DE2508523B2

DE2508523B2 - Verfahren zur Analyse von biologischen Zellen oder strukturierten Partikeln ähnlicher Größenordnung

Info

Publication number: DE2508523B2
Application number: DE19752508523
Authority: DE
Inventors: Bernhard 6000 Frankfurt Hugemann; Guenter Von Dr. 6236 Eschborn Sengbusch
Original assignee: Battelle Institut eV
Current assignee: Battelle Institut eV
Priority date: 1975-02-27
Filing date: 1975-02-27
Publication date: 1979-07-05
Also published as: DE2508523C3; DE2508523A1

Description

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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Analyse von biologischen Zellen oder Partikeln ähnlicher Größenordnung durch Messung der Fluoreszenz-, Absorptions- oder Streulichtparameter, wobei die Zellen bzw. die Partikel mit Hilfe ■ ines bandförmigen Trägers kontinuierlich durch eine Meßstelle hindurchgeführt und in der Meßstelie durch Anwendung eines fokussierten Strahls beleuchtet werden. Auf diese Weise lassen sich die morphologischen und cytochemischen Eigenschaften biologischer Zellen und ähnlich strukturierter Partikel, wie Gelpartikel (z.B. Sepharose), feststellen.

Aus der DE-AS 12 36 254 ist eine Vorrichtung zuin Zählen von mikroskopisch kleinen Partikeln, z.B. Blutkörperchen, bekannt, bei der die Probe in einem Dunkelfeld beleuchtet und mit einem photoelektrischen Wandler abgetastet wird. Der Strahl wird auf dem Probenhalter fokussiert Er ist jedoch nicht kleiner als das Objekt Eine solche Methode eignet sich nicht für die quantitative Fluoreszenz-Auflichtmikroskopie. Mit dieser Vorrichtung können die Partikel lediglich gezählt so aber nicht analysiert werden.

In der DE-OS 15 98 621 wird ein Verfahren zur Untersuchung von biologischen Zellen, die sich in einer Suspensionslösung befinden, beschrieben. Dabei wird nur die Fluoreszenz bzw. die Absorption im Durchlicht unter Verwendung von UV-Licht gemessen.

Ferner sind aus der DE-PS 21 52 510 und US-PS 35 49 263 Verfahren zum Nachweisen von Oberflächenfehlem bzw. von Fremdkörpern, die mit pulverisiertem Material vermischt sind, bekannt Dabei wird das zu ^M untersuchende Objekt durch eine nichtfokussierte Laserstrahlung abgetastet Die Abtastung erfolgt in der DE-PS 21 52 510 durch ein rotierendes Prisma, wobei der Winkel des Laserstrahls ständig verändert wird. Diese Verfahren bzw. Vorrichtungen können ebenfalls nicht für die Fluoreszenz-Auflichtmikroskopie verwendet werden, da konstante Verhältnisse nicht vorliegen, sowie eine punktförmige und zeilenweise Abtastung nicht möglich ist.

Die aus DE-OS 24 5$ 452 bekannte Vorrichtung wird zur Untersuchung von Oberflächen durch vergleichende Messung bzw. zur Analyse einer Strahlung, die von der Oberfläche reflektiert wird, herangezogen. Bei der Abtastung wird nur das Objekt bewegt, so daß sie nicht punktförmig und zeilenweise erfolgt

Zur automatisierten Identifikation von Zellen mit hoher Geschwindigkeit, d. h. mit Geschwindkeiten über etwa 10³ Zellen/min, werden bereits die zu analysierenden Zellen auf einem bandförmigen Träger in einer Zellspur deponiert oder in Flüssigkeit hydrodynamisch fokussiert und an einer Meßstelle vorbeigeführt In der Meßstelle, ζ. Β. im Meßfeld eines Mikroskopphotometers, werden dann die Zellen beleuchtet und die Absorptions-, Fluoreszenz- oder Streulichtparameter gemessen.

Um hohe Meßgeschwindigkeiten erreichen zu können, werden die Zellen kontinuierlich durch die Meßstelie hindurchbewegt Das Meßfeld wird so eingestellt, daß es quer zur Lauf- bzw. Strömungsrichtung, also lateral, etwas breiter ist als die Zellspur. In Laufrichtung, also longitudinal, wird entweder zur integralen Meßwerterfassung die Meßfeldbreite der Zeligröße angepaßt oder zur eindimensionalen Abtastung der Meßparameter nach dem »slit scan«-Verfahren ein im Vergleich zur Zelle schmales Meßfeld eingestellt Bei kontinuierlicher und homogener Ausleuchtung lassen sich dann die Fluoreszenz- oder Absorptionsparameter der Zellen messen und zur Analyse der Zellen auswerten.

Da bei diesen bekannten Verfahren der integrale Wert bei den Absorptionsmessungen kein quantitatives Maß für die Zellinhaltsstoffe liefert bleibt die integrale Meßwerterfassung praktisch auf Fluoreszenzparameter beschränkt Beim »slit scan« kann mit Absorptionsmessungen z. B. zwar die Zellänge in Laufrichtung gemessen werden, es fehlt aber, z. B. für eine Größenbestimmung, der quantitative Wert quer zur Laufrichtung. Durch Messung der Fluoreszenzparameter ist bei Anwendung des »slit scan«-Verfahrens eine bedingte Zuordnung cytochemischer zu morphologischen Eigenschaften möglich.

Ein wesentlicher Nachteil der beschriebenen bekannten Verfahren besteht darin, daß entweder nur ein integraler Meßwert pro Zelle ermittelt wird oder daß die Zelle nur in Laufrichtung, also eindimensional (mit Hilfe des »slit scj>n«-Verfahrens) abgetastet werden kann. Außerdem läßt sich bei Fluoreszenzparameter-Messungen nur ein Teil des in der Meßstelle aufgewandten Anregungslichtes ausnutzen. Unvermeidliche Inhomogenitäten des A.iregungslichtes im Meßfeld beeinflussen ebenfalls die Meßwerte nachteilig. Schließlich wird auch durch Störfluoreszenz und Streulicht aus dem gesamten Meßfeld das Signal-Rausch-Verhältnis entscheidend verschlechtert.

Um einige der vorgenannten Nachteile zu beseitigen, ist es auch bereits bekannt die Zellen auf einem Objektträger zu deponieren und meanderförmig an der Meßstelle vorbeizuführen, indem z. B. der Mikroskoptisch meanderförmig bewegt wird. Die notwendigen Start- und Stoppzeiten bei einer mechanischen Führung dieser Art begrenzen jedoch die Auswertgeschwindigkeit auf Werte von ca. 100 Zellen/min.

Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, die zuvor erläuterten Nachteile zu überwinden und ein Verfahren zur schnellen und außerdem genaueren Analyse von biologischen Zellen und vergleichbaren

Partikeln zu entwickeln. Das Verfahren sollte sowohl mit Fluoreszenzauflicht als auch im Durchlicht und in Verbindung mit Absorptions-mikroskopischen Meßverfahren anwendbar sein.

Es hat sich nun herausgestellt, daß diese Aufgabe mit s dem im beigefügten Anspruch 1 beschriebenen Verfahren in technisch sehr fortschrittlicher Weise gelöst werden kann.

Erfindungsgerr.äB wird nämlich als fokussierter Strahl ein fokussierter Laserstrahl verwendet, dessen einzelne Lichtpunkte kleiner sind als die Abmessungen des zu analysierenden Objekts und der Lichtstrahl des Lasers gepulst und in der Objektebene senkrecht zu der Bewegungsrichtung des Trägers über die gesamte Breite des Meßfeldes hin- und herbewegt 1 s

Dadurch läßt sich z. B. bei einer Analysengeschwindigkeit von über 5 χ 1(P Zellen oder Partikeln pro Minute eine Auflösung von mindestens 1 μπι in lateraler und longitudinaler Richtung erzielen. Auf diese Weise können bei der Analyse biologischer Zellen in weniger als einer Millisekunde deren morphologische, cytochemische und andere Parameter, wie beispielsweise die Größe des Zellkerns und des Plasmas, gemessen werden.

Das Pulsen des Laserstrahls läßt sich z. B. durch Verwendung eines gepulsten Lasers oder auch durch Anwendung einer Kerr-Zelle oder dergleichen im Lichtstrahl eines kontinuierlich emittierenden Lasers verwirklichen. Die Ablenkgeschwindigkeit des Laserlichtstrahls quer zur Bewegungsrichtung des Trägers sollte groß gegenüber der Transportgeschwindigkeit der zu analysierenden Objekte gewählt werden, wobei der jeweilige Wert des Geschwindigkeitsverhältnisses von dem geforderten Auflösungsvermögen der strukturellen Zuordnung der Meßparameter abhängig ist

Weitere Merkmale, Vorteile und Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung gehen aus der folgenden Erläuterung sowie aus der schematischen Darstellung eines Ausführungsbeispiels der Erfindung hervor.

In der Zeichnung befinden sich die zu analysierenden biologischen Zellen 1 in der Zellspur 2 eines bandförmigen Trägers 3.

An der Meßstelle, d.h. in dem in der Zeichnung gestrichelten Meßfeld 4, wird das zu analysierende Objekt, hier eine Zelle 1, beleuchtet und — je nach Ausführungsart der Erfindung — die Fluoreszenz, die Absorption oder Streulichtparameter gemessen.

Als Lichtquelle, die in der Zeichnung nicht dargestellt ist, wird erfindungsgemäß ein kontinuierlich emittierender oder ein gepulster Laser verwendet, der in der 5u Objektebene, in der sich die Zellspur 2 oder ein hydrodynamisch fokussierter Zellstrom befindet, auf einer Fläche < 1 μπι Durchmesser fokussiert wird. In dem Strahlengang des Lasers befindet sich ein Schwingspiegel oder ein anderer Laserstrahlablenker, und zwar mit derartiger Ausbildung, daß der Laserfleck in der Objektebene quer zu der durch den Pfeil 5 angedeuteten Laufrichtung der Zellen 1 mit einer Amplitude, die der Zellstrich- bzw. der Zellstrombreite entspricht, hin- und herschwingt; die bei der seitlichen Laserbewegung entstehenden Lichtpulse sind durch die winzigen Kreise 4' in der Zeichnung symbolisch dargestellt

Nach diesem Verfahren bzw. mit der beschriebenen Anordnung lassen sich bei einer Zellrate von mehr als 10³ Zellen/min, morphologische und cytochemische Parameter gleichzeitig mit einer lateral und longitudinal erreichbaren Auflösung von mindestens 1 μπι messen. Außerdem ergibt sich dabei nur ein minimales Fading der Fluoreszenzsignale, da die Meßzeiten kleiner als 100 μ* sind. Zellkoinzidenzen beeinflussen die Meßgenauigkeit bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht, da auch nebeneinanderliegende Zellen ausgewertet werden können.

Ferner ist von Bedeutung, daß bei Verwendung eines gepulsteT Laserstrahls eine direkte Digitalisierung der Meßsignale ermöglicht wird.

Im Gegensatz zu den bekannten Verfahren wird die Leuchtdichte optimal genutzt da das gesamte Anregungslicht in dem Meßpunkt fokussiert ist Außerdem wird durch dieses Fokussieren ein störender Einfluß von Inhomogenitäten des Anregungsstrahls ausgeschaltet

Da der Meßpunkt kleiner ist als das zu analysierende Objekt entsteht nur eine minimale Störfluoreszenz.

Bei einer Auflichtanregung erfolgt die Ablenkung des Laserstrahls am zweckmäßigsten am dichromatischen Teilerspiegel, während bei einer Durchlichtmessung die Ablenkung am Umlenkspiegel erfolgen sollte. Die Ablenkung des Laserstrahls kann aber auch mit herkömmlichen Mitteln außerhalb des Mikroskops durchgeführt werden.

D^-2 Geschwindigkeit der einzelnen biologischen Zellen bzw. der zu analysierenden Partikel und die Ablenkfrequenz des Laserlichtstrahls werden so aufeinander abgestimmt, daß eine genügend hohe Zeilenzahl pro Partikel erreicht wird. Zur Ablenkung des Laserstrahls für niedrige Frequenzen (bis etwa 10 kHz) eignen sich mechanische oder elektromechanische Antriebssysteme. Für höhere Frequenzen werden z. B. Ultraschall- und HF-Schwingkristalle, wie Biegeschwinger bevorzugt.

Hierzu 1 Blatt Zeichnujgen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Analyse von biologischen Zellen oder strukturierten Partikeln in ähnlicher Größenordnung durch Messung der Fluoreszenz-, Absorptions- oder Streuiichtparameter, wobei die Zellen oder Partikel mit Hilfe eines bandförmigen Trägers kontinuierlich durch eine Meßstelle hindurch geführt und in der Meßstelle durch Anwendung eines fokussierten Strahls beleuchtet werden, dadurch gekennzeichnet, daS als fokussierter Strahl ein fokussierter Laserstrahl verwendet wird, dessen einzelne Lichtpunkte kleiner sind als die Abmessungen des zu analysierenden Objektes (1), und daß der Lichtstrahl des Lasers gepulst und in der Objektebene senkrecht zu der Bewegungsrichtung (Pfeil 5) des Trägers (3) über die gesamte Breite des Meßfeldes (4) hin- und herbewegt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, da!) entsprechend dem geforderten Auflösungsvermögen der strukturellen Zuordnung der Meßparameter die Ablenkgeschwindigkeit des Laserlichtstrahls groß gegenüber der Transportgeschwindigkeit der zu analysierenden Objekte (1) gewählt wird.

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