DE2508523A1

DE2508523A1 - Verfahren zur analyse von biologischen zellen oder strukturierten partikeln aehnlicher groessenordnung

Info

Publication number: DE2508523A1
Application number: DE19752508523
Authority: DE
Inventors: Berhard Hugemann; Guenter Von Dr Sengbusch
Original assignee: Battelle Institut eV
Current assignee: Battelle Institut eV
Priority date: 1975-02-27
Filing date: 1975-02-27
Publication date: 1976-09-09
Also published as: DE2508523C3; DE2508523B2

Description

Verfahren zur Analyse von biologischen Zellen oder strukturierten Partikeln ähnlicher Größenordnung Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Analyse von biologischen Zellen oder Partikeln ähnlicher Größenordnung, die mit Hilfe eines bandförmigen Trägers kontinuierlich durch eine Meßstelle hindurchgeführt werden, wobei die Zellen bzw. Partikel in der Meßstelle beleuchtet und die Fluoreszenz-, Absorptions- oder Streulichtparameter gemessen werden. Auf diese Weise lassen sich die morphologischen und Cytochemischen Eigenschaften biologischer Zellen und ähnlich strukturierter Partikel, wie Gelpartikel (z.B. Sepharose) feststellen Es ist bereits bekannt, daß zur automatisierten Identifikation von Zellen mit hoher Geschwindigkeit, deh. mit Geschwindigkeiten über etwa 103 Zellen/minO, die zu analysierenden Zellen auf einem bandförmigen Träger in einer Zellspur deponiert oder in Flüssigkeit hydrodynamisch fokussiert und an einer Meßstelle vorbeigeführt werden.
In der Meßstelle, z.B. im Meßfeld eines Mikroskopphotometers, werden dann die Zellen beleuchtet und die Absorptions-, Fluoreszenz- oder Streulichtparameter gemessen Um hohe Meßgeschwindigkeiten erreichen zu können, werden die Zellen kontinuierlich durch die Meßstelle hindurchbewegt0 Das Meßfeld wird so eingestellt, daß es quer zur Lauf- bzw. Strömungsrichtung, also lateral, etwas breiter ist als die Zellspur; in Laufrichtung, also longitudinal, wird entweder zur integralen Meßwert erfassung die Meßfeldbreite der Zellgröße angepaßt oder zur eindimensionalen Abtastung der Meßparameter nach dem slit scan"-Verfahren ein im Vergleich zur Zelle schmales Meßfeld eingestellt.
Bei kontinuierlicher und homogener Ausleuchtung lassen sich dann die Fluoreszenz- oder Absorptionsparameter der Zellen messen und zur Analyse der Zellen auswerten Da bei diesen bekannten Verfahren der integrale Wert bei den Absorptionsmessungen kein quantitatives Maß für die Zellinhaltsstoffe liefert, bleibt die integrale Meßwerterfassung praktisch auf Fluoreszenzparameter beschränkt.
Beim slit scan" kann mit Absorptionsmessungen z.B. zwar die Zellänge in Laufrichtung gemessen werden, es fehlt aber z.B für eine Größenbestimmung der quantitative Wert quer zur Laufrichtung. Durch Messung der Fluoreszenzparameter ist bei Anwendung des slit scan11-Verfahrens eine bedingte Zuordnung cytochemischer zu morphologischen Eigenschaften möglich.
Ein wesentlicher Nachteil der beschriebenen bekannten Verfahren besteht darin, daß entweder nur ein integraler Meßwert pro Zelle ermittelt wird oder daß die Zelle nur in Laufrichtung, also eindimensional (mit Hilfe des 2tslit-scan' Verfahrens) abgetastet werden kann0 Außerdem läßt sich bei Fluoreszenzparameter-Messungen nur ein Teil des in der Meßstelle aufgewandten Anregungslichtes ausnutzen. Unvermeidliche Inhomogenitäten des Anregungslichtes im Meßfeld beeinflussen ebenfalls die Meßwerte nachteilig. Schließlich wird auch durch Störfluoreszenz und Streulicht aus dem gesamten Meßfeld das Signal-Rausch-Verhältnis entscheidend verschlechtert.
Um einige der vorgenannten Nachteile zu beseitigen, ist es auch bereits bekannt, die Zellen auf einem Objektträger zu deponieren und meanderförmig an der Meßstelle vorbeizuführen, indem z.B der Mikroskoptisch meanderförmig bewegt wird. Die notwendigen Start- und Stopzeiten bei einer mechanischen Führung dieser Art begrenzen å jedoch die Auswertgeschwindigkeit auf Werte von ca0 100 Zellen/minO Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, die zuvor erläuterten Nachteile zu überwinden und ein Verfahren zur schnellen und außerdem genaueren Analyse von biologischen Zellen und vergleichbaren Partikeln zu entwickeln. Das Verfahren sollte sowohl mit Fluoreszenzauflicht als auch im Durchlicht und in Verbindung mit Absorptions-mikroskopischen Meßverfahren anwendbar seinç Es hat sich nun herausgestellt, daß diese Aufgabe mit dem im beigefügten Anspruch 1 beschriebenen Verfahren in technisch sehr fortschrittlicher Weise gelost werden kann.
Erfindungsgemäß wird nämlich über die zoB auf einem bandförmigen Träger deponierten Zellen oder Partikel in der Meßstelle ein Laserstrahl, der auf eine im Vergleich zu den Abmessungen des zu analysierenden Objektes kleine Fläche fokussiert ist, mit hoher Frequenz senkrecht zur Bewegungsrichtung des Trägers hin- und herbewegt. Dadurch wird eine quasi punktförmige Abtastung der Zellen erreicht, wodurch sich z.B. bei einer Analysengeschwindigkein von über 5 x 103 Zellen oder Partikel pro Minute eine Auflösung von mindestens i /um in lateraler und longitudinaler Richtung erzielen läßt0 Auf diese Weise können bei der Analyse biologischer Zellen in weniger als einer Nillisekunde deren morphologische, cytochemische und andere Parameter, wie beispielsweise die Größe des Zellkerns und des Plasmas, gemessen werden.
Nach einer vorteilhaften Ausführungsart der Erfindung wird der Lichtstrahl des Lasers gepulst, was sich z,B,durch Verwendung eines gepulsten Lasers oder auch durch Anwendung einer Kerr-Zelle oder dergleichen im Lichtstrahl eines kontinuierlich emittierenden Lasers verwirklichen läßt Die Ablenkgeschwindigkeit des Laserlichtstrahls quer zur Bewegungsrichtung des Trägers sollte groß gegenüber der Transportgeschwindigkeit der zu analysierenden Objekte gewählt werden, wobei der jeweilige Wert des Geschwindigkeitsverhältnisses von dem geforderten Auflösungsvermögen der strukturellen Zuordnung der Meßparameter abhängig ist Weitere Merkmale, Vorteile und Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung gehen aus der folgenden Erläuterung sowie aus der beigefügten schematischen Darstellung eines Ausführungsbeispiels der Erfindung hervor.
In der Zeichnung befinden sich die zu analysierenden biologischen Zellen 1 in der Zellspur 2 eines bandförmigen Trägers 30 An der Meßstelle, d.ho in dem in der Zeichnung gestrichelten Meßfeld 4, wird das zu analysierende Objekt, hier eine Zelle 1, beleuchtet und - je nach Ausführungsart der Erfindung - die Fluoreszenz, die Absorption oder Streulichtparameter gemessen.
Als Lichtquelle, die in der Zeichnung nicht dargestellt ist, wird erfindungsgemäß ein kontinuierlich emittierender oder ein gepulster Laser verwendet, der in der Objekt ebene, in der sich die Zellspur 2 oder ein hydrodynamisch fokussierter Zellstrom befindet, auf eine Fläche ~ 1 /um Durchmesser fokussiert wird. In dem Strahlengang des Lasers befindet sich ein Schwingspiegel oder ein anderer Last£-ahlablenker, und zwar mit derartiger Ausbildung, daß der Laserfleck in der Objektebene quer zu der durch den Pfeil 5 angedeuteten Laufrichtung der Zellen 1 mit einer Amplitude, die der Zellstrich- bzw. der Zellstrombreite entspricht, hin und her schwingt; die bei der seitlichen Laserbewegung entstehende Lichtpulse sind durch die winzigen Kreise 4' in der beigefügten Zeichnung symbolisch dargestellt.
Nach diesem Verfahren bzw. mit der beschriebenen Anordnung lassen sich bei einer Zellrate von mehr als 103 Zellen/minO morphologische und cytochemische Parameter gleichzeitig mit einer lateral und longitudinal erreichbaren Auflösung von mindestens 1 /um messen. Außerdem ergibt sich dabei nur ein minimales Fading der Fluoreszenzsignale, da die Meßzeiten kleiner als 100 /us sind. Zellkoinzidenzen beeinflussen die Meßgenauigkeit bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht, da auch nebeneinanderliegende Zellen ausgewertet werden können.
Ferner ist von Bedeutung, daß bei Verwendung eines gepulsten Laserstrahles eine direkte Digitalisierung der Meßsignale ermöglicht wird.
Im Gegensatz zu den bekannten Verfahren wird die Leuchtdichte optimal genutzt, da das gesamte Anregungslicht in dem Meßpunkt fokussiert ist. Außerdem wird durch dieses Fokussieren ein störender Einfluß von Inhomogenitäten des Anregungstrahles ausgeschaltet.
Da der Meßpunkt kleiner ist als das zu analysierende Objekt, entsteht nur eine minimale StörfluoreszenzO Bei einer Auflichtanregung erfolgt die Ablenkung des Laserstrahles am zweckmäßigsten am dichromatischen Teilerspiegel, während bei einer Durchlichtmessung die Ablenkung am Umlenkspiegel erfolgen sollte. Die Ablenkung des Laserstrahls kann aber auch mit herkömmlichen Mitteln außerhalb des Mikroskops durchgeführt werden.
Die Geschwindigkeit der einzelnen biologischen Zellen bzw. der zu analysierenden Partikel und die Ablenkfrequenz des Laserlichstrahls werden so aufeinander abgestimmt, daß eine genügend hohe Zeilenzahl pro Partikel erreicht wird. Zur Ablenkung des Laserstrahls für niedrige Frequenzen (bis etwa 10 kHz) eignen sich mechanische oder elektromechanische Antriebssysteme. Für höhere Frequenzen werden z.B. Ultraschall- und HF-Schwingkristalle, wie Biegeschwinger, bevorzugt.

Claims

Patent ansprüche

Verfahren zur Analyse von biologischen Zellen oder strukturierten Partikeln ähnlicher Größenordnung, die mit Hilfe eines bandförmigen Trägers oder hydrodynamisch fokussiert kontinuierlich durch eine Meßstelle hindurchgeführt werden, wobei die Zellen bzw. die Partikeln in der Meßstelle beleuchtet und die Fluoreszenz-, Absorptions- oder Streulichtparameter gemessen werden, dadurch gekennzeichnet, daß als Lichtquelle ein Laser verwendet wird, dessen Lichtstrahl in der Objekt ebene auf eine Fläche fokussiert wird, die klein ist gegenüber den Abmessungen des zu analysierenden Objektes (1), und daß der Lichtstrahl des Lasers in der Objektebene senkrecht zu der Bewegungsrichtung (Pfeil 5) des Trägers (3) über die gesamte Breite des Meßfeldes (4) hin- und herbewegt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Laserlichtstrahl gepulst wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß entsprechend dem geforderten Auflösungsvermögen der strukturellen Zuordnung der Meßparameter die Ablenkgeschwindigkeit des Laserlichtstrahls groß gegenüber der Transportgeschwindigkeit der zu analysierenden Objekte (1) gewählt wird.

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