das entgegengesetzte Ende des Lichtleiters ist auf einen Detektor 36, wie beispielsweise eine Photomultiplierröhre, ausgerichtet In dem Übertragungssystem 30 zwischen der Lichtleitung und dem Detektor isi ein Sekundärfilter 38 angeordnet, um zu gewährleisten, daß nur von der ';obe emittierte Strahlung in den Detektor übertragen wiri Zu diesem Zweck weist das Sekundärfilter eine Durchlaßcharakteristik auf, welche von dem Erregersystem 10 erzeugte Wellenlängen unterdrückt.

Die Übertragungsvorrichtung 30 weist wie aus den F i g. 2 und 3 ersichtlich, auch eine opake Lichtabschirmung 40 eng benachbart der Ebene der zu analysierenden Proben auf. In Fig. 1 ist die Lichtabschirmung der Übersichtlichkeit halber nicht dargestellt Die Lichtabschirmung 40 weist eine Öffnung 42 auf, durch welche hindurch der Lichtschlitz bzw. -spalt 12 aus dem Erregersystem 10 in die Ebene der Probe abgebildet wird. Der Spalt 12 erstreckt sich in F i g. 3 senkrecht zur Zeichenebene und ist in Fig.3 lediglich als Lichtpunkt dargestellt. Die als Grenze mit 44 dargestellte Probenebene kann einen Träger mit siner oder mehreren Probe(n) aufweisen, der in Pfeilrichtung verschiebbar ist, um die Proben am Ort des Lichtsp^tltes 12 in Stellung zu bringen. Die Erregung der Probe durch den schmalen, fokussieren Lichtspalt gewährleistet, daß nur die jeweils interessierende Probe und gegebenenfalls sogar nur eine bestimmte Zone dieser Probe erregt wird. Die öffnung 42 der Abschirmung 40 ist so bemessen, daß das Bild des Lichtspaltes 12 von der Abschirmung hindurchgelassen wird, daß jedoch Streubilder in dem optischen System durch die Abschirmung zurückgehalten werden.

Die Lichtabschirmung 40 weist ferner einen der öffnung 42 benachbarten Durchlaß 46 auf, der auf die Probenebene ausgerichtet ist und einen Sektor der von der Probe emittierten Strahlung auffängt. Der Durchlaß 46 weist eine die Probenebene unter einem spitzen Wirkel schneidende Längsachse auf. Er steht mit einem senkrecht hierzu in der Lichtabschirmung verlaufenden Kanal 48 in Verbindung. Das eine Ende des Lichtleiters 32 ist in dem Kanal 48 befestigt und zwar so, daß die schräge Stirnfläche 34 des Lichtleiters am Schnittpunkt des Durchlasses 46 und des Kanals 48 zu liegen kommt und so die in dem Durchlaß aufgefangene Strahlung aufnimmt und sie im Inneren des Lichtleiters in Richtung auf den Detektor 34 umlenkt

Der Lichtleiter 32 ist aus einem geeigneten lichtdurchlässigen Material hergestellt, das keine Fluoreszenz in dem interessierenden Erregungswellenlängenbereich besitzt. Das eine Ende des Leiters ist zur Bildung der Fläche 34 unter einem Winkel von 45° bezüglich der Leiterlängsachse geschnitten und poliert;

am anderen Ende ist der Lichtleiter unter 90° geschnitten und poliert. Die Sammlung der von der Probe ausgehenden Strahlung durch den Lichtleiter ist in F i g. 4 veranschaulicht. Von der mit dem Lichtspalt 12 bestrahlten Fläche der Probe ausgehende Strahlung, welche in den Lichtleiter rechtwinklig zu dessen Längsachse eintritt, wird an der schrägen Stirnfläche 34 durch innere Reflexion parallel zur Achse des Lichtleiters in Richtung auf dessen anderes Ende umgelenkt. Strahlung, die unter einem anderen als einem rechten Winkel eintritt (in Fig.4 gestrichelt angedeutet), wird ebenfalls durch innere Reflexionen an der Stirnfläche 34 und an der Wandung des Lichtleiters in Richtung auf das andere Ende des Lichtleiters

^r> gelenkt. Somit wird von dem Durchlaß 46 aufgefangene Strahlung durch den Lichtleiter aufgesammelt und entlang diesem dem Detektor 36 zugeführt. Vorzugsweise ist der Lichtleiter mit einem opaken Material bedeckt bzw. überzogen, um den Eintritt von Streu- oder anderweitigem Fremdlicht zu verhindern.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche;

1. Fluorometer mit einer Erregungsstrablungsquelle, von der Licht innerhalb eines ersten Wellenlängenbandes auf eine zu analysierende Probe fällt, wobei die Probe in Abhängigkeit von der auf sie auftreffenden Erregerstrahlung Strahlung innerhalb eines zweiten Wellenlängenbandes emittiert, die von einem Lichtleiter, dessen eines Ende unmittelbar benachbart der Probe auf der mit der Erregerstrahlung beaufschlagten Seite angeordnet ist und dessen anderes Ende auf einen Strahlungsdetektor ausgerichtet ist, dem Strahlungsdetektor zugeführt wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Erregungsstrahlungsquelle aus einer Glühlampe (14) besteht, deren Strahlung von einem Fokussierungssystem (18,20,22, 24) auf eine kleine Lichtfläche in der Ebene (44) der zu analysierenden Probe fokussiert wird und daß eine opake Lichtabschirmung (401 vorgesehen ist mit einem unmittelbar benachbart üer Probe angeordneten Durchlaß (46), der so bemessen ist, daß er einen Sektor der von der Probe emittierten Strahlung auffängt und sammelt und daß der Lichtleiter (32) so in der Abschirmung (40) angeordnet ist, daß das eine Ende (34) des Lichtleiters (32) in dem Durchlaß (46) der Abschirmung zu liegen kommt und «Jessen Längsachse schneidet und daß die Stirnfläche an diesem einen Ende (34) des Lichtleiters einen spitzen Winkel mit der Lichtleiterlängsachse einschließt.

2. Fluorometer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Fokussierungssystem eine Aperturvorrichtung (20) -,owie e'je Vorrichtung (18) zur Fokussierung des von der Glühlampe (14) ausgehenden Lichtes auf eine voif ;gebene Apertur in der Aperturvorrichtung aufweist, sowie eine Vorrichtung (22, 24) zur Erzeugung eines scharfen Bildes (12) der vorgegebenen Apertur in der Probenebene (44).

3. Fluorometer nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtabschirmung (40) eine dem Durchlaß (46) benachbarte öffnung (42) für den Durchtritt der Erregerstrahlung aufweist, die so bemessen ist, daß sie die Erregerstrahlung von der Erregerstrahlungsquelle (14) zu der Probenebene (44) hindurchläßt, während von der Erregerstrahlungsquelle erzeugte Streubilder durch die Abschirmung zurückgehalten werden.

4. Fluorometer nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß am anderen Ende des Lichtleiters (32) und benachbart dem Detektor (36) ein Strahlungsfilter (38) vorgesehen ist, das nur Strahlung innerhalb des zweiten, von der Probe emittierten Wellenlängenbereichs durchläßt.

5. Fluorometer nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die als Erregerstrahlungsquelle dienende Glühlampe eine Wolframglühfadenlampe (14) ist.